We thank Julie R. Perlin for helpful comments on the manuscript. D.I.S. is supported by grants from the American Society of Hematology, the Cooley's Anemia Foundation, and the NIH (K01DK085217 and R03DK100672). E.J.H. is a Howard Hughes Medical Institute Fellow of the Helen Hay Whitney Foundation. B.L. is a Howard Hughes Medical Institute Medical Research Fellow. B.W.B. is supported by an Irvington Fellowship from the Cancer Research Institute and a Young Investigator Award from the Conquer Cancer Foundation of ASCO. L.I.Z. is supported by grants from the NIH (R01CA103846, P01HL032262, and R01HL04880), Taub Foundation for MDS Research, Harvard Stem Cell Institute, and is an investigator of the Howard Hughes Medical Institute.

Bu protokol, Boston Çocuk Hastanesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. Bu protokol daha önce yayınlanan bir yöntem 15 ile modifiye edilir. Reaktiflerin 1. Hazırlık (Peşin gün veya hafta) <ol><li> % 1.5 agaroz kaplı yemekler hazırlayın. Bir Erlenmeyer şişede 100 mi balığı E3 orta 1.5 g agarozun ekleyin. Isı, agaroz erimesi ve daha sonra yaklaşık 5 ml 100 mm çapında x 20 mm derinlik petri içine dökün. Not: Bu embriyoların dechorionation için kullanılan (3.1 Adım) ve Parabiyotik cerrahi için (3.3 Adım) vardır. Birkaç hafta boyunca 4 ° C &#39;de agaroz kaplanmış yemekler saklayın; buzdolabı üzerinden onları almak ve sıcak Parabiyotik ameliyat günü sabahı RT için. </li><li> % 4 metil selüloz hazırlayın. Bir karıştırma çubuğu olan bir Erlenmeyer şişesi içinde E3, 100 ml metil selüloz tozu, 4 g çözündürülür. en düşük hıza ayarlanmış 4 ° C&#39;de bir şişeyi çalkalama levhasının üzerine, koyun ve karıştırın izinen fazla 2 gün ısıtıldı. <ol><li> Aralıklı metil selüloz beyaz öbekler kırmak için bir spatula kullanın. metil selüloz kristaller tam bu konsantrasyonda çözünmez. Çözelti berrak hale gelir ve hiçbir beyaz topaklar, tablet, uzun süreli depolama için -20 ° C&#39;de 1.5 mi mikrofüj tüplerine çözeltisi ve dondurma kalan homojen görünür. Not: metil selüloz düşük konsantrasyonlar kullanılabilir; Bununla birlikte, bu daha yüksek bir yüzdesi, daha viskoz metil selüloz, en iyi sonuçları vermiştir. </li></ol></li><li> Yüksek Kalsiyum Ringer (HCR) çözeltisi hazırlayın. (5 M NaCl, 8 ml (116 mM son), 3M KCI 400 ul (2.9 mM nihai), 1 M HEPES 5M CaCl2 (10 son mM) ve 2 ml 800 ul karışımı, 5 HCR çözeltisi 400 ml yapmak için E3 medya 390 ml mM nihai). Not: Bir kaç hafta boyunca 4 ° C&#39;de saklayın HCR çözümü; Parabiyotik Ameliyat günü sabahı RT sıcak. </li><li> transfer için 6 modifiye Pasteur pipetler - 5 hazırlayınBlastula çiftleri halka. Kısaca Bunsen beki üzerinde pipet ucunu ısıtın. hala sıcakken sonra, geniş bir forseps kullanılarak, yaklaşık 45 ° C&#39;ye kadar pipet ucu bükümü. <ol><li> , Embriyoların zarar yaklaşık 3 saniye alev kısaca pipet ucu tutabilir keskin kenarlar olmadığından emin olmak için. Bu pipet sonu / cila pürüzsüz olacaktır. Bu modifiye edilmiş cam Pasteur pipeti aşağıdaki Aşama 3.5 10 ml pipet pompası (Şekil 1) ile bağlantılı olarak kullanılır. </li></ol></li><li> blastula çiftlerinin cerrahi dikiş için cam iğne araçları hazırlayın. zebra balığı embriyolarının mikroenjeksiyon için yapıldığı gibi 3 cam iğneler - 2 çekin. Bir odun ya da plastik saplı alay iğne (Şekil 1A) sonuna kadar her bir cam iğne düzeltmek için laboratuvar filmi kullanın. 30 mikron - forseps kullanarak, yaklaşık 20 çapında iğnenin ucunu kesiyorum. Bu adımı (Şekil 1B) yönlendirmek için bir sahne mikrometre kullanın. Not: Ne boyutunuEdle ucu önemlidir. ucu çok büyükse o tam olarak kontrol etmek zorlaşır ve aşırı hasara neden olabilir. ucu çok küçükse yeterince embriyo yara çok zordur. </li></ol> 2. (Gün 0 Günü -1) Embriyolar Zebra balığı ve Toplama Damızlık Çiftler ayarlama <ol><li> Yetişkin zebrafish üreyen ayarlayın. parabiyoz ameliyatı yapılacak olan gece önce balık ayarlayın. erkek ve kadın ayrı bölücüler kullanın. İstenilen embriyolar elde her satırın birkaç çift kurulacak oran artırmak için. çiftlerinin% 50 doğacaktır - Biz genellikle 20 olduğunu