This work was supported by Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education (2015R1A6A3A01020610 to HJP) and a grant from the Korean Health Technology R&amp;D Project, Ministry for Health, Welfare and Family Affairs, Republic of Korea (HI15C0493 to SJH).

Bu çalışmada, fareler Yonsei Üniversitesi Yonsei Laboratuar Hayvan Araştırma Merkezi belirli bir patojen içermeyen tesiste muhafaza edildi. Tüm hayvan deneyleri Yonsei Üniversitesi Yonsei Laboratuar Hayvan Araştırma Merkezi Uluslararası Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan protokolleri kullanarak Kore Gıda ve İlaç İdaresi kurallarına uygun olarak yapılmıştır. Çözümler 1. hazırlanması <ol><li> RPMI içinde% 1% 2 ve penisilin-streptomisin fetal sığır serumu (FBS) seyrelterek% 2 RPMI ortamı hazırlamak </li><li> tam RPMI ortamı hazırlayın. RPMI ortam FBS% 10, penisilin-streptomisin,% 1 L-glutamin,% 1 ve 50 uM 2-merkaptoetanol ekleyin. </li><li> flöresanla aktive edilen hücre tasnif (FACS) tamponu hazırlayın. FBS% 2 ile çok, ek fosfat tamponlu tuz (PBS) yapmak için. </li><li> T hücre izolasyonu tampon hazırlayın. Bunu yapmak için, FBS% 2 ve 2 mM ethylenediaminetetraa PBS ile ekasetik asit elde edildi. </li></ol> Splenik Lenfositler 2. izolasyonu <ol><li> Daha önce tarif edildiği gibi 19 saf ya da LCMV CL13 enfekte farelerden dalak çıkarın ve% 2 RPMI ortam, 10 ml ihtiva eden x 15 mm&#39;lik Petri kaplara 60 mm koyun. NOT: Bu çalışma deneylerde, 5, 6 haftalık için C57B1L / 6J dişi fareler kuyruk veninden intravenöz enjeksiyon yoluyla LCMV CL13 2 x 10 6 plak oluşturucu birim (pfu) aldı. Gün 16 sonrası enfeksiyon (16 d pi) 25 fareler Kurban. Analiz ge-uyumlu naif fareler aynı gün idi. </li><li> 50 ml&#39;lik bir tüp içine, bir hücre süzgeci yerleştirin ve% 2 RPMI ortam, 2 ml ile durulayın. 70 mikron hücre süzgecinden üzerinde dalak yerleştirin ve bir şırınga pistonu kullanarak eziyet. % 2 RPMI ortam 2 ml hücre süzgecinden yıkayın ve 50 ml&#39;lik bir tüp çıkarın. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de% 2 RPMI ortam ve santrifüj tüpü doldurmak. Süpernatantı atın ve tekrar süspansiyonACK yokedici tamponda 1 ml hücre topağı. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) inkübe edin. NOT: Yukarıda belirtilen ACK parçalama tampon hacmi bir dalak içindir. toplanmış dalak örnekleri için buna göre hacmi büyütmek. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de% 2 RPMI ortam ve santrifüj tüpü doldurmak. Süpernatant atılır ve tam RPMI ortamında 1 x 10 7 hücre / ml&#39;lik bir yoğunlukta hücreler tekrar süspansiyon. NOT: tripan mavi ve sadece hemasitometre kullanarak lekeli olmayan hücreleri canlı sayısı ile canlı hücre sayımı, leke hücreleri için. </li></ol> Dalak Konvansiyonel T (T dönüşüm) Hücreler ve T reg Hücreler 3. Fenotiplendirme Not: regülatör T hücre izolasyonu önce, çeşitli antikorlarla hücrelerin boyanması ve akış sitometrisi ile analiz ederek saf ya da enfekte olmuş farelerde izole edilmiş dalak lenfositleri fenotipinin inceleyin. <ol><li> hücreler 50 ul transferYeni bir U tabanlı, 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna, toplam dalak lenfositler arasındaki (5 x 10 5 hücre) ve oyuk başına FACS tampon 150 ul ekle. 4 ° C&#39;de 2 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> süpernatant atın. Hücre topağı karıştırın ve oyuk başına FACS tampon 200 ul ekle. 4 ° C&#39;de (2 kez), 2 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Aşağıdaki antikorlar ve reaktifler ile göz başına FACS tamponu 50 ul lekeleme hücre yüzey markörleri için antikor kokteyli hazırlanır. Anti-CD4, mor bir boya, anti-CD25 yeşil boya, anti-PD-1, mor bir boya, anti-CD8 PerCP Cy5.5 boyası ve hücre canlılığı saptama reaktif maddesi yakın kızılötesi (IR), floresan reaktif boya. Not: Aktifleştirilmiş regülatör T hücrelerinin fenotipi analiz etmek için, anti-CD103 23,25 hücre yüzey markör boyanması için ilave edilebilir. </li><li> oyuk başına antikor kokteylinin 50 ul hücre pelletini. 4 ° C&#39;de karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe edin. ile iki kez hücreleri yıkayın4 ° C&#39;de 2 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile FACS tamponu. </li><li> Son yıkama aşamasından sonra, süpernatant süzün ve üreticinin protokolüne uygun olarak hazırlanan sabitleme tampon 100 ul ile 4 ° C&#39;de karanlıkta 20 dakika boyunca hücrelerin tespit. </li><li> 4 ° C&#39;de 2 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile (üreticinin protokolüne uygun olarak hazırlandı) permeabilizasyon yıkama tamponu ile iki kez hücreleri yıkayın. </li><li> hücre içi Foxp3 boyama için antikor çözeltisi hazırlayın ve anti-Foxp3 antikor çözeltisi 50 ul hücre pelletini. Not: daha CTLA bu aşamada eklenebilir T Dönüşümün ve regülatör T hücreleri, fenotipleri analiz etmek. </li><li> 4 ° C&#39;de karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe edilir ve adım 3.6 tekrarlayın. Son yıkama aşamasından sonra, FACS tampon 200 ul hücre pelletini ve 25 akış sitometresi ile hücrelerin fenotipini inceleyin. </li><li> Kapısı canlı hücre nüfuslarıyon. CD4 + veya CD8 + T-hücreleri arasında PD-1 + hücrelerinin - LCMV CL13 enfeksiyonu sırasında T dönüşüm hücrelerin fenotipleri analiz etmek için, Foxp3 sıklığını inceleyin. NOT: Deneysel sonuçlara dayanarak, Foxp3 yüzdesi - PD-1 + LCMV CL13 ile 16 d pi CD4 + ve CD8 + T hem hücre popülasyonlarının% 50&#39;den fazla olduğunu. <ol><li> Regülatör T hücrelerinin frekansı ve fenotipleri analiz etmek için, CD4 + T-hücreleri arasında FoxP3 + ya Foxp3 + PD-1 + hücrelerinin frekansları inceleyin. Not: Deney sonuçlarına göre, Foxp3 + veya Foxp3 + PD-1 + hücrelerinin yüzdesi, sırasıyla, CD4 + T hücresi popülasyonunda fazla% 20&#39;dir. </li></ol></li></ol> CD4 + CD25 + regülatör T hücrelerinin 4. Yalıtım Not: Tüm reaktifler hacimleri aşağıdaki belirtilen bir içindir1 x 10 7 toplam splenositlerin hücre sayısını başlangıç. <ol><li> saf ve LCMV kronik olarak enfekte olan fareler kullanılarak bölüm 2&#39;de tarif edildiği gibi hücreler hazırlayın. T hücresi izolasyon tamponunda 10 ml ilave edilerek hücreler yıkanır. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin. Tamamen Süpernatantı atın ve tampon 40 ul hücre pelletini. </li><li> Manyetik Hücre Ayırma Sistemi kullanılarak, CD4 + T hücresi zenginleştirme için, biyotin-antikor kokteyli 10 ul ekleyin ve iyice karıştırın. 4 ° C&#39;de 10 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> Tampon 30 ul olmayan CD4 + T hücrelerinin etiketlenmesi için, anti-biyotin mikro boncuklar 20 ul ve CD25 + hücrelerinin floresan etiketlemesi için CD25-PE antikorun 10 ul ekle. İyice karıştırın ve karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> tampon maddesinin 2 ml ilave edilir ve hücre debrisini uzaklaştırmak için yeni bir 50 ml&#39;lik bir tüp içine, 40 mikron hücre süzgecinden hücreleri geçer. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile hücreler yıkanır.Tamamen Süpernatant atılır ve en fazla 1.25 x 10 8 hücre yoğunluğunda 500 ul tampon içinde hücre pelletini. </li><li> kolona hücreleri uygulayın ve sütunun geçmesine etiketsiz hücreleri toplamak. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de tampon ve santrifüj 2 ml ekleyerek sütun yıkayın. Tamamen Süpernatantı atın ve tampon 90 ul izole CD4 + T hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> CD25 + hücreleri manyetik işaretleme için, anti-PE mikro 10 ul ilave edilir, iyice karıştırın ve 4 ° C sıcaklıkta karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> tampon maddesinin 2 ml ilave edilir ve 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile hücreler yıkayın. Tamamen Süpernatant atılır ve en fazla 1 x 10 8 hücre yoğunluğunda tampon 500 ul hücre pelletini. </li><li> CD4 + CD25 + regülatör T hücreleri zenginleştirmek pozitif seçim için kolona hücreleri uygulamak ve colum yıkamatampon maddesinin 2 ml ekleyerek n. yıkandıkları üç kez tekrarlayın. </li><li> Kolon son yıkama aşamasından sonra boşaldığında, kolona tampon 1 ml ekleyin ve manyetik olarak etiketlenmiş CD4 + CD25 + piston kullanarak hücrelerin dışarı yıkayın. </li><li> Tekrar izole CD4 + CD25 + regülatör T hücrelerinin saflığı artırmak için 4.8-4.9 adımları tekrarlayın. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile FACS tamponu ile hücreleri yıkayın. Süpernatant atılır ve tam RPMI ortamında 2 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir konsantrasyonda izole CD4 + CD25 + regülatör T hücrelerinin yeniden süspanse edin. </li><li> Izole edilmiş-CD4 + CD25 + regülatör T hücrelerinin saflığı kontrol etmek için, toplam izole-CD4 + CD25 + regülatör T hücreleri 2 x 10 5 hücre kullanımı. FACS tamponu 50 ul anti-CD4 FITC içeren ve hücre canlılığı, IR-yakını flüoresan reaktif boya saptama reaktif maddesi ile hücreleri Leke. NOT: CD25 zaten izolasyonu sırasında PE ile işaretlenmiştir. </li><li> 4 ° C&#39;de karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe edin. 4 ° C&#39;de 2 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile FACS tamponu ile hücreleri yıkayın. Yıkama işleminden sonra, FACS tampon 100 ul hücre pelletini ve akış sitometrisi ile saflığını kontrol. </li><li> Kapısı canlı hücre popülasyonu. Regülatör T hücrelerinin saflığı analiz etmek için, CD4 + CD25 + hücrelerinin yüzdesi teyit etmektedir. Not: Deney sonuçlarına göre, saflaştırılmış hücreler arasında CD4 + CD25 + hücrelerinin yüzdesi yaklaşık% 80 üzerindedir. </li></ol> CD8 + T hücreleri ve CD8 + T hücrelerinin etiketlenmesi 5. Yalıtım NOT: Tüm reaktif hacimleri aşağıda belirtilen 1 x 10 7 toplam splenositlerin bir başlangıç ​​hücre sayısı içindir. <ol><li> saf fareler kullanılarak bölüm 2&#39;de tarif edildiği gibi hücreler hazırlayın. T hücresi izolasyon devetüyü 10 ml ekleyerek hücreleri yıkanırer. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin. Tamamen supernatant atmak ve tampon 40 ul hücre pelletini. </li><li> Manyetik Hücre Ayırma Sistemi kullanılarak CD8 + T hücre izolasyonu için, sigara CD8 + T hücresi etiketlemesi için, biyotin-antikor kokteyli 10 ul ekleyin ve iyice karıştırın. 4 ° C&#39;de 5 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> tampon 30 ul anti-biyotin mikro-20 ul ekle. İyice karıştırın ve 4 ° C&#39;de 10 dakika inkübe edilir. </li><li> kolona hücreleri uygulayın ve sütunun geçmesine etiketsiz hücreleri toplamak. Bunu tamponun üç kez 2 ml ekleyerek sütun yıkayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin. Tamamen Süpernatant atılır ve tamponun 2 ml izole edilmiş CD8 + T hücrelerini yeniden süspanse edin. </li><li> İzole hücreler saflığını kontrol etmek için FACS tamponu içerisinde antikor çözeltisi 50 ul hazırlar. İzole CD8 + T cel arasında 2 x 10 5 hücreleri tekrar süspansiyonAntikor çözeltisinin 50 ul mi. Not: Anti-CD8 FITC ekleyin antikor çözeltisinin hazırlanması ve hücre canlılığı saptama reaktif maddesi (IR-yakını flüoresan reaktif boya) FACS tampon içine için. </li><li> 4 ° C&#39;de karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe edin. 4 ° C&#39;de 2 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile FACS tamponu ile hücreleri yıkayın. Yıkama işleminden sonra, FACS tampon 100 ul hücre pelletini, ve akış sitometrisi ile hücre saflığını kontrol. </li><li> Kapısı canlı hücre popülasyonu. CD8 + T hücrelerinin saflığını kontrol etmek için, CD8 + T hücrelerinin yüzdesini teyit etmektedir. Not: Deney sonuçlarına göre, arıtılmış, hücreleri arasında CD8 + hücrelerinin yüzdesi yaklaşık% 90 üzerindedir. </li><li> Izole edilmiş CD8 + T hücrelerine PBS ekleyin. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin. süpernatant atın. PBS içinde 1 x 10 7 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyonda izole CD8 + T hücreleri yeniden süspanse edin. </li><li> CD8 + T ce etiketlemek içinin vitro bastırma deneyi için LLS, oda sıcaklığında 5 uM&#39;lik bir konsantrasyon elde etmek için PBS içinde hücre çoğalması izleme mor boya seyreltin. NOT: Çalışmada kullanılan hücre çoğalması izleme mor boya yaklaşık uyarma ve emisyon zirveleri sırasıyla 405 ve 450 nm. </li><li> 15 ml&#39;lik bir tüp içinde hücre çoğalması, izleme, mor bir boya (5 uM) ve hücre süspansiyonu (CD8 + T hücreleri 1 x 10 7 hücre / ml) de eşit hacimde karıştırılır ve 37 ° C&#39;de 20 dakika inkübe edilir. tüpü her 10 dakikada Vortex. </li><li> Soğuk tam RPMI ortamı ile tüp doldurun ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca tüpü terk. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin. Tamamen supernatant atmak ve önceden ısıtılmış tam RPMI ortamı ile 2 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir konsantrasyonda tekrar süspansiyon hücreleri. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe hücreleri. </li></ol> 6. CD4 + CD25 + T &lt;kullanma İn Vitro Bastırma Testi Kurmasub&gt; reg ve CD8 + T hücreleri <ol><li> Anti-CD3 / CD28 kaplı taneler hazırlamak için, borunun, 15 ml (2.5 ul / 1 x 10 5 hücre) manyetik boncuk uygun hacim transferi. PBS eşit hacimde ilave et ve karıştır. 4 ° C&#39;de 2 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile yıkayın ve supernatant atın. tam ortam içinde manyetik boncuk (50 ul / oyuk) ile seyreltilir. </li><li> CD4 + CD25 + regülatör T hücrelerinin kısım 50 ul, U tabanlı, 96 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu (1 x 10 5 hücre / oyuk). Cevaplayıcı T (T resp) CD8 + T hücrelerinin hücre oyuk başına (1 x 10 5 hücre / çukur) 50 ul ekle. oyuk başına seyreltilmiş, anti-CD3 / CD28 kaplı manyetik boncuklar 50 ul ekle. NOT: aşağıdaki gibi kontrol kuyuları kurmak bu adımı, etiketli ve: hiçbir anti-CD3 / CD28 kaplı boncuklar ile &quot;sadece uyarılmamış CD8 + T hücresi&quot;; &quot;CD8 + T hücresi yalnızca&quot; anti-CD3 / CD28 kaplı boncuklar ile; &quot;CD8 + T hücresi yalnızca&quot;Anti-CD3 / CD28 kaplı boncuklar,&quot;. Regülatör T hücresi sadece &quot;anti-CD3 / CD28 kaplı boncuklar ile regülatör T hücreleri, T, farklı bir oranda tam ortam ve CO-kültürlenmiş T solunum hücreleri ile seyreltilmiş olabilir Solunum hücreleri: regülatör T hücreleri (1: 0.25-1: 1). </li><li> 200 ul toplam hacmine her kuyulara 50 ul ya da ortamın uygun bir hacim. Folyo ile plaka Kapak ve 72 saat boyunca 37 ° C&#39;de bir CO2 kuluçka makinesi içinde inkübe edilir. </li></ol> CD8 + T hücrelerinde 7. analizi CD8 + T hücre proliferasyonu ve sitokin üretim <ol><li> sitokin üretimi analizi için, kültür, 3 gün sonra, iyi bir plaka her yüzey maddesi ayrılır ve enzim-bağlı immünosorbent deneyi (ELISA) ile yerine getirir. Not: üstteki sıvı kısımlar halinde -70 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. Bu deneyde, anti-fare IFN-γ, antikor kaplı plaka IFN-γ üretimi anlaşması tespit etmek için kullanıldıÜreticinin protokolüne ing. Bir tek hücre düzeyinde, CD8 + T hücrelerinin proliferasyon IFN-γ üretimini belirlemek için, hücre içi sitokin boyama yapılabilir. </li><li> her gözden üst fazın ayrılmasından sonra, 4 ° C&#39;de (3 kez), 2 dakika boyunca 300 xg&#39;de FACS tamponu ve santrifüj ile hücreler içeren plakayı yıkayın. </li><li> Yıkama işleminden sonra, süpernatant atılır. Prolifere CD8 + T hücrelerinin boyanması için antikor kokteyli 50 ul hücre pelletini. 4 ° C&#39;de karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe edin. Not: FACS tampon, anti-CD4 FITC, anti-CD8 PerCP Cy5.5 ve hücre canlılığı saptama reajanı (IR-yakını flüoresan reaktif boya) ekleyin, antikor kokteyli hazırlanması. NOT: Bu, CD44 veya CD69 gibi çeşitli belirteçler karşı olan antikorlar, CD8 + T hücrelerinin aktivasyonunu teyit etmek için, diğer antikorlar ile birleştirilebilir. CD8 + T hücreleri zaten hücre çoğalması izleme v ile etiketlenmiş edilmiştir unutmayınAdım 5.10 de iolet boya. </li><li> 4 ° C&#39;de 2 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile iki kez yıkanır. Son yıkama aşamasından sonra, supernatant atmak ve sabitleme tampon 100 ul ile 4 ° C&#39;de karanlıkta 20 dakika boyunca hücrelerin tespit. </li><li> 4 ° C&#39;de 2 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile iki kez yıkanır. FACS tampon 200 ul hücreleri yeniden süspanse edin ve akış sitometrisi ile hücre çoğalması izleme mor boya etiketli CD8 + T hücrelerinin proliferasyonunu ölçer. <ol><li> Kapı canlı hücreleri arasında CD8 + T hücresi popülasyonu. Hücre çoğalması, izleme, mor bir boya ve şu denkleme göre, CD8 + T hücresi seyreltme seyreltme göre ayrılır ve kesintisiz hücrelerin yüzdelerini ölçün. % Önleme = [(T Reg hücrelerin yokluğunda çoğaldı CD8 + T hücrelerinin% - regülatör T hücrelerin varlığında çoğalan CD8 + T hücrelerinin%) / (% olarak çoğalmıştır CD8 + T hücrelerininT reg hücrelerinin yokluğu)] x 100 Ayrıntılı yazılımın 25 flow sitometri kullanarak verileri analiz. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3.">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).</li><li>Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+self-tolerance+maintained+by+activated+T+cells+expressing+IL-2+receptor+alpha-chains+(CD25).+Breakdown+of+a+single+mechanism+of+self-tolerance+causes+various+autoimmune+diseases.">Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases.</a> J Immunol. 155 (3), 1151-1164 (1995).</li><li>Huang, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+LAG-3+in+regulatory+T+cells.">Role of LAG-3 in regulatory T cells.</a> Immunity. 21 (4), 503-513 (2004).</li><li>McHugh, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)CD25(+)+immunoregulatory+T+cells:+gene+expression+analysis+reveals+a+functional+role+for+the+glucocorticoid-induced+TNF+receptor.">CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor.</a> Immunity. 16 (2), 311-323 (2002).</li><li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+self-tolerance+maintained+by+CD25(+)CD4(+)+regulatory+T+cells+constitutively+expressing+cytotoxic+T+lymphocyte-associated+antigen+4.">Immunologic self-tolerance maintained by CD25(+)CD4(+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4.</a> J Exp Med. 192 (2), 303-310 (2000).</li><li>Manigold, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp3+CD4+CD25++T+cells+control+virus-specific+memory+T+cells+in+chimpanzees+that+recovered+from+hepatitis.">Foxp3+CD4+CD25+ T cells control virus-specific memory T cells in chimpanzees that recovered from hepatitis.</a> C. Blood. 107 (11), 4424-4432 (2006).</li><li>Andersson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+regulatory+T+cells+in+lymphoid+tissue+is+correlated+with+viral+load+in+HIV-infected+patients.">The prevalence of regulatory T cells in lymphoid tissue is correlated with viral load in HIV-infected patients.</a> J Immunol. 174 (6), 3143-3147 (2005).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)CD25(+)FoxP3(+)+regulatory+T+cells+suppress+Mycobacterium+tuberculosis+immunity+in+patients+with+active+disease.">CD4(+)CD25(+)FoxP3(+) regulatory T cells suppress Mycobacterium tuberculosis immunity in patients with active disease.