Ringraziamo Darren Obbard per Drosophila immagine in figura 3 e nel manoscritto dei video; J. Marie Hardwick, Wade Gibson e Heather M. Lamb per la preziosa discussione di questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da un Sir Edward Youde Memorial Fellowship (H.L.T.), Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (H.L.T.), Fulbright grant 007-2009 (H.L.T.), Life Science Research Foundation fellowship (H.L.T.) e NCI K22 concedere CA204458 (H.L.T.). Ho Lam Tang è stato un Hildi e Kay Curci Foundation Fellow della Life Sciences Research Foundation (2014-2017).

1) preparazione del biosensore CaspaseTracker mosche
<ol><li>Anestetizzare mosche con CO2e utilizzare un pennello per trasferire 7 a 10 caspase-sensibile Gal4 (DQVD)19 femmine vergini e 7 a 10 G-traccia53 Gal4 reporter giovane maschi mosche (o viceversa) nella stessa fiala con alimento e pasta di lievito fresco. Nota: Croce di mosche Gal4 Caspase-sensibili (DQVD) e G-traccia produrrà CaspaseTracker mosche di progenie. Croce dellaCaspase - sensibili (DQVA)19 Gal4e mosche G-traccia fornirà controllo negativo Vola (vedi discussione). Pasta di lievito fresco serve come fonte di proteine per migliorare la produzione di uova, così che aumenta il numero di discendenti. Selezionare le femmine vergini e giovane maschio vola secondo loro fenotipi54.</li>
	<li>Incubare le mosche a 18 gradi Celsius (oC) durante la croce per 3-7 giorni e quindi trasferire le mosche per un nuovo flacone per impostare una nuova croce a 18 ° C. Continuare a incubare il flaconcino originale a 18 ° C fino a progenie Vola eclose. Nota: Trasferire le mosche del padre a new Fiale per evitare sovraffollamento della progenie al flacone originale. Mosche di genitore in grado di produrre progenie con cibo fresco e pasta di lievito i primi 2-3 interruttori, e quindi la produttività significativamente diminuirà con il tempo. Alzando le mosche 18 ° C può ridurre il segnale aspecifiche di biosensore CaspaseTracker (vedi discussione).</li>
	<li>Selezionare progenie Vola con fenotipi corretta54 per i seguenti esperimenti. Nota: I transgeni di Gal4 caspase-sensibile e G-traccia qui si trova il secondo cromosoma, equilibrato con bilanciatore CyO. Selezionare la progenie di ala non-ricci (senza CyO), che ha entrambi transgeni di caspase-sensibili Gal4 e G-traccia.</li>
</ol>2) applicazione di induzione di morte transitoria delle cellule CaspaseTracker biosensore mosche
<ol><li>Trasferire 10 a 20 appena obtecta donna Vola in un nuovo flacone con alimento fresco e pasta di lievito fresco per 1 giorno a 18 ° C per consentire la produzione di uova camera da oogenesi. Nota: Mantenendo la femmina con mosche maschi potrebbe migliorare la produzione di uova da camera.</li>
	<li>Per indurre l'uovo di Colombo all'apoptosi da colpo di freddo, trasferimento la femmina Vola al nuovo flacone vuoto, che viene poi collocato a-7 ° C per 1 h. Nota: Cold shock danneggia le cellule inducendo la rottura della membrana plasmatica55,56.</li>
	<li>Per indurre l'uovo chambers all'apoptosi da inedia di proteina, trasferire le mosche femminile ad un nuovo flacone con cibo di agar di saccarosio e 1% 8% a 18 ° C per 3 giorni. Nota: Fame di proteine (senza proteine alimentari) può innescare uovo di Colombo per subire apoptosi57,58,59 e autofagia60,61. Interruttore Vola in un nuovo flacone con 8% di saccarosio e 1% di cibo agar ogni giorno per mantenere condizioni ottimali del saccarosio volare.</li>
	<li>Trasferire le mosche stressate per 3 giorni a 18 ° C per consentire loro di recuperare un nuovo flacone con alimento fresco e pasta di lievito fresco. Sezionare la fame e le mosche affamato-recuperati per ottenere l'uovo di Colombo alle ovaie come descritto62. Nota: Per sezionare Drosophila per ottenere le ovaie, anestetizzare mosche con CO2e utilizzare 2 paia di pinze per rimuovere la testa di Mosca e utilizzare le pinze per estrarre la base dell'addome per rimuovere le ovaie delle mosche.</li>
</ol>3) fissazione e colorazione di Uovo sezionato alloggiamenti per l'Imaging
