We thank Julie R. Perlin for helpful comments on the manuscript. D.I.S. is supported by grants from the American Society of Hematology, the Cooley's Anemia Foundation, and the NIH (K01DK085217 and R03DK100672). E.J.H. is a Howard Hughes Medical Institute Fellow of the Helen Hay Whitney Foundation. B.L. is a Howard Hughes Medical Institute Medical Research Fellow. B.W.B. is supported by an Irvington Fellowship from the Cancer Research Institute and a Young Investigator Award from the Conquer Cancer Foundation of ASCO. L.I.Z. is supported by grants from the NIH (R01CA103846, P01HL032262, and R01HL04880), Taub Foundation for MDS Research, Harvard Stem Cell Institute, and is an investigator of the Howard Hughes Medical Institute.

Questo protocollo è stato approvato dal Comitato di cura e l&#39;uso di animali all&#39;ospedale dei bambini Boston. Questo protocollo viene modificato da un metodo precedentemente pubblicato 15. 1. Preparazione dei reagenti (giorni o settimane in anticipo) <ol><li> Preparare piatti 1,5% agarosio rivestite. Aggiungere 1,5 g di agarosio a 100 ml di mezzo Zebrafish E3 in una beuta. Calore, sciogliere l&#39;agarosio, e poi versare circa 5 ml in 100 mm di diametro x 20 mm piatti Petri di profondità. Nota: Questi sono usati per dechorionation di embrioni (Passo 3.1) e per la chirurgia parabiotic (passo 3,3). Conservare piatti agarosio rivestite a 4 ° C per un paio di settimane; portarli fuori dal frigo e caldo al Rt la mattina del giorno dell&#39;intervento parabiotic. </li><li> Preparare 4% metilcellulosa. Sciogliere 4 g di polvere di cellulosa di metile in 100 ml di E3 in una beuta con un ancoretta. Porre il pallone su un piatto mescolare a 4 ° C, impostare la velocità minima, e lasciate mescolareper un massimo di 2 giorni. <ol><li> Intermittenza usare una spatola per rompere grumi bianchi di metilcellulosa. I cristalli metil cellulosa non pienamente dissolvono a questa concentrazione. Quando la soluzione diventa chiara e appare omogeneo, senza grumi bianchi rimanente, un&#39;aliquota la soluzione in provette da 1,5 ml microcentrifuga e congelare a -20 ° C per una conservazione a lungo termine. Nota: Le concentrazioni più basse di metil cellulosa possono essere utilizzate; tuttavia, tale percentuale più elevata, più viscoso metilcellulosa ha dato i migliori risultati. </li></ol></li><li> Preparare la soluzione High Calcium Ringer (HCR). Per fare 400 ml di soluzione di HCR, mescolare 8 ml di 5M NaCl (116 mm finale), 400 ml di 3M KCl (2,9 mm finale), 800 ml di 5M CaCl 2 (10 mM finali), e 2 ml di 1M HEPES (5 mM finale) con 390 ml di E3 media. Nota: Conservare la soluzione HCR a 4 ° C per un paio di settimane; caldo a Rt la mattina del giorno dell&#39;intervento parabiotic. </li><li> Preparare 5 - 6 pipette Pasteur modificati per il trasferimentoanello blastula coppie. Brevemente riscaldare l&#39;estremità della pipetta su un becco Bunsen. Quindi, utilizzando grandi pinze, piegare l&#39;estremità della pipetta a circa 45 ° C mentre è ancora caldo. <ol><li> Per garantire non ci sono spigoli vivi che potrebbero danneggiare gli embrioni, tenere la punta della pipetta brevemente la fiamma per circa 3 sec. Questo sarà liscia / polacco alla fine della pipetta. Questo pipetta Pasteur di vetro modificato viene utilizzato in combinazione con una pompa pipetta 10 ml (Figura 1) al punto 3.5. </li></ol></li><li> Preparare strumenti ago di vetro per la cucitura chirurgica di coppie blastula. Pull 2 ​​- 3 aghi di vetro, come fatto per la microiniezione di embrioni di zebrafish. Utilizzare lab-pellicola per fissare ciascun ago di vetro al fine di un ago eccitante legna o plastica manico (Figura 1A). Utilizzando pinze, rompere l&#39;estremità dell&#39;ago a un diametro di circa 20 - 30 micron. Utilizzare