</a> Clin Immunol. 123 (1), 50-59 (2007).</li><li>Shafiani, S., Tucker-Heard, G., Kariyone, A., Takatsu, K., Urdahl, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen-specific+regulatory+T+cells+delay+the+arrival+of+effector+T+cells+in+the+lung+during+early+tuberculosis.">Pathogen-specific regulatory T cells delay the arrival of effector T cells in the lung during early tuberculosis.</a> J Exp Med. 207 (7), 1409-1420 (2010).</li><li>Belkaid, Y., Piccirillo, C. A., Mendez, S., Shevach, E. M., Sacks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+CD25++regulatory+T+cells+control+Leishmania+major+persistence+and+immunity.">CD4+CD25+ regulatory T cells control Leishmania major persistence and immunity.</a> Nature. 420 (6915), 502-507 (2002).</li><li>Grainger, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helminth+secretions+induce+de+novo+T+cell+Foxp3+expression+and+regulatory+function+through+the+TGF-beta+pathway.">Helminth secretions induce de novo T cell Foxp3 expression and regulatory function through the TGF-beta pathway.</a> J Exp Med. 207 (11), 2331-2341 (2010).</li><li>Taylor, M. D., van der Werf, N., Maizels, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cells+in+helminth+infection:+the+regulators+and+the+regulated.">cells in helminth infection: the regulators and the regulated.</a> Trends Immunol. 33 (4), 181-189 (2012).</li><li>You, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+regulatory+T+cells+potently+abrogate+antitumor+immunity.">Tumor regulatory T cells potently abrogate antitumor immunity.</a> J Immunol. 182 (10), 6160-6167 (2009).</li><li>Curiel, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+recruitment+of+regulatory+T+cells+in+ovarian+carcinoma+fosters+immune+privilege+and+predicts+reduced+survival.">Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival.</a> Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).</li><li>Dittmer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+impairment+of+CD8(+)+T+cells+by+regulatory+T+cells+during+persistent+retroviral+infection.">Functional impairment of CD8(+) T cells by regulatory T cells during persistent retroviral infection.</a> Immunity. 20 (3), 293-303 (2004).</li><li>Robertson, S. J., Messer, R. J., Carmody, A. B., Hasenkrug, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+suppression+of+CD8++T+cell+function+by+Friend+virus-induced+regulatory+T+cells.">In vitro suppression of CD8+ T cell function by Friend virus-induced regulatory T cells.</a> J Immunol. 176 (6), 3342-3349 (2006).</li><li>Iwashiro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosuppression+by+CD4++regulatory+T+cells+induced+by+chronic+retroviral+infection.">Immunosuppression by CD4+ regulatory T cells induced by chronic retroviral infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (16), 9226-9230 (2001).</li><li>Suvas, S., Kumaraguru, U., Pack, C. D., Lee, S., Rouse, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+CD25++T+cells+regulate+virus-specific+primary+and+memory+CD8++T+cell+responses.">CD4+CD25+ T cells regulate virus-specific primary and memory CD8+ T cell responses.</a> J Exp Med. 198 (6), 889-901 (2003).</li><li>Suvas, S., Azkur, A. K., Kim, B. S., Kumaraguru, U., Rouse, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+CD25++regulatory+T+cells+control+the+severity+of+viral+immunoinflammatory+lesions.">CD4+CD25+ regulatory T cells control the severity of viral immunoinflammatory lesions.</a> J Immunol. 172 (7), 4123-4132 (2004).</li><li>Veiga-Parga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+regulatory+T+cells+during+viral-induced+inflammatory+lesions.">On the role of regulatory T cells during viral-induced inflammatory lesions.</a> J Immunol. 189 (12), 5924-5933 (2012).</li><li>Wherry, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signature+of+CD8++T+cell+exhaustion+during+chronic+viral+infection.">Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection.</a> Immunity. 27 (4), 670-684 (2007).</li><li>Jin, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+of+Tim-3+and+PD-1+in+CD8+T-cell+exhaustion+during+chronic+viral+infection.">Cooperation of Tim-3 and PD-1 in CD8 T-cell exhaustion during chronic viral infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14733-14738 (2010).</li><li>Punkosdy, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T-cell+expansion+during+chronic+viral+infection+is+dependent+on+endogenous+retroviral+superantigens.">Regulatory T-cell expansion during chronic viral infection is dependent on endogenous retroviral superantigens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3677-3682 (2011).</li><li>Blackburn, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coregulation+of+CD8++T+cell+exhaustion+by+multiple+inhibitory+receptors+during+chronic+viral+infection.">Coregulation of CD8+ T cell exhaustion by multiple inhibitory receptors during chronic viral infection.</a> Nat Immunol. 10 (1), 29-37 (2009).</li><li>Park, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+upregulated+on+regulatory+T+cells+during+chronic+virus+infection+enhances+the+suppression+of+CD8++T+cell+immune+response+via+the+interaction+with+PD-L1+expressed+on+CD8++T+cells.">PD-1 upregulated on regulatory T cells during chronic virus infection enhances the suppression of CD8+ T cell immune response via the interaction with PD-L1 expressed on CD8+ T cells.</a> J Immunol. 194 (12), 5801-5811 (2015).</li><li>Virgin, H. W., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+chronic+viral+infection.">Redefining chronic viral infection.</a> Cell. 138 (1), 30-50 (2009).</li><li>Penaloza-MacMaster, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+regulatory+T+cells+and+PD-1+in+modulating+T+cell+exhaustion+and+viral+control+during+chronic+LCMV+infection.">Interplay between regulatory T cells and PD-1 in modulating T cell exhaustion and viral control during chronic LCMV infection.</a> J Exp Med. 211 (9), 1905-1918 (2014).</li><li>Chang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+ligase+Peli1+negatively+regulates+T+cell+activation+and+prevents+autoimmunity.">The ubiquitin ligase Peli1 negatively regulates T cell activation and prevents autoimmunity.</a> Nat Immunol. 12 (10), 1002-1009 (2011).</li><li>Krishnamoorthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+infection+with+respiratory+syncytial+virus+impairs+regulatory+T+cell+function+and+increases+susceptibility+to+allergic+asthma.">Early infection with respiratory syncytial virus impairs regulatory T cell function and increases susceptibility to allergic asthma.</a> Nat Med. 18 (10), 1525-1530 (2012).</li><li>Yadav, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-1+distinguishes+natural+and+inducible+regulatory+T+cells+among+regulatory+T+cell+subsets+in+vivo.">Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo.</a> J Exp Med. 209 (10), 1713-1722 (2012).</li><li>Tai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basis+of+CTLA-4+function+in+regulatory+and+conventional+CD4(+)+T+cells.">Basis of CTLA-4 function in regulatory and conventional CD4(+) T cells.</a> Blood. 119 (22), 5155-5163 (2012).</li><li>Rushbrook, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+suppress+in+vitro+proliferation+of+virus-specific+CD8++T+cells+during+persistent+hepatitis+C+virus+infection.">Regulatory T cells suppress in vitro proliferation of virus-specific CD8+ T cells during persistent hepatitis C virus infection.</a> J Virol. 79 (12), 7852-7859 (2005).</li><li>Sekiya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+orphan+receptor+Nr4a2+induces+Foxp3+and+regulates+differentiation+of+CD4.">The nuclear orphan receptor Nr4a2 induces Foxp3 and regulates differentiation of CD4.</a> T cells. Nat Commun. 2 (269), (2011).</li><li>Merianos, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+alloantibodies+induce+a+postnatal+immune+response+that+limits+engraftment+following+in+utero+hematopoietic+cell+transplantation+in+mice.">Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice.</a> J Clin Invest. 119 (9), 2590-2600 (2009).</li><li>Allakhverdi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+CD103+identifies+human+regulatory+T-cell+subsets.">Expression of CD103 identifies human regulatory T-cell subsets.</a> J Allergy Clin Immunol. 118 (6), 1342-1349 (2006).</li><li>Camisaschi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LAG-3+expression+defines+a+subset+of+CD4(+)CD25(high)Foxp3(+)+regulatory+T+cells+that+are+expanded+at+tumor+sites.">LAG-3 expression defines a subset of CD4(+)CD25(high)Foxp3(+) regulatory T cells that are expanded at tumor sites.</a> J Immunol. 184 (11), 6545-6551 (2010).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GARP+selectively+identifies+activated+human+FOXP3++regulatory+T+cells.">Expression of GARP selectively identifies activated human FOXP3+ regulatory T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13439-13444 (2009).</li><li>Myers, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-2-independent+and+TNF-alpha-dependent+expansion+of+Vbeta5++natural+regulatory+T+cells+during+retrovirus+infection.">IL-2-independent and TNF-alpha-dependent expansion of Vbeta5+ natural regulatory T cells during retrovirus infection.</a> J Immunol. 190 (11), 5485-5495 (2013).</li></ol>

