This work was supported by Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education (2015R1A6A3A01020610 to HJP) and a grant from the Korean Health Technology R&amp;D Project, Ministry for Health, Welfare and Family Affairs, Republic of Korea (HI15C0493 to SJH).

In dieser Studie wurden die Mäuse in einem spezifischen Pathogen freie Einrichtung des Yonsei Laboratory Animal Research Center of Yonsei University gehalten. mit von der International genehmigten Protokollen Animal Care und Use Committee des Yonsei Laboratory Animal Research Center an der Yonsei University Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den koreanischen Food and Drug Administration Richtlinien durchgeführt. 1. Herstellung der Lösungen <ol><li> Bereiten 2% RPMI-Medium durch Verdünnen fötalem Rinderserum (FBS) und 2% Penicillin-Streptomycin und 1% in RPMI </li><li> Bereiten komplettem RPMI-Medien. Zu RPMI Medien Hinzufügen 10% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin, 1% L-Glutamin und 50 uM 2-Mercaptoethanol. </li><li> Bereiten fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) Puffer. so, Ergänzungs phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 2% FBS zu tun. </li><li> Bereiten Sie T-Zell-Isolationspuffer. Dazu ergänzen PBS mit 2% FBS und 2 mM ethylenediaminetetraacetic Säure. </li></ol> 2. Isolierung von Milzlymphozyten <ol><li> Entfernen der Milzen von naiven oder LCMV CL13-infizierten Mäusen , wie zuvor beschrieben , 19 und legen sie in 60 mm x 15 mm Petrischalen , die 10 ml von 2% RPMI - Medien. HINWEIS: In dieser Studie Experimenten 5 bis 6 Wochen alten C57B1L / 6J weibliche Mäuse erhielten 2 x 10 6 plaquebildenden Einheiten (pfu) von LCMV CL13 durch intravenöse Injektion über die Schwanzvene. Opfern , um die Mäuse am Tag 16 nach der Infektion (16 d pi) 25. Analyse ge angepassten naive Mäuse wurden am selben Tag. </li><li> Legen Sie eine Zelle Sieb in einen 50-ml-Röhrchen und spülen Sie ihn mit 2 ml 2% RPMI Medien. Legen Sie die Milz auf die 70 &amp; mgr; m Zellsieb und schleifen den Kolben einer Spritze. Spülen Sie die Zelle Sieb mit 2 ml 2% RPMI Medien und entfernen Sie sie aus dem 50-ml-Tube. </li><li> Füllen des Röhrchens mit 2% RPMI-Medium und Zentrifugation bei 300 × g für 5 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und resuspendierenZellpellet in 1 ml Lysepuffer ACK. Inkubieren der Proben bei Raumtemperatur (RT) für 5 min. HINWEIS: Das Volumen der ACK Lysepuffer oben für eine Milz angegeben ist. Scale up das Volumen entsprechend für gepoolte Milzproben. </li><li> Füllen des Röhrchens mit 2% RPMI-Medium und Zentrifugation bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in einer Dichte von 1 x 10 7 Zellen / ml in kompletten RPMI - Medium. HINWEIS: Für die Live-Zellzählung, Flecken Zellen mit Trypanblau und nur Zellen leben zählen, die nicht gefärbt werden mit Hämozytometer. </li></ol> 3. Phänotypisierung von Splenic Herkömmliche T (T conv) Zellen und T - Zellen reg HINWEIS: Vor Isolierung T reg Zelle, untersuchen den Phänotyp splenic von naiven oder infizierten Mäusen isoliert Lymphozyten durch die Zellen mit verschiedenen Antikörpern Färbung und Durchflusszytometrie sie durch die Strömung zu analysieren. <ol><li> Dann werden 50 &amp; mgr; l der Zellen(5 x 10 5 Zellen) unter insgesamt Milz- Lymphozyten in jede Vertiefung einer neuen U-Boden - 96-Well - Platte und fügen 150 ul Puffer FACS pro Vertiefung. Zentrifuge bei 300 × g für 2 min bei 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen. Rühre das Zellpellet und mit 200 &amp; mgr; l FACS-Puffer pro Vertiefung. Zentrifuge bei 300 × g für 2 min bei 4 ° C (2 mal). </li><li> Bereiten Sie die Antikörper-Cocktail für die Färbung Zelloberflächenmarker in 50 &amp; mgr; l FACS-Puffer pro Vertiefung mit den folgenden Antikörpern und Reagenzien. Anti-CD4 violetten Farbstoff, Anti-CD25 grünen Farbstoff, Anti-PD-1 violetten Farbstoff, Anti-CD8-PerCP Cy5.5 Farbstoff und die Lebensfähigkeit der Zellen Nachweisreagenz nahen Infrarot (IR) fluoreszierenden Reaktivfarbstoff. HINWEIS: Um den Phänotyp von aktivierten T - reg - Zellen zu analysieren, anti-CD103 23,25 kann für Zelloberflächenmarker Färbung hinzugefügt werden. </li><li> Zellpellet mit 50 ul Antikörper-Cocktail pro Vertiefung. Inkubieren für 20 min im Dunkeln bei 4 ° C. Wasche die Zellen zweimal mitFACS-Puffer durch Zentrifugation bei 300 × g für 