We thank Julie R. Perlin for helpful comments on the manuscript. D.I.S. is supported by grants from the American Society of Hematology, the Cooley's Anemia Foundation, and the NIH (K01DK085217 and R03DK100672). E.J.H. is a Howard Hughes Medical Institute Fellow of the Helen Hay Whitney Foundation. B.L. is a Howard Hughes Medical Institute Medical Research Fellow. B.W.B. is supported by an Irvington Fellowship from the Cancer Research Institute and a Young Investigator Award from the Conquer Cancer Foundation of ASCO. L.I.Z. is supported by grants from the NIH (R01CA103846, P01HL032262, and R01HL04880), Taub Foundation for MDS Research, Harvard Stem Cell Institute, and is an investigator of the Howard Hughes Medical Institute.

Dieses Protokoll wurde von Boston Kinderkrankenhaus Animal Care und Use Committee genehmigt. Dieses Protokoll wird von einem zuvor veröffentlichten Verfahren 15 modifiziert. 1. Vorbereitung der Reagenzien (Tage oder Wochen im Voraus) <ol><li> Bereiten Sie 1,5% Agarose-beschichteten Schalen. In 1,5 g Agarose zu 100 ml Zebrabärbling E3 Medium in einem Erlenmeyerkolben. Wärme, lösen sich die Agarose und dann etwa 5 ml in 100 mm Durchmesser x 20 mm tief Petrischalen gießen. Anmerkung: Diese werden verwendet für dechorionation von Embryonen (Schritt 3.1) und für die parabiotic Operation (Schritt 3.3). Bewahren Sie Agarose-beschichteten Schalen bei 4 ° C für ein paar Wochen; nehmen sie aus dem Kühlschrank und warm am Morgen des Tages der parabiotic Operation auf RT. </li><li> Herstellung von 4% Methylcellulose. Man löst 4 g Methylcellulose-Pulver in 100 ml E3 in einem Erlenmeyerkolben mit einem Rührstab. Der Kolben wird auf einer Rührplatte bei 4 ° C, auf die niedrigste Geschwindigkeit, und lassen Sie es mischenfür bis zu 2 Tage. <ol><li> verwenden Intermittently einem Spatel weißen Klumpen von Methylcellulose aufzubrechen. Die Methylcellulose Kristalle lösen sich nicht vollständig in dieser Konzentration. Wenn wird die Lösung klar und homogen erscheint mit keine weißen Klumpen verbleibenden aliquote die Lösung in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und gefrier bei -20 ° C für die Langzeitlagerung. Hinweis: Geringere Konzentrationen von Methylcellulose können verwendet werden; aber diese höheren Prozentsatz, zähflüssiger Methylcellulose hat die besten Ergebnisse erzielt. </li></ol></li><li> Bereiten High Calcium Ringer (HCR) Lösung. Zu 400 ml der HCR - Lösung herzustellen, 8 ml 5M NaCl mischen (116 mM Endkonzentration), 400 &amp; mgr; l 3 M KCl (2,9 mM Endkonzentration), 800 &amp; mgr; l 5 M CaCl 2 (10 mM Endkonzentration) und 2 ml 1M HEPES (5 mM final) mit 390 ml E3 Medien. Hinweis: Bewahren HCR Lösung bei 4 ° C für ein paar Wochen; warme am Morgen des Tages der parabiotic Operation auf RT. </li><li> Bereiten Sie 5 - 6 modifizierte Pasteurpipetten für den TransferRing blastula Paare. kurz erhitzen das Ende der Pipette über einem Bunsenbrenner. Dann großen Pinzette, biegen Sie das Ende der Pipette auf etwa 45 ° C, während es noch heiß ist. <ol><li> Um sicherzustellen, dass keine scharfen Kanten, die Embryonen schädigen könnten, halten Sie die Spitze der Pipette kurz in der Flamme für etwa 3 Sekunden. Dies wird glätten / polieren das Ende der Pipette. Diese modifizierte Glaspasteurpipette wird in Verbindung mit einer 10 ml Pipette Pumpe (1) in Schritt 3.5 unten verwendet. </li></ol></li><li> Bereiten Sie Glasnadel Werkzeuge für chirurgische Nähte von blastula Paare. Ziehen Sie 2 - 3 Glasnadeln wie für die Mikroinjektion von Zebrafischembryonen durchgeführt. Verwenden Sie Lab-Film jedes Glas Nadel bis zum Ende eines holz- oder kunststoff behandelt teasing Nadel (Abbildung 1A) zu beheben. Mit einer Pinzette, brechen das Ende der Nadel bei einem Durchmesser von ca. 20 aus - 30 um. Verwenden Sie einen Stufenmikrometer diesen Schritt (1B) zu führen. Hinweis: Die Größe des needle Spitze ist wichtig. Wenn die Spitze zu groß ist, wird es schwierig, genau zu steuern und zu übermäßigen Schaden verursachen können. Wenn die Spitze zu klein ist, ist es schwierig, ausreichend die Embryonen aufgewickelt. </li></ol> 2. Einrichten Brutpaare von Zebrabärbling und Sammlung von Embryonen (Tag -1 bis Tag 0) <ol><li> Richten Sie Brutpaare von erwachsenen Zebrafisch. Richten Sie Fisch in der Nacht vor der Parabiose Operation durchgeführt werden soll. Verwenden Sie Teiler Männchen und Weibchen zu trennen. Um die Chancen zu erhöhen, dass die gewünschten Embryonen werden mehrere Paare von jeder Zeile erhalten, eingerichtet. Wir finden, dass typischerweise 20 - 50% der Paare laichen. </li><li> Am nächsten Morgen ziehen die Teiler und Paarung zu ermöglichen. Sammeln Sie alle Embryonen einen feinmaschigen Teesieb