un micrometro per guidare questo passaggio (Figura 1B). Nota: La dimensione del NEpunta edle è importante. Se la punta è troppo grande diventa difficile controllare con precisione e può causare danni eccessivi. Se la punta è troppo piccola, è difficile sufficientemente ferire gli embrioni. </li></ol> 2. Impostazione coppie nidificanti di Zebrafish e raccolta di embrioni (Giorno -1 al giorno 0) <ol><li> Impostare coppie nidificanti di zebrafish adulto. Impostare il pesce la sera prima della chirurgia parabiosis deve essere effettuata. Utilizzare divisori per separare maschi e femmine. Per aumentare le probabilità che gli embrioni desiderati saranno ottenuti, impostare diverse coppie di ogni linea. Troviamo che in genere 20 - 50% delle coppie si riproducono. </li><li> La mattina seguente, tirare i divisori e consentire l&#39;accoppiamento. Raccogliere eventuali embrioni usando una a maglia fine colino da tè, poi trasferirli in una capsula di Petri contenente E3 medio embrione 18. </li><li> Embrioni Micro-iniettare come desiderato (ad esempio, con 25 pg di DNA plasmidico, 200 pg mRNA, o: 1 - 6 ng morfolino) entro 1 ora di raccolta. permettere loro dicrescere fino a quando fase a 256 cellule. Se il costrutto di espressione del DNA è posto sotto il controllo di un promotore shock termico (ad esempio, hsp70, Figura 4B), controllano la tempistica di espressione genica dal calore shocking le parabionts a 37 ° C in una fase successiva (ad es., A 36 HPF ). Nota: In alternativa ad un transgene fluorescente, destrano fluorescente può essere aggiunto al DNA, RNA, o mix iniezione morfolino (ad esempio, destrano, blu cascata a 2 mg / ml). Il colorante destrano non interferirà con il normale sviluppo e consentirà per l&#39;embrione iniettato da identificare sotto la luce fluorescente appropriato dopo la fusione parabiotic. In alternativa, il parabiosis di un ceppo pigmentata (ad esempio, AB) con un ceppo non pigmentato (ad esempio, Casper) potrebbe essere utilizzato per identificare l&#39;embrione iniettato in fasi successive. </li><li> Incubare gli embrioni a 28,5 ° C.Use uno stereoscopio per monitorare il loro sviluppo periodicamente in quanto nei pressi del dev-256 cellulefase elopmental (circa 2,5 HPF). Nota: Se necessario, spostare gli embrioni a temperature diverse per garantire la corrispondenza fase tra i partner parabiotic (ad esempio, gli embrioni morpholino-iniettato spesso sviluppano più lentamente rispetto alle loro controparti non-iniettato Spostando gli embrioni non-iniettata per RT, mentre gli embrioni morpholino-iniettata sono collocati. a 28,5 ° C si tradurrà in loro fasi allineamento dopo un paio d&#39;ore di sviluppo). </li></ol> 3. Generazione di Parabiotic embrioni di zebrafish da fusione chirurgica di Sviluppo Blastulae <ol><li> Come gli embrioni si avvicinano alla fase 256 celle (circa 2,5 HPF), di trasferire gli embrioni da ogni background genetico (cioè, mutante genetico, linee transgeniche e / o manipolazione genetica) in piatti agarosio rivestite separate (per esempio, un piatto per morpholino- embrioni iniettati e un secondo piatto per gli embrioni di controllo). In alternativa, il trasferimento degli embrioni per la pulizia, bicchieri di vetro senza graffio o vetro piastre di Petri. Nota: evitare di utilizzare piatti di plastica non rivestite come gli embrioni che si attacchi alla plastica ed essere danneggiata una volta fuori dalle loro chorions. </li><li> Decantare il supporto E3 fino a poco abbastanza liquido rimane per coprire gli embrioni (circa 7 - 10 ml). Aggiungere 200 ml di 50 mg / ml della miscela di proteasi isolato dal liquido extracellulare di Streptomyces griseus (proteasi). Agitare delicatamente gli embrioni ogni paio di minuti. <ol><li> Quando il 50% degli embrioni sono usciti