<ol><li>Trasferire gli alloggiamenti di Uovo sezionato insieme con intorno salino di 0,5 mL tamponato fosfato (PBS) per provette da centrifuga 1 mL. Lasciare le uova a stabilirsi. Nota: Ricoprire le punte di pipetta di plastica con 1% albumina di siero bovino (BSA) dissolto in acqua o in PBS per impedire gli alloggiamenti di uovo a bastone sulla superficie di plastica delle punte. Eseguire le procedure seguenti nel buio per evitare photobleaching di proteina fluorescente rossa (RFP, noto anche come DsRed) e la proteina fluorescente verde (GFP) nelle camere di uovo.</li>
	<li>Rimuovere il PBS pipettando e quindi applicare paraformaldeide 4% 0,5 mL in PBS per fissare gli alloggiamenti di uovo a temperatura ambiente al buio per 20-30 min. Nota: Applicare la rotazione delicata in questa e le seguenti fasi di incubazione.</li>
	<li>Rimuovere il paraformaldeide pipettando e poi lavato la camera con 0,5 mL PBST (PBS + 0.1% Triton X-100) per 3 volte. Nota: Fissazione prolungata potrebbe ridurre i segnali RFP e GFP.</li>
	<li>Incubare le camere di uovo con PBST per 1 o 2 h a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C con delicata rotazione per permeabilize gli alloggiamenti di uovo. Nota: PBST può anche evitare uovo alloggiamenti per attaccare la superficie di plastica rivestita di non-BSA.</li>
	<li>Rimuovere il PBST pipettando e quindi applicare 0,5 mL di 10 μg/mL di colorante Hoechst nucleare in PBST agli alloggiamenti di uovo per 1 o 2 h a temperatura ambiente a macchiare per nucleo. Nota 1: Evitare l'incubazione prolungata con colorante nucleare come questo aumenterà il segnale aspecifico. Nota2: Approccio alternativo a macchiare il nucleo senza Hoechst consiste nell'aggiungere 200 agente di montaggio anti-candeggio μL con DAPI (Vedi materiali) ed incubare overnight63, prima di montare i tessuti il coprioggetto di vetro come descritto al protocollo 3.8. Nota3: eseguire la colorazione e le procedure seguenti nel buio per evitare photobleaching.</li>
	<li>Rimuovere il colorante nucleare pipettando e quindi applicare 0,5 mL PBST per lavare gli alloggiamenti di uovo nelle provette da centrifuga 1 mL per 3 volte, con incubazione di 10-20 min con delicata rotazione tra ogni fase di lavaggio.</li>
	<li>Rimuovere tutti i PBST con pipetta bene e quindi applicare 200 agente di montaggio anti-candeggio μL (Vedi materiali) per Incubare gli alloggiamenti di uovo a temperatura ambiente per 3 ore o una notte a 4 ° C fino a quando gli alloggiamenti di uovo affondano sul fondo del tubo. Nota: i tessuti che hanno completamente assorbito l'agente di montaggio affondano sul fondo del tubo.</li>
	<li>Montare gli alloggiamenti di uovo tinto trasferendoli con 200 μL anti-sbianca fissaggio agente su una lastra di vetro pre-pulito per l'imaging di pipettaggio, coprire gli alloggiamenti di uovo con un vetrino coprioggetto 20x20 mm vetro pre-pulito e sigillare il coprioggetto sul vetrino mettendo smalto al bordo del vetrino coprioggetti. Nota 1: Pre-pulire il vetrino e il coprioggetto con acqua o 70% di etanolo. Nota2: Applicare vaselina tra il vetrino e il coprioggetto per evitare di distruggere gli alloggiamenti di uovo di compressione.</li>
	<li>Gli alloggiamenti di uovo usando la fluorescenza o microscopio confocale, utilizzando un 20x, NA 0,8 di immagine obiettivo piano-apocromatico, con eccitazione luce lunghezza d'onda 405 nm per la macchiatura nucleare (rilevare emissioni ~ 461 nm), 561 nm per RFP (attività di caspase in corso o recente) segnale ( rilevare l'emissione ~ 590 nm) e 488 nm per segnale di GFP (passato l'attività della caspasi) (rilevare emissioni ~ 518nm). Nota: Vedi i nostri protocolli pubblicati per microscopia20,64.</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il sistema di biosensore dual CaspaseTracker è un romanzo e l'unico strumento che permette la rilevazione di recente o attività di caspase in corso, rilevamento delle cellule che hanno invertito la morte delle cellule e di sopravvivere dopo aver sperimentato caspase attività in vivo. Mentre l'attività della caspasi è stato tradizionalmente assunto come un segno distintivo dell'apoptosi, crescente gli studi rivelano che non apoptotiche caspase attività svolge ruoli potenzial...