2 min bei 4 ° C. </li><li> Nach dem letzten Waschschritt, dekantiert den Überstand und fixieren die Zellen für 20 min im Dunkeln bei 4 ° C mit 100 ul Puffer Fixierung hergestellt gemäß dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal mit dem Permeabilisations-Waschpuffer (hergestellt nach dem Protokoll des Herstellers) durch Zentrifugation bei 300 × g für 2 min bei 4 ° C. </li><li> Bereiten Sie die Antikörperlösung für die intrazelluläre Foxp3-Färbung und Zellpellet mit 50 ul Anti-Foxp3 Antikörperlösung. HINWEIS: weiter Um die Phänotypen von T conv und T reg Zellen analysieren, anti-CTLA kann in diesem Schritt hinzugefügt werden. </li><li> Inkubieren für 20 min im Dunkeln bei 4 ° C und wiederholen Sie Schritt 3.6. Nach dem letzten Waschschritt, Resuspendieren des Zellpellets in 200 &amp; mgr; l FACS - Puffer und den Phänotyp der Zellen durch Durchfluss - Zytometer 25 untersuchen. </li><li> Tor der lebenden Zellen population. Um die Phänotypen von T conv Zellen während der LCMV - Infektion CL13 analysieren, untersuchen die Häufigkeit von Foxp3 - PD-1 + Zellen unter CD4 + oder CD8 + T - Zellen. HINWEIS: Basierend auf experimentellen Ergebnissen der Prozentsatz der Foxp3 - PD-1 + mehr als 50% sowohl in CD4 + und CD8 + T - Zell - Populationen mit 16 d pi mit LCMV CL13. <ol><li> Um die Frequenz und Phänotypen von T reg Zellen analysieren, untersuchen Sie die Frequenzen von Foxp3 + oder Foxp3 + PD-1 + Zellen unter CD4 + T - Zellen. HINWEIS: Basierend auf experimentellen Ergebnissen der Prozentsatz der Foxp3 + Foxp3 + bzw. PD-1 + Zellen ist mehr als 20% der CD4 + T - Zellpopulation, respectively. </li></ol></li></ol> 4. Isolierung von CD4 + CD25 + T - Zellen reg HINWEIS: Die Volumina aller Reagenzien unten angegeben sind für eineAusgangszellzahl von 1 x 10 7 gesamt Splenozyten. <ol><li> Bereiten Sie die Zellen, wie in Abschnitt 2 unter Verwendung von naiven und LCMV chronisch infizierten Mäusen beschrieben. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 10 ml der T-Zellisolierungspuffer. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen vollständig und Zellpellet in 40 ul Puffer. </li><li> Für CD4 + T - Zell - Anreicherung der magnetischen Zellseparationssystem, 10 ul Biotin-Antikörper - Cocktail hinzufügen und gut mischen. Inkubieren für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Zugabe von 30 ul Puffer, 20 ul von Anti-Biotin - Mikrokügelchen für die Kennzeichnung von nicht-CD4 + T - Zellen und 10 &amp; mgr; l von CD25-PE - Antikörpers zur Fluoreszenzmarkierung von CD25 + Zellen. Gut mischen und Inkubation für 15 min im Dunkeln. </li><li> 2 ml Puffer und übergeben die Zellen durch ein 40 &amp; mgr; m Zellsieb in ein neues 50 ml Rohrzelltrümmer zu entfernen. Waschen Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C.Überstand verwerfen vollständig und Resuspendieren des Zellpellets in 500 &amp; mgr; l Puffer mit einer Dichte von bis zu 1,25 x 10 8 Zellen. </li><li> Übernehmen Sie die Zellen auf die Säule und sammeln die nicht markierten Zellen, die die Säule passieren. Die Säule wird durch Zugabe von 2 ml Puffer und Zentrifugieren bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen vollständig und Resuspendieren der isolierten CD4 + T - Zellen in 90 ul Puffer. </li><li> Für magnetische Markierung von CD25 + Zellen, mit 10 &amp; mgr; l anti-PE - Mikrokügelchen, gut mischen und bei 4 ° C für 15 min im Dunkeln inkubiert. </li><li> 2 ml Puffer und wasche die Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen vollständig und Resuspendieren des Zellpellets in 500 &amp; mgr; l Puffer mit einer Dichte von bis zu 1 x 10 8 Zellen. </li><li> Um die CD4 + CD25 + T - reg - Zellen anreichern, gelten die Zellen auf die Säule für eine positive Selektion, und waschen Sie die column durch Zugabe von 2 ml Puffer. Wiederholen Sie die Wäsche dreimal. </li><li> Wenn die Säule nach dem letzten Waschschritt leer ist, fügen Sie 1 ml Puffer auf die Säule, und spülen Sie den Kolben der magnetisch markierten CD4 + CD25 + Zellen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4,8-4,9 um die Reinheit der isolierten CD4 + CD25 + T reg Zellen zu verbessern. Waschen der Zellen mit FACS-Puffer durch Zentrifugation bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und Resuspendieren der isolierten CD4 + CD25 + T reg Zellen bei einer Konzentration von 2 x 10 6 Zellen / ml in kompletten