S.-J.H. has a patent and receives patent royalties related to the PD-1 pathway. The other authors have no financial conflicts of interest.

Regülatör T hücrelerinin sadece küçük bir bölümü, farelerde ve insanlarda mevcut olmakla beraber, bunların bir bağışıklık tepkisi düzenlenmesi ve immün tolerans korumada önemli bir rol oynar olarak işlev anlamak önemlidir. T numarası ve baskılayıcı işlevleri kronik virüs enfeksiyonuna 15-20 yanı sıra kanser ilerlemesi 13,14 sırasında hücreler artar reg. Bu muhtemelen devam antijen uyarılmasına bağlıdır. Reg hücreleri antijen sebat ve hastalık gelişimi altında faaliyet T değerlendirmek, onların baskılayıcı aktivitesi ölçülür gerekmektedir. Burada, regülatör T hücrelerinin ex vivo fenotip analizi ve CD8 + T hücreleri ve regülatör T hücrelerinin in vitro ko-kültür sistemi kullanılarak baskılayıcı aktivitesini ölçmek için bir protokolü tarif eder. Mevcut protokol Kritik adımlar analizi ve T reg hücrelerinin izolasyonu vardır. Canlı ve taze izole edilen T <sub&gt; reg hücreleri in vitro açık baskılayıcı aktivite gösterirler. Biz de kronik bir virüs enfeksiyonu sırasında T sohbetler ve T reg hücrelerinin fenotipleri incelenmiştir. T dönüşüm hücreleri, örneğin, Foxp3 - CD4 + ve CD8 + T hücreleri, kronik virüs enfeksiyonu (Şekil 1) sonra hücre aktivitesinde bir azalma olduğunu gösterdi. PD-1 ifadesi, her iki T dönüşüm hücre popülasyonlarında yukarı regüle edilmiştir. Regülatör T hücre sayısındaki artış ve yukarı regülasyonu PD-1 ifadesinin kronik virüs enfeksiyonu, bağışıklık tepkisinin özellikleridir. Ek olarak, TİM-3 ve CTLA-4 gibi diğer önleyici reseptörleri için önleyici organları choric virüsü enfeksiyonu sonrası FACS ile T hücresi fenotipi incelemek için PD-1 ile kombinasyon halinde de kullanılabilir. Baskılayıcı aktivitesi incelemek için, T hücreleri ve solunum regülatör T hücreleri, regülatör T 1 1. ortak-kültürünün bir oranda eş kültürlenmiştiryerli farelerden regülatör T hücreleri ile karşılaştırıldığında kronik olarak enfekte olan farelerden alınan hücrelerin önemli ölçüde CD8 + T hücre çoğalmasını ve IFN-γ salgısı azalır. Bu regülatör T hücreleri ile birlikte-kültür, CD8 + T hücrelerinin çoğalma ve sitokin üretimi ters regülatör T hücrelerinin bastırma fonksiyonu ile ilgili olduğunu ima eder. Bu protokol dışı T reg hücreleri ile T reg hücre izolasyonu, kontaminasyon için bir manyetik hücre ayırma sistemi kullanılmasını önerir rağmen göz ardı edilemez. CD25 sık sık aktive CD4 + T dönüşüm yanı sıra T reg hücreleri üzerinde aşırı olarak Foxp3-GFP muhabiri farelerden 28-30 elde edilen T reg hücreleri, doğru manyetik hücre ayırma sisteminden daha regülatör T hücrelerinin işlevini araştırmak için daha iyi adaylardır. T reg hücrelerinin baskılayıcı fonksiyonu çeşitli in vitro değerlendirilmiştirbastırma deneyleri 16,28,31-34. In vitro bastırma tahlilinde avantajı, yalnızca T solunum hücreleri regülatör T hücreleri ile birlikte-kültür, çünkü CD8 + T hücresi tepkisinin inhibisyonu üzerindeki regülatör T hücrelerinin doğrudan etki değerlendirir olmasıdır. CD8 + T hücreleri ile birlikte, CD25 - CD4 + T hücreleri yerine T solunum hücreleri 25 kullanılabilir. Örneğin dendritik hücreler ya da doğal katil hücreler gibi bağışıklık hücreleri üzerinde regülatör T veya T dönüşüm hücrelerinin etkisi deneysel koşullar değiştirilerek değerlendirilebilir. Bir tekrarların glikoprotein gibi CD103 35, LAG-3 36 olarak Moleküller, CD43 38, CD11a 38 37 egemen, ya da öldürücü hücre lektin benzeri reseptör altfamilya G üye 1 38 özel hastalıklarda aktive T reg hücrelerinin belirteçleri olarak kullanılmaktadır. Bu protokol, biz bir şekilde PD-1 kullanılırGösterge kronik virüs enfeksiyonu sırasında T reg hücrelerini aktive tanımlamak için. Bu protokol, spesifik koşullar altında regülatör T hücrelerinin yönlü analizi (fenotipik ve işlevsel) için de kullanılabilir.

