We thank Julie R. Perlin for helpful comments on the manuscript. D.I.S. is supported by grants from the American Society of Hematology, the Cooley's Anemia Foundation, and the NIH (K01DK085217 and R03DK100672). E.J.H. is a Howard Hughes Medical Institute Fellow of the Helen Hay Whitney Foundation. B.L. is a Howard Hughes Medical Institute Medical Research Fellow. B.W.B. is supported by an Irvington Fellowship from the Cancer Research Institute and a Young Investigator Award from the Conquer Cancer Foundation of ASCO. L.I.Z. is supported by grants from the NIH (R01CA103846, P01HL032262, and R01HL04880), Taub Foundation for MDS Research, Harvard Stem Cell Institute, and is an investigator of the Howard Hughes Medical Institute.

Este protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Hospital Infantil de Boston. Este protocolo se modificó a partir de un método publicado previamente 15. 1. Preparación de los reactivos (días o semanas de anticipación) <ol><li> Preparar 1,5% de agarosa recubiertas de platos. Añadir 1,5 g de agarosa a 100 ml de medio de pez cebra E3 en un matraz Erlenmeyer. El calor, disolver la agarosa, y luego vierta aproximadamente 5 ml en 100 mm de diámetro x 20 mm placas de Petri profundas. Nota: Estos se utilizan para dechorionation de embriones (Paso 3.1) y para la cirugía parabiotic (paso 3.3). Almacenar placas revestidas con agarosa a 4 ° C durante unas semanas; sacarlos de la nevera y calentar a ta la mañana del día de la cirugía parabiotic. </li><li> Preparar 4% de celulosa de metilo. Disolver 4 g de polvo de metilcelulosa en 100 ml de E3 en un matraz Erlenmeyer con una barra de agitación. Colocar el matraz en una placa de agitación a 4 ° C, ajuste a la velocidad más baja, y dejar que se mezclepara un máximo de 2 días. <ol><li> utilizar de forma intermitente una espátula para romper los grumos blancos de metilcelulosa. Los cristales metil celulosa no se disuelven completamente a esta concentración. Cuando la solución se vuelva clara y aparece homogénea sin grumos blancos restante, parte alícuota de la solución en 1,5 ml tubos de microcentrífuga y se congelan a -20 ° C para almacenamiento a largo plazo. Nota: Las concentraciones más bajas de metil celulosa se pueden utilizar; Sin embargo, este porcentaje más alto, más viscosa de celulosa de metilo ha dado los mejores resultados. </li></ol></li><li> Preparar la solución de Ringer alta de calcio (HCR). Para hacer 400 ml de solución HCR, mezcla 8 ml de NaCl 5 M (116 mM final), 400 l de 3M KCl (2,9 mM final), 800 l de 5M de CaCl2 (10 mM final), y 2 ml de HEPES 1 M (5 mM final) con 390 ml de medio E3. Nota: La solución de tienda HCR a 4 ° C durante unas semanas; calentar a ta la mañana del día de la cirugía parabiotic. </li><li> Preparar 5 - 6 pipetas Pasteur modificados para la transferenciasonar blástula pares. Brevemente calentar el extremo de la pipeta sobre un mechero Bunsen. Entonces, el uso de grandes pinzas, doblar el extremo de la pipeta a aproximadamente 45 ° C mientras todavía está caliente. <ol><li> Para asegurarse de que no hay bordes afilados que puedan dañar embriones, sostenga la punta de la pipeta brevemente en la llama durante unos 3 seg. Esto suavizará / esmalte al final de la pipeta. Esta pipeta Pasteur de vidrio modificada se utiliza en conjunción con una bomba de pipeta 10 ml (Figura 1) en el paso 3.5 a continuación. </li></ol></li><li> Preparar herramientas de aguja de vidrio para la costura quirúrgica de pares de blástula. Tire 2 - 3 agujas de vidrio como se hizo para la microinyección de embriones de pez cebra. Utilizar el laboratorio de película para fijar cada aguja de vidrio en el extremo de una aguja burlas leña o con mango de plástico (Figura 1A). El uso de pinzas, rompa el extremo de la aguja en un diámetro de aproximadamente 20 - 30 micras. Use un micrómetro de platina para guiar este paso (Figura 1B). Nota: El tamaño del needle punta es importante. Si la punta es demasiado grande se hace difícil de controlar con precisión y puede causar un daño excesivo. Si la punta es demasiado pequeño, es difícil bobinado suficientemente los embriones. </li></ol> 2. La creación de parejas reproductoras de pez cebra y percepción de los embriones (día -1 al día 0) <ol><li> Configurar parejas de adultos de pez cebra. Configurar el pescado la noche anterior se va a realizar la cirugía parabiosis. Utilice divisores para separar machos y hembras. Para aumentar las probabilidades de que se obtengan los embriones deseados, la creación de varias parejas de cada línea. Nos encontramos con que normalmente 20 - 50% de las parejas se generan. </li><li> A la mañana siguiente, tire de los divisores y permitir el apareamiento. Recoger los embriones utilizando un colador de té de malla fina, y luego transferirlos a una placa de