bulmak. </li><li> Ertesi sabah, bölücüler çekin ve çiftleşme izin verir. Bir ince gözenekli çay süzgeci kullanarak herhangi bir embriyolar toplayın, sonra E3 embriyo orta 18 içeren Petri aktarabilirsiniz. </li><li> Istenildiği gibi embriyolar mikro enjekte (örneğin, 25 ug plasmid DNA, ya da 1 ile 200 ug mRNA ile - 6 ng morfolino) toplama 1 saat içerisinde. Onları izin256 hücre aşamasına kadar büyür. DNA ekspresyon yapısı, bir ısı şoku promotör kontrolü altına yerleştirildiği (örneğin, HSP70, Şekil 4B), (daha sonraki bir aşamada, 37 ° C&#39;de parabionts şok ısı ile gen ifadesinin zamanlaması kontrol örn., 36 hpf ). Not: bir flüoresan transgen bir alternatif, floresan dekstran (2 mg / ml&#39;de, örneğin, dekstran, çağlayan mavisi), DNA, RNA, veya morfolino enjeksiyon karışımına ilave edilebilir zamanda. dekstran boya normal gelişim engel olmaz ve enjekte embriyo Parabiyotik füzyon sonra uygun floresan ışığı altında tespit edilmesi için izin verecektir. Seçenek olarak ise, bir pigmentsiz suş ile pigmentli bir soyunun parabiyoz (örneğin, AB) (örneğin, Casper) sonraki aşamalarda enjekte embriyo tanımlamak için kullanılabilir. </li><li> periyodik olarak kendi gelişimini izlemek için 28.5 ° C.Use bir Stereoskop embriyolar inkübe 256 hücre dev yakın onlarelopmental aşama (yaklaşık 2,5 hpf). Not:. Gerekirse morfolino enjekte embriyolar yer alırken, Parabiyotik ortakları (örneğin, morfolino enjekte embriyolar genellikle un enjekte muadillerine göre daha yavaş geliştirmek RT un enjekte embriyolar Shifting arasındaki sahne eşleştirme sağlamak için farklı sıcaklıklara embriyolar vardiya 28,5 ° C&#39;de bir gelişim birkaç saat sonra) hizalama aşamalarına neden olur. </li></ol> Blastulae Gelişmekte Cerrahi Fusion tarafından Parabiyotik Zebra balığı Embriyolar 3. Nesil <ol><li> Embriyolar 256 hücre aşamasına (yaklaşık 2.5 HPF) yaklaştıkça, ayrı agaroz kaplı tabaklar (morfolino örneğin, bir çanak her bir genetik arka plan (yani, genetik mutant transgenik kuşaklar ve / veya genetik manipülasyon) için embriyo transferine enjekte edilen embriyoların ve kontrol embriyoları için ikinci bir tabak). Alternatif, çizilmeye ücretsiz cam beher veya cam Petri kapları temizlemek için embriyolar transfer. Not: embriyolar plastik sopa ve chorions dışarı kez zarar olarak kaplanmamış plastik yemekleri kullanmaktan kaçının. </li><li> (- 10 ml, yaklaşık 7) yeterli sıvı embriyoların kapsayacak şekilde kalana kadar E3 medya süzün. 50 mg / Streptomyces griseus (proteazlar) hücre dışı sıvıdan izole proteaz mi karışımına 200 ul ekle. nazikçe embriyoların her birkaç dakikada bir girdap. <ol><li> Embriyoların% 50 genellikle 5 sürer kendi chorions, dışarı gelmiş olduğunda - taze E3 embriyo orta - (20 ml yaklaşık 15) 10 dk, cömert bir hacim ile onları üç kez yıkayın. <ol><li> onları hafifçe giderilmesinde sonra yavaşça modifiye cam Pasteur pipeti içine hazırlanması ve kendi chorions kalan tüm embriyolar Dechorionate. Embriyolar dechorionated ve yıkanmış edildikten sonra, HCR çözümü ile E3 ortamı değiştirin. proteazlar alternatif olarak, el ile ince forseps kullanılarak chorions çıkarın. 100 dechor - 60 var hedefliyoruzHer deneysel koşul için uygun ionated embriyolar. Not: Bu sonuçta kullanılacak kat daha fazla birkaç, ancak birçok embriyolar ele ya da parabiyoz için ameliyat sırasında hasar olması muhtemeldir. Embriyolar dechorionated sonra, onları batık tutmak ve yüzey gerilimi onları imha edilmesine neden olacak gibi onları su yüzeyine dokunmamaya izin vermeyin. proteazlar yüksek doz kullanılarak embriyolar er kendi chorions çıkıp bir daha senkronize bir şekilde gelmesini sağlar unutmayın. proteazlar daha düşük bir dozda kullanıldığında, embriyolar chorions çıkmaya daha uzun sürer ve proteazlar uzun süre maruz kalma sonucu zarar gördüğü embriyoların bir kısmına neden olabilecek daha az uyumlu bir şekilde, çok yok. </li></ol></li></ol></li><li> Embriyoların hasar ya da yumurta sarısı yırtılacaktır, çözünmemiş kristallerin pelet, 10 dakika boyunca maksimum hızda bir masaüstü santrifüj (yukarıdaki Aşama 1.2&#39;de) metilselüloz ve santrifüj çözülmes. <ol><li> Santrifüj işleminden sonra, berrak üst kısmını (hacminin yaklaşık% 75) kullanır. Aktarım 1 -% 1.5 agaroz kaplı Petri kabı içine metil selüloz 1.5 cm çaplı bir düşer. tüpün dibinden pelet kristaller herhangi hazırlanması önlemek için özen gösterin. </li><li> çanak alt tarafında her damla konumunu önceden belirlemek için işaretleyici kullanın. 