Morte programmata delle cellule, come apoptosi, svolge un ruolo essenziale nello sviluppo embrionale e normale omeostasi eliminando le cellule indesiderate, ferite o pericolose in organismi multicellulari1,2,3. La perdita di equilibrio tra sopravvivenza e morte cellulare può portare a conseguenze fatali come cancro, insufficienza cardiaca, dell'autoimmunità e degenerazione4,5,6,7,8. Attivazione del boia caspases tradizionalmente è stato considerato come il "punto di non ritorno" in apoptosi9,10,11, come si innesca rapida e massiccia demolizione cellulare12, 13,14,15,16. Impegnativo questo dogma generale, abbiamo dimostrato che cellule primarie morente coltivate e le cellule tumorali possono recuperare non solo dopo l'attivazione delle caspasi, ma anche seguente cellula importante tra cui membrana plasmatica blebbing, restringimento delle cellule, tratti distintivi di morte frammentazione mitocondriale, rilascio di mitocondriale del citocromo c nel cytosol, nucleare e condensazione della cromatina, danno del DNA, frammentazione nucleare, l'esposizione di superficie delle cellule della fosfatidilserina (PS) e la formazione di corpi apoptotici 17 , 18 , 19 , 20 , 21. vi proponiamo quella anastasis è un fenomeno di recupero intrinseco delle cellule, come le cellule morte possono recuperare dopo la rimozione delle cellule morte stimoli17,18,19,20, 21. abbiamo coniato il termine "Anastasis" (Αναστάσης)18, che significa "rising alla vita" in greco, a descrivere questo fenomeno di recupero cellulare inaspettato. La nostra osservazione di anastasis è ulteriormente supportata da recenti studi indipendenti che rivelano anche il recupero delle cellule dopo la fosfatidilserina esternalizzazione22,23,24, limitata mitocondriale esterna di permeabilizzazione della membrana25, attivazione di stirpe misto chinasi-come (MLKL) e cella restringimento26.
Caratterizzare i meccanismi che regolano l'anastasis avrà implicazioni fisiologiche, patologiche e terapeutiche lo spostamento di paradigma. Anastasis potrebbe rappresentare un meccanismo di cytoprotective precedentemente sconosciuti per salvare o preservare importanti cellule postmitotic e tessuti che sono difficili da sostituire e possibilmente conto per l'inversione di insufficienza cardiaca ventricolare scaricando con ventricolare di sinistra assistere dispositivi (LVADs)27,28, recupero di cellule fotorecettrici dopo esposizione transitoria di luce eccessiva29,30,31, o la riparazione dei neuroni dopo la ferita di cervello32. Se è così promuovere anastasis potrebbe migliorare il recupero di cellule e tessuti. Al contrario, anastasis potrebbe essere una tattica di fuga inaspettata usata dalle cellule tumorali per sopravvivere terapia d'induzione di morte delle cellule, causando cancro ricorrenza17,18. Di conseguenza, sopprimendo anastasis morendo, le cellule tumorali durante e dopo il trattamento del cancro potrebbe essere una strategia terapeutica novella per curare tumori impedendo loro ricaduta.
Durante il processo di anastasis, abbiamo trovato che alcune cellule recuperate acquisito alterazioni genetiche permanente e ha subito la trasformazione oncogena, probabilmente a causa di danni al DNA sostenute durante l'apoptosi18,20,21 . Invertire il processo di morte delle cellule con DNA danneggiato potrebbe essere un meccanismo della tumorigenesi, potenzialmente sottostante l'osservazione che ripete la lesione del tessuto aumenta il rischio di cancro in una varietà di tessuti, come lesione cronica termica nell'esofago indotto tramite il consumo di bevande molto calde33,34,35, danni al fegato a causa di alcolismo36,37, evoluzione del tumore dopo genotossici cancro terapia38, 39,40e lo sviluppo di nuovi cancri dai tessuti normali che si verificano durante gli intervalli tra i cicli di terapia anti-cancro41,42,43,44 . Se true, targeting anastasis potrebbe prevenire o arrestare e progressione del tumore. Abbiamo trovato che indotta da inedia morente le cellule di germe subiscono anastasis in ri-nutriti Drosophila19.  In caso di anastasis in cellule di germe con danno del DNA, potrebbe essere conto per l'osservazione che il prolungato stress ambientale promuove lo sviluppo di malattie genetiche. Ad esempio, carestie e contribuire allo sviluppo di transgenerazionale ereditabili malattie come il diabete e malattie cardiache coronariche45. Di conseguenza, anastasis comprensione potrebbe portare a strategie per la prevenzione di malattie ereditarie causate da questo meccanismo potenziale di sviluppo.