Petri que contiene medio de embrión E3 18. </li><li> Micro-inyectar embriones como desee (por ejemplo, con 25 pg de ADN de plásmido, el ARNm pg 200, o con 1 a 6 ng morfolino) dentro de 1 h de colección. Permitirlescrecer hasta la etapa 256 de células. Si la construcción de expresión de ADN se coloca bajo el control de un promotor de choque térmico (por ejemplo, la hsp70, la Figura 4B), controlar el momento de la expresión génica por desconchado térmico los parabionts a 37 ° C en una etapa posterior (por ejemplo., En 36 hpf ). Nota: Como alternativa a un transgén fluorescente, dextrano fluorescente se puede añadir a la DNA, RNA, o la mezcla de inyección de morfolino (por ejemplo, dextrano, azul cascada a 2 mg / ml). El tinte de dextrano no interfiere con el desarrollo normal y permitirá el embrión inyectado para ser identificado bajo la luz fluorescente apropiada después de la fusión parabiotic. Alternativamente, la parabiosis de una cepa pigmentado (por ejemplo, AB) con una cepa no pigmentado (por ejemplo, Casper) podría ser utilizado para identificar el embrión inyectado en etapas posteriores. </li><li> Incubar los embriones a 28,5 ° C.Use un estereoscopio para controlar su evolución periódicamente a medida que se acercan al dev-256 célulaselopmental etapa (aproximadamente 2,5 HPF). Nota: Si es necesario, cambiar los embriones a diferentes temperaturas para garantizar la coincidencia de fase entre los socios parabiotic (por ejemplo, embriones de morfolino-inyectada a menudo desarrollan más lento que sus contrapartes de la ONU con inyección de desplazamiento de los embriones de la ONU-inyectada a RT mientras que los embriones de morfolino-inyectada se colocan. a 28,5 ° C resultará en sus etapas de alineación después de un par de horas de desarrollo). </li></ol> 3. Generación de Parabiotic embriones de pez cebra por fusión quirúrgica de Desarrollar blástulas <ol><li> Como los embriones se acercan a la etapa 256 de células (aproximadamente 2,5 hpf), la transferencia de los embriones de cada fondo genético (es decir, mutante genético, líneas transgénicas y / o la manipulación genética) en placas de agarosa recubiertas de separados (por ejemplo, un plato de morfolino embriones inyectados y un segundo plato para el control de embriones). Por otra parte, la transferencia de los embriones para limpiar, vasos de vidrio libre de arañazos o platos de Petri de vidrio. Nota: Evitar el uso de placas de plástico no revestidas como los embriones se adhieren al plástico y dañarse una vez fuera de sus chorions. </li><li> Decantar los medios de comunicación E3 hasta justo suficiente líquido permanece para cubrir los embriones (aproximadamente 7 - 10 ml). Añadir 200 l de 50 mg / ml de mezcla de proteasas aislados del fluido extracelular de Streptomyces griseus (proteasas). Agitar suavemente los embriones cada par de minutos. <ol><li> Cuando el 50% de los embriones han salido de sus corion, que por lo general tarda de 5 - 10 minutos, enjuagar tres veces con un volumen generoso (aproximadamente 15 - 20 ml) de medio E3 de embriones frescos. <ol><li> Dechorionate los embriones restantes en sus chorions dibujando suavemente hacia arriba en la pipeta Pasteur de vidrio modificado y luego suavemente disiparlas. Una vez que los embriones se han dechorionated y lavado, vuelva a colocar los medios de comunicación E3 con una solución de HCR. Como una alternativa a las proteasas, retire los chorions forma manual utilizando una pinza fina. Trate de tener 60 - 100 dechorembriones ionated disponibles para cada condición experimental. Nota: Esta es varias veces más que en última instancia ser utilizado, pero muchos embriones son propensos a sufrir daños durante la manipulación o la cirugía para la parabiosis. Una vez que los embriones se dechorionated, mantenerlos sumergidos y no permita que se toquen la superficie del agua, ya que la tensión superficial causará que sean destruidos. Tenga en cuenta que el uso de una dosis más alta de las proteasas permite que los embriones salen de sus chorions más pronto y de una forma más sincronizada. Cuando se utiliza una dosis más baja de las proteasas, los embriones toman más tiempo para salir de sus chorions y lo hacen de una manera síncrona menos, lo que puede resultar en una parte de los embriones ser dañado por la exposición prolongada a proteasas. </li></ol></li></ol></li><li> Descongelar la metilcelulosa (hecho en el paso 1.2 anterior) y se centrifuga en una centrífuga de mesa de la velocidad máxima durante 10 minutos para sedimentar los cristales sin disolver que dañarán los embriones o la ruptura de su yemas. <ol><li> Después de la centrifugación, utilice la fracción superior clara (aproximadamente 75% del volumen). Transfer 1 - gotas de diámetro 1,5 cm de metil celulosa en una placa Petri