Name: detecting anastasis in vivo by caspasetracker biosensor
Uploaded: 2018-02-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 20 min 16 s
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우리는 초파리 이미지 그림 3C와 비디오 원고;에 감사 대런 Obbard J. 마리 하드 윅, 웨이드 깁슨, 그리고 가치에 대 한 내용은이 원고 헤더 M. 양고기. 이 작품으로는 선생님 에드워드 Youde 기념 친교 (H.L.T.), 박사 월터 Szeto 기념 장학금 (H.L.T.) 지원 되었다 풀브라이트 생명 과학 연구 재단 친교 (H.L.T.), 및 NCI K22 부여 CA204458 (H.L.T.) 007-2009 (H.L.T.), 부여 합니다. 호 람 탕 Shurl 및 생명 과학 연구 재단 (2014-2017)의 케이 Curci 재단 연구원 이었다.

CaspaseTracker 바이오 센서의 1) 준비
<ol><li>CO2, 파리 anesthetize를 사용 하는 붓 비행 음식과 신선한 효 모 반죽과 같은 유리병에 7 ~ 10 caspase 민감한 Gal4 (DQVD)19 처녀 암컷과 7 10 G-추적53 Gal4 기자 젊은 남성 파리 (또는 반대로) 전송. 참고: 크로스 (DQVD)에 민감한 Caspase Gal4 및 G-추적 파리의 CaspaseTracker 자손 파리를 생산할 예정 이다. Caspase-에민감한 (DQVA)19 Gal4 크로스 고 G-추적 파리 부정적인 제어 파리 (내용 참조)을 제공 합니다. 신선한 효 모 반죽 그래서 그 자손의 수를 증가 계란 생산을 향상 시키기 위해 단백질 소스 역할을 합니다. 처녀 여성 및 젊은 남성 파리 그들의 고기54에 따라 선택 합니다.</li>
	<li>3 ~ 7 일, 십자가 동안 섭씨 18도 (oC)에서 파리를 품 어 그리고 파리 18 ° c.에 새로운 십자가를 설정 하는 새로운 유리병에 전송 계속 때까지 자손 파리 eclose 18 ° C에서 원래 유리병을 품 어. 참고: 원래 유리병에 자손의과 밀을 피하기 위해 새로운 튜브에 부모 파리를 전송. 부모 파리 신선한 음식과 처음 2-3 스위치에 효 모 반죽으로 자손을 생산할 수 있는 그리고 생산성 크게 줄어 시간. 파리를 높이 18 ° C CaspaseTracker 바이오 센서의 일반적인 신호를 줄일 수 있습니다 (내용 참조).</li>
	<li>선택 자손 다음 실험에 대 한 올바른 고기54 파리. 참고: 여기 caspase 민감한 Gal4 및 G-추적 transgenes CyO 분산 균형 두 번째 염색체에 있습니다. Caspase Gal4 민감하고 G-추적의 두 transgenes는 (CyO) 없이 비 곱슬 날개 자손을 선택 합니다.</li>
</ol>CaspaseTracker 바이오 센서 파리에 과도 세포 죽음 유도의 응용 프로그램 2)
<ol><li>10 ~ 20 새로 eclosed 여성 oogenesis 여 계란 약 실 생산을 허용 하도록 18 ° C에서 1 일 신선한 비행 음식과 신선한 효 모 반죽과 새로운 유리병에 파리를 전송 합니다. 참고: 남성 파리 여성을 유지 계란 약 실 생산 향상 시킬 수 있습니다.</li>
	<li>차가운 충격, 전송에 의해 apoptosis를 받 다 계란 챔버를 유도 하기 위해 여성 1 h-7 ° C에 배치 됩니다 새 빈 유리병 날아갑니다. 참고: 차가운 충격 유도 플라즈마 막 파열55,56세포 손상.</li>
	<li>유도 단백질 기아에 의해 apoptosis를 받 다 계란 챔버, 전송 여성 파리 18 ° C에서 8% 자당 및 1% 한 천은 식품과 새로운 유리병에 3 일. 참고: 단백질 기아 (비 단백질 음식) 계란 챔버 apoptosis57,,5859 와 autophagy60,61을 트리거할 수 있습니다. 스위치 이동 8% 자당 및 1% 한 천은 식품 새로운 유리병에 매일 비행 음식을 자당의 최적의 상태를 유지 합니다.</li>
	<li>스트레스 파리를 복구할 수 있도록 18 ° C에서 3 일 동안 신선한 비행 음식과 신선한 효 모 반죽과 새로운 유리병 다시 전송. 굶 어과 설명된62으로 난소에서 계란 챔버를 굶 어-복구 파리를 해 부. 참고: 난소를 초파리 해 부, anesthetize CO2, 파리 하 고 2 쌍이 집게를 사용 하 여 비행 머리를 제거 하는 집게는 파리의 난소를 제거 하는 복 부의 기지를 사용 하 여.</li>