Per sfruttare la scoperta dell'anastasis e dirigerla per sviluppare terapie innovative, è essenziale per studiare la causa e conseguenza di anastasis in animali vivi. Tuttavia, è tecnicamente difficile da identificare e tracciare anastatica cellule in vivo, perché le cellule che ha recuperato dal processo di morte cellulare appaiono morfologicamente indistinguibili dalle cellule sane normali, e non c'è nessun biomarcatore dell'anastasis identificato ancora17,18,21. Per risolvere questi problemi, abbiamo recentemente sviluppato un nuova in vivo caspase biosensore indicato "CaspaseTracker"19, per identificare e tenere traccia di cellule che sopravvivono apoptosi dopo19,l'attivazione di caspase46, il segno distintivo di apoptosi10,14. Distinguendola dai biosensori di caspasi "tempo reale" come SCAT12,47, Apoliner48, CA-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51 e iCasper52 che rileva l'attività della caspasi in corso, il biosensore CaspaseTracker inoltre offre la possibilità per marcare permanentemente le cellule che attività di caspase espressa anche transitoriamente. Pertanto, il biosensore CaspaseTracker consente la registrazione a lungo termine dell'anastasis dopo inversione di caspase-mediata delle cellule morte processo in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1024">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">CONSUMABLES AND REAGENTS</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Vectashield mounting medium</td>
			<td style="width:229px;">Vector Products</td>
			<td style="width:225px;">H-1000</td>
			<td>Antifade mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield mounting medium (with DAPI)</td>
			<td style="width:229px;">Vector Products</td>
			<td style="width:225px;">H-1200</td>
			<td>Antifade mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td style="width:229px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:225px;">#505 (110mm, #5)</td>
			<td>Dumont tweezer biology grade, stainless steel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanging Drop Slides</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:225px;">12-565B</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">H1399</td>
			<td>DNA stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mitotracker Red CMXRos&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">M-7512</td>
			<td>Mitochondria stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody</td>
			<td style="width:229px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:225px;">#9661</td>
			<td>Stain for active fragment of caspase-3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Bovine Serum Albumin (BAS)</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:225px;">A8806</td>
			<td>Blocking agent for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:225px;">114-056-101</td>
			<td>Medium for washing and immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton&#8482; X-100</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:225px;">T8787</td>
			<td>Detergent for cell permeabilization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Name</td>
			<td style="width:229px;">Company</td>
			<td style="width:225px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSM780 confocal microscope</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Drosophila dissection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W</td>
			<td style="width:229px;">AmScope</td>
			<td style="width:225px;">WBM99316&#160;</td>
			<td>Light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting anastasis in vivo by caspasetracker biosensor