recubierta de agarosa 1,5%. Tenga cuidado de evitar la elaboración de cualquiera de los cristales sedimentadas desde el fondo del tubo. </li><li> Use un marcador para predeterminar la posición de cada gota en la parte inferior del plato. Coloca 12 - 15 gotas (2 - 3 por valor de alícuotas &#39;) de metil celulosa por 100 mm placa de Petri de diámetro. Preparar tantas placas como sea necesario por experimento. Nota: Use cada gota para la fusión de un solo par de blástula. La marca designará la ubicación de cada gotita vez se añade-en el punto de medios de comunicación que las gotas se convierten casi invisible. </li></ol></li><li> Preparar uno 40 ml alícuota de solución HCR antibiótico suplementada por placa de agarosa recubiertas de preparado anteriormente en el paso 3.3. A cada 40 ml alícuota de HCR añadir penicilina-estreptomicina a 50 U / ml, ampicilina a 50 U / ml, y kanamicina a 0,5 g/ Ml. <ol><li> Cuando esté listo para realizar fusiones de blástula, llenar cuidadosamente cada uno de los platos que contienen gotitas de celulosa de metilo con 40 ml de la solución de antibiótico HCR-suplementado. Si se añade la solución HCR demasiado rápido, puede interrumpir las gotas. </li></ol></li><li> Una el vidrio modificado pipeta Pasteur (hecho en el paso 1.4 anterior) a una bomba de pipeta 10 ml. En un estereoscopio recoger un embrión dechorionated de cada plano (por ejemplo, un embrión morfolino-inyectado y uno de tipo salvaje embriones). <ol><li> Antes de dispensar los dos embriones, utilizar la pipeta Pasteur para hacer una pequeña depresión en el medio de la caída de metil celulosa, luego suavemente depositar ambos embriones en la depresión. Nota: Durante el proceso de transferencia, gire la pipeta Pasteur ligeramente hacia arriba para que los embriones se depositan en la curva de la pipeta Pasteur a fin de evitar su toma de contacto con la superficie del líquido en la parte superior o inferior de la pipeta (que puede conducir a their ruptura). </li></ol></li><li> Inmediatamente después de depositar los embriones en el metilcelulosa, utilizar una aguja burlas leña o con mango de plástico con una punta de pipeta de carga de gel en el extremo (Figura 1 A) para volver a colocar cuidadosamente los embriones dentro de la metilcelulosa tal manera que sus polos animales son directamente tocarse. <ol><li> Utilizar suaves movimientos de barrido a través de la metilcelulosa cerca de los embriones para cambiar su posición sin tocar directamente. Deje que los embriones se sientan durante 5 minutos por lo que la metilcelulosa se instalará en torno a ellos. Durante este tiempo, cargue el siguiente par en otra gota. Nota: Evitar el contacto directo con los embriones y tener especial cuidado de no tocar ninguna parte del saco vitelino, que se romperá fácilmente. </li></ol></li><li> Con la herramienta de aguja de vidrio, la herida cuidadosamente cada embrión en su punto de contacto. Con un movimiento suave de costura, las células de la primera embriones pueden introducirse en el segundo embrión y luego de vuelta otra vez.Al final de este movimiento, mantener la aguja en el lugar durante 2 - 3 segundos y después alejarla muy lentamente. Nota: Hay un período de aproximadamente 2 a 3 segundos después de los embriones son heridas donde los dos tejidos parecen ser más adhesivo y más probable para unir el uno al otro. Por lo tanto, creemos que la celebración de la aguja en su lugar brevemente después de la herida ayuda a mantener los tejidos heridos de cada embrión en contacto durante el período inicial de tiempo inmediatamente después de la herida. </li><li> Permitir que estos embriones para sentarse durante 10 - 15 min a TA. Mientras tanto, seguir puntadas nuevos pares en otras gotas de metil celulosa. Después de 10-15 min, evaluar si el primer par se ha mantenido adjunto (Figura 2A). Nota: Si los embriones son ya unidos, repetir el proceso de costura durante el tiempo que los embriones son menores de alrededor del escenario epibolia 30%. Normalmente, esto permite hasta tres intentos para coser los embriones juntos. Si los embriones parecen haber mantenido un archivo adjunto pero la cone xión no es sustancial, realizar la costura adicional en el borde de la conexión para reforzarla. Evite agitar o mover los platos durante los períodos de incubación y de cirugía parabiotic. Nota: A pesar de su etapa de desarrollo temprano y fragilidad percibido, las masas de células de los embriones pueden tolerar una cantidad sustancial de manipulación (es decir, heridas y la costura), y aún desarrollarse normalmente. La yema de huevo, sin embargo, puede romperse con sólo el más mínimo contacto, causando la muerte del embrión. Cuando coser las dos blástulas con la aguja de vidrio, no para hacer contacto con la superficie de contacto entre la masa