</ol>3) 고정 및 이미징에 대 한 해 부 계란 챔버의 얼룩
<ol><li>1 mL 원심 분리기 튜브를 0.5 mL 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 주위와 함께 해 부 계란 챔버를 전송 합니다. 진정 알 수 있습니다. 참고: 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 물 또는 끝의 플라스틱 표면에 붙어 계란 챔버를 방지 하기 위해 PBS에 용 해 된 플라스틱 피 펫 팁 코트. 빨간 형광 성 단백질 (RFP, 일컬어 DsRed)의 photobleaching을 피하기 위해 어둠 속에서 다음 절차를 수행 및 계란 약 실에서 녹색 형광 단백질 (GFP).</li>
	<li>Pipetting, PBS를 제거 한 다음 0.5 mL 4 %paraformaldehyde 실내 온도 20 ~ 30 분 동안 어둠에 계란 챔버를 해결 하기 위해 PBS에 적용. 참고: 이에 다음 인큐베이션 단계 부드러운 회전을 적용 합니다.</li>
	<li>Pipetting, 여는 paraformaldehyde를 제거 하 고 다음 씻어 0.5 mL PBST와 계란 챔버 (PBS + 0.1% 트라이 톤 X-100) 3 번. 참고: 장시간된 고정 RFP 및 GFP 신호를 줄일 수 있습니다.</li>
	<li>실 온에서 1 ~ 2 h에 대 한 PBST와 계란 챔버를 품 어 또는 달걀 챔버를 permeabilize 부드러운 회전으로 4 ° C에서 하룻밤. 참고: PBST 비 BSA 코팅된 플라스틱 표면에 붙어 계란 챔버를 방지할 수도 있습니다.</li>
	<li>Pipetting, 여는 PBST를 제거 하 고 0.5 mL PBST에 블루 핵 Hoechst 염료의 10 μ g/mL의 핵에 대 한 얼룩을 실 온에서 1 ~ 2 h에 대 한 계란 챔버에 적용. NOTE1: 이것은 일반적인 신호 증가 핵 염료와 장기간된 부 화를 하지 마십시오. NOTE2: 핵 없이 Hoechst 얼룩을 대체 접근 200를 추가 하는 μ 안티 표백 장착 에이전트 DAPI (자료 참조)와 하룻밤63, 프로토콜 3.8에 설명 된 대로 조직 유리 커버 슬립에 장착 하기 전에 품 어. NOTE3: photobleaching을 피하기 위해 어둠에는 얼룩 및 다음 절차를 수행.</li>
	<li>Pipetting, 여 핵 염료를 제거 하 고 0.5 mL PBST 3 번, 10 ~ 20 분 부 화 각 세척 단계 사이 부드러운 회전으로 1 mL 원심 분리기 튜브에 계란 약 실을 씻어을 적용 합니다.</li>
	<li>미세 피 펫과 모든 PBST를 제거 하 고 다음 적용 200 μ 안티 표백 장착 에이전트 (참조 자료) 계란 챔버 튜브의 바닥에 침 몰 될 때까지 또는 하룻밤 4 ° C에서 3 시간 실내 온도에 계란 챔버를 품 어를. 참고: 장착 에이전트 흡수 완전히 조직 관의 바닥에 싱크.</li>
	<li>안티 표백 하는 200 μ와 그들을 전송 하 여 스테인드 계란 챔버 탑재 20 x 20 m m 미리 청소 유리 커버 슬립와 계란 실 커버 하 고 인감 넣어 유리 슬라이드에 커버 슬립, pipetting으로 이미징 미리 청소 유리 슬라이드에 에이전트를 설치 커버 슬립의 가장자리에 매니큐어. NOTE1: 전 유리 슬라이드와 커버 슬립 물 또는 70% 에탄올으로 청소. NOTE2: 바 셀 린 유리 슬라이드와 커버 슬립 overcompression에 의해 계란 챔버를 파괴 하지 않으려면 사이 적용 합니다.</li>
	<li>형광 또는 confocal 현미경, 20 배, 나 0.8 사용 하 여 사용 하 여 계란 약 실 이미지 핵 얼룩에 대 한 흥분 빛 파장 405 nm와 계획 Apochromat 목표 (감지 방출 ~ 461 nm), 561 RFP (지속적인 또는 최근 caspase 활동) 신호 (nm 검색 방출 ~ 590 nm), 및 488 nm (caspase 활동) 과거 GFP 신호 (방출 감지 ~ 518nm). 참고: 현미경20,64에 대 한 우리의 게시 프로토콜을 참조 하십시오.</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