Anastasis (dal greco "risurrezione alla vita") è un fenomeno di recupero cellulare recentemente scoperto per cui morire cellule può invertire i processi di morte delle cellule della fase tardiva che sono presupposti generalmente per essere intrinsecamente irreversibili. Promozione anastasis potrebbe in principio salvataggio o preservare ferito le cellule che sono difficili da sostituire come cardiomiociti o neuroni, facilitando così il recupero dei tessuti. Al contrario, sopprimendo anastasis in cellule tumorali, che subiscono gli apoptosi dopo terapie anti-cancro, può garantire la morte della cellula tumorale e ridurre le probabilità di recidiva. Tuttavia, questi studi sono stati ostacolati dalla mancanza di strumenti per il monitoraggio il destino delle cellule che subiscono anastasis in animali vivi. La sfida consiste nell'identificare le cellule che hanno invertito il processo di morte cellulare nonostante il loro aspetto morfologicamente normale dopo il recupero. Per superare questa difficoltà, abbiamo sviluppato in Drosophila e sistemi di biosensore CaspaseTracker mammiferi che possono identificare e tracciare definitivamente anastatica cellule in vitro o in vivo. Qui, presentiamo in vivo protocolli per la generazione e l'utilizzo del sistema dual biosensore CaspaseTracker per rilevare e tenere traccia di anastasis in Drosophila melanogaster dopo esposizione transitoria agli stimoli di morte delle cellule. Mentre convenzionale biosensori e protocolli possono marcare le cellule attivamente che subisce la morte apoptotica delle cellule, il biosensore CaspaseTracker permanentemente può marcare le cellule che hanno recuperato dopo l'attivazione di caspase - un marchio di garanzia dell'apoptosi in fase avanzata, e contemporaneamente identificare processi apoptotici attivo. Questo biosensore può anche monitorare il recupero delle cellule che hanno tentato di altre forme di morte delle cellule che direttamente o indirettamente interessate attività di caspase. Di conseguenza, questo protocollo permette di monitorare continuamente il destino di queste cellule e la loro progenie, facilitando gli studi futuri delle funzioni biologiche, meccanismi molecolari, le conseguenze fisiologiche e patologiche e implicazioni terapeutiche di Anastasis. Inoltre discutiamo i controlli appropriati per distinguere le cellule che subiscono anastasis da quelle che visualizzano non apoptotiche caspase attività in vivo.