celular y la yema de cada embrión. </li><li> Incubar los embriones O / N a 28,5 ° C en el mismo plato y medios de comunicación (no cambie los medios de comunicación). Por la mañana siguiente, los embriones se han mudado de las gotitas de metil celulosa sobre todo disueltos. Retire cualquier embriones que no fueron fusionadas con éxito. Decantar los medios de comunicación y reemplazar con una fresca 25 ml E3. Nota: Si se trabaja con unacepa pigmentada, añadir 500 l feniltiourea 0,15% (50x) (PTU) a una concentración final de 0,003% para bloquear la pigmentación. Los embriones deberán permanecer continuamente en la PTU para mantener la supresión de la pigmentación. </li></ol> 4. Configuración del microscopio, adquisición de imágenes, procesamiento y análisis <ol><li> Preparar agarosa al 0,8% de bajo punto de fusión (LMP): Añadir 0,8 g de agarosa LMP a 100 ml E3 y el calor hasta que esté completamente disuelto. Si bien caliente, alícuota de 1 ml de agarosa LMP en 1,5 ml tubos de microcentrífuga en un bloque de calentamiento de 37 ° C. La agarosa LMP permanecerá fundido a 37 ° C. Añadir 40 l de 4 mg / ml (25x), pH 7,0 tricaína a cada alícuota de 1 ml de agarosa LMP a 37 ° C. Nota: Si se trabaja con una cepa pigmentada, se añaden 20 l de 0,15% (50x) PTU a cada alícuota de 1 ml. <ol><li> Almacenar la agarosa LMP restante durante varios meses en tubos de 50 ml sellados a 4 ° C. </li></ol></li><li> Anestesie embriones parabiotic a ser fotografiado mediante la adición de 1 ml de 4 mg / ml (25x), pH 7,0 tricaínaa los 25 ml de E3 que los embriones ya en lo son. </li><li> Hacer girar suavemente el plato de manera que los embriones pondrán en común en el medio. Luego, utilizando una pipeta de transferencia de plástico con puntas anchas elaborar los embriones en tan poco líquido como sea posible. Girar la pipeta en posición vertical y rebotar suavemente los embriones para que se depositan en el fondo mismo de la pipeta. <ol><li> Con los embriones en la parte inferior de la pipeta, transferirlos a una alícuota de 1 ml de agarosa LMP tocando ligeramente la punta de pipeta a la superficie de la agarosa. Evitar la transferencia de líquido en exceso ya que esto va a diluir la agarosa. </li></ol></li><li> Después de expulsar el exceso de líquido de la pipeta, use la pipeta para mezclar suavemente los embriones dentro de la agarosa, a continuación, utilizar la pipeta para transferir la totalidad de la agarosa y embriones para el bienestar de un fondo de vidrio (Nº 1.5 cubreobjetos), 6- así placa. Nota: Asegúrese de desechar la pipeta después de transferir los embriones a la placa de imagen. agarosa residual se establece dentro de la pipeta, rendering ineficaz para su uso posterior. Más bien, utilizar una pipeta nueva cada vez. </li><li> En virtud de un estereoscopio, utilizar una punta de pipeta de carga de gel fijado en el extremo de una aguja burlas mango de madera para colocar los embriones hacia abajo hacia la cubierta de vidrio (para asegurar que están dentro de la distancia de trabajo del objetivo de microscopio), y en la orientación deseada para formación de imágenes. Nota: Vuelva a colocar de forma continua hasta que la agarosa se ha establecido plenamente. Tenga cuidado para montar los embriones parabiotic según la cual el embrión de la pareja es a explorar. Dada la orientación aleatoria de los embriones unidos, para algunos pares puede ser difícil de imagen ambos embriones. En este escenario, la recuperación de los embriones a partir de la agarosa utilizando unas pinzas y una pipeta de transferencia de plástico con puntas anchas y luego volver a montar para obtener imágenes desde una perspectiva diferente. </li><li> Una vez que la agarosa se ha puesto, cubrir con 2 - 3 ml de E3 suplementado con tricaína (y PTU si es necesario). </li><li> Imagen los embriones utilizando un campo amplio epi-fluorescencia invertido, lasconfocal de barrido-er, o girando el disco microscopio confocal. Seleccionar el objetivo más apropiada para la formación de imágenes deseado. Para un campo de todo el embrión de vista, utilice un objetivo de 4x. Seleccionar un aumento mayor, tal como un objetivo de 20x, a la imagen un tejido específico 16, 19. Nota: Si se utiliza un microscopio vertical, montar en LMP agarosa (similar al anterior) en una hoja de la cubierta de vidrio. Invertir el cubreobjetos sobre un portaobjetos de vidrio que tiene un anillo de grasa de vacío lleno con el mismo E3-tricaína-PTU 16, 19. </li><li> Proceso de las imágenes adquiridas utilizando paquetes de software de análisis de imágenes gratuitas, tales como NIH Image J / FIJI 16, 19. Nota: Contar el número de células y cuantificar la dinámica como la migración celular y la división celular utilizando la segmentación y el seguimiento de los algoritmos 16, 19. </li></ol>