RPMI - Medium. </li><li> Um die Reinheit der isolierten CD4 + CD25 + T - reg - Zellen zu überprüfen, können 2 x 10 5 Zellen aus der Summe der isolierten CD4 + CD25 + T - reg - Zellen. Beflecken die Zellen mit 50 &amp; mgr; l FACS-Puffer, enthaltend anti-CD4-FITC und die Lebensfähigkeit der Zellen Nachweisreagenz nahen IR-fluoreszierenden Reaktivfarbstoff. HINWEIS: CD25 wurde bereits mit PE während der Isolierung gekennzeichnet. </li><li> Inkubieren für 20 min im Dunkeln bei 4 ° C. Waschen der Zellen mit FACS-Puffer durch Zentrifugation bei 300 × g für 2 min bei 4 ° C. Nach dem Waschen des Zellpellets in 100 &amp; mgr; l FACS-Puffer resuspendiert und die Reinheit mittels Durchflusszytometrie überprüfen. </li><li> Tor der Live-Zellpopulation. Um die Reinheit von T reg Zellen analysieren, bestätigen den Prozentsatz der CD4 + CD25 + Zellen. HINWEIS: Basierend auf experimentellen Ergebnissen der Prozentsatz der CD4 + CD25 + Zellen unter gereinigter Zellen über etwa 80%. </li></ol> 5. Isolierung von CD8 + T - Zellen und Labeling of CD8 + T - Zellen HINWEIS: Die Volumina aller Reagenzien unten angegeben sind für eine Startzellzahl von 1 x 10 7 Splenozyten insgesamt. <ol><li> Vorbereitung der Zellen, wie in Kapitel 2 unter Verwendung von naiven Mäusen beschrieben. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 10 ml der T-Zellisolations Schwabbelscheibeer. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen vollständig und Zellpellet in 40 ul Puffer. </li><li> Für CD8 + T - Zell - Isolierung der magnetischen Zellseparationssystem, 10 ul Biotin-Antikörper - Cocktail für Nicht-CD8 + T - Zell - Markierung hinzufügen und gut mischen. Inkubieren Sie für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Zugabe von 30 ul Puffer und 20 ul Anti-Biotin-Mikrokügelchen. Gut mischen und Inkubation für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Übernehmen Sie die Zellen auf die Säule und sammeln die nicht markierten Zellen, die die Säule passieren. Die Säule wird durch Zugabe von 2 ml Puffer dreimal. </li><li> Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen vollständig und Resuspendieren der isolierten CD8 + T - Zellen in 2 ml Puffer. </li><li> Um die Reinheit der isolierten Zellen kontrollieren, bereiten 50 ul Antikörperlösung in FACS-Puffer. Resuspendieren der 2 x 10 5 Zellen unter isolierten CD8 + T - cells in 50 ul Antikörperlösung. HINWEIS: Antikörper-Lösung herzustellen, fügen Anti-CD8-FITC, und die Lebensfähigkeit der Zellen Nachweisreagenz (nahen IR-fluoreszierenden Reaktivfarbstoff) in FACS-Puffer. </li><li> Inkubieren für 20 min im Dunkeln bei 4 ° C. Waschen der Zellen mit FACS-Puffer durch Zentrifugation bei 300 × g für 2 min bei 4 ° C. Nach dem Waschen Zellpellet in 100 ul FACS-Puffer, und überprüfen Sie die Reinheit der Zellen mittels Durchflusszytometrie. </li><li> Tor der Live-Zellpopulation. Um die Reinheit von CD8 + T - Zellen zu überprüfen, bestätigen den Prozentsatz der CD8 + T - Zellen. HINWEIS: Basierend auf experimentellen Ergebnissen der Prozentsatz der CD8 + Zellen unter den Zellen gereinigt wird über etwa 90%. </li><li> Hinzufügen PBS zu den isolierten CD8 + T - Zellen. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen. Resuspendieren der isolierten CD8 + T - Zellen in einer Konzentration von 1 x 10 7 Zellen / ml in PBS. </li><li> Um die CD8 + T CE - Kennzeichnunglls für die in vitro - Suppression Assay Zellproliferation Verfolgungs violetten Farbstoff in PBS verdünnen , um eine Konzentration von 5 uM bei RT zu erhalten. HINWEIS: Die ungefähre Anregungs- und Emissionspeaks des Zellproliferation Verfolgungs violetten Farbstoff in der Studie verwendet werden, sind 405 und 450 nm, respectively. </li><li> Gut mischen gleiche Volumina der Zellproliferation Verfolgungs violetten Farbstoff (5 &amp; mgr; M) und der Zellsuspension (1 x 10 7 Zellen / ml von CD8 + T - Zellen) in einem 15 ml - Röhrchen, und Inkubieren bei 20 min bei 37 ° C. Mischen Sie den Schlauch alle 10 min. </li><li> Füllen Sie den Schlauch mit kaltem komplettem RPMI Medien auf, und lassen Sie das Röhrchen für 10 min bei RT. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei RT. Überstand verwerfen vollständig und Resuspendieren der Zellen in einer Konzentration von 2 x 10 6 Zellen / ml mit vorgewärmten RPMI Komplettmedium. Inkubieren der Zellen für 15 min bei RT. </li></ol> 6. Einrichten der In - vitro - Suppression - Test unter Verwendung CD4 + CD25 + T &lt;sub&gt; reg und CD8 + T - Zellen <ol><li> Zur Herstellung von anti-CD3 / CD28-beschichteten Kügelchen, übertragen das entsprechende Volumen von magnetischen Kügelchen auf ein 15 ml Röhrchen (2,5 ul / 1 x 10 5 Zellen). Fügen Sie ein gleiches Volumen von PBS und mischen. Waschen durch Zentrifugation bei 300 g für 2 min bei 4 ° C und den Überstand verwerfen. Verdünnen Sie die magnetischen Kügelchen in komplettem Medium (50 &amp; mgr; l / Well). </li><li> Aliquot von 50 &amp; mgr; l CD4 + CD25 + T reg Zellen pro Vertiefung U-Boden 96-Well - Platte (1 x 10 5 Zellen / Vertiefung). Je 50 ul von CD8 + T - Zellen als Responder - T (T bzw.) Zellen pro Vertiefung (1 x 10 5 Zellen / Vertiefung). In 50 ul des verdünnten anti-CD3 / CD28-beschichteten Kügelchen in pro Vertiefung. HINWEIS: In diesem Schritt Etikett und Kontrollvertiefungen setzen sich wie folgt zusammen : &quot;nicht - stimulierten CD8 + T - Zellen nur&quot; ohne anti-CD3 / CD28-beschichteten Kügelchen; &quot;CD8 + T - Zell - only&quot; mit anti-CD3 / CD28-beschichteten Kügelchen; &quot;CD8 + T - Zellen erst&quot;Mit anti-CD3 / CD28-beschichteten Kügelchen;&quot;. T reg Zelle nur &quot;mit anti-CD3 / CD28-beschichteten Kügelchen T reg Zellen können durch vollständige Medien und co-kultiviert mit T bzw. Zellen in einem anderen Verhältnis von T verdünnt werden , bzw. Zellen: T reg Zellen (1: 0,25-1: 1). </li><li> Zugabe von 50 &amp; mgr; l oder geeigneten Volumen Medium in alle Vertiefungen auf ein Gesamtvolumen von 200 ul. Die Platte mit Folie und Inkubation in einem CO 2 Inkubator bei 37 ° C für 72 Stunden. </li></ol> 7. Analyse der CD8 + T - Zellproliferation und Cytokin - Produktion von CD8 + T - Zellen <ol><li> Für die Cytokinproduktion Analyse nach 3 Tagen Kultur, trennen den Überstand von jeder Vertiefung in eine andere Platte und führen enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). HINWEIS: Der Überstand kann bei -70 ° C aliquotiert und gelagert werden. In diesem Experiment wurde anti-Maus-IFN-γ Antikörper-beschichteten Platte verwendet IFN-γ Produktion Übereinstimmung zu erkennening des Herstellers s Protokoll. Zu IFN-γ Produktion von proliferierenden CD8 + T - Zellen auf einem Einzelzellebene, intrazelluläre Cytokin - Färbung bestimmen kann durchgeführt werden. </li><li> Nach Abtrennen der Überstand aus jeder Vertiefung, waschen Sie die Platte, die Zellen mit FACS-Puffer und Zentrifuge bei 300 g für 2 min bei 4 ° C (3-mal) enthält. </li><li> Nach dem Waschen den Überstand verwerfen. Resuspendieren des Zellpellets mit 50 ul Antikörper - Cocktail für die Färbung von proliferierten CD8 + T - Zellen. Inkubieren für 20 min im Dunkeln bei 4 ° C. HINWEIS: Antikörper-Cocktail vorzubereiten, fügen anti-CD4 FITC, anti-CD8-PerCP-Cy5.5, und die Lebensfähigkeit der Zellen Nachweisreagenz (nahen IR-fluoreszierenden Reaktivfarbstoff) in FACS-Puffer. HINWEIS: Antikörper gegen verschiedene Marker wie CD44 oder CD69 können mit anderen Antikörpern kombiniert werden , um zu bestätigen , Aktivierung von CD8 + T - Zellen. Denken Sie daran , dass CD8 + T - Zellen haben bereits mit der Zellproliferation Tracking v markiert wordenIolet Farbstoff in Schritt 5.10. </li><li> Wasche zweimal durch Zentrifugation bei 300 × g für 2 min bei 4 ° C. Nach dem letzten Waschschritt, den Überstand verwerfen, und fixieren die Zellen für 20 Minuten im Dunkeln bei 4 ° C mit 100 ul Fixierungspuffer. </li><li> Wasche zweimal durch Zentrifugation bei 300 × g für 2 min bei 4 ° C. Die Proliferation der Zellproliferation Verfolgungs violetten Farbstoff-markierten CD8 + T - Zellen mittels Durchflusszytometrie resuspendieren der Zellen mit 200 &amp; mgr; l FACS - Puffer und zu messen. <ol><li> Tor der CD8 + T - Zell - Population unter den lebenden Zellen. Messen Sie die Prozentsätze der geteilten und ungeteilten Zellen gemäß der Verdünnung der Zellproliferation Verfolgungs violetten Farbstoff und CD8 + T - Zell - Verdünnung nach der folgenden Gleichung. Inhibition% = [(% der proliferierten CD8 + T - Zellen in Abwesenheit von T - Zellen reg -% der proliferierten CD8 + T - Zellen in Gegenwart von T reg Zellen) / (% der proliferierten CD8 + T - Zellen indas Fehlen von T reg - Zellen)] x 100. Weitere Analyse der Daten durch die Durchflusszytometrie Software 25 verwendet wird . </li></ol></li></ol>