100 mm çaplı petri başına metil selüloz - (3 alikotları &#39;değerinde 2) 15 damla - 12 yerleştirin. Deneme başına gerektiği kadar tabak hazırlayın. Not: Tek Blastula çiftinin füzyon için her damla kullanın. mark medya katma de hangi nokta damla neredeyse görünmez hale kez her damla yerini tayin edecektir. </li></ol></li><li> Adım 3.3 yukarıda hazırlanan agaroz kaplı çanak başına antibiyotik takviye HCR çözümün bir 40 ml kısım hazırlayın. HCR her biri 40 mi kana 0.5 ug 50 U / ml, 50 U / ml ampisilin ve kanamisin penisilin-streptomisin ilave/ Ml olmuştur. <ol><li> Hazır Blastula füzyonlarının gerçekleştirmek için zaman, dikkatli bir şekilde, antibiyotik ile takviye HCR çözeltisi 40 ml metil selüloz damlacıkları içeren tabakların her birine doldurun. HCR çözeltisi çok hızlı bir şekilde ilave edilir, bu damlacıklar bozabilir. </li></ol></li><li> 10 ml&#39;lik pipet pompasına (yukarıdaki adım 1.4&#39;de yapılan) modifiye cam Pasteur pipeti takın. Bir Stereoskop altında her arka plan (örneğin, bir morfolino enjekte embriyo ve bir vahşi tip embriyo) dan bir dechorionated embriyo toplamak. <ol><li> iki embriyo dağıtım önce, sonra yavaşça, metil selüloz damla ortasında küçük bir depresyon yapmak için Pasteur pipet kullanın depresyon içine hem embriyolar mevduat. Not: yol açabilir pipet üst veya alt kısmında sıvı yüzeyi ile kendi yapım teması (önleyecek şekilde aktarma işlemi sırasında, hafifçe yukarı embriyolar Pasteur pipeti viraj içine yerleşmek, böylece Pasteur pipeti çevirin thei içinr rüptürü). </li></ol></li><li> , Hayvan kutupları ile doğrudan olarak hemen metil selüloz embriyolar saklandıktan sonra, dikkatli bir şekilde metil selüloz olan embriyolar yeniden konumlandırmak için son (Şekil 1A) bir jel yükleme pipet ucu ile odun ya da plastik saplı alay iğne kullanmak şekilde birbirlerine dokunmadan. <ol><li> doğrudan onlara dokunmadan onları yeniden konumlandırmak için embriyolar metil selüloz yakın yoluyla nazik süpürme hareketleri yararlanın. metil selüloz etraflarında yerleşmek böylece embriyolar 5 dakika bekletin. Bu süre zarfında, başka damla içine sonraki çifti yükleyin. Not: embriyoların doğrudan temas etmeyin ve kolayca rüptüre olur yumurta sarısının, herhangi bir bölümünü dokunmamaya özel özen gösterin. </li></ol></li><li> Cam iğne aracını kullanarak, dikkatli temas onların noktada her bir embriyo yara. yumuşak dikiş hareketi ile, ilk embriyo hücreleri tekrar ikinci embriyo içine çekilir ve edilebilir.Bu hareketin sonunda, 2 iğneyi yerinde tutun - 3 saniye sonra çok yavaş uzak çizin. Not: yaklaşık 2 dönemi vardır - iki dokular daha yapışkan ve birbirlerine takmak için daha muhtemel gibi görünüyor nerede embriyolar yaralı sonra 3 sn. Böylece, kısaca yaralama sonra iğneyi yerinde tutarak hemen yaralama sonra zaman ilk dönem için temas halinde her embriyo yaralı dokuların tutmaya yardımcı olduğuna inanıyorum. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika - bu embriyolar, 10 bekletin. Bu arada, metil selüloz diğer damla yeni çiftleri dikiş devam ediyor. 10 Sonra - 15 dakika, ilk çifti ekli (Şekil 2A) kalmıştır olup olmadığını değerlendirmek. Not: embriyolar daha bağlıysa, sürece embriyolar% 30 epiboly sahne etrafında daha genç olduğu gibi için dikiş işlemini tekrarlayın. üç denemeden kadar birlikte embriyoların dikiş için genellikle bu izin verir. Embriyolar bir eki ama c korumuştur görünüyorsaonnection değil önemli olan, bunu güçlendirmek için bağlantı kenarında ek dikiş gerçekleştirin. sallayarak veya Parabiyotik cerrahi ve inkübasyon dönemlerinde yemekleri hareketli kaçının. Not: erken gelişim aşamasında ve algılanan kırılganlık rağmen, embriyoların hücre kütleleri manipülasyon