<ol>
	<li>Zon, L. I., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoiesis:+An+evolving+paradigm+for+stem+cell+biology.">Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology.</a> Cell. 132 (4), 631-644 (2008).</li><li>Dzierzak, E., Speck, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+lineage+and+legacy:+the+development+of+mammalian+hematopoietic+stem+cells.">Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells.</a> Nat Immunol. 9 (2), 129-136 (2008).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epoxyeicosatrienoic+acids+enhance+embryonic+haematopoiesis+and+adult+marrow+engraftment.">Epoxyeicosatrienoic acids enhance embryonic haematopoiesis and adult marrow engraftment.</a> Nature. 523 (7561), 468-471 (2015).</li><li>Tam, P. P., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+embryonic+chimeras:+tools+for+studying+mammalian+development.">Mouse embryonic chimeras: tools for studying mammalian development.</a> Development. 130 (25), 6155-6163 (2003).</li><li>Tanaka, M., Gertsenstein, M., Rossant, J., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mash2+acts+cell+autonomously+in+mouse+spongiotrophoblast+development.">Mash2 acts cell autonomously in mouse spongiotrophoblast development.</a> Dev. Biol. 190 (1), 55-65 (1997).</li><li>Morin-Kensicki, E. M., Faust, C., LaMantia, C., Magnuson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+requirements+for+the+gene+eed+during+mouse+gastrulation+and+organogenesis.">Cell and tissue requirements for the gene eed during mouse gastrulation and organogenesis.</a> Genesis. 31 (4), 142-146 (2001).</li><li>Ho, R. K., Kane, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+action+of+zebrafish+spt-1+mutation+in+specific+mesodermal+precursors.">Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors.</a> Nature. 348 (6303), 728-730 (1999).</li><li>Parker, L., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+and+non-autonomous+requirements+for+the+zebrafish+gene+cloche+in+hematopoiesis.">Cell-autonomous and non-autonomous requirements for the zebrafish gene cloche in hematopoiesis.</a> Development. 126 (12), 2643-2651 (1999).</li><li>Liao, E. C., Trede, N. S., Ransom, D., Zapata, A., Kieran, M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-cell+autonomous+requirement+for+the+bloodless+gene+in+primitive+hematopoiesis+of+zebrafish.">Non-cell autonomous requirement for the bloodless gene in primitive hematopoiesis of zebrafish.</a> Development. 3 (3), 649-659 (2002).</li><li>Kamran, P., Sereti, K. I., Zhao, P., Ali, S. R., Weissman, I. L., Ardehali, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parabiosis+in+mice:+a+detailed+protocol.">Parabiosis in mice: a detailed protocol.</a> J Vis Exp. (80), (2013).</li><li>Wagers, A. J., Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Little+evidence+for+developmental+plasticity+of+adult+hematopoietic+stem+cells.">Little evidence for developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells.</a> Science. 297 (5590), 2256-2259 (2002).</li><li>Hervey, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+lesions+in+the+hypothalamus+in+parabiotic+rats.">The effects of lesions in the hypothalamus in parabiotic rats.</a> J. Physiol. 145 (2), 336-352 (1959).</li><li>Goldman, D. C., Bailey, A. S., Pfaffle, D. L., Al Masri, A., Christian, J. L., Fleming, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP4+regulates+the+hematopoietic+stem+cell+niche.">BMP4 regulates the hematopoietic stem cell niche.</a> Blood. 114 (20), 4393-4401 (2009).</li><li>Dieterlen-Li&#232;vre, F., Martin, C., Beaupain, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quail-chick+chimaeras+and+parabionts:+several+new+models+to+investigate+early+developmental+events+in+the+haemopoietic+system.">Quail-chick chimaeras and parabionts: several new models to investigate early developmental events in the haemopoietic system.</a> Folia Biol (Praha). 25 (5), 293-295 (1979).</li><li>Demy, D. L., Ranta, Z., Giorgi, J. M., Gonzalez, M., Herbomel, P., Kissa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+parabiotic+zebrafish+embryos+for+cell+migration+and+homing+studies).">Generating parabiotic zebrafish embryos for cell migration and homing studies).</a> Nat. Methods. 10 (3), 256-258 (2013).</li><li>Anderson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+develop+the+absence+of+endothelial+cadherin+5+expression.">Hematopoietic stem cells develop the absence of endothelial cadherin 5 expression.</a> Blood. 126 (26), 2811-2820 (2015).</li><li>Murayama, E., Sarris, M., Redd, M., Le Guyader, D., Vivier, C., Horsley, W., Trede, N., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NACA+deficiency+reveals+the+crucial+role+of+somite-derived+stromal+cells+in+haematopoietic+niche+formation.">NACA deficiency reveals the crucial role of somite-derived stromal cells in haematopoietic niche formation.</a> Nat Commun. 28 (6), 8375 (2015).</li><li>Shah, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Atpif1+regulates+haem+synthesis+in+developing+erythroblasts.">Mitochondrial Atpif1 regulates haem synthesis in developing erythroblasts.</a> Nature. 491 (7425), 608-612 (2012).</li><li>Tamplin, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+arrival+triggers+dynamic+remodeling+of+the+perivascular+niche.">Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche.</a> Cell. 160 (1-2), 241-252 (2015).</li><li>Ad&#225;m, A., B&#225;rtfai, R., Lele, Z., Krone, P. H., Orb&#225;n, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-inducible+expression+of+a+reporter+gene+detected+by+transient+assay+in+zebrafish.">Heat-inducible expression of a reporter gene detected by transient assay in zebrafish.</a> Exp. Cell Res. 256 (1), 282-290 (2000).</li></ol>