Düzenleyici T (T reg) hücreleri kendi gelişimi ve işlevi 1 için bir transkripsiyon faktörü olarak forkhead kutusu P3 (Foxp3) ifade eder. Buna ek olarak, regülatör T hücreleri, CD25 2, lenfosit aktivasyonu geni 3 (ara-3) 3, glukokortikoitin yol açtığı tümör nekroz faktörü reseptör 4, ve sitotoksik gibi çeşitli başka molekülleri ifade T-lenfosit-ilişkili protein 4 (CTLA-4) &#39;5 yüzeylerinde ya da hücre içi bölgeye. Bu tür virüsler 6,7, bakteriler 8,9, ve parazitler 10-12 veya kanser gelişimi 13,14 sırasında olduğu gibi patojenlerin çeşitli kronik enfeksiyon sırasında, T reg hücreleri gelişmiş baskılayıcı fonksiyon gösteren, aktif hücrelerin içine ayırt hale hedefleme efektör CD4 + ve CD8 + T hücreleri. Kağıtların bir dizi genişletilmiş ve aktive regülatör T hücreleri, bozulmuş CD8 + T hücresi yanıt vermeyen katkıda sürmüşlerdirarkadaş retrovirüs (FV) enfeksiyonu 15-17 sırasında e. FV kaynaklı regülatör T hücrelerinin IFN-y ya da Granzim B ekspresyonu ve CD8 + T hücrelerinin 15-17 sitotoksik reaktivite inhibe eder. Ayrıca, bir herpes simpleks virüsü enfeksiyon modelinde, bu virüse spesifik CD8 + T hücreleri ve immünopatojenik CD4 + T hücrelerinin 18-20 infiltrasyonu ile ciddi doku hasarının genişleme sonuçlandı CD4 + CD25 + regülatör T hücrelerinin tükenmesinin bildirilmiştir. Lenfositik koryomenenjit virüsünün klon 13 suşu ile kronik olarak enfekte olan fareler (LCMV CL13) 21-24 yaygın kronik virüs enfeksiyonu esnasında efektör T hücrelerinin (EFF) ve regülatör T hücrelerinin fenotip ve işlevini karakterize etmek için kullanılmaktadır. Kalıcı LCMV enfeksiyonunun sırasında virüs spesifik T EFF hücreleri kademeli olarak efektör fonksiyonunu kaybeder ve tükenmiş T (T exh) hücreler haline gelirler. Diğer yandan, TREG hücreleri virüs-belirgin T hücre tepkisine 25 önleme yeteneklerinden güçlendirir. T eff hücrelerinin çalışması kapasitesinde azalma, T eff hücreleri üzerinde inhibe edici reseptör artışı, antijen-sunan hücrelerin değişmiş fonksiyonu, bağışıklık sitokinlerin üretimi ve artan frekans veya regülatör T gelişmiş fonksiyonu olarak çeşitli faktörler tarafından açıklanabilir hücreler 26. T hücresi bastırılmasıyla ilgili faktörler arasında, programlanmış hücre ölümü proteini-1 (PD-1) -expressing T exh hücreleri ve regülatör T hücreleri yaygın antijene kalıcılık ve baskılayıcı çevre işaretlerinden olarak kabul edilmiştir. Son zamanlarda, bu T reg hücrelerinin PD-1 yolunun ve ablasyon abluka gelişmiş T hücre fonksiyonuna neden olduğunu bildirdi ve LCMV kronik enfeksiyon 27 sırasında viral yük azaltıldı. Ayrıca, regülatör T hücreleri LCMV 23,25 ile farelerin kronik enfeksiyon sırasında aktive edilir </syukarı&gt; ve baskılayıcı fonksiyonu 25 güçlendirilmiştir. PD-1 yüksek regülatör T hücreleri hem de T exh hücre ifade edilir, ve PD-1 regülatör T hücreleri tarafından ifade seviyesi, T hücre proliferasyonunu 25 inhibe etme baskılayıcı fonksiyonu gücü ile ilişkilidir. Burada, LCMV CL13 ve naif farelerden izole dinlenme T reg hücreleri ile enfekte edilen farelerin izole aktive T reg hücrelerinin özelliklerini karşılaştırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca, aktive edilmiş T-hücrelerinin ayrılmasında reg ve ex vivo fenotipi incelenmesi, hem de in vitro olarak da bastırma etkinliğini ölçmek için bir dizi işlemden açıklar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="976">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">FITC Rat Anti-Mouse CD4</td>
			<td style="width:67px;">RM4-5</td>
			<td style="width:173px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:104px;">553047</td>
			<td style="width:249px;">Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytofix/Cytoperm</td>
			<td></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>Use this reagent for cell surface staining.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">U-Bottom Tissue Culture Plates</td>
			<td></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fixation buffer</td>
			<td></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td align="right">554655</td>
			<td>Use this reagent for cell surface staining.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC Rat Anti-Mouse CD25</td>
			<td>7D4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553072</td>
			<td>Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell strainer, 70mm</td>
			<td></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352350</td>
			<td>Use this strainer for grinding the whole spleen.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell strainer, 40mm</td>
			<td></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352340</td>
			<td>Use this strainer for filtering the cells before column enrichment.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1)</td>
			<td>29F.1A12</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>135217</td>
			<td>Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4</td>
			<td>RM4-5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td align="right">100547</td>
			<td>Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC Anti-Mouse/Rat Foxp3&#160;</td>
			<td>FJK-16s</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-5773</td>
			<td>Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td></td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a</td>
			<td>53-6.7</td>
			<td>eBiosicence</td>
			<td>45-0081</td>
			<td>Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse IFN-gamma Platinum ELISA</td>
			<td></td>
			<td>eBiosicence</td>
			<td>BMS606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640</td>
			<td></td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>SH30027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS (1X)</td>
			<td></td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>SH30256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td></td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine, 200mM solution</td>
			<td></td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin, 10,000U/mL</td>
			<td></td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit</td>
			<td></td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L-34975</td>
			<td>Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 500X in FACS buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse</td>
			<td></td>
			<td>Miltenyibiotec</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse</td>
			<td></td>
			<td>Miltenyibiotec</td>
			<td>130-091-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACS Separation Columns, LD columns</td>
			<td></td>
			<td>Miltenyibiotec</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td>Use this column for Treg cell isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACS Separation Columns, LS columns</td>
			<td></td>
			<td>Miltenyibiotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Use this column for CD8+ T cell and Treg cell isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA, 0.5M (pH 8.0)</td>
			<td></td>
			<td>Promega</td>
			<td>V4231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td></td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30919.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTrace Violet Cell Proliferation Kit</td>
			<td></td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Canto II flowcytometer</td>
			<td></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer*</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flowjo</td>
			<td></td>
			<td>TreeStar</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometry software&#8224;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hematocytomer</td>
			<td></td>
			<td>Marienfeld superior</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phenotypic and functional analysis of activated regulatory t cells isolated from chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice

Bir transkripsiyon faktörü olarak Foxp3 ifade eden düzenleyici T (T reg) hücreleri, CD4 + T hücrelerinin alt kümeleridir. T reg hücreleri bağışıklık yanıtını düzenleyerek immün tolerans ve homeostasis bakım çok önemli rol oynarlar. Regülatör T hücrelerinin temel görevi efektör T (T EFF) hücrelerinin çoğalması ve IFN-y, TNF-a ve IL-2 gibi sitokinlerin üretimini baskılamaktır. T eff hücrelerin fonksiyonunu inhibe regülatör T hücrelerinin yeteneği inatçı bir patojen enfeksiyon ve kanser gelişimi sırasında gelişmiş olduğu gösterilmiştir. Dinlenme veya iltihaplı koşullar altında regülatör T hücrelerin fonksiyonunu fare ya da insan regülatör T hücreleri kullanılarak in vitro bastırma edilen çeşitli testler öne sürülmüştür değerlendirmektir. Bu çalışmanın temel amacı, fenotip ve dinlenme arasındaki baskılayıcı fonksiyon farklılıkları ve aktive olmuş T reg karşılaştırmak için bir yöntem geliştirmektirHücreler. Aktive T reg hücreleri izole etmek için, fareler, lenfositik koryomenenjit virüsü (LCMV) klon 13 (CL13) ile LCMV kronik zorlanma enfekte edildi. LCMV CL13-enfekte edilen farelerin dalak izole regülatör T hücreleri naif farelerden izole edilen regülatör T hücreleri dinlenme ile karşılaştırıldığında aktive fenotip ve geliştirilmiş baskılayıcı aktivitesini sergiledi. Burada, T reg hücrelerini dinlenme aktive T reg hücreleri ayırt etmek ex vivo fenotip analizi için temel protokol açıklar. Ayrıca, tam olarak aktif regülatör T hücrelerin baskılayıcı aktivitesi ölçümü için bir protokol açıklar.