loro chorions, che prende tipicamente 5 - 10 min, risciacquarli tre volte con un volume generoso (circa 15 - 20 ml) di mezzo di E3 embrione fresco. <ol><li> Dechorionate eventuali embrioni rimasti nelle loro chorions trascinandoli delicatamente nella pipetta Pasteur di vetro modificato e poi delicatamente dissipare. Una volta che gli embrioni sono stati dechorionated e lavato, sostituire il supporto E3 con soluzione HCR. In alternativa alla proteasi, rimuovere le chorions manualmente utilizzando una pinza sottile. Obiettivo di avere 60 - 100 dechorembrioni ionated disponibili per ogni condizione sperimentale. Nota: Questo è molte volte più che in ultima analisi, essere usato, ma molti embrioni sono suscettibili di essere danneggiate durante la movimentazione o l&#39;intervento chirurgico per parabiosis. Una volta che gli embrioni sono dechorionated, tenerli sommerse e non permettere loro di toccare la superficie dell&#39;acqua, come la tensione superficiale causerà loro di essere distrutti. Tenete a mente che l&#39;utilizzo di una dose maggiore di proteasi permette embrioni a venire fuori dalle loro chorions più presto e in modo più sincronizzato. Quando si utilizza una dose minore di proteasi, gli embrioni richiedono più tempo per uscire dalla loro chorions e fanno in modo sincrono meno, che può risultare in una porzione degli embrioni essere danneggiato da una prolungata esposizione alle proteasi. </li></ol></li></ol></li><li> Scongelare la metilcellulosa (fatta al precedente punto 1.2) e centrifugare in una centrifuga da tavolo sulla velocità massima per 10 minuti per far sedimentare cristalli insoluti, che danneggiano gli embrioni o rompersi il tuorloS. <ol><li> Dopo centrifugazione, utilizzare la frazione superiore chiaro (circa il 75% del volume). Trasferimento 1-1,5 cm gocce del diametro di metilcellulosa in una capsula di Petri 1,5% agarosio rivestite. Fare attenzione ad evitare stesura qualsiasi cristalli pellettati dal fondo della provetta. </li><li> Utilizzare un marcatore per predeterminare la posizione di ogni gocciolina sul lato inferiore del piatto. Mettere 12 - 15 gocce (2 - del valore di 3 aliquote &#39;) di metilcellulosa ogni 100 mm di diametro piatto di Petri. Preparare come molti piatti come necessario per esperimento. Nota: utilizzare ogni goccia per la fusione di una singola coppia blastula. Il marchio designa la posizione di ogni goccia una volta che si aggiunge-in media che punto le gocce diventano quasi invisibili. </li></ol></li><li> Preparare un 40 ml un&#39;aliquota di soluzione HCR antibiotico-integrato per ogni piatto agarosio rivestite preparata sopra al punto 3.3. Per ogni 40 ml aliquota di HCR aggiungere penicillina-streptomicina a 50 U / ml, ampicillina a 50 U / ml, e kanamicina a 0.5 mg/ Ml. <ol><li> Quando si è pronti per eseguire blastula fusioni, riempire con cura ciascuno dei piatti contenenti goccioline metilcellulosa con 40 ml di soluzione HCR antibiotico-integrato. Se viene aggiunto troppo rapidamente la soluzione HCR, può disturbare le goccioline. </li></ol></li><li> Fissare la pipetta Pasteur di vetro modificata (fatta al precedente punto 1.4) ad una pompa pipetta 10 ml. Sotto uno stereoscopio raccogliere un embrione dechorionated da ogni background (ad esempio, un embrione morfolino-iniettata e una wild-type embrione). <ol><li> Prima di erogare i due embrioni, utilizzare la pipetta Pasteur di fare una piccola depressione nel mezzo della goccia metil cellulosa, poi delicatamente depositare due embrioni nella depressione. Nota: Durante il processo di trasferimento, ruotare la pipetta Pasteur leggermente verso l&#39;alto in modo che gli embrioni stabilirsi nella curva della pipetta Pasteur in modo da evitare il contatto making con la superficie del liquido nella