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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+CD25++regulatory+T+cells+control+the+severity+of+viral+immunoinflammatory+lesions.">CD4+CD25+ regulatory T cells control the severity of viral immunoinflammatory lesions.</a> J Immunol. 172 (7), 4123-4132 (2004).</li><li>Veiga-Parga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+regulatory+T+cells+during+viral-induced+inflammatory+lesions.">On the role of regulatory T cells during viral-induced inflammatory lesions.</a> J Immunol. 189 (12), 5924-5933 (2012).</li><li>Wherry, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signature+of+CD8++T+cell+exhaustion+during+chronic+viral+infection.">Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection.</a> Immunity. 27 (4), 670-684 (2007).</li><li>Jin, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+of+Tim-3+and+PD-1+in+CD8+T-cell+exhaustion+during+chronic+viral+infection.">Cooperation of Tim-3 and PD-1 in CD8 T-cell exhaustion during chronic viral infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14733-14738 (2010).</li><li>Punkosdy, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T-cell+expansion+during+chronic+viral+infection+is+dependent+on+endogenous+retroviral+superantigens.">Regulatory T-cell expansion during chronic viral infection is dependent on endogenous retroviral superantigens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3677-3682 (2011).</li><li>Blackburn, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coregulation+of+CD8++T+cell+exhaustion+by+multiple+inhibitory+receptors+during+chronic+viral+infection.">Coregulation of CD8+ T cell exhaustion by multiple inhibitory receptors during chronic viral infection.</a> Nat Immunol. 10 (1), 29-37 (2009).</li><li>Park, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+upregulated+on+regulatory+T+cells+during+chronic+virus+infection+enhances+the+suppression+of+CD8++T+cell+immune+response+via+the+interaction+with+PD-L1+expressed+on+CD8++T+cells.">PD-1 upregulated on regulatory T cells during chronic virus infection enhances the suppression of CD8+ T cell immune response via the interaction with PD-L1 expressed on CD8+ T cells.</a> J Immunol. 194 (12), 5801-5811 (2015).</li><li>Virgin, H. W., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+chronic+viral+infection.">Redefining chronic viral infection.</a> Cell. 138 (1), 30-50 (2009).</li><li>Penaloza-MacMaster, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+regulatory+T+cells+and+PD-1+in+modulating+T+cell+exhaustion+and+viral+control+during+chronic+LCMV+infection.">Interplay between regulatory T cells and PD-1 in modulating T cell exhaustion and viral control during chronic LCMV infection.</a> J Exp Med. 211 (9), 1905-1918 (2014).</li><li>Chang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+ligase+Peli1+negatively+regulates+T+cell+activation+and+prevents+autoimmunity.">The ubiquitin ligase Peli1 negatively regulates T cell activation and prevents autoimmunity.</a> Nat Immunol. 12 (10), 1002-1009 (2011).</li><li>Krishnamoorthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+infection+with+respiratory+syncytial+virus+impairs+regulatory+T+cell+function+and+increases+susceptibility+to+allergic+asthma.">Early infection with respiratory syncytial virus impairs regulatory T cell function and increases susceptibility to allergic asthma.</a> Nat Med. 18 (10), 1525-1530 (2012).</li><li>Yadav, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-1+distinguishes+natural+and+inducible+regulatory+T+cells+among+regulatory+T+cell+subsets+in+vivo.">Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo.</a> J Exp Med. 209 (10), 1713-1722 (2012).</li><li>Tai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basis+of+CTLA-4+function+in+regulatory+and+conventional+CD4(+)+T+cells.">Basis of CTLA-4 function in regulatory and conventional CD4(+) T cells.</a> Blood. 119 (22), 5155-5163 (2012).</li><li>Rushbrook, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+suppress+in+vitro+proliferation+of+virus-specific+CD8++T+cells+during+persistent+hepatitis+C+virus+infection.">Regulatory T cells suppress in vitro proliferation of virus-specific CD8+ T cells during persistent hepatitis C virus infection.</a> J Virol. 79 (12), 7852-7859 (2005).</li><li>Sekiya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+orphan+receptor+Nr4a2+induces+Foxp3+and+regulates+differentiation+of+CD4.">The nuclear orphan receptor Nr4a2 induces Foxp3 and regulates differentiation of CD4.</a> T cells. Nat Commun. 2 (269), (2011).</li><li>Merianos, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+alloantibodies+induce+a+postnatal+immune+response+that+limits+engraftment+following+in+utero+hematopoietic+cell+transplantation+in+mice.">Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice.</a> J Clin Invest. 119 (9), 2590-2600 (2009).</li><li>Allakhverdi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+CD103+identifies+human+regulatory+T-cell+subsets.">Expression of CD103 identifies human regulatory T-cell subsets.</a> J Allergy Clin Immunol. 118 (6), 1342-1349 (2006).</li><li>Camisaschi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LAG-3+expression+defines+a+subset+of+CD4(+)CD25(high)Foxp3(+)+regulatory+T+cells+that+are+expanded+at+tumor+sites.">LAG-3 expression defines a subset of CD4(+)CD25(high)Foxp3(+) regulatory T cells that are expanded at tumor sites.</a> J Immunol. 184 (11), 6545-6551 (2010).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GARP+selectively+identifies+activated+human+FOXP3++regulatory+T+cells.">Expression of GARP selectively identifies activated human FOXP3+ regulatory T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13439-13444 (2009).</li><li>Myers, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-2-independent+and+TNF-alpha-dependent+expansion+of+Vbeta5++natural+regulatory+T+cells+during+retrovirus+infection.">IL-2-independent and TNF-alpha-dependent expansion of Vbeta5+ natural regulatory T cells during retrovirus infection.</a> J Immunol. 190 (11), 5485-5495 (2013).</li></ol>