Mentre la microscopia time-lapse cellula viva è un metodo affidabile per tratto anastasis in cellule coltivate20, è difficile da identificare le celle che sono stati sottoposti a anastasis in animali, perché le cellule recuperate appaiono morfologicamente indistinguibili da cellule sane normali che non hanno tentato la morte delle cellule. Ad esempio, le cellule umane del cancro cervicale HeLa visualizzare caratteristiche morfologiche di apoptosi1,<sup class="...

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Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis è tecnicamente difficile da rilevare in vivo perché le cellule che hanno invertito il processo di morte cellulare possono essere morfologicamente indistinguibili dalle cellule sane normali. Qui descriviamo i protocolli per il rilevamento e il monitoraggio delle cellule che subiscono anastasis animali vivi utilizzando il nostro sistema di biosensore del CaspaseTracker recente sviluppato in vivo .

Rilevazione di Anastasis In Vivo di biosensore CaspaseTracker

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

9.2K Views.  Johns Hopkins University School of Medicine. Anastasis è tecnicamente difficile da rilevare in vivo perché le cellule che hanno invertito il processo di morte cellulare possono essere morfologicamente indistinguibili dalle cellule sane normali. Qui descriviamo i protocolli per il rilevamento e il monitoraggio delle cellule che subiscono anastasis animali vivi utilizzando il nostro sistema di biosensore del CaspaseTracker recente sviluppato in vivo .

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In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
contractions. The pelvic limb of an anesthetized dog is immobilized in a stereotactic frame to align the tibia at a right angle to the femur. Adhesive wrap affixes the 
paw to a pedal mounted on the shaft of a servomotor to measure torque. Percutaneous nerve stimulation activates pelvic limb muscles of the paw to either push (extend) or 
pull (flex) against the pedal to generate isometric torque. Percutaneous tibial nerve stimulation activates tibiotarsal extensor muscles. Repeated eccentric (lengthening) 
contractions are induced in the tibiotarsal flexor muscles by percutaneous peroneal nerve stimulation. The eccentric protocol consists of an initial isometric contraction 
followed by a forced stretch imposed by the servomotor. The rotation effectively lengthens the muscle while it contracts, e.g., an eccentric contraction. During 
stimulation flexor muscles are subjected to an 800 msec isometric and 200 msec eccentric contraction. This procedure is repeated every 5 sec. To avoid fatigue, 4 min rest 
follows every 10 contractions with a total of 30 contractions performed.

In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and painless method to measure canine hindlimb muscle strength and muscle response to repeated eccentric contractions.

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In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury

Following injury to the CNS, astrocytes undergo a broad range of biochemical, morphological, and molecular changes collectively referred to as reactive astrogliosis. Reactive astrocytes exert both inflammatory and protective effects that inhibit and promote, respectively, neural repair. The mechanisms underlying the diverse functional properties of reactive astrogliosis are not well understood. Achieving a greater understanding of these mechanisms is critical to developing therapeutic strategies to treat the injured CNS. Here we demonstrate a method to trigger reactive astrogliosis in the adult mouse forebrain using a forebrain stab lesion. This lesion model is simple, reliable, and requires only a stereotaxic device and a scalpel blade to produce the injury. The use of stab lesions as an injury model in the forebrain is well established and amenable to studies addressing a broad range of neuropathological outcomes, such as neuronal degeneration, neuroinflammation, and disruptions in the blood brain barrier (BBB). Thus, the forebrain stab injury model serves as a powerful tool that can be applied for a broad range of studies on the CNS response to trauma.

Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury

This article describes a detailed protocol to produce a forebrain stab injury in adult mice. The stab injury induces severe reactive gliosis and glial scar formation which can be subsequently examined by standard immunohistochemistry methods.

Attivazione reattiva Gliosi<em&gt; In Vivo</em&gt; Da un Forebrain Stab Injury

Following injury to the CNS, astrocytes undergo a broad range of biochemical, morphological, and molecular changes collectively referred to as reactive ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

Generazione di Microtumors Uso 3D Biogel Umano Sistema Cultura e cellule di glioblastoma paziente-derivato per Kinomic Profiling and Drug Testing risposta

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

L&#39;esaurimento delle cellule di topo da xenotrapianti tumorali umani migliora in modo significativo Analisi A valle delle cellule bersaglio

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Regenerative Therapy by Suprachoroidal Cell Autograft in Dry Age-related Macular Degeneration: Preliminary In Vivo Report