parte superiore o inferiore della pipetta (che può portare a theiR rottura). </li></ol></li><li> Subito dopo aver depositato gli embrioni in metilcellulosa, utilizzare un ago eccitante legna o plastica manico con puntali gel di caricamento sulla estremità (Figura 1A) per riposizionare accuratamente gli embrioni all&#39;interno della metilcellulosa tale che i loro poli animali sono direttamente toccarsi. <ol><li> Utilizzare delicati movimenti radicali attraverso il metil cellulosa vicino agli embrioni per riposizionare loro senza toccarli direttamente. Lasciate che gli embrioni riposare per 5 minuti in modo che il metil cellulosa si assesterà intorno a loro. Durante questo tempo, caricare la coppia successiva in un&#39;altra goccia. Nota: evitare il contatto diretto con gli embrioni e prestare particolare attenzione a non toccare alcuna parte del sacco vitellino, che sarà facilmente rompersi. </li></ol></li><li> Utilizzando lo strumento ago di vetro, accuratamente avvolto ogni embrione al loro punto di contatto. Con un movimento di cucitura dolce, le cellule del primo embrione può essere tirato nel secondo embrione e poi di nuovo indietro.Al termine di questo movimento, tenere l&#39;ago in posizione per 2 - 3 secondi e quindi trascinare via molto lentamente. Nota: Vi è un periodo di circa 2 - 3 secondi dopo che gli embrioni sono feriti dove i due tessuti sembrano essere più adesivo e più probabile per collegare l&#39;uno all&#39;altro. Così, noi crediamo che tenere l&#39;ago in posizione brevemente dopo il ferimento aiuta a mantenere i tessuti feriti di ogni embrione in contatto per il periodo iniziale di tempo subito dopo il ferimento. </li><li> Lasciare questi embrioni di sedersi per 10 - 15 minuti a temperatura ambiente. Nel frattempo, continuare a punto nuove coppie in altre gocce di metilcellulosa. Dopo 10 - 15 minuti, valutare se la prima coppia è rimasta attaccata (Figura 2A). Nota: Se gli embrioni sono più collegati, ripetere il processo di cucitura finché gli embrioni sono più giovani attorno al palco epiboly 30%. In genere questo permette fino a tre tentativi di cucire gli embrioni insieme. Se gli embrioni sembrano aver mantenuto un allegato ma il connection non è sostanziale, eseguire ulteriori cuciture sul bordo della connessione per rinforzarlo. Evitare di scuotere o spostare i piatti durante i periodi di chirurgia e di incubazione parabiotic. Nota: Nonostante la loro fase iniziale di sviluppo e fragilità percepita, le masse cellulari dei embrioni possono tollerare una notevole quantità di manipolazione (cioè, ferendo e cuciture), e ancora svilupparsi normalmente. Il tuorlo, tuttavia, può rompersi con solo il minimo tocco, uccidendo l&#39;embrione. Quando le due cuciture blastulae con l&#39;ago di vetro, non di entrare in contatto con l&#39;interfaccia tra la massa cellulare e tuorlo di ogni embrione. </li><li> Incubare gli embrioni O / N a 28,5 ° C nello stesso piatto e dei media (non modificare la media). Il mattino seguente, gli embrioni sono spostati fuori delle goccioline metil cellulosa prevalentemente disciolti. Rimuovere eventuali embrioni che non sono stati fusi con successo. Decantare i media e sostituirlo con un nuovo 25 ml E3. Nota: Se si lavora con unceppo pigmentata, aggiungere 500 microlitri phenylthiourea 0,15% (50x) (PTU) ad una concentrazione finale di 0,003% per bloccare la pigmentazione. Gli embrioni dovranno restare costantemente in PTU per mantenere la soppressione di pigmentazione. </li></ol> 4. Configurazione Microscopio, Immagine acquisizione, elaborazione e analisi <ol><li> Preparare 0,8% agarosio a basso punto di fusione (LMP): Aggiungere 0,8 g LMP agarosio a 100 ml E3 e di calore fino a completo scioglimento. Mentre caldo, aliquota 1 ml di LMP agarosio in provette