S.-J.H. has a patent and receives patent royalties related to the PD-1 pathway. The other authors have no financial conflicts of interest.

Obwohl nur eine kleine Anzahl von T reg Zellen in Mäusen und Menschen vorhanden sind , ist es wichtig , ihre Funktion zu verstehen , wie sie die Immunantwort bei der Regulierung und Aufrechterhaltung der Immuntoleranz eine wichtige Rolle spielen. Die Anzahl und die unterdrückenden Funktionen von T reg Zellen erhöht sich während einer chronischen Virusinfektion 15-20 sowie Krebsprogression 13,14. Dies ist wahrscheinlich aufgrund der fortgesetzten Antigen-Stimulation. Zur Au...

Regulatorische T (T reg) Zellen exprimieren forkhead box P3 (Foxp3) als Transkriptionsfaktor für ihre Entwicklung und Funktion 1. Zusätzlich exprimieren T reg Zellen verschiedene andere Moleküle wie CD25 2, Lymphozytenaktivierung Gen 3 (LAG-3) 3, Glucocorticoid-induzierter Tumor necrosis factor receptor 4 und zytotoxische T-Lymphozyten assoziiertes Protein 4 (CTLA-4) 5 auf ihrer Oberfläche oder intrazelluläre Region. Während einer chronischen Infektion mit verschiedenen Arten von Krankheitserregern wie Viren 6,7, Bakterien 8,9 und Parasiten 10-12, oder im Verlauf der Krebsentwicklung 13,14 geworden T reg Zellen in aktivierten Zellen differenziert, verbesserte Unterdrückungsfunktion anzeigt Targeting - Effektor CD4 + und CD8 + T - Zellen. Eine Reihe von Arbeiten haben vorgeschlagen , dass erweitert und aktivierten T - reg - Zellen auf die Beeinträchtigung der CD8 + T - Zell - respons beitragene während Freund Retrovirus (FV) Infektion 15-17. FV-induzierte T - Zellen hemmen reg IFN-γ oder Granzym B Expression und zytotoxische Reaktivität von CD8 + T - Zellen 15-17. Darüber hinaus wurde in einem Herpes simplex - Virus - Infektionsmodell berichtet geführt , die Depletion von CD4 + CD25 + T - Zellen in reg Expansion der virusspezifischen CD8 + T - Zellen und schwere Gewebeschäden durch Infiltration von immunopathogenen CD4 + T - Zellen 18-20. Mäuse chronisch mit dem 13 - Stamm von lymphatischer choriomeningitis Virusklon infiziert (LCMV CL13) 21-24 haben den Phänotyp und die Funktion der Effektor - T - Zellen (T eff) und T reg Zellen während der chronischen Virusinfektion weit verbreitet zu charakterisieren. Während persistent LCMV - Infektion, Virus-spezifischen T - Zellen eff schrittweise ihre Effektor - Funktion verlieren und erschöpft T (T exh) Zellen werden. Auf der anderen Seite, Treg Zellen verstärken ihre Fähigkeit , 25 Virus-spezifischen T - Zell - Antwort zu unterdrücken. Die Abnahme der Funktionsfähigkeit der T eff Zellen kann durch verschiedene Faktoren wie Aufregulation von inhibitorischen Rezeptoren auf T eff Zellen veränderte Funktion von Antigen-präsentierenden Zellen, die Herstellung von immunregulatorischen Zytokine und erhöhter Frequenz oder verstärkte Funktion von T reg erklärt Zellen 26. Unter den Faktoren , die bei T - Zell - Unterdrückung, den programmierten Zelltod - Protein-1 (PD-1) exprimierenden T exh Zellen und T - reg - Zellen wurden als Kennzeichen der Antigen Persistenz und unterdrückende Umwelt weit betrachtet. Vor kurzem wurde berichtet , dass die Blockade des PD-1 - Weg und Ablation von T reg Zellen verbesserte T - Zell - Funktion führen und Viruslast während LCMV chronischen Infektion 27 verringert. Darüber hinaus werden T reg Zellen während einer chronischen Infektion von Mäusen mit LCMV aktiviert 23,25 </sup&gt; und ihre unterdrückende Funktion 25 verstärkt. PD-1 ist stark auf T - Zellen exprimiert reg sowie T exh Zellen und der Grad der PD-1 durch T - Zellen exprimiert reg korreliert mit der Stärke ihrer suppressive Funktion T - Zell - Proliferation 25 zu hemmen. Hier beschreiben wir ein Verfahren mit den Merkmalen von aktivierten T - reg - Zellen von Mäusen , infiziert mit LCMV CL13 und ruhenden T reg Zellen isoliert aus naiven Mäusen isoliert zu vergleichen. Weiterhin erläutern wir eine Reihe von Prozessen aktiviert T reg Zellen zu trennen und ihre ex vivo Phänotyp zu untersuchen, sowie ihre suppressive Aktivität in vitro zu messen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="976">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">FITC Rat Anti-Mouse CD4</td>
			<td style="width:67px;">RM4-5</td>
			<td style="width:173px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:104px;">553047</td>
			<td style="width:249px;">Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytofix/Cytoperm</td>
			<td></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>Use this reagent for cell surface staining.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">U-Bottom Tissue Culture Plates</td>
			<td></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fixation buffer</td>
			<td></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td align="right">554655</td>
			<td>Use this reagent for cell surface staining.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC Rat Anti-Mouse CD25</td>
			<td>7D4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553072</td>
			<td>Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell strainer, 70mm</td>
			<td></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352350</td>
			<td>Use this strainer for grinding the whole spleen.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell strainer, 40mm</td>
			<td></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352340</td>
			<td>Use this strainer for filtering the cells before column enrichment.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1)</td>
			<td>29F.1A12</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>135217</td>
			<td>Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4</td>
			<td>RM4-5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td align="right">100547</td>
			<td>Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC Anti-Mouse/Rat Foxp3&#160;</td>
			<td>FJK-16s</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-5773</td>
			<td>Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td></td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a</td>
			<td>53-6.7</td>
			<td>eBiosicence</td>
			<td>45-0081</td>
			<td>Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse IFN-gamma Platinum ELISA</td>
			<td></td>
			<td>eBiosicence</td>
			<td>BMS606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640</td>
			<td></td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>SH30027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS (1X)</td>
			<td></td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>SH30256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td></td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine, 200mM solution</td>
			<td></td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin, 10,000U/mL</td>
			<td></td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit</td>
			<td></td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L-34975</td>
			<td>Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 500X in FACS buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse</td>
			<td></td>
			<td>Miltenyibiotec</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse</td>
			<td></td>
			<td>Miltenyibiotec</td>
			<td>130-091-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACS Separation Columns, LD columns</td>
			<td></td>
			<td>Miltenyibiotec</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td>Use this column for Treg cell isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACS Separation Columns, LS columns</td>
			<td></td>
			<td>Miltenyibiotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Use this column for CD8+ T cell and Treg cell isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA, 0.5M (pH 8.0)</td>
			<td></td>
			<td>Promega</td>
			<td>V4231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td></td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30919.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTrace Violet Cell Proliferation Kit</td>
			<td></td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Canto II flowcytometer</td>
			<td></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer*</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flowjo</td>
			<td></td>
			<td>TreeStar</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometry software&#8224;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hematocytomer</td>
			<td></td>
			<td>Marienfeld superior</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phenotypic and functional analysis of activated regulatory t cells isolated from chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice

Regulatory T (T reg) Zellen, die Foxp3 als Transkriptionsfaktor exprimieren, sind Untergruppen von CD4 + T - Zellen. T reg - Zellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Immuntoleranz und Homöostase Wartung durch die Immunantwort regulieren. Die primäre Rolle der T reg Zellen ist , die Proliferation von Effektor - T (T eff) Zellen und die Produktion von Zytokinen wie IFN-γ, TNF-α und IL-2 zu unterdrücken. Es wurde gezeigt , dass T reg Zellen die Fähigkeit , die Funktion von T - Zellen zu hemmen eff während persistent Pathogen - Infektion und der Entwicklung von Krebs verbessert. Um die Funktion von T reg Zellen unter ruhenden oder entzündeten Bedingungen, die eine Vielzahl von in - vitro - Unterdrückung Tests unter Verwendung von Maus oder humanen T - reg - Zellen klären entwickelt worden. Das Hauptziel dieser Studie ist es, ein Verfahren zu entwickeln , um die Unterschiede im Phänotyp und unterdrückende Funktion zwischen ruhenden und aktivierten T reg zu vergleichenZellen. Um aktivierten T - reg - Zellen wurden die Mäuse infiziert mit lymphatischer choriomeningitis Virus (LCMV) Klon 13 (CL13), eine chronische Belastung von LCMV isolieren. T reg Zellen aus der Milz von LCMV CL13-infizierten Mäusen isoliert zeigten sowohl die aktivierten Phänotyp und verbesserte suppressive Aktivität gegenüber T - Zellen aus naiven reg Mäusen isoliert ruht. Hier beschreiben wir die Basisprotokoll für ex vivo - Phänotyp - Analyse aktivierten T - reg - Zellen unterscheiden von T reg ruhenden Zellen. Weiterhin beschreiben wir ein Protokoll für die Messung der suppressive Aktivität von vollständig aktivierten T reg Zellen.