CaspaseTracker 듀얼 바이오 센서 시스템은 소설과 최근의 탐지를 허용 하는 독특한 도구 또는 지속적인 caspase 활동, 세포 죽음을 반대 해야 하는 셀을 추적 하 고 프로세스 caspase 활동에서 vivo에서발생 후 생존. Caspase 활동 apoptosis의 특징으로 전통적으로 생각 되었습니다, 하는 동안 성장 연구 공개 비 apoptotic caspase 활동 신경 활동79, 의 규칙 등?...

프로그램 된 세포 죽음, apoptosis 등, 다세포 생물1,2,3, 부상, 원치 않는 또는 위험한 셀을 제거 하 여 배아 개발 및 정상적인 항상성에서 중요 한 역할. 생존 세포의 죽음 사이의 균형의 손실 암, 심장 마비, 면역, 등 변성4,5,6,,78치명적인 결과가 발생할 수 있습니다. Caspases는 전통적으로 "돌아올 수 없는 지점" apoptosis9,,1011, 그것으로 간주 되어 사형 집행의 활성화 트리거 신속 하 고 대규모 세포 파괴12, 13,14,,1516. 우리는 교양된 죽어가는 기본 세포와 암 세포는 원형질 막 blebbing, 셀 수축를 포함 하 여 죽음 특징 caspase 활성화, 하지만 또한 다음과 같은 중요 한 세포 뿐만 아니라 복구할 수 있습니다 입증이 일반적인 정설에 도전, 미토 콘 드 리아 조각화, cytosol, 핵 chromatin 응축이, DNA 손상, 핵 분열에 미토 콘 드리 아 시 토 크롬 c 의 릴리스 세포 phosphatidylserine (PS)의 표면 노출 및 apoptotic 시체의 형성 17 , 18 , 19 , 20 , 21. 우리 제안 그 anastasis은 기본 셀 복구 현상으로 죽어가는 세포 세포 죽음 자극17,,1819,20, 의 제거 후 복구할 수 있습니다 21. 우리가 만들어낸 용어 "Anastasis" (Αναστάσης)18, 의미 "상승 생활" 그리스어,에이 예기치 않은 셀 복구 현상 설명. Anastasis의 우리의 관찰은 추가 phosphatidylserine 외부화22,23,24, 미토 콘 드 리아 제한 후 세포의 복구를 또한 공개 최근 독립적인 학문에 의해 지원 되는 외부 멤브레인 permeabilization25, 혼합된 계보 니 같은의 활성화 (MLKL), 그리고 세포 수축26.
Anastasis 규제 메커니즘을 특성화 하는 것은 패러다임 변화 생리, 병리학, 그리고 치료 의미 있을 것 이다. Anastasis 구출 또는 왼쪽 심 실 심 실 역 중요 한 postmitotic 세포와 대체, 하기 어려운 조직 및 가능 하 게 심장 마비 반전에 대 한 계정 보존 이전에 알려지지 않은 cytoprotective 메커니즘을 나타내는 수 있습니다. 뇌 부상32후 장치 (LVADs)27,28, 과도 한 빛29,,3031, 과도 노출 또는 뉴런의 수리 후 포토 리셉터 세포의 복구를 지원 합니다. Anastasis 홍보 세포 및 조직 복구를 향상 시킬 수 있도록 하는 경우. 반대로, anastasis 생존 세포 죽음을 유도 하는 치료, 암 재발17,18을 일으키는 암 세포에 의해 사용 되는 예기치 않은 탈출 전술 수 있습니다. 따라서, 억제 anastasis 동안 암 세포 죽어 그리고 암 치료 그들의 재발을 방지 하 여 암을 치료 하는 새로운 치료 전략 수 있습니다.
Anastasis의 과정에서 우리는 일부 복구 된 셀 영구 유전 변경 취득 종양 전이 겪었다, apoptosis18,20,21 동안 DNA 손상으로 인해 발생 한 발견 . DNA 손상 된 세포의 죽음 과정 반전 수 tumorigenesis의 메커니즘, 식도에 만성 열 상해 유도 같은 조직, 다양 한 암 위험 증가 잠재적으로 조직 상해를 반복 관찰을 기본 차적인 암 치료38, 후 매우 뜨거운 음료33,,3435, 알코올 중독36,37인 한 간 손상, 종양 진화의 소비에 의해 3940,,및 새로운 암 항 암 치료41,42,,4344 의 주기 사이 간격 동안 발생 하는 정상 조직에서의 개발 . True 이면 방지 수 anastasis 타겟팅 또는 암 개발 및 진행을 체포. 우리는 죽어가는 세균 세포 기아 유도 다시 먹이 초파리19anastasis 수술을 발견 했다.  Anastasis 생식 세포 DNA 손상에서 발생 하면, 그것은 유전 질병의 개발을 촉진 하는 환경 스트레스를 장기간 관찰에 대 한 계정 수 있습니다. 예를 들어 기근 transgenerational 상속 질병 당뇨병, 관상 심장 질환45등의 개발에 기여 한다. 따라서, 이해 anastasis 전략 개발이 잠재적인 메커니즘으로 인 한 상속 질병의 예방에 대 한 발생할 수 있습니다.