da 1,5 ml microcentrifuga in C blocco riscaldante 37 °. L&#39;agarosio LMP rimarrà fuso a 37 ° C. Aggiungere 40 ml di 4 mg / ml (25x), pH 7,0 tricaine ad ogni 1 ml aliquota di LMP agarosio a 37 ° C. Nota: Se si lavora con un ceppo pigmentata, aggiungere 20 ml di 0,15% (50x) PTU per ogni aliquota 1 ml. <ol><li> Conservare il restante LMP agarosio per diversi mesi in sigillati provette da 50 ml a 4 ° C. </li></ol></li><li> Anestetizzare gli embrioni parabiotic per essere ripreso con l&#39;aggiunta di 1 ml di 4 mg / ml (25x), pH 7,0 tricaineai 25 ml di E3 che gli embrioni sono già in. </li><li> Agitare delicatamente il piatto in modo che gli embrioni piscina in mezzo. Quindi, utilizzando una pipetta di trasferimento di plastica a livello di punta elaborare gli embrioni in appena liquido possibile. Girare la pipetta in posizione verticale e rimbalzare delicatamente gli embrioni in modo che essi depositano sul fondo della pipetta. <ol><li> Con gli embrioni nella parte inferiore della pipetta, trasferirli ad un&#39;aliquota di 1 ml di agarosio LMP toccando leggermente la punta della pipetta alla superficie del agarosio. Evitare di trasferire il liquido in eccesso come questo diluire il agarosio. </li></ol></li><li> Dopo l&#39;espulsione del liquido in eccesso dalla pipetta, utilizzare la pipetta per mescolare delicatamente gli embrioni all&#39;interno del agarosio, quindi utilizzare la pipetta per trasferire tutto il agarosio e embrioni al pozzo di un fondo di vetro (No. 1.5 vetrino), 6- pozzetti. Nota: Assicurarsi di scartare la pipetta dopo il trasferimento degli embrioni alla piastra di imaging. agarosio residua imposterà all&#39;interno della pipetta, rendering inefficace per ulteriore uso. Piuttosto, utilizzare una nuova pipetta ogni volta. </li><li> In uno stereoscopio, utilizzare un puntale gel-loading fisso sull&#39;estremità di un ago eccitante manico legno per posizionare gli embrioni verso il vetro di copertura (per garantire che siano all&#39;interno della distanza di lavoro del obiettivo microscopio) e nell&#39;orientamento desiderato per l&#39;imaging. Nota: Riposizionare continuamente fino l&#39;agarosio si è completamente impostata. Fare attenzione a montare gli embrioni parabiotic secondo cui embrione della coppia è quello di essere ripreso. Dato l&#39;orientamento casuale degli embrioni siamesi, per alcune coppie può essere difficile immagine entrambe embrioni. In questo scenario, recuperare gli embrioni dal agarosio utilizzando una pinza e una vasta a punta pipetta di trasferimento di plastica e poi rimontare per l&#39;imaging da una prospettiva diversa. </li><li> Una volta che l&#39;agarosio si è impostato, coprire con 2 - 3 ml di E3 integrato con tricaine (e PTU se necessario). </li><li> Immagine gli embrioni utilizzando una rovesciata a grande campo epi-fluorescenza, lasconfocale er-scansione o disco rotante microscopio confocale. Selezionare l&#39;obiettivo più appropriato per imaging desiderata. Per un campo intero embrione di vista, utilizzare un obiettivo 4x. Selezionare un ingrandimento superiore, come un obiettivo 20x, all&#39;immagine un tessuto specifico 16, 19. Nota: Se si utilizza un microscopio in posizione verticale, il montaggio a LMP agarosio (simile al precedente) su un vetrino di vetro. Capovolgere il vetrino di vetro su un vetrino da microscopio in vetro che ha un anello di grasso per vuoto riempito con lo stesso E3-tricaine-PTU 16, 19. </li><li> Processo di immagini utilizzando libere pacchetti software di analisi delle immagini, quali NIH Immagine J / FIJI 16, 19 acquisito. Nota: Contare il numero di cellule e quantificare le dinamiche quali la migrazione delle cellule e la divisione cellulare utilizzando la segmentazione e monitoraggio di algoritmi di 16, 19. </li></ol>