Wir erzeugten Mäuse mit persistenten Virusinfektion , indem sie mit 2 × 10 6 pfu von LCMV CL13 intravenös injiziert wird . Um die phänotypische Veränderungen in T reg Zellen und T conv Zellen während der chronischen Virusinfektion, Milzlymphozyten erhalten von naiven und infizierten Mäusen wurden gefärbt mit verschiedenen Antikörpern und analysiert mittels Durchflusszytometrie untersucht. CD4 + T conv (1A, o...

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Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from na&#239;ve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

Die phänotypische und funktionale Analyse von aktivierten regulatorischen T-Zellen isoliert von chronischer lymphatischer Choriomeningitisvirus-infizierte Mäuse

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

phenotypic-functional-analysis-activated-regulatory-t-cells-isolated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.7K Aufrufe.  Yonsei University. Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from naïve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

Serie: Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

Generation der induzierte regulatorische T-Zellen aus primären humanen naiven und Gedächtnis-T-Zellen

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Forschung

Immunologie und Infektion

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

Neue Tools erweitern regulatorischen T-Zellen von HIV-1-infizierten Personen

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative neurology. This directive has arisen from the extensive evidence that brain repair is achieved after focal or systemic NPC transplantation in several preclinical models of neurological diseases.
These experimental data have identified the cell delivery route as one of the main hurdles of restorative stem cell therapies for brain diseases that requires urgent assessment. Intraparenchymal stem cell grafting represents a logical approach to those pathologies characterized by isolated and accessible brain lesions such as spinal cord injuries and Parkinson's disease. Unfortunately, this principle is poorly applicable to conditions characterized by a multifocal, inflammatory and disseminated (both in time and space) nature, including multiple sclerosis (MS). As such, brain targeting by systemic NPC delivery has become a low invasive and therapeutically efficacious protocol to deliver cells to the brain and spinal cord of rodents and nonhuman primates affected by experimental chronic inflammatory damage of the central nervous system (CNS).
This alternative method of cell delivery relies on the NPC pathotropism, specifically their innate capacity to (i) sense the environment via functional cell adhesion molecules and inflammatory cytokine and chemokine receptors; (ii) cross the leaking anatomical barriers after intravenous (i.v.) or intracerebroventricular (i.c.v.) injection; (iii) accumulate at the level of multiple perivascular site(s) of inflammatory brain and spinal cord damage; and (i.v.) exert remarkable tissue trophic and immune regulatory effects onto different host target cells in vivo.
Here we describe the methods that we have developed for the i.v. and i.c.v. delivery of syngeneic NPCs in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), as model of chronic CNS inflammatory demyelination, and envisage the systemic stem cell delivery as a valuable technique for the selective targeting of the inflamed brain in regenerative neurology.

The transplantation of neural stem/progenitor cells (NPCs) holds great promises in regenerative neurology. The systemic delivery of NPCs has turned into effective, low invasive, and therapeutically very efficacious protocol to deliver stem cells in the brain and spinal cord of rodents and nonhuman primates affected by experimental chronic inflammatory damage of the central nervous system.

Die systemische Injektion von Neural Stem / Progenitor-Zellen in Mäusen mit chronischer EAE

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

Ableitung von T-Zellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Aus embryonalen Stammzellen der Maus

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Generation of Human Alloantigen-spezifischen T-Zellen aus peripherem Blut

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Lymphocyte Isolierung von menschlicher Haut für phänotypische Analyse und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Zellkultur

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

T-Zellen erfassen Bakterien durch Transinfection von dendritischen Zellen

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with respect to how viral members of the microbiome affect subsequent microbe interactions with these virus-infected host cells. The co-habitation of virus with bacteria and fungi is principally present on the mucosal surfaces of the oral cavity and genital tract. Mucosal cells, particularly those with persistent chronic or persistent latent viral infections, could have a significant impact on members of the microbiome through virus alteration in number and type of receptors expressed. Modification in host cell membrane architecture would result in altered ability of subsequent members of the normal flora and opportunistic pathogens to initiate the first step in biofilm formation, i.e., adherence. This study describes a method for quantitation and visual examination of HSV&#39;s effect on the initiation of biofilm formation (adherence) of S. aureus and C. albicans.

A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.

Bestimmung von Biofilm Initiation auf Virus-infizierte Zellen durch Bakterien und Fungi

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...

Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the allograft early after transplantation, mount a graft reactive response against the transplanted organ, and initiate organ rejection2. Recent data suggest that suppressive macrophages facilitate successful long-term transplantation3 and are required for the induction of transplantation tolerance4. This suggests a multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation, and function, which demands a new roadmap for the isolation and analysis of macrophage function5. Due to the plasticity of macrophages, it is necessary to provide a methodology to isolate and characterize macrophages, depending on the tissue environment, and to define their functions according to different scenarios. Here, we describe a protocol for immune characterization of graft-infiltrating macrophages and the methods we used to functionally evaluate their capacity to inhibit CD8+ T proliferation and to promote CD4+Foxp3+ Treg expansion in vitro.

Macrophages are plastic cells of the hematopoietic system that have a crucial role in protective immunity and homeostasis. In this report, we describe optimized in vitro techniques to phenotypically and functionally characterize graft-infiltrating regulatory macrophages that accumulate in the transplanted organ under tolerogenic conditions.

Funktionelle Charakterisierung von regulatorischen Makrophagen, die eine pfropfreaktive Immunität hemmen

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.