Biz intravenöz LCMV CL13 2 x 10 6 pfu ile enjekte edilerek kalıcı virüs enfeksiyonu ile fareler üretti. Regülatör T hücreleri ve kronik virüs enfeksiyonu sırasında T dönüşüm hücrelerde fenotipik değişiklikler araştırıldı, saf ve enfekte farelerden elde edilen dalak lenfositleri çeşitli antikorlarla boyanmış ve akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. CD4 + T sohbetler (Şekil 1A, üst panel) ve Foxp3 - - CD8 + T sohbetler (Şekil 1B, üst panel) hücreleri 16 d pi anda, PD-1 Foxp3 hem de yukarı regüle edilmiştir. Foxp3 + CD4 + regülatör T hücrelerinin frekansı saf farelerde (Şekil 1A) daha LCMV CL13 ile enfekte olmuş farelerde, iki kat daha yüksek olmuştur. Özellikle, FoxP3 + CD4 + regülatör T hücrelerinin çoğu yüksek seviyede ifade eden, aktif fenotipini gösterdiPD-1, bu zaman noktasında (Şekil 1A). In vitro bastırma deneyi için, CD8 + T dönüşüm hücre ve CD4 + CD25 + regülatör T hücrelerinin önemli bir bölümü gerekmiştir. 1 x 10 7 hücre çoğalma izleme mor boya etiketli CD8 + T hücreleri elde etmek için, saf fareler iki dalaklarından splenositler toplandı. 2 x 10 6 veya CD4 + CD25 + regülatör T hücrelerinin x 10 6 3 elde edilmesi için, saf ve LCMV CL13 ile enfekte farelerde en az üç dalakları, sırasıyla bir araya toplanmıştır. T hücreleri gibi solunum, CD8 + T hücreleri, diğer bağışıklık hücreleri (Şekil 2A) ile birlikte önemli bir kirlenme olmadan başarılı bir şekilde ayrıldı. Regülatör T hücreleri de% 80&#39;den fazla saflığa (Şekil 2B) olan CD25 +, CD4 + T hücreleri baskın nüfusu ile izole edildi. Saf ve kronik regülatör T hücrelerinin baskılayıcı işlevi karşılaştırmak için, izole edilmiş T Reg ve T resp hücreleri 3 gün boyunca 37 ° C &#39;de, anti-CD3 / CD28 kaplı boncuklar ile stimülasyon altında birlikte inkübe edildi. CD8 + T solunum hücresi çoğalmasının% inhibisyon, bir regülatör T hücre Dese bağlı bir şekilde (Şekil 3A) artmıştır. CD8 + T hücreleri, resp 1 oranında kronik regülatör T hücreleri ile birlikte-kültür edilmişlerdir: 1, CD8 + T solunum hücrelerinin proliferasyonu anlamlı (Şekil 3b) inhibe edilmiştir. CD8 + T hücreleri, solunum, kronik olarak enfekte farelerden yerine regülatör T naif farelerin regülatör T hücreleri dinlenme aktive regülatör T hücreleri ile birlikte-kültür iken, CD8 + T hücreleri tarafından solunum IFN-γ üretimi önemli ölçüde önlendi </alt&gt; Hücre doza bağlı bir şekilde (Şekil 3C). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54138/54138fig1.jpg" /> Şekil 1: 16 d PI (A) PD-1 ya da Foxp3 üzerindeki CD25 ifadesi, bir saf fare ya da LCMV CL13-enfekte edilen farelerin dalak CD4 + ve CD8 + T hücrelerinin fenotipleri - CD4 + T sohbetler ve Foxp3 + CD4 + regülatör T hücreleri. Foxp3 Pd-1 ya da CD25 (B) ifade - CD8 + T dönüşüm hücreleri. Dalaktaki lenfositler CD4, CD8, CD25, PD-1 ve Foxp3 karşı antikorlar ile boyandı. Veriler, üç bağımsız deneyi temsil etmektedir. Panel A referans olarak 25 modifiye edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54138/54138fig1large.jpg" target="_blank">Tıklayınız</a><html> Burada bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54138/54138fig2.jpg" /> Şekil 2: saf ya da LCMV CL13 enfekte farelerden izole naif farelerde ve regülatör T hücrelerinden izole edilen T solunum hücrelerinin saflığı izolasyonundan sonra, CD8 + T hücreleri (A) yüzdesi.. Izolasyondan sonra CD25-eksprese eden CD4 + regülatör T hücrelerinin (B) oranı. (B) &#39;de her bir kadran CD4 ve CD25 ekspresyon seviyeleri ile belirlenir. Veriler, üç bağımsız deneyler temsilcisi vardır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54138/54138fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> les / ftp_upload / 54138 / 54138fig3.jpg &quot;/&gt; Şekil 3: CD8 + T hücresi yanıtı aktive regülatör T hücrelerinin Etkisi regülatör T hücresi doza bağlı bir şekilde regülatör T hücreleri ile birlikte-kültür, CD8 + T hücreleri (A)% inhibisyon.. 1&#39;de regülatör T hücreleri ile birlikte-kültür, CD8 + T hücreleri (B) Çoğalma: 1 oranında. Bir regülatör T hücresi doza bağlı bir şekilde regülatör T hücreleri ile birlikte-kültür, CD8 + T hücrelerinin (Cı), IFN-γ üretimi. CD8 + T hücrelerinin proliferasyonu çoğaldı CD8 + T hücreleri ve IFN-γ salgılanmasına hücre çoğalması izleme mor boyanın seyreltme ile ölçülmüştür ELISA ile değerlendirilmiştir. Hücre çoğalması, izleme mor boya etiketli CD8 + T hücreleri, T varlığında ya da yokluğunda, 3 gün boyunca, anti-CD3 / CD28 kaplı boncuklar ile uyarıldı <snaif ya da kronik enfekte farelerde ya izole ub&gt; reg hücreleri. Histogramda olmadan parantez sahip sayılar, sırasıyla, ve regülatör T hücreleri olmadan birlikte kültüre CD8 + T hücrelerinin proliferasyonu yüzdesini gösterir. Histogramda dolu gri tepe regülatör T hücreleri olmadan birlikte kültüre CD8 + T hücrelerinin proliferasyonunu göstermektedir. Her bir grup, üç kez tasarlanmıştır. bar + SEM temsil etmektedir. Bu rakam bir referans olarak 25 modifiye edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54138/54138fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice at JoVE.com