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H., Orb&#225;n, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-inducible+expression+of+a+reporter+gene+detected+by+transient+assay+in+zebrafish.">Heat-inducible expression of a reporter gene detected by transient assay in zebrafish.</a> Exp. Cell Res. 256 (1), 282-290 (2000).</li></ol>

The authors declare that they have no conflict of interest.

Fusion Parabiotic è stato un potente strumento per studiare le funzioni cellulari di geni candidati in modelli murini adulti e embrioni di pollo 10-14. Più di recente, un metodo di fusione blastula è stata descritta per la generazione di embrioni di zebrafish siamesi 15. Nel presente protocollo, video tutorial-based sono utilizzati per dimostrare e meglio descrivere la metodologia per la creazione di parabiotic embrioni di zebrafish di diversi background genetico al fine di studiare i ruoli temp...

La creazione di mosaici genetici (chimere) tra wild-type e animali geneticamente modificati è una strategia ben consolidata e classica per indagare cellule intrinseca contro le funzioni delle cellule-estrinseca di geni candidati 1-6. Blastula trapianto in zebrafish è stato ampiamente utilizzato per generare embrioni chimerici per gli studi di cellule-autonomia 7-9. A seconda del tessuto di interesse, tuttavia, può essere difficile per indirizzare prevedibile cellule del donatore al tessuto desiderato (ad esempio, sangue) 1-3, 7-9. Genetisti mouse hanno a lungo utilizzato metodi chirurgici parabiotic per generare organismi congiunti con una tiratura condiviso 10-14. Perché gli animali parabiotic condividono un flusso sanguigno comune, le interazioni tra le cellule che ha avuto origine da un animale con cellule del altro animale di un diverso background genetico possono essere studiati 10-16. Di recente, il gruppo di Karima Kissa elegantemente dimostrato la capacità di create embrioni di zebrafish siamesi e quindi utilizzare questo sistema per studiare staminali ematopoietiche e la migrazione 15 cellule progenitrici (HSPC). Inoltre, parabiosis zebrafish è stato recentemente utilizzato per studiare il ruolo della caderina endoteliali 5 di cellule staminali ematopoietiche (HSC) comparsa e la migrazione, e 16 per studiare il ruolo delle cellule stromali nella nicchia HSPC durante lo sviluppo zebrafish 17. A differenza di topi, embrioni di zebrafish sono trasparenti e consentono la visualizzazione diretta delle cellule durante lo sviluppo parabiotic, rendendo il sistema unico potente. L&#39;utilità di parabiosis in zebrafish, tuttavia, è limitato da una ripida curva di apprendimento, e la chirurgia parabiotic sugli embrioni delicati può essere tecnicamente impegnativo, senza istruzioni dettagliate e dimostrazione visiva. L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di fornire una serie di chiare istruzioni passo-passo per accompagnare video tutorial basati su come generare embrioni di zebrafish parabiotic per lo studiotemporale, cellule intrinseca, o funzioni delle cellule-estrinseca di un gene candidato (s) dalla fusione chirurgica di sviluppare blastulae. modifiche chiave e ulteriori raccomandazioni per aumentare la sopravvivenza parabiont e nuove applicazioni sperimentali sono inclusi.