önemli bir miktar (yani, yaralama ve dikiş) tahammül ve hala normal gelişebilir. yumurta sarısı, ancak embriyo öldürme, sadece ufak bir dokunuş ile bozulabilir. cam iğne ile iki blastulae dikerken, her embriyonun hücre kütlesi ve yumurta sarısı arasında bir arayüz ile temas kurmaya yok. </li><li> Aynı yemeğin ve medya (ortam değişmez) 28.5 ° C embriyolar O / N inkübe edin. Ertesi sabah tarafından, embriyolar çoğu çözülmüş metil selüloz damlacıklarının dışarı taşımış olacaktır. başarıyla erimiş değil tüm embriyolar çıkarın. medyayı Durusu ve taze bir 25 ml E3 ile değiştirin. Not: ile çalışma durumundaPigmentli soyu, pigmentasyon engellemek için% 0.003 nihai konsantrasyon 500 ul% 0.15 (50x) feniltiyoüre (PTU) ekleyin. Embriyolar pigmentasyon bastırılmasını sağlamak için PTU sürekli kalması gerekir. </li></ol> 4. Mikroskop Kurulum, Görüntü Alma, İşleme ve Analizi <ol><li> % 0.8 düşük erime noktası (LMP) agaroz hazırlayın: tamamen çözünene dek 0.8 g agarozun 100 mi E3 LMP ve ısıtılır. sıcakken, kısım agaroz 37 ° C bir ısıtma bloğu içinde 1.5 mi mikrofüj tüplerine LMP 1 mi. LMP agaroz, 37 ° C&#39;de, erimiş kalır. agaroz, 37 ° C &#39;de, 4 mg / ml (25x), pH LMP her biri 1 mi kısım 7.0 tricaine 40 ul ekle. Not: Bir pigmentli suşu ile çalışan, her 1ml kana% 0.15 (50x) PTU 20 ul ekleyin. <ol><li> 4 ° C&#39;de mühürlü 50 ml tüpler birkaç ay için kalan LMP agaroz saklayın. </li></ol></li><li> Parabiyotik embriyolar anestezisi 4 mg / ml 1 ml (25x), pH 7.0 tricaine eklenerek yansımasıE3 25 ml embriyo zaten olduğu. </li><li> Embriyolar ortada havuz olacak şekilde hafifçe çanak girdap. Sonra, geniş uçlu plastik transfer pipet kullanarak mümkün olduğunca az sıvı embriyoların hazırlar. dik pipet çevirin ve pipet çok dibe şekilde hafifçe embriyolar sıçrama. <ol><li> Pipet altındaki embriyolar ile hafifçe agaroz yüzeyine pipet dokunarak LMP agaroz 1 mi tümböleni aktarın. agaroz sulandırmak bu kadar fazla sıvıyı transfer kaçının. </li></ol></li><li> pipet fazla sıvıyı attıktan sonra, yavaşça, 6- ardından, agaroz içinde embriyo karıştırın cam alt kuyu (No 1.5 lamel) için agaroz ve embriyo tüm aktarmak için pipet kullanmak için pipet kullanın iyi plaka. Not: Görüntüleme plakasına embriyolar aktardıktan sonra pipet atmak için emin olun. Kalıntı agaroz pipet içine koyacaktır, rendering bir sonraki aşama için etkisiz. Aksine, yeni bir pipet her zaman kullanın. </li><li> Bir Stereoskop altında, aşağı cam kapak doğru embriyoları yerleştirmek için ahşap saplı alay iğnenin ucunda sabit bir jel yükleme pipet kullanın (onlar mikroskop objektif çalışma mesafesi sağlamak için) ve istenilen yönde görüntüleme için. Not: Agaroz tamamen belirledi kadar sürekli yerleştirin. çiftin hangi embriyonun göre Parabiyotik embriyolar monte etmeye özen görüntülü olmaktır. Yapışık embriyoların rastgele yönünü göz önüne alındığında, bir çiftleri için her iki embriyolar görüntü zor olabilir. Bu senaryoda, bir forseps ve geniş uçlu plastik transfer pipet kullanarak agaroz embriyolar kurtarmak ve daha sonra farklı bir bakış açısıyla görüntüleme için yeniden bağlayın. </li><li> tricaine (ve PTU gerekirse) ile takviye edilmiş E3 3 ml - agaroz donduktan sonra, 2 ile kaplayın. </li><li> , Las ters geniş bir alan epi-floresan kullanarak görüntü embriyolarkonfokal er-tarayarak veya disk konfokal mikroskop iplik. İstenen görüntüleme için en uygun hedefi seçin. görünümünde bir bütün embriyo alanı için, bir 4x objektif kullanımı. Görüntü, bir 20x objektif olarak, belirli bir doku 16, 19 daha yüksek bir büyütme seçin. Not: dik bir mikroskop kullanıyorsanız, bir cam kapak kayma (yukarıda benzer) LMP agaroz monte edilir. Aynı E3-tricaine-PTU 16, 19 ile doldurulmuş vakum gres bir halka sahip bir cam mikroskop lamı üzerine cam lamel ters çevirin. </li><li> Süreç böyle NIH Image J / FIJI 16, 19 olarak ücretsiz görüntü analiz yazılımı paketleri kullanarak görüntüleri satın aldı. Not: hücre sayıları Sayısı ve hücre göçü ve hücre bölünmesi segmentasyon kullanarak ve algoritmaları 16, 19 izleme olarak dinamiklerini ölçmek. </li></ol>