Anastasis의 발견을 활용 하 고 혁신적인 치료법 개발을 직접, 원인 anastasis 살아있는 동물에서의 결과 공부 하 고 필수적 이다. 그러나, 그것은 기술적으로 확인 하 고 anastatic 셀에 추적 vivo에서, 세포 죽음 과정에서 발견 된 셀 표시 정상적인 건강 한 세포 형태학 상으로 구별할 고 아무 biomarker anastasis의 도전 확인 아직17,,1821. 이러한 문제를 해결 하려면 우리는 새로운 비보에 caspase 바이오 센서를 식별 하 여46, caspase의 활성화19,후 apoptosis를 생존 하는 셀 추적 "CaspaseTracker"19, 지정을 최근 개발 된 apoptosis10,14각 인이 고 "실시간" caspase 바이오 센서 등 배설물12,47, Apoliner48, 캘리포니아-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51 iCasper52에서 구별 는 온가 caspase 활동 감지, CaspaseTracker 바이오 센서 또한 기능을 영구적으로 셀 익스프레스 caspase 활동 정도 능력. 따라서, CaspaseTracker 바이오 센서는 caspase 중재의 세포 죽음 과정 비보후 anastasis의 장기 추적을 하면 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;CONSUMABLES AND REAGENTS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mounting medium</td><td>Vector Products</td><td>H-1000</td><td>Antifade mounting medium</td></tr><tr><td>Vectashield mounting medium (with DAPI)</td><td>Vector Products</td><td>H-1200</td><td>Antifade mounting medium with DAPI</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Ted Pella</td><td>#505 (110mm, #5)</td><td>Dumont tweezer biology grade, stainless steel</td></tr><tr><td>Hanging Drop Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565B</td><td>Glass slides</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Molecular Probes</td><td>H1399</td><td>DNA stain</td></tr><tr><td>Mitotracker Red CMXRos&amp;nbsp;</td><td>Molecular Probes</td><td>M-7512</td><td>Mitochondria stain</td></tr><tr><td>Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#9661</td><td>Stain for active fragment of caspase-3</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BAS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806</td><td>Blocking agent for immunostaining</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>114-056-101</td><td>Medium for washing and immunostaining</td></tr><tr><td>Triton&amp;trade; X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Detergent for cell permeabilization</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM780 confocal microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Drosophila dissection</td></tr><tr><td>AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W</td><td>AmScope</td><td>WBM99316&amp;nbsp;</td><td>Light source</td></tr></tbody></table>