<table><tbody><tr><td>Methyl cellulose</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Individual components for E3/HCR:</td><td></td><td>For 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 1,99g MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (Sodium chloride)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>KCl (Potassium chloride)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (Calcium chloride dihydrate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (Magnessium sulfate heptahydrate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (1M ) buffer solution</td><td>ThermoFisher</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibiotics:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>gibco by Life technologies</td><td>15140-120</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin sodium salt</td><td>Sigma Life Science</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus</td><td>Sigma Life Science</td><td>K1377</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>50 mg/ml Pronase from Streptomyces griseus</td><td>Roche</td><td>11459643001</td><td></td></tr><tr><td>capillary glass used for needles (Capillary Glass &amp;amp; Filaments)</td><td>Sutter Instrument</td><td>ITEM#: BF 100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Teasing needles with wooden handles</td><td>Fisher Scientific</td><td>S07894</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipettes</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor)</td><td>Novatech International</td><td>F37898-0000</td><td></td></tr><tr><td>100 mm diameter/ 20 mm deep plastic petri dishes (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS,&lt;br/&gt; HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG )</td><td>Greiner Bio-one</td><td>664102</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td><td>ThermoFisher</td><td>D-1976</td><td></td></tr><tr><td>PTU. working stock is 0.003% (50x is 0.15%). for 500 ml, 0.75 g N-Phenylthiourea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S)</td><td>Western Chemical Inc</td><td>MS 222</td><td></td></tr><tr><td>LMP agarose (Ultrapure LMP agarose)</td><td>Invitrogen</td><td>16520100</td><td></td></tr><tr><td>plastic transfer pipette (just the wide ended one I think)</td><td>Fisherbrand</td><td>137115AM</td><td></td></tr><tr><td>Glass-bottom 6-well plates used for imaging</td><td>MatTek</td><td>P06G1.5-20-F</td><td></td></tr><tr><td>plastic western gel loading tip fixed on the end of a wood-handled dissecting needle (GELoader tips)</td><td>Eppendorf</td><td>22351656</td><td></td></tr><tr><td>glass cover slips, slides and vacuum grease if mounting for an upright microscope:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vaccum grease ( Dow Corning&amp;reg; high-vacuum silicone grease&lt;br/&gt; colorless, weight 5.3 oz (tube) )</td><td>Dow Corning</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>Glass cover slips</td><td>Corning Life Sciences</td><td>2960-244</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of parabiotic zebrafish embryos by surgical fusion of developing blastulae

parabiosis chirurgica di due animali di differenti background genetico crea uno scenario unico per lo studio delle cellule-intrinseco rispetto a ruoli di cellule-estrinseca per geni candidati di interesse, i comportamenti migratori delle cellule, e segnali secreti in contesti genetici distinti. Perché gli animali parabiotic condividono una circolazione comune, il sangue o fattore ematica da un animale saranno scambiati con il suo partner e viceversa. Così, cellule e fattori molecolari derivate da uno sfondo genetico possono essere studiati nel contesto di una seconda background genetico. Parabiosis di topi adulti è stato ampiamente utilizzato per l&#39;invecchiamento della ricerca, il cancro, il diabete, l&#39;obesità, e lo sviluppo del cervello. Più di recente, parabiosis di embrioni di zebrafish è stato utilizzato per studiare la biologia dello sviluppo di emopoiesi. In contrasto con i topi, la natura trasparente di embrioni di zebrafish permette la visualizzazione diretta delle cellule nel contesto parabiotic, che lo rende un metodo unico potente per indagare fmeccanismi cellulari e molecolari FONDAMENTALI. L&#39;utilità di questa tecnica, tuttavia, è limitata da una curva di apprendimento ripida per generare gli embrioni zebrafish parabiotic. Questo protocollo fornisce un metodo passo-passo su come fondere chirurgicamente la blastulae di due embrioni di zebrafish di diversi background genetici per studiare il ruolo dei geni candidati di interesse. Inoltre, gli embrioni di zebrafish parabiotic sono tolleranti a shock termico, rendendo il controllo temporale dell&#39;espressione genica possibile. Questo metodo non richiede un sofisticato set-up e ha ampie applicazioni per lo studio migrazione delle cellule, specifica il destino, e la differenziazione in vivo durante lo sviluppo embrionale.

In linea con gli studi pubblicati in precedenza 15, con successo la fusione parabiotic di embrioni di zebrafish dipende la messa in scena e l&#39;orientamento dei due embrioni e la concentrazione di metilcellulosa. Con pochi e semplici, poco costosi strumenti, blastulae in via di sviluppo chirurgicamente fuse sono stati generati che è cresciuta in embrioni parabiotic con circolazione condiviso. Questi strumenti inclusi una pipetta Pasteur modificato, una pompa pipetta 10 ml, ...

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Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.