verwendet, übertragen sie dann auf eine Petrischale mit E3 Embryo Medium 18. </li><li> Micro-injizieren Embryonen nach Wunsch (zB mit 25 pg Plasmid - DNA, 200 pg mRNA oder mit 1 bis 6 ng Morpholin) innerhalb 1 Stunde der Sammlung. Lassen Sie sie aufbis 256-Zellen-Stadium wachsen. Wenn das DNA - Expressionskonstrukt unter der Kontrolle eines Hitzeschock - Promotors gestellt wird (zB hsp70, 4B), steuern die Zeitsteuerung der Genexpression durch Wärme schocken die parabionts bei 37 ° C zu einem späteren Zeitpunkt (z. B. bei 36 hpf ). Anmerkung: Als Alternative zu einem fluoreszierenden Transgen können fluoreszierende Dextran an die DNA, RNA zugesetzt werden oder Morpholino Injektionsmischung (beispielsweise Dextran, Cascade blue bei 2 mg / ml). Das Dextran Farbstoff wird nicht mit der normalen Entwicklung stören und können für die injizierten Embryo unter der entsprechenden Leuchtstofflampe nach parabiotic Fusion identifiziert werden. Alternativ kann die Parabiose eines pigmentierten Stamm (zB AB) mit einem nicht-pigmentierten Stamm (zB Casper) verwendet werden, um die injizierten Embryonen in späteren Stadien zu identifizieren. </li><li> Inkubieren Sie die Embryonen bei 28,5 ° C liegt.Verwendung einer Stereoskop ihre Entwicklung in regelmäßigen Abständen, wie sie in der Nähe der 256-Zellen-Entwickler zu überwachenelopmental Stufe (ca. 2,5 HPF). Hinweis: Bei Bedarf verschieben Embryonen auf unterschiedliche Temperaturen Stufe Anpassung zwischen parabiotic Partnern zu gewährleisten (zB Morpholino-injizierten Embryonen entwickeln sich oft langsamer als ihre nicht-injizierten Pendants Verschiebung der un-injizierten Embryonen auf RT während die Morpholino-injizierten Embryonen platziert werden. bei 28,5 ° C in ihren Stufen führen nach ein paar Stunden der Entwicklung auszurichten). </li></ol> 3. Erzeugung von Parabiotic Zebrabärbling Embryonen, die durch chirurgische Fusion von Blastulae Entwicklung <ol><li> Da die Embryonen , die 256-Zellen - Stadium (etwa 2,5 HPF), übertragen Sie die Embryonen von jedem genetischen Hintergrund (dh genetische Mutante, transgenen Linien und / oder genetische Manipulation) in separate Agarose-beschichteten Schalen (zB ein Gericht für Morpholino- nähern injizierten Embryonen und eine zweite Schale für die Kontrolle Embryonen). Alternativ übertragen die Embryonen zu reinigen, kratzfreie Glasbecher oder Petrischalen aus Glas. Hinweis: Vermeiden Sie unbeschichteten Plastikschalen mit, da die Embryonen in die Kunststoff haften und einmal aus ihrem Chorion beschädigt werden. </li><li> Dekantiert die E3 Medien bis gerade genug Flüssigkeit bleibt die Embryonen zu decken (etwa 7 bis 10 ml). Zugabe von 200 ul 50 mg / ml Gemisch aus der extrazellulären Flüssigkeit von Streptomyces griseus isoliert Proteasen (Proteasen). Schwenken Sie die Embryonen vorsichtig alle paar Minuten. <ol><li> Wenn 50% der Embryonen aus ihrem Chorion gekommen sind, die in der Regel 5 nimmt - 10 min, spülen Sie sie dreimal mit einem großzügigen Volumen (ca. 15 - 20 ml) von frischen E3 Embryo Medium. <ol><li> Dechorionate alle Embryonen in ihren Chorion verbleibenden, indem sie sanft Ausarbeitung in die modifizierte Glas Pasteur Pipette und dann sanft zu zerstreuen. Sobald die Embryonen dechorionated und gewaschen worden ist, ersetzen Sie die E3 Medien mit HCR-Lösung. Als Alternative zu Proteasen, entfernen Sie die Chorion manuell einer feinen Pinzette verwenden. Ziel 60 zu haben - 100 dechorionated Embryonen für jede Versuchsbedingung zur Verfügung. Anmerkung: Dies ist ein Vielfaches mehr als letztendlich verwendet werden, aber viele Embryonen werden wahrscheinlich während der Handhabung oder der Chirurgie für Parabiose beschädigt werden. Sobald die Embryonen dechorionated sind, halten sie untergetaucht und nicht zulassen, dass sie die Oberfläche des Wassers zu berühren, da die Oberflächenspannung bewirkt, dass sie vernichtet werden. Beachten Sie, dass eine höhere Dosis von Proteasen, die Embryonen erlaubt aus ihrem Chorion früher und in einer synchronisierten Art und Weise zu kommen. Wenn eine niedrigere Dosis von Proteasen, bringen Sie die Embryonen länger von ihrem Chorion entstehen und tun dies in einer weniger synchronen Art und Weise, die in einem Teil der Embryonen beschädigt längerer Exposition durch Proteasen führen kann. </li></ol></li></ol></li><li> Auftauen Methyl (hergestellt in Schritt 1.2 oben) und Zentrifuge in einer Tischzentrifuge bei Höchstgeschwindigkeit für 10 min ungelöste Kristalle zu pelletieren, die die Embryonen schädigen oder reißen ihren Dotters. <ol><li> Nach dem Zentrifugieren, verwenden Sie die klare obere Fraktion (etwa 75% des Volumens). Transfer 1-1,5 cm Durchmesser Tropfen Methylcellulose in einem 