detecting anastasis in vivo by caspasetracker biosensor

Anastasis (그리스어 "생활에 상승")은 그것에 의하여 일반적으로 본질적으로 가역 적인 것으로 간주 하는 단계의 세포 죽음 프로세스에 뒤집을 수 있는 세포 죽어 최근에 발견 된 세포 복구 현상. Anastasis 홍보 수 원리 구조 또는 보존 부상을 cardiomyocytes 등 신경, 조직 복구를 촉진 함으로써 대체 하기 어려운 세포. 반대로, 억제 anastasis 암 세포에 항 암 치료 후 apoptosis를 겪고 수 있습니다 암 세포 죽음 고 재발의 가능성을 줄일 수 있습니다. 그러나, 이러한 연구 anastasis 살아있는 동물에서 받아야 하는 셀의 운명을 추적 하기 위한 도구의 부족에 의해 방해 되어 있다. 복구 후 그들의 형태학 상으로 정상적인 외관에도 불구 하 고 세포 죽음 프로세스를 반전 하는 셀을 식별 하는 도전이입니다. 이 어려움을 극복 하기 위해 우리 초파리 및 식별 하 고 영구적으로 anastatic 세포 생체 외에서 또는 vivo에서추적할 수 있는 포유류 CaspaseTracker 바이오 센서 시스템을 개발 했습니다. 여기, 우리는 생성 및 감지 하 고 세포 죽음 자극에 과도 노출 후에 초파리 melanogaster anastasis 추적 CaspaseTracker 듀얼 바이오 센서 시스템의 사용에 대 한 vivo에서 프로토콜을 제시. 기존의 바이오 센서 프로토콜 수 레이블 셀 적극적으로 겪고 apoptotic 세포 죽음, 그러나 CaspaseTracker 바이오 센서 caspase 활성화-단계의 apoptosis의 각 인 후 회복 된 셀 라벨 영구적으로 수 고 동시에 활성 apoptotic 프로세스를 식별 합니다. 이 바이오 센서는 직접 또는 간접적으로 관련 된 caspase 활동 세포 죽음의 다른 형태를 시도 하는 셀의 복구를 추적할 수도 있습니다. 따라서,이 프로토콜을 수 있습니다 이러한 세포와 생물 학적 기능, 분자 메커니즘, 생리 및 병리학 결과 및 치료 의미의 미래 연구를 촉진 하는 그들의 자손의 운명을 지속적으로 추적 anastasis입니다. 우리는 또한 그 비 apoptotic caspase 활동 비보를 표시 하는 anastasis 받아야 하는 셀을 구별 하는 적절 한 컨트롤을 논의.