This study is aimed at examining whether a suprachoroidal graft of autologous cells can improve best corrected visual acuity (BCVA) and responses to microperimetry (MY) in eyes affected by dry Age-related Macular Degeneration (AMD) over time through the production and secretion of growth factors (GFs) on surrounding tissue. Patients were randomly assigned to each study group. All patients were diagnosed with dry AMD and with BCVA equal to or greater than 1 logarithm of the minimum angle of resolution (logMAR). A suprachoroidal autologous graft by Limoli Retinal Restoration Technique (LRRT) was carried out on group A, which included 11 eyes from 11 patients. The technique was performed by implanting adipocytes, adipose-derived stem cells obtained from the stromal vascular fraction, and platelets from platelet-rich plasma in the suprachoroidal space. Conversely, group B, including 14 eyes of 14 patients, was used as a control group. For each patient, diagnosis was verified by confocal scanning laser ophthalmoscope and spectral domain-optical coherence tomography (SD-OCT). In group A, BCVA improved by 0.581 to 0.504 at 90 days and to 0.376 logMAR at 180 days (+32.20%) postoperatively. Furthermore, MY test increased by 11.44 dB to 12.59 dB at 180 days. The different cell types grafted behind the choroid were able to ensure constant GF secretion in the choroidal flow. Consequently, the results indicate that visual acuity (VA) in the grafted group can increase more than in the control group after six months.

Regenerative Therapy by Suprachoroidal Cell Autograft in Dry Age-related Macular Degeneration: Preliminary In Vivo Report

The goal of this study is to assess whether the suprachoroidal graft of adipose-derived stem cells included in the stromal vascular fraction and platelets derived from platelet-rich plasma by the Limoli Retinal Restoration Technique can improve visual acuity and retinal sensitivity responses in eyes affected by dry age-related macular degeneration.

La terapia rigenerativa da Suprachoroidal cella autoinnesto nella degenerazione maculare senile secca: Report preliminare In Vivo

This study is aimed at examining whether a suprachoroidal graft of autologous cells can improve best corrected visual acuity (BCVA) and responses to ...

Preparation of Naringenin Solution for In Vivo Application

The preparation of a compound (phytochemical) solution is an overlooked but critical step prior to its application in studies such as drug screening. The complete solubilization of the compound is necessary for its safe use and relatively stable results. Here, a protocol for preparing naringenin solution and its intraperitoneal administration in a high-fat diet and streptozotocin (STZ)-induced diabetic model is demonstrated as an example. A small amount of naringenin (3.52-6.69 mg) was used to test its solubilization in solvents, including ethanol, dimethylsulfoxide (DMSO), and DMSO plus Tween 80 reconstituted in physiological saline (PS), respectively. Complete solubilization of the compound is determined by observing the color of the solution, the presence of precipitates after centrifugation (2000 x g for 30 s), or allowing the solution to stand for 2 h at room temperature (RT). After obtaining a stable compound/phytochemical solution, the final concentration/amount of the compound required for in vivo studies can be prepared in a solvent-only (no PS) stock solution, and then diluted/mixed with PS as desired. The antidiabetic osteoporotic effects of naringenin in mice (intraperitoneal administration at 20 mg/kg b.w., 2 mg/mL) were assessed by measuring blood glucose, bone mass (micro-CT), and bone resorption rate (TRAP staining and ELISA). Researchers looking for detailed organic/phytochemical solution preparations will benefit from this technique.

Preparation of Naringenin Solution for In Vivo Application

Here, the protocol presents the preparation of naringenin solution for in vivo intraperitoneal administration. Naringenin is fully dissolved in a mixture of dimethylsulfoxide, Tween 80, and saline. The antidiabetic osteoporotic effects of naringenin were assessed by blood glucose testing, tartrate-resistant acid phosphatase staining, and enzyme-linked immunosorbent assay.

Preparazione della soluzione di Naringenin per l'applicazione in vivo

The preparation of a compound (phytochemical) solution is an overlooked but critical step prior to its application in studies such as drug screening. The ...