1,5% Agarose-beschichteten Petrischale. Achten Sie darauf, von der Unterseite des Rohres eine der pelletierten Kristalle zeichnen zu vermeiden. </li><li> Verwenden, um eine Markierung, um die Position jedes Tröpfchens an der Unterseite des Tellers vorzubestimmen. Legen Sie 12 bis 15 Tropfen (2 - 3 Teilmengen im Wert) von Methylcellulose pro 100 mm Durchmesser Petrischale. Bereiten Sie so viele Platten wie pro Experiment benötigt. Hinweis: Verwenden Sie jedes Tröpfchen für die Fusion eines einzelnen blastula Paar. Die Markierung wird die Position jedes Tröpfchen bezeichnen, sobald das Medium Mehr, an welchem ​​Punkt die Tropfen werden fast unsichtbar. </li></ol></li><li> Bereiten Sie eine 40 ml aliquote Menge von Antibiotika ergänzt HCR Lösung pro Agarose-beschichtete Schale oben hergestellt in Schritt 3.3. Zu jeder 40 ml Aliquot von HCR hinzufügen Penicillin-Streptomycin bei 50 U / ml, Ampicillin, bei 50 U / ml und Kanamycin mit 0,5 &amp; mgr; g/ Ml. <ol><li> Wenn Sie bereit sind blastula Fusionen durchzuführen, füllen Sie sorgfältig jedes der Gerichte mit 40 ml des Antibiotikums ergänzten HCR Lösung Methylcellulose Tröpfchen enthält. Wenn der HCR-Lösung zu schnell hinzugefügt wird, kann es um die Tröpfchen zu stören. </li></ol></li><li> Bringen Sie die modifizierte Glaspasteurpipette (hergestellt in Schritt 1.4 oben) zu einer 10 ml Pipette Pumpe. Unter einem Stereoskop sammeln ein dechorionated Embryo aus jedem Hintergrund (zB ein Morpholino-injizierten Embryo und ein Embryo Wildtyp). <ol><li> Bevor die beiden Embryonen Abgabe, verwenden Sie die Pasteur-Pipette eine kleine Vertiefung in der Mitte der Methylcellulose Tropfen zu machen, dann deponieren sanft beide Embryonen in die Depression. Hinweis: Während des Transferprozesses, drehen Sie das Pasteur-Pipette leicht nach oben, so dass die Embryonen in die Biegung des Pasteur-Pipette absetzen, um ihre Herstellung Kontakt mit der Oberfläche der Flüssigkeit am oberen oder unteren Ende der Pipette zu vermeiden (was führen kann zu their Bruch). </li></ol></li><li> Unmittelbar nach der Embryos in die Methylcellulose Ablagern, mit einem Holz- oder Kunststoffgriff Necken Nadel mit einem Gel-Ladepipettenspitze auf dem Ende (1A) , um sorgfältig die Embryonen in der Methylcellulose repositionieren , so dass ihre Tier Pole direkt berühren einander. <ol><li> Nutzen Sie sanft geschwungenen Bewegungen durch die Methylcellulose nahe an den Embryonen sie neu zu positionieren, ohne sie direkt zu berühren. Lassen Sie die Embryonen für 5 Minuten sitzen, so dass die Methylcellulose um sie herum siedeln in wird. Während dieser Zeit, laden Sie das nächste Paar in einen anderen Tropfen. Hinweis: Vermeiden Sie direkten Kontakt mit den Embryonen zu machen und besondere Sorgfalt walten lassen keinen Teil des Dottersacks zu berühren, die leicht platzen wird. </li></ol></li><li> Mit der Glasnadel Werkzeug, Wunde sorgfältig jeden Embryo in ihrem Kontaktpunkt. Mit einer sanften Bewegung Nähen, Zellen aus dem ersten Embryo in den zweiten Embryo herausgezogen werden und dann wieder zurück.Am Ende dieser Bewegung, halten Sie die Nadel an Ort und Stelle für 2 - 3 Sekunden und dann sehr langsam ziehen weg. Hinweis: Es gibt einen Zeitraum von etwa 2 bis 3 sec, nachdem die Embryonen verwundet werden, wo die beiden Geweben zu sein scheinen mehr Klebstoff und eher aneinander zu befestigen. Daher glauben wir, dass die Nadel an Ort und Stelle hält kurz nach der Verwundung die verwundeten Gewebe jedes Embryos in Kontakt für die Anfangszeit der Zeit unmittelbar nach der Verwundung zu halten hilft. </li><li> Lassen Sie diese Embryonen für 10 sitzen - 15 min bei RT. In der Zwischenzeit weiterhin neue Paare in anderen Tropfen Methylcellulose zu nähen. Nach 10 bis 15 min, zu beurteilen , ob das erste Paar befestigt ist geblieben (2A). Hinweis: Wenn die Embryonen länger angebracht, wiederholen Sie den Nähvorgang solange die Embryonen jünger sind als etwa 30% epiboly Bühne. Typischerweise kann dies bis zu drei Versuche, die Embryonen zusammenheften. Wenn erscheinen die Embryonen eine Anlage gehalten zu haben, aber die cSteckerspleiss ist nicht erheblich, führen zusätzliche Nähte am Rand der Verbindung es zu verstärken. Vermeiden Sie Schütteln oder Gerichte während der parabiotic Chirurgie und Inkubationszeiten bewegen. Hinweis: Trotz ihres frühen Entwicklungsstadium und wahrgenommen Zerbrechlichkeit, die Zellmassen der Embryonen eine erhebliche Menge an Manipulation tolerieren kann (dh, Verwundung und Nähen), und noch normal entwickeln. Das Eigelb kann jedoch Bruch mit nur der geringsten Berührung, den Embryo zu töten. Wenn die beiden Blastulae mit der Glasnaht, nicht den Kontakt mit der Schnittstelle zwischen der