시간 경과 라이브 셀 현미경은 배양된 세포20로 anastasis 신뢰할 수 있는 방법, 그것은 복구 된 셀 표시 형태학 상으로 구별할 수 있기 때문에 셀 동물, anastasis 받은 식별 하는 도전 정상적인 건강 한 세포에서 세포 죽음 시도 하지는. 예를 들어 인간의 자궁암 HeLa 세포 세포 죽음에 대 한 응답에서 apoptosis1,,214, 세...

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Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis는 vivo에서 감지 하는 세포 죽음 프로세스를 반대로 세포 형태학 상으로 정상적인 건강 한 세포와 구별할 수 있기 때문에 기술적으로 도전적 이다. 여기 우리는 감지 하 고 우리의 새로 개발 된 vivo에서 CaspaseTracker 바이오 센서 시스템을 사용 하 여 라이브 동물에서 anastasis 받아야 하는 셀 추적에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

Anastasis에서 Vivo에서 CaspaseTracker 바이오 센서에 의해 감지

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

9.2K 조회수.  Johns Hopkins University School of Medicine. Anastasis는 vivo에서 감지 하는 세포 죽음 프로세스를 반대로 세포 형태학 상으로 정상적인 건강 한 세포와 구별할 수 있기 때문에 기술적으로 도전적 이다. 여기 우리는 감지 하 고 우리의 새로 개발 된 vivo에서 CaspaseTracker 바이오 센서 시스템을 사용 하 여 라이브 동물에서 anastasis 받아야 하는 셀 추적에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

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Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first to be activated in these pathways. This group includes caspase-2, -8, and -9, as well as the inflammatory caspases, caspase-1, -4, and -5. The initiator caspases are all activated by dimerization following recruitment to specific multiprotein complexes called activation platforms. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is an imaging-based approach where split fluorescent proteins fused to initiator caspases are used to visualize the recruitment of initiator caspases to their activation platforms and the resulting induced proximity. This fluorescence provides a readout of one of the earliest steps required for initiator caspase activation. Using a number of different microscopy-based approaches, this technique can provide quantitative data on the efficiency of caspase activation on a population level as well as the kinetics of caspase activation and the size and number of caspase activating complexes on a per cell basis.

This protocol describes caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC); an imaging-based method that can be used to visualize induced proximity of initiator caspases, which is the first step in their activation.

Caspase 활성화 분자 형광 보완성을 사용 하 여 경로를 조명

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

연구

생화학

cADDis를 사용한 cAMP 분석: 단일 세포에서 고처리량 스크리닝

Real-Time cAMP Dynamics in Live Cells Using the Fluorescent cAMP Difference Detector In Situ

cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) is a novel biosensor that allows for the continuous measurement of cAMP levels in living cells. The biosensor is created from a circularly permuted fluorescent protein linked to the hinge region of Epac2. This creates a single fluorophore biosensor that displays either increased or decreased fluorescence upon binding of cAMP. The biosensor exists in red and green upward versions, as well as green downward versions, and several red and green versions targeted to subcellular locations. To illustrate the effectiveness of the biosensor, the green downward version, which decreases in fluorescence upon cAMP binding, was used. Two protocols using this sensor are demonstrated: one utilizing a 96-well plate reading spectrophotometer&#160;compatible with high-throughput screening and another utilizing single-cell imaging on a fluorescent microscope. On the plate reader, HEK-293 cells cultured in 96-well plates were stimulated with 10 &#181;M forskolin or 10 nM isoproterenol, which induced rapid and large decreases in fluorescence in the green downward version. The biosensor was used to measure cAMP levels in individual human airway smooth muscle (HASM) cells monitored under a fluorescent microscope. The green downward biosensor displayed similar responses to populations of cells when stimulated with forskolin or isoproterenol. This single-cell assay allows visualization of the biosensor location at 20x and 40x magnification. Thus, this cAMP biosensor is sensitive and flexible, allowing real-time measurement of cAMP in both immortalized and primary cells, and with single cells or populations of cells. These attributes make cADDis a valuable tool for studying cAMP signaling dynamics in living cells.