Generazione di Parabiotic embrioni di zebrafish da fusione chirurgica di Sviluppo Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

generation-parabiotic-zebrafish-embryos-surgical-fusion-developing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.5K Views.  Boston Children’s Hospital. This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.

Video: Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microperla impianto nel zebrafish

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Generare embrioni di zebrafish Chimerico da trapianto

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Biologia

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

Tessuto Chimere mirate embrionali: Zebrafish gastrula trapianto di cellule

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Spinal Cord transezione nel larvale Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Neuroscienze

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

Il trapianto di GFP che esprimono blastomeri per dell&#39;immagine in tempo reale dello sviluppo della retina e del cervello in embrioni di zebrafish Chimerico

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

Un dispositivo di trapianto semplice ed efficace per embrioni di zebrafish

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

Generation of Na&#239;ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. However, because of the complexity and redundancy of embryonic signals, it can be challenging to discern the complete role of any single signal during early embryogenesis. By explanting the animal region of the zebrafish blastoderm, relatively na&#239;ve clusters of embryonic cells are generated that can be easily cultured and manipulated ex vivo. By introducing a gene of interest by RNA injection before explantation, one can assess the effect of this molecule on gene expression, cell behaviors, and other developmental processes in relative isolation. Furthermore, cells from embryos of different genotypes or conditions can be combined in a single chimeric explant to examine cell/tissue interactions and tissue-specific gene functions. This article provides instructions for generating zebrafish blastoderm explants and demonstrates that a single signaling molecule - a Nodal ligand - is sufficient to induce germ layer formation and extension morphogenesis in otherwise na&#239;ve embryonic tissues. Due to their ability to recapitulate embryonic cell behaviors, morphogen gradients, and gene expression patterns in a simplified ex vivo system, these explants are anticipated to be of great utility to many zebrafish researchers.

Zebrafish blastoderm explants are generated by isolating embryonic cells from endogenous signaling centers within the early embryo, producing relatively na&#239;ve cell clusters easily manipulated and cultured ex vivo. This article provides instructions for making such explants and demonstrates their utility by interrogating roles for Nodal signaling during gastrulation.

Generazione di espianti di blastoderma naïve da embrioni di zebrafish

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. ...

<meta charset="utf8"></head><body>Robusto trapianto di cellule di pesce zebra per la ricerca sulla rigenerazione e lo sviluppo

High-resolution Cell Transplantation in Embryonic and Larval Zebrafish

Development and regeneration occur by a process of genetically encoded spatiotemporally dynamic cellular interactions. The use of cell transplantation between animals to track cell fate and to induce mismatches in the genetic, spatial, or temporal properties of donor and host cells is a powerful means of examining the nature of these interactions. Organisms such as chick and amphibians have made crucial contributions to our understanding of development and regeneration, respectively, in large part because of their amenability to transplantation. The power of these models, however, has been limited by low genetic tractability. Likewise, the major genetic model organisms have lower amenability to transplantation. 
The zebrafish is a major genetic model for development and regeneration, and while cell transplantation is common in zebrafish, it is generally limited to the transfer of undifferentiated cells at the early blastula and gastrula stages of development. In this article, we present a simple and robust method that extends the zebrafish transplantation window to any embryonic or larval stage between at least 1 and 7 days post fertilization. The precision of this approach allows for the transplantation of as little as one cell with near-perfect spatial and temporal resolution in both donor and host animals. While we highlight here the transplantation of embryonic and larval neurons for the study of nerve development and regeneration, respectively, this approach is applicable to a wide range of progenitor and differentiated cell types and research questions.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Mappatura della connettività cellulare nel sistema nervoso del pesce zebra durante lo sviluppo e la rigenerazione

Here we present a protocol to transplant cells with high spatial and temporal resolution in zebrafish embryos and larvae at any stage between at least 1 and 7 days post fertilization.

Trapianto di cellule ad alta risoluzione in zebrafish embrionale e larvale

Development and regeneration occur by a process of genetically encoded spatiotemporally dynamic cellular interactions. The use of cell transplantation ...

Generazione di Parabiotic embrioni di zebrafish da fusione chirurgica di Sviluppo Blastulae

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