Zellmasse und Eigelb von jedem Embryo zu machen. </li><li> Inkubieren Sie die Embryonen O / N bei 28,5 ° C in der gleichen Gericht und Medien (nicht über die Medien ändern). Mit dem folgenden Morgen werden sich die Embryonen der meist gelösten Methylcellulose Tröpfchen ausgezogen. Entfernen Sie alle Embryonen, die nicht erfolgreich verschmolzen waren. Dekantiert die Medien und ersetzen mit einem frischen 25 ml E3. Hinweis: Wenn bei einem Arbeitspigmentierte Stamm, 500 &amp; mgr; l 0,15% (50x) Phenylthioharnstoff (PTU) bis zu einer Endkonzentration von 0,003% Pigmentierung zu blockieren. Die Embryonen müssen kontinuierlich in PTU bleiben Unterdrückung der Pigmentierung zu halten. </li></ol> 4. Mikroskopaufbau, Bildaufnahme, Verarbeitung und Analyse <ol><li> Bereiten Sie 0,8% mit niedrigem Schmelzpunkt (LMP) Agarose: In 0,8 g LMP-Agarose zu 100 ml E3 und Hitze, bis sie vollständig gelöst. Während heiß, aliquoten 1 ml LMP-Agarose in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen in einem 37 ° C Heizblock. Die LMP-Agarose bleiben wird geschmolzen bei 37 ° C. Werden 40 &amp; mgr; l 4 mg / ml (25x), pH 7,0 Tricaine zu je 1 ml Aliquot von LMP-Agarose bei 37 ° C. Hinweis: Wenn mit einer pigmentierten Stamm arbeiten, fügen Sie 20 ul 0,15% (50x) PTU zu jedem 1 ml aliquoten. <ol><li> Bewahren Sie die restlichen LMP-Agarose für mehrere Monate in verschlossenen 50-ml-Röhrchen bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Anästhesieren parabiotic Embryonen abzubildenden durch Zugabe von 1 ml von 4 mg / ml (25x), pH 7,0 Tricainezu den 25 ml der E3, dass die Embryonen bereits in. </li><li> Vorsichtig schwenken die Schale, so dass die Embryonen in der Mitte gebündelt werden. Dann eine breite bestückte Plastiktransferpipette die Embryonen in so wenig Flüssigkeit wie möglich aufzustellen verwenden. Drehen Sie die Pipette aufrecht und prallen sanft die Embryonen, so dass sie bis auf den Grund der Pipette zu begleichen. <ol><li> Mit den Embryonen am Boden der Pipette, übertragen sie zu einem 1 ml Aliquot der Agarose LMP durch leichtes die Pipettenspitze auf die Oberfläche der Agarose berühren. Vermeiden Sie überschüssige Flüssigkeit, da diese Übertragung wird die Agarose verdünnen. </li></ol></li><li> Nachdem die überschüssige Flüssigkeit aus der Pipette ausgestoßen, verwenden Sie die Pipette die Embryonen vorsichtig innerhalb der Agarose mischen, dann die Pipette verwenden, um alle der Agarose und Embryonen in die Vertiefung einer Glasboden (Nr 1.5 Deckglas) zu übertragen, 6- Well-Platte. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Pipette zu verwerfen, nachdem die Embryonen auf die Bildplatte zu übertragen. Rest Agarose wird im Inneren der Pipette eingestellt, rendering unwirksam für die weitere Verwendung. Vielmehr ist eine neue Pipette jedes Mal verwenden. </li><li> Unter einem Stereoskop, verwenden Sie ein Necken am Ende eines Holz behandelt Nadel fixiert Pipettenspitze Gel-Laden um die Embryonen nach unten in Richtung des Deckglases zu positionieren (sicherzustellen, dass sie innerhalb der Arbeitsabstand des Mikroskopobjektivs sind) und in der gewünschten Ausrichtung für die Bildgebung. Hinweis: Positionieren Sie kontinuierlich, bis die Agarose vollständig gesetzt hat. Achten Sie darauf, die parabiotic Embryonen nach der Embryo des Paares zu montieren abgebildet werden soll. In Anbetracht der zufällige Orientierung der verbundenen Embryonen für einige Paare können es beide Embryonen Bild schwierig sein. In diesem Szenario zu erholen, die Embryonen aus der Agarose eine Zange und eine breite bestückte Plastiktransferpipette und dann wieder montieren für die Bildgebung aus einer anderen Perspektive. </li><li> Nachdem die Agarose gesetzt hat, Deckel mit 2 - 3 ml E3 mit Tricaine ergänzt (und PTU falls erforderlich). </li><li> Bild die Embryonen eines invertierten Weitfeld-Epi-Fluoreszenz unter Verwendung, laser-konfokalen oder konfokalen Mikroskop drehende Scheibe. Wählen Sie das Ziel am besten geeignet für die gewünschte Bildgebung. Für einen ganzen Embryo Sichtfeld, mit einem 4-fach Objektiv. Wählen Sie eine höhere Vergrßerung, wie beispielsweise ein 20x - Objektiv, dem Bild mit einem spezifischen Gewebe 16, 19. Hinweis: Wenn ein aufrechtes Mikroskop, montieren in LMP-Agarose (ähnlich oben) auf einem Deckglas. Kehren Sie die Deckglas auf einem Glasobjektträger , die einen Ring von Vakuumfett mit dem gleichen E3-Tricaine-PTU 16, 19 gefüllt hat. </li><li> Prozess erfassten Bilder frei Bildanalyse - Software - Pakete wie NIH Bild J / FIJI 16, 19 verwendet wird . Hinweis: Count - Zellzahlen und zu quantifizieren Dynamik wie Zellmigration und die Zellteilung Segmentierung und Tracking 16 Algorithmen, 19. </li></ol>