저자 스포트라이트: Advancing Real-Time cAMP Detection in Cells Using cADDis Biosensor (cADDis 바이오센서를 사용한 세포의 실시간 cAMP 검출 발전)

The protocol presented in this study illustrates the effectiveness of the cAMP Difference Detector In Situ in measuring cAMP through two methods. One method utilizes a 96-well plate reading spectrophotometer with HEK-293 cells. The other method demonstrates individual HASM cells under a fluorescent microscope.

In Situ Fluorescent cAMP Difference Detector를 사용한 살아있는 세포의 실시간 cAMP 역학

cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) is a novel biosensor that allows for the continuous measurement of cAMP levels in living cells. The biosensor is ...

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and allostasis. Moreover, dysregulated protease activity drives pathogenesis and is a functional biomarker of diseases such as cancer; therefore, the ability to detect protease activity in vivo may provide clinically relevant information for biomedical diagnostics. The goal of this protocol is to create nanosensors that probe for protease activity in vivo by producing a quantifiable signal in urine. These protease nanosensors consist of two components: a nanoparticle and substrate. The nanoparticle functions to increase circulation half-life and substrate delivery to target disease sites. The substrate is a short peptide sequence (6-8 AA), which is designed to be specific to a target protease or group of proteases. The substrate is conjugated to the surface of the nanoparticle and is terminated by a reporter, such as a fluorescent marker, for detection. As dysregulated proteases cleave the peptide substrate, the reporter is filtered into urine for quantification as a biomarker of protease activity. Herein we describe construction of a nanosensor for matrix metalloproteinase 9 (MMP9), which is associated with tumor progression and metastasis, for detection of colorectal cancer in a mouse model.

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are tightly regulated enzymes involved in fundamental biological processes, and dysregulated protease activity drives progression of complex diseases such as cancer. This method&#39;s goal is to create nanosensors that measure protease activity in vivo by producing a cleavage signal that is detectable from host urine and discriminates disease.

Nanosensors 프로 테아 제 활동에 감지 비보에 비 침 투 적인 진단에 대 한

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...

생체공학

암 진단을 위한 CRISPR-Cas 합성 소변 바이오마커 검사

CRISPR-Cas-mediated Multianalyte Synthetic Urine Biomarker Test for Portable Diagnostics

Creating synthetic biomarkers for the development of precision diagnostics has enabled detection of disease through pathways beyond those used for traditional biofluid measurements. Synthetic biomarkers generally make use of reporters that provide readable signals in the biofluid to reflect the biochemical alterations in the local disease microenvironment during disease incidence and progression. The pharmacokinetic concentration of the reporters and biochemical amplification of the disease signal are paramount to achieving high sensitivity and specificity in a diagnostic test. Here, a cancer diagnostic platform is built using one format of synthetic biomarkers: activity-based nanosensors carrying chemically stabilized DNA reporters that can be liberated by aberrant proteolytic signatures in the tumor microenvironment. Synthetic DNA as a disease reporter affords multiplexing capability through its use as a barcode, allowing for the readout of multiple proteolytic signatures at once. DNA reporters released into the urine are detected using CRISPR nucleases via hybridization with CRISPR RNAs, which in turn produce a fluorescent or colorimetric signal upon enzyme activation. In this protocol, DNA-barcoded, activity-based nanosensors are constructed and their application is exemplified in a preclinical mouse model of metastatic colorectal cancer. This system is highly modifiable according to disease biology and generates multiple disease signals simultaneously, affording a comprehensive understanding of the disease characteristics through a minimally invasive process requiring only nanosensor administration, urine collection, and a paper test which enables point-of-care diagnostics.

저자 스포트라이트: Engineering Molecular Tools for Disease Detection and Imaging(질병 검출 및 이미징을 위한 분자 도구 엔지니어링)

This protocol describes a CRISPR-Cas-mediated, multianalyte synthetic urine biomarker test that enables point-of-care cancer diagnostics through the ex vivo analysis of tumor-associated protease activities.

휴대용 진단을 위한 CRISPR-Cas 매개 다중분석물 합성 소변 바이오마커 검사

Creating synthetic biomarkers for the development of precision diagnostics has enabled detection of disease through pathways beyond those used for ...