The authors declare that they have no conflict of interest.

Parabiotic fusión ha sido una herramienta poderosa para investigar las funciones celulares de genes candidatos en modelos murinos adultos y embriones de pollo de 10-14. Más recientemente, un método de fusión de blástula se ha descrito para la generación de embriones de pez cebra unidos 15. En el presente protocolo, tutoriales basados ​​en vídeo se utilizan para demostrar y describir la metodología para la creación de embriones de pez cebra parabiotic de diferentes orígenes genéticos ...

Creación de mosaicos genéticos (quimeras) entre los de tipo salvaje y animales modificados genéticamente es una estrategia bien establecida y clásica para la investigación de células intrínseca frente funciones de las células extrínseca de genes candidatos 1-6. Blastula trasplante en el pez cebra ha sido ampliamente utilizado para generar embriones quiméricos para estudios de células autonomía 7-9. Dependiendo del tejido de interés, sin embargo, puede ser un reto para apuntar predecible células del donante en el tejido deseado (por ejemplo, sangre) 1-3, 7-9. Genetistas de ratón han utilizado mucho los métodos quirúrgicos parabiotic para generar organismos unidos con una circulación compartida 10-14. Debido a que los animales parabiotic comparten un torrente sanguíneo común, las interacciones entre las células que se originaron de un animal con células de los demás animales de un fondo genético diferente pueden ser estudiados 10-16. Recientemente, el grupo de Karima Kissa elegantemente demostrado la capacidad de crecomió embriones de pez cebra unidos y luego utilizar este sistema para estudiar madre hematopoyéticas y la migración de células progenitoras (HSPC) 15. Además, parabiosis pez cebra se utilizó recientemente para investigar el papel de cadherina endotelial 5 en células madre hematopoyéticas de la emergencia (HSC) y la migración, 16 y para estudiar el papel de las células del estroma en el nicho de HSPC durante el desarrollo de pez cebra 17. A diferencia de los ratones, embriones de pez cebra son transparentes y permiten la visualización directa de las células durante el desarrollo parabiotic, haciendo que el sistema únicamente de gran alcance. La utilidad de parabiosis en el pez cebra, sin embargo, está limitada por una curva de aprendizaje, y la cirugía parabiotic en los embriones delicados puede ser técnicamente difícil sin una instrucción detallada y demostración visual. El objetivo de este protocolo es proporcionar un conjunto de instrucciones claras, paso a paso para acompañar tutoriales basados ​​en vídeo sobre cómo generar embriones de pez cebra para el estudio de parabioticfunciones de las células extrínseca de un gen (s) candidato por fusión quirúrgica de desarrollar blástulas temporal, celular intrínseco, o. modificaciones clave y recomendaciones adicionales para aumentar la supervivencia parabiont y nuevas aplicaciones experimentales se incluyen.

<table><tbody><tr><td>Methyl cellulose</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Individual components for E3/HCR:</td><td></td><td>For 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 1,99g MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (Sodium chloride)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>KCl (Potassium chloride)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (Calcium chloride dihydrate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (Magnessium sulfate heptahydrate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (1M ) buffer solution</td><td>ThermoFisher</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibiotics:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>gibco by Life technologies</td><td>15140-120</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin sodium salt</td><td>Sigma Life Science</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus</td><td>Sigma Life Science</td><td>K1377</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>50 mg/ml Pronase from Streptomyces griseus</td><td>Roche</td><td>11459643001</td><td></td></tr><tr><td>capillary glass used for needles (Capillary Glass &amp;amp; Filaments)</td><td>Sutter Instrument</td><td>ITEM#: BF 100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Teasing needles with wooden handles</td><td>Fisher Scientific</td><td>S07894</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipettes</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor)</td><td>Novatech International</td><td>F37898-0000</td><td></td></tr><tr><td>100 mm diameter/ 20 mm deep plastic petri dishes (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS,&lt;br/&gt; HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG )</td><td>Greiner Bio-one</td><td>664102</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td><td>ThermoFisher</td><td>D-1976</td><td></td></tr><tr><td>PTU. working stock is 0.003% (50x is 0.15%). for 500 ml, 0.75 g N-Phenylthiourea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S)</td><td>Western Chemical Inc</td><td>MS 222</td><td></td></tr><tr><td>LMP agarose (Ultrapure LMP agarose)</td><td>Invitrogen</td><td>16520100</td><td></td></tr><tr><td>plastic transfer pipette (just the wide ended one I think)</td><td>Fisherbrand</td><td>137115AM</td><td></td></tr><tr><td>Glass-bottom 6-well plates used for imaging</td><td>MatTek</td><td>P06G1.5-20-F</td><td></td></tr><tr><td>plastic western gel loading tip fixed on the end of a wood-handled dissecting needle (GELoader tips)</td><td>Eppendorf</td><td>22351656</td><td></td></tr><tr><td>glass cover slips, slides and vacuum grease if mounting for an upright microscope:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vaccum grease ( Dow Corning&amp;reg; high-vacuum silicone grease&lt;br/&gt; colorless, weight 5.3 oz (tube) )</td><td>Dow Corning</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>Glass cover slips</td><td>Corning Life Sciences</td><td>2960-244</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of parabiotic zebrafish embryos by surgical fusion of developing blastulae

parabiosis quirúrgica de dos animales de diferentes orígenes genéticos crea un escenario único para el estudio de células intrínseca frente a las funciones de las células extrínseca de genes candidatos de interés, los comportamientos migratorios de las células, y las señales secretadas en los entornos genéticos distintos. Porque los animales parabiotic comparten una circulación común, nada de sangre o factor transmitida por la sangre de un animal se intercambiarán con su pareja y viceversa. Así, las células y los factores moleculares derivadas de uno antecedentes genéticos pueden ser estudiados en el contexto de un segundo fondo genético. Parabiosis de ratones adultos se ha utilizado ampliamente para la investigación del envejecimiento, cáncer, diabetes, obesidad, y el desarrollo del cerebro. Más recientemente, parabiosis de embriones de pez cebra se ha utilizado para estudiar la biología del desarrollo de la hematopoyesis. En contraste con los ratones, la naturaleza transparente de embriones de pez cebra permite la visualización directa de las células en el contexto parabiotic, por lo que es un método única y poderosa para la investigación de fmecanismos celulares y moleculares undamental. La utilidad de esta técnica, sin embargo, está limitada por una curva de aprendizaje para la generación de los embriones de pez cebra parabiotic. Este protocolo proporciona un método paso a paso sobre cómo fusionar quirúrgicamente el blástulas de dos embriones de pez cebra de diferentes orígenes genéticos para investigar el papel de los genes candidatos de interés. Además, los embriones de pez cebra parabiotic son tolerantes a choque térmico, por lo que el control temporal de la expresión génica posible. Este método no requiere una sofisticada puesta a punto y tiene amplias aplicaciones para el estudio de la migración celular, la especificación del destino, y la diferenciación in vivo durante el desarrollo embrionario.

De acuerdo con estudios publicados previamente 15, el éxito de la fusión parabiotic de embriones de pez cebra depende de la puesta en escena y la orientación de los dos embriones y la concentración de metilcelulosa. Con tan solo unos simples, herramientas de bajo costo, mediante intervención quirúrgica fusionados blástulas en desarrollo se generaron embriones que se convirtió en parabiotic con circulación compartida. Estas herramientas incluyen una pipeta Pasteur modi...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae at JoVE.com

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.

Generación de Parabiotic embriones de pez cebra por fusión quirúrgica de Desarrollar blástulas

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

generation-parabiotic-zebrafish-embryos-surgical-fusion-developing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.4K vistas.  Boston Children’s Hospital. This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.

Video: Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead Implantación en el embrión de pez cebra

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

La generación de embriones quiméricos de pez cebra mediante un trasplante

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Biología

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

Tejido diana quimeras embrionarias: pez cebra Gástrula Trasplante de células

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

La transección de la médula espinal en el pez cebra larval

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Neurociencias

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

El trasplante de las buenas prácticas agrarias-que expresa Blastómeros de imágenes en vivo del desarrollo de la retina y el cerebro en embriones de pez cebra quiméricos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

Un dispositivo de trasplante simple y efectivo para embriones de pez cebra

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

Generation of Na&#239;ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. However, because of the complexity and redundancy of embryonic signals, it can be challenging to discern the complete role of any single signal during early embryogenesis. By explanting the animal region of the zebrafish blastoderm, relatively na&#239;ve clusters of embryonic cells are generated that can be easily cultured and manipulated ex vivo. By introducing a gene of interest by RNA injection before explantation, one can assess the effect of this molecule on gene expression, cell behaviors, and other developmental processes in relative isolation. Furthermore, cells from embryos of different genotypes or conditions can be combined in a single chimeric explant to examine cell/tissue interactions and tissue-specific gene functions. This article provides instructions for generating zebrafish blastoderm explants and demonstrates that a single signaling molecule - a Nodal ligand - is sufficient to induce germ layer formation and extension morphogenesis in otherwise na&#239;ve embryonic tissues. Due to their ability to recapitulate embryonic cell behaviors, morphogen gradients, and gene expression patterns in a simplified ex vivo system, these explants are anticipated to be of great utility to many zebrafish researchers.

Zebrafish blastoderm explants are generated by isolating embryonic cells from endogenous signaling centers within the early embryo, producing relatively na&#239;ve cell clusters easily manipulated and cultured ex vivo. This article provides instructions for making such explants and demonstrates their utility by interrogating roles for Nodal signaling during gastrulation.

Generación de explantes de Blastoderm naïve a partir de embriones de pez cebra

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. ...

<meta charset="utf8"></head><body>Trasplante robusto de células de pez cebra para la investigación de regeneración y desarrollo

High-resolution Cell Transplantation in Embryonic and Larval Zebrafish

Development and regeneration occur by a process of genetically encoded spatiotemporally dynamic cellular interactions. The use of cell transplantation between animals to track cell fate and to induce mismatches in the genetic, spatial, or temporal properties of donor and host cells is a powerful means of examining the nature of these interactions. Organisms such as chick and amphibians have made crucial contributions to our understanding of development and regeneration, respectively, in large part because of their amenability to transplantation. The power of these models, however, has been limited by low genetic tractability. Likewise, the major genetic model organisms have lower amenability to transplantation. 
The zebrafish is a major genetic model for development and regeneration, and while cell transplantation is common in zebrafish, it is generally limited to the transfer of undifferentiated cells at the early blastula and gastrula stages of development. In this article, we present a simple and robust method that extends the zebrafish transplantation window to any embryonic or larval stage between at least 1 and 7 days post fertilization. The precision of this approach allows for the transplantation of as little as one cell with near-perfect spatial and temporal resolution in both donor and host animals. While we highlight here the transplantation of embryonic and larval neurons for the study of nerve development and regeneration, respectively, this approach is applicable to a wide range of progenitor and differentiated cell types and research questions.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Mapeo de la conectividad celular en el sistema nervioso del pez cebra durante el desarrollo y la regeneración

Here we present a protocol to transplant cells with high spatial and temporal resolution in zebrafish embryos and larvae at any stage between at least 1 and 7 days post fertilization.

Trasplante celular de alta resolución en embriones y larvas de pez cebra

Development and regeneration occur by a process of genetically encoded spatiotemporally dynamic cellular interactions. The use of cell transplantation ...

Generación de Parabiotic embriones de pez cebra por fusión quirúrgica de Desarrollar blástulas

Resumen

Explorar más videos

PLAYLIST