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The authors declare that they have no conflict of interest.

Parabiotic Fusion ist ein leistungsfähiges Werkzeug gewesen , um zelluläre Funktionen von Kandidatengenen bei erwachsenen Mausmodellen und Hühnerembryonen 14.10 untersuchen. In jüngerer Zeit wurde zur Erzeugung verbunden Zebrabärbling - Embryonen 15 a blastula Fusionsverfahren beschrieben. Im vorliegenden Protokoll, Video-basierte Tutorials werden verwendet, um die Methodik zu demonstrieren und besser zu beschreiben für die Erstellung von parabiotic Genaktivität von verschiedenen genetischen...

Erstellung von genetischen Mosaiken (Chimären) zwischen Wildtyp und gentechnisch veränderten Tieren ist eine gut etablierte und klassische Strategie zur Untersuchung von Zell-Eigengegenüber zell extrinsische Funktionen von Kandidatengenen 1-6. Blastula Transplantation in Zebrabärbling wurde in großem Umfang Chimären - Embryonen für die Untersuchung der Zell Autonomie 7-9 zu erzeugen , verwendet werden . In Abhängigkeit von dem Gewebe von Interesse kann es jedoch schwierig sein , vorhersagbar 7-9 Donorzellen zu dem gewünschten Gewebe (zB Blut) 1-3, abzuzielen. Maus - Genetiker haben lange parabiotic chirurgische Methoden verwendet , um verbundene Organismen mit einem gemeinsamen Kreislauf 10-14 erzeugen. Da die Tiere parabiotic eine gemeinsame Blutstrom, Wechselwirkungen zwischen Zellen teilen , die von einem Tier mit Zellen des anderen Tieres von einem anderen genetischen Hintergrund hat , kann 10-16 untersucht werden. Vor kurzem elegant Karima Kissa Gruppe demonstriert die Fähigkeit, creaß verbunden Genaktivität und dann dieses System verwenden , um 15 hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzelle (HSPC) Migration studieren. Darüber hinaus wurde kürzlich Zebrabärbling Parabiose während Zebrabärblingentwicklung 17 zur Untersuchung der Rolle der endothelialen cadherin 5 in hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Emergenz und Migration, 16 und zur Untersuchung der Rolle von Stromazellen in der HSPC Nische eingesetzt. Im Gegensatz zu Mäusen sind Genaktivität transparent und ermöglichen eine direkte Visualisierung von Zellen während der parabiotic Entwicklung, so dass das System einzigartig leistungsfähige. Die Nützlichkeit von Parabiose in Zebrabärbling, wird jedoch durch eine steile Lernkurve begrenzt und parabiotic Operation an den empfindlichen Embryonen ohne detaillierte Anleitung und visuelle Demonstration technisch anspruchsvoll sein. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine Reihe von klaren, Schritt-für-Schritt-Anleitungen Videoschulungen auf zu begleiten, wie parabiotic Zebrabärblingembryonen erzeugen für das Studiumtemporal, zell intrinsische oder extrinsische zell Funktionen eines Kandidatengens (e) durch chirurgische Fusion von Blastulae entwickeln. Key Modifikationen und zusätzliche Empfehlungen zur Erhöhung parabiont Überleben und neue experimentelle Anwendungen sind im Lieferumfang enthalten.