<ol>
	<li>Zon, L. I., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoiesis:+An+evolving+paradigm+for+stem+cell+biology.">Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology.</a> Cell. 132 (4), 631-644 (2008).</li><li>Dzierzak, E., Speck, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+lineage+and+legacy:+the+development+of+mammalian+hematopoietic+stem+cells.">Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells.</a> Nat Immunol. 9 (2), 129-136 (2008).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epoxyeicosatrienoic+acids+enhance+embryonic+haematopoiesis+and+adult+marrow+engraftment.">Epoxyeicosatrienoic acids enhance embryonic haematopoiesis and adult marrow engraftment.</a> Nature. 523 (7561), 468-471 (2015).</li><li>Tam, P. P., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+embryonic+chimeras:+tools+for+studying+mammalian+development.">Mouse embryonic chimeras: tools for studying mammalian development.</a> Development. 130 (25), 6155-6163 (2003).</li><li>Tanaka, M., Gertsenstein, M., Rossant, J., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mash2+acts+cell+autonomously+in+mouse+spongiotrophoblast+development.">Mash2 acts cell autonomously in mouse spongiotrophoblast development.</a> Dev. Biol. 190 (1), 55-65 (1997).</li><li>Morin-Kensicki, E. M., Faust, C., LaMantia, C., Magnuson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+requirements+for+the+gene+eed+during+mouse+gastrulation+and+organogenesis.">Cell and tissue requirements for the gene eed during mouse gastrulation and organogenesis.</a> Genesis. 31 (4), 142-146 (2001).</li><li>Ho, R. K., Kane, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+action+of+zebrafish+spt-1+mutation+in+specific+mesodermal+precursors.">Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors.</a> Nature. 348 (6303), 728-730 (1999).</li><li>Parker, L., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+and+non-autonomous+requirements+for+the+zebrafish+gene+cloche+in+hematopoiesis.">Cell-autonomous and non-autonomous requirements for the zebrafish gene cloche in hematopoiesis.</a> Development. 126 (12), 2643-2651 (1999).</li><li>Liao, E. C., Trede, N. S., Ransom, D., Zapata, A., Kieran, M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-cell+autonomous+requirement+for+the+bloodless+gene+in+primitive+hematopoiesis+of+zebrafish.">Non-cell autonomous requirement for the bloodless gene in primitive hematopoiesis of zebrafish.</a> Development. 3 (3), 649-659 (2002).</li><li>Kamran, P., Sereti, K. I., Zhao, P., Ali, S. R., Weissman, I. L., Ardehali, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parabiosis+in+mice:+a+detailed+protocol.">Parabiosis in mice: a detailed protocol.</a> J Vis Exp. (80), (2013).</li><li>Wagers, A. J., Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Little+evidence+for+developmental+plasticity+of+adult+hematopoietic+stem+cells.">Little evidence for developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells.</a> Science. 297 (5590), 2256-2259 (2002).</li><li>Hervey, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+lesions+in+the+hypothalamus+in+parabiotic+rats.">The effects of lesions in the hypothalamus in parabiotic rats.</a> J. Physiol. 145 (2), 336-352 (1959).</li><li>Goldman, D. C., Bailey, A. S., Pfaffle, D. L., Al Masri, A., Christian, J. L., Fleming, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP4+regulates+the+hematopoietic+stem+cell+niche.">BMP4 regulates the hematopoietic stem cell niche.</a> Blood. 114 (20), 4393-4401 (2009).</li><li>Dieterlen-Li&#232;vre, F., Martin, C., Beaupain, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quail-chick+chimaeras+and+parabionts:+several+new+models+to+investigate+early+developmental+events+in+the+haemopoietic+system.">Quail-chick chimaeras and parabionts: several new models to investigate early developmental events in the haemopoietic system.</a> Folia Biol (Praha). 25 (5), 293-295 (1979).</li><li>Demy, D. L., Ranta, Z., Giorgi, J. M., Gonzalez, M., Herbomel, P., Kissa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+parabiotic+zebrafish+embryos+for+cell+migration+and+homing+studies).">Generating parabiotic zebrafish embryos for cell migration and homing studies).</a> Nat. Methods. 10 (3), 256-258 (2013).</li><li>Anderson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+develop+the+absence+of+endothelial+cadherin+5+expression.">Hematopoietic stem cells develop the absence of endothelial cadherin 5 expression.</a> Blood. 126 (26), 2811-2820 (2015).</li><li>Murayama, E., Sarris, M., Redd, M., Le Guyader, D., Vivier, C., Horsley, W., Trede, N., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NACA+deficiency+reveals+the+crucial+role+of+somite-derived+stromal+cells+in+haematopoietic+niche+formation.">NACA deficiency reveals the crucial role of somite-derived stromal cells in haematopoietic niche formation.</a> Nat Commun. 28 (6), 8375 (2015).</li><li>Shah, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Atpif1+regulates+haem+synthesis+in+developing+erythroblasts.">Mitochondrial Atpif1 regulates haem synthesis in developing erythroblasts.</a> Nature. 491 (7425), 608-612 (2012).</li><li>Tamplin, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+arrival+triggers+dynamic+remodeling+of+the+perivascular+niche.">Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche.</a> Cell. 160 (1-2), 241-252 (2015).</li><li>Ad&#225;m, A., B&#225;rtfai, R., Lele, Z., Krone, P. H., Orb&#225;n, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-inducible+expression+of+a+reporter+gene+detected+by+transient+assay+in+zebrafish.">Heat-inducible expression of a reporter gene detected by transient assay in zebrafish.</a> Exp. Cell Res. 256 (1), 282-290 (2000).</li></ol>