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct regulation of inflammatory signaling and is activated by proximity-induced dimerization following recruitment to inflammasomes. Caspase-1 is abundant in the monocytic cell lineage and induces maturation of the pro-inflammatory cytokines interleukin (IL)-1&#946; and IL-18 to active secreted molecules. The other inflammatory caspases, caspase-4 and -5 (and their murine homolog caspase-11) promote IL-1&#946; release by inducing pyroptosis. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is a tool used to measure inflammatory caspase induced proximity as a readout of caspase activation. The caspase-1, -4, or -5 prodomain, which contains the region that binds to the inflammasome, is fused to non-fluorescent fragments of the yellow fluorescent protein Venus (Venus-N [VN] or Venus-C [VC]) that associate to reform the fluorescent Venus complex when the caspases undergo induced proximity. This protocol describes how to introduce these reporters into primary human monocyte-derived macrophages (MDM) using nucleofection, treat the cells to induce inflammatory caspase activation, and measure caspase activation using fluorescence and confocal microscopy. The advantage of this approach is that it can be used to identify the components, requirements, and localization of the inflammatory caspase activation complex in living cells. However, careful controls need to be considered to avoid compromising cell viability and behavior. This technique is a powerful tool for the analysis of dynamic caspase interactions at the inflammasome level as well as for the interrogation of the inflammatory signaling cascades in living MDM and monocytes derived from human blood samples.

This protocol describes the workflow to obtain monocytes-derived macrophages (MDM) from human blood samples, a simple method to efficiently introduce inflammatory caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) reporters into human MDM without compromising cell viability and behavior, and an imaging-based approach to measure inflammatory caspase activation in living cells.

인간 단핵구 유래 대식세포에서 근접성을 유도한 염증성 카스파제의 시각화

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

면역학 및 감염병학

Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is the initiation of innate immune programmed cell death (PCD) to eliminate infected or damaged cells and propagate immune responses. However, excess PCD is associated with inflammation and pathology. Therefore, understanding the activation and regulation of PCD is a central aspect of characterizing innate immune responses and identifying new therapeutic targets across the disease spectrum.
This protocol provides methods for characterizing innate immune PCD activation by monitoring caspases, a family of cysteine-dependent proteases that are often associated with diverse PCD pathways, including&#160;apoptosis,&#160;pyroptosis, necroptosis, and PANoptosis. Initial reports characterized caspase-2, caspase-8, caspase-9, and caspase-10 as initiator caspases and caspase-3, caspase-6, and caspase-7 as effector caspases in apoptosis, while later studies found the inflammatory caspases, caspase-1, caspase-4, caspase-5, and caspase-11, drive pyroptosis. It is now known that there is extensive crosstalk between the caspases and other innate immune and&#160;cell death molecules across the previously defined PCD pathways, identifying a key knowledge gap in the mechanistic understanding of innate immunity and PCD and&#160;leading to the characterization of PANoptosis. PANoptosis is a unique innate immune inflammatory PCD pathway regulated by PANoptosome complexes, which integrate components, including caspases,&#160;from other cell death pathways.
Here, methods for assessing the activation of caspases in response to various stimuli are provided. These methods allow for the characterization of PCD pathways both in vitro and in vivo, as activated caspases undergo proteolytic cleavage that can be visualized by western blotting using optimal antibodies and blotting conditions. A protocol and western blotting workflow have been established that allow for the assessment of the activation of multiple caspases from the same cellular population, providing a comprehensive characterization of the PCD processes. This method can be applied across research areas in development, homeostasis, infection, inflammation, and cancer to evaluate PCD pathways throughout cellular processes in health and disease.

This protocol describes a comprehensive method for assessing caspase activation (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9, and caspase-11) in response to both in vitro and in vivo (in mice) models of infection, sterile insults, and cancer to determine the initiation of cell death pathways, such as pyroptosis, apoptosis, necroptosis, and PANoptosis.

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