<table><tbody><tr><td>Methyl cellulose</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Individual components for E3/HCR:</td><td></td><td>For 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 1,99g MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (Sodium chloride)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>KCl (Potassium chloride)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (Calcium chloride dihydrate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (Magnessium sulfate heptahydrate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (1M ) buffer solution</td><td>ThermoFisher</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibiotics:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>gibco by Life technologies</td><td>15140-120</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin sodium salt</td><td>Sigma Life Science</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus</td><td>Sigma Life Science</td><td>K1377</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>50 mg/ml Pronase from Streptomyces griseus</td><td>Roche</td><td>11459643001</td><td></td></tr><tr><td>capillary glass used for needles (Capillary Glass &amp;amp; Filaments)</td><td>Sutter Instrument</td><td>ITEM#: BF 100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Teasing needles with wooden handles</td><td>Fisher Scientific</td><td>S07894</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipettes</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor)</td><td>Novatech International</td><td>F37898-0000</td><td></td></tr><tr><td>100 mm diameter/ 20 mm deep plastic petri dishes (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS,&lt;br/&gt; HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG )</td><td>Greiner Bio-one</td><td>664102</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td><td>ThermoFisher</td><td>D-1976</td><td></td></tr><tr><td>PTU. working stock is 0.003% (50x is 0.15%). for 500 ml, 0.75 g N-Phenylthiourea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S)</td><td>Western Chemical Inc</td><td>MS 222</td><td></td></tr><tr><td>LMP agarose (Ultrapure LMP agarose)</td><td>Invitrogen</td><td>16520100</td><td></td></tr><tr><td>plastic transfer pipette (just the wide ended one I think)</td><td>Fisherbrand</td><td>137115AM</td><td></td></tr><tr><td>Glass-bottom 6-well plates used for imaging</td><td>MatTek</td><td>P06G1.5-20-F</td><td></td></tr><tr><td>plastic western gel loading tip fixed on the end of a wood-handled dissecting needle (GELoader tips)</td><td>Eppendorf</td><td>22351656</td><td></td></tr><tr><td>glass cover slips, slides and vacuum grease if mounting for an upright microscope:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vaccum grease ( Dow Corning&amp;reg; high-vacuum silicone grease&lt;br/&gt; colorless, weight 5.3 oz (tube) )</td><td>Dow Corning</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>Glass cover slips</td><td>Corning Life Sciences</td><td>2960-244</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of parabiotic zebrafish embryos by surgical fusion of developing blastulae

Chirurgische Parabiose von zwei Tiere von verschiedenen genetischen Hintergründe schafft ein einzigartiges Szenario Zell-Eigengegenüber zell extrinsische Rollen für Kandidatengene von Interesse, Migrationsverhalten von Zellen zu untersuchen, und sekretiertes Signale in unterschiedlichen genetischen Einstellungen. Da parabiotic Tiere eine gemeinsame Kreislauf, jede Blut oder durch Blut übertragbaren Faktor von einem Tier gemeinsam mit dem Partner ausgetauscht werden und umgekehrt. So ist aus einem genetischen Hintergrund abgeleiteten Zellen und molekularen Faktoren kann im Kontext eines zweiten genetischen Hintergrund studiert werden. Parabiose von erwachsenen Mäusen wurde intensiv für die Forschung Alterung, Krebs, Diabetes, Fettleibigkeit, und die Entwicklung des Gehirns eingesetzt. In jüngerer Zeit hat Parabiose von Genaktivität verwendet worden, um die Entwicklungsbiologie der Hämatopoese zu studieren. Im Gegensatz zu Mäusen erlaubt die transparente Natur der Genaktivität die direkte Visualisierung von Zellen im parabiotic Zusammenhang ist ein einmalig leistungsfähiges Verfahren zur Untersuchung von f machenundamental zellulären und molekularen Mechanismen. Die Nützlichkeit dieser Technik wird jedoch durch eine steile Lernkurve begrenzt für die parabiotic Genaktivität zu erzeugen. Dieses Protokoll stellt eine Schritt-für-Schritt-Methode, wie die Blastulae von zwei Genaktivität von verschiedenen genetischen Hintergründen chirurgisch verschmelzen die Rolle der Kandidaten-Gene von Interesse zu untersuchen. Darüber hinaus sind die parabiotic Zebrabärblingembryonen Hitzeschock-tolerant, mögliche zeitliche Kontrolle der Genexpression zu machen. Diese Methode ist nicht ein ausgeklügeltes Set-up erfordert und hat breite Anwendungen für das Studium der Zellmigration, das Schicksal der Beschreibung und Differenzierung in vivo während der embryonalen Entwicklung.

In Übereinstimmung mit zuvor veröffentlichten Studien 15, erfolgreiche parabiotic Fusion von Zebrabärbling - Embryonen , hängt von der Bereitstellung und Ausrichtung der beiden Embryonen und die Konzentration von Methylcellulose. Mit nur ein paar einfache, kostengünstige Tools, operativ fusioniert Entwicklung Blastulae wurden erzeugt, die in parabiotic Embryonen mit gemeinsamen Umlauf wuchs. Diese Werkzeuge enthalten eine modifizierte Pasteurpipette, eine 10 ml - Pipette ...

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Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.

Die Erzeugung von Parabiotic Zebrabärbling Embryonen, die durch chirurgische Fusion der Entwicklung Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

generation-parabiotic-zebrafish-embryos-surgical-fusion-developing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.5K Aufrufe.  Boston Children’s Hospital. This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.

Serie: Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead Implantation im Zebrafischembryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Generieren Chimäre Zebrafischembryonen durch Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Biologie

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

Tissue Gezielte Embryonale Chimären: Zebrafisch Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Rückenmarksdurchtrennung in der Zebrafisch-Larven

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Neurowissenschaften

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

Die Transplantation von GFP-exprimierenden Blastomeren für Live Imaging von Retinal und Entwicklung des Gehirns in Chimäre Zebrafischembryonen

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

Ein einfaches und effektives Transplantationsgerät für Zebrafischembryonen

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

Generation of Na&#239;ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. However, because of the complexity and redundancy of embryonic signals, it can be challenging to discern the complete role of any single signal during early embryogenesis. By explanting the animal region of the zebrafish blastoderm, relatively na&#239;ve clusters of embryonic cells are generated that can be easily cultured and manipulated ex vivo. By introducing a gene of interest by RNA injection before explantation, one can assess the effect of this molecule on gene expression, cell behaviors, and other developmental processes in relative isolation. Furthermore, cells from embryos of different genotypes or conditions can be combined in a single chimeric explant to examine cell/tissue interactions and tissue-specific gene functions. This article provides instructions for generating zebrafish blastoderm explants and demonstrates that a single signaling molecule - a Nodal ligand - is sufficient to induce germ layer formation and extension morphogenesis in otherwise na&#239;ve embryonic tissues. Due to their ability to recapitulate embryonic cell behaviors, morphogen gradients, and gene expression patterns in a simplified ex vivo system, these explants are anticipated to be of great utility to many zebrafish researchers.

Zebrafish blastoderm explants are generated by isolating embryonic cells from endogenous signaling centers within the early embryo, producing relatively na&#239;ve cell clusters easily manipulated and cultured ex vivo. This article provides instructions for making such explants and demonstrates their utility by interrogating roles for Nodal signaling during gastrulation.

Erzeugung naiver Blastoderm-Expflanzen aus Zebrafisch-Embryonen

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. ...

<meta charset="utf8"></head><body>Robuste Zebrafischzelltransplantation für die Regenerations- und Entwicklungsforschung

High-resolution Cell Transplantation in Embryonic and Larval Zebrafish

Development and regeneration occur by a process of genetically encoded spatiotemporally dynamic cellular interactions. The use of cell transplantation between animals to track cell fate and to induce mismatches in the genetic, spatial, or temporal properties of donor and host cells is a powerful means of examining the nature of these interactions. Organisms such as chick and amphibians have made crucial contributions to our understanding of development and regeneration, respectively, in large part because of their amenability to transplantation. The power of these models, however, has been limited by low genetic tractability. Likewise, the major genetic model organisms have lower amenability to transplantation. 
The zebrafish is a major genetic model for development and regeneration, and while cell transplantation is common in zebrafish, it is generally limited to the transfer of undifferentiated cells at the early blastula and gastrula stages of development. In this article, we present a simple and robust method that extends the zebrafish transplantation window to any embryonic or larval stage between at least 1 and 7 days post fertilization. The precision of this approach allows for the transplantation of as little as one cell with near-perfect spatial and temporal resolution in both donor and host animals. While we highlight here the transplantation of embryonic and larval neurons for the study of nerve development and regeneration, respectively, this approach is applicable to a wide range of progenitor and differentiated cell types and research questions.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Kartierung der zellulären Konnektivität im Nervensystem des Zebrafisches während der Entwicklung und Regeneration

Here we present a protocol to transplant cells with high spatial and temporal resolution in zebrafish embryos and larvae at any stage between at least 1 and 7 days post fertilization.

Hochauflösende Zelltransplantation in embryonalen und larvalen Zebrafischen

Development and regeneration occur by a process of genetically encoded spatiotemporally dynamic cellular interactions. The use of cell transplantation ...

Die Erzeugung von Parabiotic Zebrabärbling Embryonen, die durch chirurgische Fusion der Entwicklung Blastulae

Zusammenfassung

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