The authors declare that they have no conflict of interest.

Parabiyotik füzyon yetişkin fare modelleri ve civciv embriyolarının 10-14 aday genlerin hücresel fonksiyonları araştırmak için güçlü bir araç olmuştur. Daha yakın bir zamanda Blastula füzyon metodu yapışık zebrabalıkları embriyolar 15 üretilmesi için tarif edilmiştir. Mevcut protokolde, video tabanlı öğreticiler göstermek ve daha iyi hematopoetik gelişiminde ilgi aday genlerin, zamansal hücre içsel ve dışsal hücre rollerini incelemek amacıyla farklı genetik köke...

Yabani tip ve genetik olarak değiştirilmiş hayvanların arasındaki genetik mozaikler (şimerleri) oluşturulması hücre içsel aday genlerin 1-6 hücre-dışsal fonksiyonlar karşı araştırılması için köklü ve klasik bir stratejidir. Zebrabalıkları Blastula nakli yaygın hücre özerklik 7-9 çalışmaları için kimerik embriyolar oluşturmak için kullanılmıştır. Ilgi konusu doku bağlı olarak, ancak, tahmin edilebileceği gibi istenen dokuya (örneğin, kan) 1-3, 7-9 verici hedef hücrelere zor olabilir. Fare genetikçiler uzun bir ortak dolaşımı 10-14 ile yapışık organizmaları üretmek için Parabiyotik cerrahi yöntemler kullanmışlardır. Parabiyotik hayvanlar ortak kan dolaşımına paylaştığından, farklı genetik arka plan diğer hayvan hücreleri, bir hayvanda kökenli hücreler arasındaki etkileşimleri 10-16 incelenebilir. Son zamanlarda, Karima Kissa grubu zarif CRE yeteneğini gösterdiyapışık zebrafish embriyolar yedik ve daha sonra hematopoetik kök ve progenitör hücre (HSPC) göç 15 incelemek için bu sistemi kullanabilirsiniz. Buna ek olarak, Zebra balığı parabiyoz son zamanlarda hematopoetik kök hücre (HSC) ortaya çıkması ve göç, 16 endotelyal kaderin 5 rolünü araştırmak için ve zebra balığı gelişim 17 sırasında HSPC niş içinde stromal hücrelerin rolünü araştırmak için kullanıldı. Farelerde aksine, Zebra balığı embriyolar şeffaf ve sistem benzersiz güçlü hale Parabiyotik gelişimi sırasında hücrelerin doğrudan görselleştirme için izin verir. Zebra balığı parabiyoz yarar, ancak ayrıntılı talimat ve görsel gösteri olmadan teknik olarak zor olabilir hassas embriyolar üzerinde dik bir öğrenme eğrisi ve Parabiyotik cerrahi ile sınırlıdır. Bu protokolün amacı, eğitim için Parabiyotik zebrafish embriyolar oluşturmak için nasıl video tabanlı öğreticiler eşlik net, adım adım talimatlar bir dizi sağlamaktırTemporal, hücreye özgü veya blastulae geliştirme cerrahi füzyonu ile aday gen (ler), hücre-dışsal fonksiyonlar. Anahtar değişiklikler ve artan parabiont hayatta kalma ve yeni deneysel uygulamalar için ek öneriler yer almaktadır.

<table><tbody><tr><td>Methyl cellulose</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Individual components for E3/HCR:</td><td></td><td>For 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 1,99g MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (Sodium chloride)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>KCl (Potassium chloride)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (Calcium chloride dihydrate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (Magnessium sulfate heptahydrate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (1M ) buffer solution</td><td>ThermoFisher</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibiotics:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>gibco by Life technologies</td><td>15140-120</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin sodium salt</td><td>Sigma Life Science</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus</td><td>Sigma Life Science</td><td>K1377</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>50 mg/ml Pronase from Streptomyces griseus</td><td>Roche</td><td>11459643001</td><td></td></tr><tr><td>capillary glass used for needles (Capillary Glass &amp;amp; Filaments)</td><td>Sutter Instrument</td><td>ITEM#: BF 100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Teasing needles with wooden handles</td><td>Fisher Scientific</td><td>S07894</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipettes</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor)</td><td>Novatech International</td><td>F37898-0000</td><td></td></tr><tr><td>100 mm diameter/ 20 mm deep plastic petri dishes (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS,&lt;br/&gt; HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG )</td><td>Greiner Bio-one</td><td>664102</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td><td>ThermoFisher</td><td>D-1976</td><td></td></tr><tr><td>PTU. working stock is 0.003% (50x is 0.15%). for 500 ml, 0.75 g N-Phenylthiourea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S)</td><td>Western Chemical Inc</td><td>MS 222</td><td></td></tr><tr><td>LMP agarose (Ultrapure LMP agarose)</td><td>Invitrogen</td><td>16520100</td><td></td></tr><tr><td>plastic transfer pipette (just the wide ended one I think)</td><td>Fisherbrand</td><td>137115AM</td><td></td></tr><tr><td>Glass-bottom 6-well plates used for imaging</td><td>MatTek</td><td>P06G1.5-20-F</td><td></td></tr><tr><td>plastic western gel loading tip fixed on the end of a wood-handled dissecting needle (GELoader tips)</td><td>Eppendorf</td><td>22351656</td><td></td></tr><tr><td>glass cover slips, slides and vacuum grease if mounting for an upright microscope:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vaccum grease ( Dow Corning&amp;reg; high-vacuum silicone grease&lt;br/&gt; colorless, weight 5.3 oz (tube) )</td><td>Dow Corning</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>Glass cover slips</td><td>Corning Life Sciences</td><td>2960-244</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of parabiotic zebrafish embryos by surgical fusion of developing blastulae

farklı genetik geçmişleri iki hayvan cerrahi parabiyoz hücre içsel farklı genetik ortamlarda aday ilgi genlerin, hücrelerin göç davranışları ve salgılanan sinyaller için hücre dış roller karşı çalışmak için benzersiz bir senaryo oluşturur. Parabiyotik hayvanlar ortak bir dolaşım paylaştığından, bir hayvandan herhangi bir kan ya da kan yoluyla bulaşan faktör ortağı ve tersi geçerli olacak. Bu nedenle, tek bir genetik geçmişe türetilmiş hücreler ve moleküler faktörler ikinci bir genetik arka bağlamında incelenebilir. Yetişkin farelerin parabiyoz araştırma yaşlanmanın, kanser, diyabet, obezite ve beyin gelişimi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Daha yakın zamanda, zebra balığı embriyoların parabiyoz hematopoez gelişim biyolojisi okumak için kullanılmıştır. Farelerde tersine, zebra balığı embriyolarının şeffaf doğası f araştırmak için benzersiz bir güçlü bir yöntem yapım Parabiyotik bağlamda hücrelerinin doğrudan görselleştirme izin verirundamental hücresel ve moleküler mekanizmalar. Bu tekniğin programı Ancak Parabiyotik zebrabalıkları embriyolar oluşturmak için bir öğrenme eğrisi ile sınırlıdır. Bu protokol ilgi aday genlerin rolünü araştırmak için farklı genetik geçmişleri iki zebra balığı embriyolarının blastulae sigorta cerrahi için nasıl bir adım-adım bir yöntem sağlar. Buna ek olarak, Parabiyotik zebrafish embriyolar olası gen ifadesinin zamansal kontrolü yapmak, ısı şok hoşgörülü. Bu yöntem sofistike bir set-up gerektirir ve embriyonik gelişim sırasında in vivo hücre göçü, kader özellikleri ve farklılaşma çalışmak için geniş uygulamalar mevcut değil.

Daha önce yayınlanmış çalışmaların 15 ile uyumlu olarak, zebra balığı embriyolarının başarıyla Parabiyotik füzyon evreleme ve oryantasyon iki embriyo ve metilselüloz konsantrasyonuna bağlıdır. Sadece birkaç basit ile, ucuz araçlar, cerrahi kaynaşmış gelişmekte blastulae paylaşılan tirajlı Parabiyotik embriyoların içine büyüdüğünü üretildi. Bu araçlar, bir tadil edilmiş Pasteur pipeti, 10 ml pipet pompası ve tek başına ya da laboratuar...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae at JoVE.com

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.

Blastulae Gelişmekte Cerrahi Fusion tarafından Parabiyotik balığı Embriyolar Üretimi

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

generation-parabiotic-zebrafish-embryos-surgical-fusion-developing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.5K Görüntüleme.  Boston Children’s Hospital. This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.

Video: Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Zebra balığı Embriyo microbead İmplantasyonu

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Gelişim Biyolojisi

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Transplantasyon Kimerik Zebra balığı Embriyolar Yaratma

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Biyoloji

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

Doku Hedeflenen Embriyonik Chimeras: Zebra balığı Gastrula Hücre Nakli

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Larva Zebra balığı Omurilik Kesisi

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Nörobilim

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

Transplantasyon GFP of-Kimerik Zebra balığı Embriyolar Retina ve Beyin Gelişimi Canlı Görüntüleme blastomer ifade

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

Zebra Balığı Embriyoları İçin Basit ve Etkili Bir Transplantasyon Cihazı

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

Generation of Na&#239;ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. However, because of the complexity and redundancy of embryonic signals, it can be challenging to discern the complete role of any single signal during early embryogenesis. By explanting the animal region of the zebrafish blastoderm, relatively na&#239;ve clusters of embryonic cells are generated that can be easily cultured and manipulated ex vivo. By introducing a gene of interest by RNA injection before explantation, one can assess the effect of this molecule on gene expression, cell behaviors, and other developmental processes in relative isolation. Furthermore, cells from embryos of different genotypes or conditions can be combined in a single chimeric explant to examine cell/tissue interactions and tissue-specific gene functions. This article provides instructions for generating zebrafish blastoderm explants and demonstrates that a single signaling molecule - a Nodal ligand - is sufficient to induce germ layer formation and extension morphogenesis in otherwise na&#239;ve embryonic tissues. Due to their ability to recapitulate embryonic cell behaviors, morphogen gradients, and gene expression patterns in a simplified ex vivo system, these explants are anticipated to be of great utility to many zebrafish researchers.

Zebrafish blastoderm explants are generated by isolating embryonic cells from endogenous signaling centers within the early embryo, producing relatively na&#239;ve cell clusters easily manipulated and cultured ex vivo. This article provides instructions for making such explants and demonstrates their utility by interrogating roles for Nodal signaling during gastrulation.

Zebra Balığı Embriyolarından Naïve Blastoderm Explants Üretimi

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. ...

<meta charset="utf8"></head><body>Rejenerasyon ve Gelişim Araştırmaları için Sağlam Zebra Balığı Hücre Nakli

High-resolution Cell Transplantation in Embryonic and Larval Zebrafish

Development and regeneration occur by a process of genetically encoded spatiotemporally dynamic cellular interactions. The use of cell transplantation between animals to track cell fate and to induce mismatches in the genetic, spatial, or temporal properties of donor and host cells is a powerful means of examining the nature of these interactions. Organisms such as chick and amphibians have made crucial contributions to our understanding of development and regeneration, respectively, in large part because of their amenability to transplantation. The power of these models, however, has been limited by low genetic tractability. Likewise, the major genetic model organisms have lower amenability to transplantation. 
The zebrafish is a major genetic model for development and regeneration, and while cell transplantation is common in zebrafish, it is generally limited to the transfer of undifferentiated cells at the early blastula and gastrula stages of development. In this article, we present a simple and robust method that extends the zebrafish transplantation window to any embryonic or larval stage between at least 1 and 7 days post fertilization. The precision of this approach allows for the transplantation of as little as one cell with near-perfect spatial and temporal resolution in both donor and host animals. While we highlight here the transplantation of embryonic and larval neurons for the study of nerve development and regeneration, respectively, this approach is applicable to a wide range of progenitor and differentiated cell types and research questions.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Gelişim ve Rejenerasyon Sırasında Zebra Balığı Sinir Sisteminde Hücresel Bağlantının Haritalanması

Here we present a protocol to transplant cells with high spatial and temporal resolution in zebrafish embryos and larvae at any stage between at least 1 and 7 days post fertilization.

Embriyonik ve Larva Zebra Balıklarında Yüksek Çözünürlüklü Hücre Nakli

Development and regeneration occur by a process of genetically encoded spatiotemporally dynamic cellular interactions. The use of cell transplantation ...

Blastulae Gelişmekte Cerrahi Fusion tarafından Parabiyotik balığı Embriyolar Üretimi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

PLAYLIST