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from na&#239;ve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

Fenotipik ve Kronik Lenfositik koryomenenjit Virüs ile enfekte Fare İzole Aktif Düzenleyici T hücrelerinin Fonksiyonel Analiz

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

phenotypic-functional-analysis-activated-regulatory-t-cells-isolated

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.7K Görüntüleme.  Yonsei University. Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from naïve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

Video: Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

İlköğretim İnsan naif ve Bellek T Hücreleri gelen İsteyerek Düzenleyici T Hücreleri Üretimi

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

Yeni Araçlar HIV-1 ile enfekte bireyler gelen Düzenleyici T hücreleri büyütmek için

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative neurology. This directive has arisen from the extensive evidence that brain repair is achieved after focal or systemic NPC transplantation in several preclinical models of neurological diseases.
These experimental data have identified the cell delivery route as one of the main hurdles of restorative stem cell therapies for brain diseases that requires urgent assessment. Intraparenchymal stem cell grafting represents a logical approach to those pathologies characterized by isolated and accessible brain lesions such as spinal cord injuries and Parkinson's disease. Unfortunately, this principle is poorly applicable to conditions characterized by a multifocal, inflammatory and disseminated (both in time and space) nature, including multiple sclerosis (MS). As such, brain targeting by systemic NPC delivery has become a low invasive and therapeutically efficacious protocol to deliver cells to the brain and spinal cord of rodents and nonhuman primates affected by experimental chronic inflammatory damage of the central nervous system (CNS).
This alternative method of cell delivery relies on the NPC pathotropism, specifically their innate capacity to (i) sense the environment via functional cell adhesion molecules and inflammatory cytokine and chemokine receptors; (ii) cross the leaking anatomical barriers after intravenous (i.v.) or intracerebroventricular (i.c.v.) injection; (iii) accumulate at the level of multiple perivascular site(s) of inflammatory brain and spinal cord damage; and (i.v.) exert remarkable tissue trophic and immune regulatory effects onto different host target cells in vivo.
Here we describe the methods that we have developed for the i.v. and i.c.v. delivery of syngeneic NPCs in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), as model of chronic CNS inflammatory demyelination, and envisage the systemic stem cell delivery as a valuable technique for the selective targeting of the inflamed brain in regenerative neurology.

The transplantation of neural stem/progenitor cells (NPCs) holds great promises in regenerative neurology. The systemic delivery of NPCs has turned into effective, low invasive, and therapeutically very efficacious protocol to deliver stem cells in the brain and spinal cord of rodents and nonhuman primates affected by experimental chronic inflammatory damage of the central nervous system.

Kronik EAE ile Fare nöral kök / progenitör hücrelerinin sistemik enjeksiyonundan

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

T hücrelerinin türetilmesi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Fare Embriyonik Kök Hücreleri

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Periferik Kan İnsan alloantijen-özgü T hücrelerinin üretilmesi

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Fenotipik Analizi ve İnsan Cilt lenfosit izolasyonu<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Hücre Kültürü

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

T hücreleri dendritik hücreler gelen Transinfection tarafından Bakteriler Yakalama

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with respect to how viral members of the microbiome affect subsequent microbe interactions with these virus-infected host cells. The co-habitation of virus with bacteria and fungi is principally present on the mucosal surfaces of the oral cavity and genital tract. Mucosal cells, particularly those with persistent chronic or persistent latent viral infections, could have a significant impact on members of the microbiome through virus alteration in number and type of receptors expressed. Modification in host cell membrane architecture would result in altered ability of subsequent members of the normal flora and opportunistic pathogens to initiate the first step in biofilm formation, i.e., adherence. This study describes a method for quantitation and visual examination of HSV&#39;s effect on the initiation of biofilm formation (adherence) of S. aureus and C. albicans.

A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.

Bakteri ve mantar virüsle enfekte olmuş hücreler üzerinde Biyofilm Başlatma Belirlenmesi

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...

Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the allograft early after transplantation, mount a graft reactive response against the transplanted organ, and initiate organ rejection2. Recent data suggest that suppressive macrophages facilitate successful long-term transplantation3 and are required for the induction of transplantation tolerance4. This suggests a multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation, and function, which demands a new roadmap for the isolation and analysis of macrophage function5. Due to the plasticity of macrophages, it is necessary to provide a methodology to isolate and characterize macrophages, depending on the tissue environment, and to define their functions according to different scenarios. Here, we describe a protocol for immune characterization of graft-infiltrating macrophages and the methods we used to functionally evaluate their capacity to inhibit CD8+ T proliferation and to promote CD4+Foxp3+ Treg expansion in vitro.

Macrophages are plastic cells of the hematopoietic system that have a crucial role in protective immunity and homeostasis. In this report, we describe optimized in vitro techniques to phenotypically and functionally characterize graft-infiltrating regulatory macrophages that accumulate in the transplanted organ under tolerogenic conditions.

Greft Reaktif Bağışıklığı Engelleyen Düzenleyici Makrofajların Fonksiyonel Karakterizasyonu

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

Fenotipik ve Kronik Lenfositik koryomenenjit Virüs ile enfekte Fare İzole Aktif Düzenleyici T hücrelerinin Fonksiyonel Analiz

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler