We thank Julie R. Perlin for helpful comments on the manuscript. D.I.S. is supported by grants from the American Society of Hematology, the Cooley's Anemia Foundation, and the NIH (K01DK085217 and R03DK100672). E.J.H. is a Howard Hughes Medical Institute Fellow of the Helen Hay Whitney Foundation. B.L. is a Howard Hughes Medical Institute Medical Research Fellow. B.W.B. is supported by an Irvington Fellowship from the Cancer Research Institute and a Young Investigator Award from the Conquer Cancer Foundation of ASCO. L.I.Z. is supported by grants from the NIH (R01CA103846, P01HL032262, and R01HL04880), Taub Foundation for MDS Research, Harvard Stem Cell Institute, and is an investigator of the Howard Hughes Medical Institute.

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Animal Hospital Infantil de Boston. Este protocolo é modificado de um método previamente publicado a 15. 1. Preparação de Reagentes (dias ou semanas de antecedência) <ol><li> Prepare 1,5% pratos revestidos por agarose. Adicionar 1,5 g de agarose a 100 ml de meio de Zebrafish E3 em uma garrafa de Erlenmeyer. Calor, dissolver a agarose, e depois verter em aproximadamente 5 ml de 100 mm de diâmetro x 20 mm de placas de petri profundas. Nota: Estes são usados ​​para dechorionation de embriões (Etapa 3.1) e para a cirurgia parabiótica (Passo 3.3). Armazenar pratos de agarose revestidas a 4 ° C durante algumas semanas; levá-los para fora do frigorífico e aquecimento à temperatura ambiente na manhã do dia da cirurgia parabiótica. </li><li> Prepare a 4% de metil-celulose. Dissolve-se 4 g de pó de celulose de metilo em 100 ml de E3, em um balão de Erlenmeyer com uma barra de agitação. Colocar o balão sobre uma placa de agitação a 4 ° C, definida para a velocidade mais baixa, e deixá-lo misturarpor até 2 dias. <ol><li> Intermitentemente use uma espátula para quebrar aglomerados brancos de metil-celulose. Os cristais de metil celulose não se dissolve totalmente nesta concentração. Quando a solução se torna claro e parece homogénea, sem grumos brancos restante, parte alíquota da solução em tubos de 1,5 ml de microcentrífuga e congelamento a -20 ° C para armazenamento a longo prazo. Nota: as concentrações mais baixas de metilcelulose pode ser utilizado; No entanto, esta percentagem mais elevada, metilcelulose mais viscoso produziu os melhores resultados. </li></ol></li><li> Preparar a solução de cálcio elevado Ringer (HCR). Para fazer 400 ml de solução HCR, mistura 8 mL de 5M NaCl (116 mM final), 400 ul de KCl 3M (2,9 mM final), 800 ul de 5M de CaCl2 (10 mM final) e 2 mL de HEPES 1 M (5 mM final) com 390 ml de meio E3. Nota: A solução da loja HCR a 4 ° C durante algumas semanas; aquecimento à temperatura ambiente na manhã do dia da cirurgia parabiótica. </li><li> Prepare 5 - 6 pipetas Pasteur modificados para a transferênciatocar blástula pares. Resumidamente aquecer a extremidade da pipeta ao longo de um bico de Bunsen. Em seguida, usando uma pinça grandes, dobrar a extremidade da pipeta para aproximadamente 45 ° C, enquanto ele ainda está quente. <ol><li> Para garantir que não existem arestas cortantes que possam danificar embriões, segure a ponta da pipeta brevemente na chama por cerca de 3 segundos. Isto irá suavizar / polonês a extremidade da pipeta. Esta pipeta de Pasteur de vidro modificado é utilizado em conjunto com uma pipeta 10 ml de bomba (Figura 1) no passo 3.5 a seguir. </li></ol></li><li> Preparar as ferramentas de seringas de vidro para costura cirúrgica de pares de blástula. Puxe 2 - 3 agulhas de vidro como se fez para microinjeção de embriões de peixe-zebra. Use laboratório de película para corrigir cada agulha de vidro para o final de uma agulha provocação lenha ou de plástico de cabo (Figura 1A). Usando fórceps, parta a ponta da agulha com um diâmetro de cerca de 20 - 30 | im. Use um micrômetro estágio para orientar esta etapa (Figura 1B). Nota: O tamanho do NEponta edle é importante. Se a ponta for muito grande, torna-se difícil de controlar com precisão e pode causar danos excessivos. Se a ponta é demasiado pequeno, é difícil para os embriões suficientemente enrolada. </li></ol> 2. Criação de casais reprodutores de Zebrafish e colheita de embriões (dia -1 para o Dia 0) <ol><li> Configurar casais reprodutores de peixe-zebra adulto. Configurar peixes na noite anterior à cirurgia parabiosis deve ser conduzida. Use divisórias para separar machos e fêmeas. Para aumentar as chances de que os embriões desejados serão obtidos, criados vários pares de cada linha. Nós achamos que tipicamente 20 - 50% dos pares vão aparecer. </li><li> Na manhã seguinte, retire os divisores e permitir o acasalamento. Recolher qualquer embriões usando um chá coador de malha fina, em seguida, transferi-los para uma placa de Petri contendo meio embrião E3 18. </li><li> Embriões micro-injectar como desejado (por exemplo, com 25 pg de DNA de plasmídeo, 200 pg de ARNm, ou com 1-6 ng morfolino) dentro de 1 hora da recolha. Permitir-lhescrescer até o estágio de 256 células. Se a construção de expressão de ADN é colocado sob o controlo de um promotor de choque térmico (por exemplo, hsp70, Figura 4B), controlar o momento da expressão do gene pelo calor chocar os parabionts a 37 ° C, numa fase posterior (por ex., Em 36 HPF ). Nota: Como uma alternativa para um transgene fluorescente, dextrano fluorescente pode ser adicionado ao DNA, RNA, ou mistura de injecção morfolino (por exemplo, dextrano, azul cascata a 2 mg / ml). O corante de dextrano não irá interferir com o desenvolvimento normal e permitirão que para o embrião injectada a ser identificado sob a luz fluorescente apropriado após a fusão parabiótica. Alternativamente, o parabiose de uma estirpe pigmentado (por exemplo, AB), com uma estirpe não-pigmentadas (por exemplo, Casper) poderia ser usado para identificar o embrião injectado em fases posteriores. </li><li> Incubar os embriões a 28,5 ° C.Use um estereoscópio para acompanhar o seu desenvolvimento periodicamente conforme eles se aproximam o dev de 256 célulasestágio elopmental (aproximadamente 2,5 hpf). Nota: Se necessário, deslocar embriões a diferentes temperaturas para garantir fase correspondência entre os parceiros parabiótica (por exemplo, os embriões injetados-morfolino desenvolvem frequentemente mais lento do que os seus homólogos com injecção de un Mudando os embriões injetados pela ONU para RT enquanto os embriões injetados-morfolino são colocados. a 28,5 ° C resultará em seus estágios alinhando depois de um par de horas de desenvolvimento). </li></ol> 3. Geração de parabiótica embriões Zebrafish por Fusion cirúrgica de Desenvolvimento blástulas <ol><li> À medida que os embriões se aproximar da fase de 256 células (aproximadamente 2,5 HPF), transferir os embriões a partir de cada fundo genético (isto é, mutante genética, linhas transgénicas e / ou manipulação genética) em placas revestidas com agarose separadas (por exemplo, um prato para morfolino- embriões injetados e um segundo prato de embriões de controle). Em alternativa, transferir os embriões para limpar, copos de vidro sem riscar ou placas de Petri de vidro. Nota: Evite o uso de pratos de plástico não revestidos, como os embriões vai ficar com o plástico e ser danificado uma vez fora de seus córions. </li><li> Decantar os meios E3 até que apenas permanece líquido suficiente para cobrir os embriões (aproximadamente 7 - 10 ml). Adicionar 200 ul de 50 mg / ml de mistura de proteases isoladas a partir do fluido extracelular de Streptomyces griseus (proteases). Agitar os embriões suavemente a cada dois minutos. <ol><li> Quando 50% dos embriões têm de sair de suas córions, que normalmente leva 5 - 10 min, lavá-los três vezes com um volume generoso (cerca de 15 - 20 ml) de meio E3 embrião fresco. <ol><li> Dechorionate quaisquer embriões restantes em seus córions delicadamente sua elaboração para a pipeta Pasteur de vidro modificado e, em seguida, delicadamente desfazendo-los. Uma vez que os embriões foram dechorionated e lavou-se, substitua a mídia E3 com uma solução de HCR. Como uma alternativa a proteases, remover os córions manualmente utilizando uma pinça fina. Objectivo de ter 60-100 dechorembriões ionated disponíveis para cada condição experimental. Nota: Este é várias vezes mais do que acabará por ser utilizado, mas muitos embriões são susceptíveis de ser danificado durante o manuseamento ou a cirurgia para parabiose. Uma vez que os embriões são dechorionated, mantê-los submersa e não permitir que eles para tocar a superfície da água, como a tensão superficial vai levá-los a ser destruído. Tenha em mente que a utilização de uma dose mais elevada de proteases permite que os embriões para sair dos seus córions mais cedo e de forma mais sincronizada. Quando se utiliza uma dose inferior de proteases, os embriões demorar mais tempo a sair do seu córions e fazê-lo de uma forma síncrona menos, o que pode resultar em uma porção dos embriões ser danificada por exposição prolongada a proteases. </li></ol></li></ol></li><li> Descongelar o metilcelulose (feita no Passo 1.2 acima) e centrifugar em uma centrífuga de mesa na velocidade máxima de 10 min para sedimentar cristais não dissolvidos que irá danificar os embriões ou ruptura, os seus gemas. <ol><li> Após centrifugação, utilizar a fracção superior clara (aproximadamente 75% do volume). Transferir 1 - gotas com diâmetro de 1,5 cm de metil celulose em uma placa de Petri de 1,5% de agarose-revestido. Tome cuidado para evitar a elaboração de qualquer um dos cristais peletizadas a partir do fundo do tubo. </li><li> Use um marcador para predeterminar a posição de cada gotícula no lado inferior do prato. Coloque 12 - 15 gotas (2 - no valor de 3 alíquotas &#39;) de metil celulose por 100 milímetros de diâmetro prato de petri. Prepare como muitos pratos como necessários por experimento. Nota: Use cada gota para a fusão de um único par de blástula. A marca irá designar a localização de cada gota uma vez que a mídia é acrescentado no ponto em que as gotas se tornam quase invisíveis. </li></ol></li><li> Preparar 40 ml de uma alíquota de solução de HCR suplementado com antibiótico por prato revestido-agarose, preparada antes no passo 3.3. Para cada 40 ml de aliquota de HCR adicionar penicilina-estreptomicina a 50 U / ml de ampicilina, a 50 U / ml e canamicina a 0,5 ug/ Ml. <ol><li> Quando estiver pronto para executar blástula fusões, preencher cuidadosamente cada uma das placas contendo gotículas de celulose de metilo com 40 ml da solução de HCR suplementado com antibiótico. Se a solução HCR for adicionada muito rapidamente, pode perturbar as gotículas. </li></ol></li><li> Anexar a pipeta Pasteur de vidro modificado (feita no Passo 1.4 acima) para uma bomba de pipeta de 10 ml. Sob um estereoscópio recolher um embrião dechorionated de cada fundo (por exemplo, um embrião com injecção de morfolino e um tipo selvagem de embriões). <ol><li> Antes de fornecer as duas embriões, utilizar a pipeta de Pasteur para fazer uma pequena depressão no meio da queda de metil celulose, então suavemente depositar ambos os embriões para a depressão. Nota: Durante o processo de transferência, transformar a pipeta de Pasteur ligeiramente para cima de modo que os embriões se adaptar à curvatura da pipeta de Pasteur de modo a evitar o seu contacto tomada com a superfície do líquido, na parte superior ou inferior da pipeta (o que pode levar para theiruptura r). </li></ol></li><li> Imediatamente após a deposição dos embriões em que a celulose de metilo, usar uma agulha provocando a lenha ou plástico tratado com uma ponta de pipeta de gel de carga na extremidade (Figura 1A) para reposicionar cuidadosamente os embriões dentro da metil-celulose de tal modo que os seus pólos animais são directamente tocando um ao outro. <ol><li> Utilize movimentos arrebatadores suaves através da metil-celulose perto dos embriões para reposicioná-los sem tocá-los diretamente. Deixe os embriões sentar-se por 5 minutos para que o metil celulose vai se estabelecer em torno deles. Durante este tempo, carregar o próximo par em outra queda. Nota: Evite o contato direto com os embriões e ter um cuidado especial para não tocar qualquer parte do saco vitelino, que facilmente se romper. </li></ol></li><li> Usando a ferramenta de agulha de vidro, cuidadosamente enrolado cada embrião no seu ponto de contato. Com um movimento suave costura, células a partir do primeiro embrião pode ser puxado para dentro do segundo embrião e, em seguida, novamente.No final deste movimento, segure a agulha no lugar de 2-3 segundos e depois desenhá-lo afastado muito lentamente. Nota: Não é um período de cerca de 2-3 segundos após os embriões são feridos em que os dois tecidos parecem ser mais aderentes e mais provável para anexar a um outro. Assim, acreditamos que segura a agulha no lugar brevemente após o ferimento ajuda a manter os tecidos feridos de cada embrião em contacto durante o período inicial de tempo imediatamente após o ferimento. </li><li> Permitir que esses embriões para se sentar por 10 - 15 min a RT. Nesse meio tempo, continuar a costurar novos pares em outras gotas de metil-celulose. Após 10 - 15 minutos, avaliar se o primeiro par permaneceu ligada (Figura 2A). Nota: Se os embriões são mais tempo ligado, repetir o processo de costura, enquanto os embriões são mais jovens do que em torno da fase epiboly 30%. Normalmente, isso permite até três tentativas para costurar os embriões juntos. Se os embriões parecem ter mantido um anexo mas o cONEXÃO não é substancial, executar costura adicional na extremidade da ligação para o reforçar. Evitar agitar ou mover pratos durante os períodos de cirurgia e de incubação parabiótica. Nota: Apesar do seu estádio de desenvolvimento precoce e fragilidade percebido, as massas de células dos embriões pode tolerar uma quantidade substancial de manipulação (ou seja, ferindo e costura), e ainda se desenvolvem normalmente. A gema, no entanto, pode romper-se, apenas o menor toque, matando o embrião. Quando costurando os dois blástulas com a agulha de vidro, não de fazer contato com a interface entre a massa celular e gema de cada embrião. </li><li> Incubar os embriões O / N a 28,5 ° C no mesmo prato e meios de comunicação (não altere a mídia). Na manhã seguinte, os embriões ter saído das gotículas metil celulose principalmente dissolvidos. Remova todos os embriões que não foram fundidas com sucesso. Decantar a mídia e substituir por um novo 25 ml E3. Nota: Se trabalhar com umestirpe pigmentada, adicionar 500 ul feniltioureia 0,15% (50x) (PTU) para uma concentração final de 0,003% para bloquear a pigmentação. Embriões terá de permanecer continuamente em PTU para manter a supressão de pigmentação. </li></ol> 4. Setup microscópio, aquisição de imagens, processamento e análise <ol><li> Prepare 0,8% de agarose de baixo ponto de fusão (LMP): Adicionar 0,8 g LMP agarose a 100 ml E3 e calor até que esteja totalmente dissolvido. Enquanto quente, alíquota de 1 ml de agarose LMP em 1,5 ml tubos de microcentrífuga em um bloco de aquecimento C 37 °. A agarose LMP permanecerá fundido a 37 ° C. Adicionar 40 ul de 4 mg / ml (25x), pH 7,0 tricaina a cada alíquota de 1 ml de agarose LMP a 37 ° C. Nota: Se estiver trabalhando com uma cepa pigmentada, adicionar 20 mL de 0,15% (50x) PTU para cada alíquota de 1 ml. <ol><li> Armazenar a agarose LMP restante durante vários meses em tubos de 50 ml selados a 4 ° C. </li></ol></li><li> Anestesiar embriões parabiótica a ser trabalhada pela adição de 1 ml de 4 mg / ml (25x), pH 7,0 tricainapara os 25 ml de E3 que os embriões se encontra. </li><li> Agite suavemente o prato de modo que os embriões serão piscina no meio. Em seguida, usando uma pipeta de plástico de largura de ponta elaborar os embriões em tão pouco de líquido possível. Vire a pipeta na posição vertical e gentilmente saltar os embriões para que eles se depositam no fundo da pipeta. <ol><li> Com os embriões na parte inferior da pipeta, transferi-los para uma aliquota de 1 ml de agarose LMP por tocar levemente a ponta da pipeta para a superfície da agarose. Evitar a transferência de líquido em excesso, pois isso irá diluir a agarose. </li></ol></li><li> Depois de expulsar o excesso de líquido da pipeta, use a pipeta para misturar delicadamente os embriões dentro do agarose, em seguida, use a pipeta para transferir todo o agarose e embriões para o bem de um-fundo de vidro (No. 1.5 lamela), 6- bem placa. Nota: Certifique-se de descartar a pipeta após a transferência dos embriões para a placa de imagem. agarose residual irá definir dentro da pipeta, rendering-lo ineficaz para uso posterior. Em vez disso, utilizar uma pipeta de novo de cada vez. </li><li> Sob um estereoscópio, utilizar uma ponta de pipeta de gel de carregamento fixado na extremidade de uma agulha de provocação de cabo de madeira para posicionar os embriões para baixo para a tampa de vidro (para assegurar que estão dentro da distância de trabalho do objectivo microscópio) e na orientação desejada para imagiologia. Nota: Reposicionar continuamente até que a agarose foi totalmente definida. Tome o cuidado de montar os embriões parabiótica segundo a qual embrião do par está a ser trabalhada. Dada a orientação aleatória dos embriões conjugados, para alguns pares pode ser difícil para a imagem ambos os embriões. Neste cenário, recuperar os embriões a partir da agarose usando uma pinça e uma pipeta de plástico de largura de ponta e remontar para geração de imagens a partir de uma perspectiva diferente. </li><li> Uma vez que a agarose definiu, cobrir com 2 - 3 ml de E3 suplementadas com tricaina (PTU e, se necessário). </li><li> Imagem dos embriões usando um grande campo de epi-fluorescência invertido, laser-varredura confocal, ou girando disco microscópio confocal. Seleccionar o objectivo mais adequado para a imagem desejada. Para um campo de todo o embrião de vista, use um objectivo de 4x. Seleccionar uma ampliação mais elevada, tal como uma objectiva de 20x, a imagem de um tecido específico 16, 19. Nota: Se estiver usando um microscópio vertical, montagem em LMP agarose (semelhante ao anterior) em uma lamela de vidro. Inverter a lamela de vidro sobre uma lâmina de microscópio de vidro que tem um anel de graxa de vácuo preenchido com o mesmo E3-tricaina-PTU 16, 19. </li><li> Processo de aquisição de imagens usando pacotes gratuitos de software de análise de imagem, tais como NIH Imagem J / FIJI 16, 19. Nota: Contagem o número de células e quantificar a dinâmica como a migração celular e divisão celular usando segmentação e rastreamento algoritmos 16, 19. </li></ol>

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The authors declare that they have no conflict of interest.

Fusion parabiótica tem sido uma ferramenta poderosa para investigar as funções celulares de genes candidatos em modelos murinos adultos e embriões de galinha 10-14. Mais recentemente, um método de fusão blástula foi descrito para a geração de embriões de peixe-zebra siameses 15. No presente protocolo, tutoriais em vídeo são usados ​​para demonstrar e descrever a metodologia para a criação de embriões de peixe-zebra parabiótica de diferentes origens genéticas para estudar funç?...

Criação de mosaicos genéticos (quimeras) entre o tipo selvagem e animais geneticamente modificados é uma estratégia bem estabelecida e clássica para a investigação de células-intrínseca contra as funções das células-extrínseca de genes candidatos 1-6. Blástula transplante no peixe-zebra tem sido amplamente utilizada para gerar embriões quiméricos para estudos de célula-autonomia 7-9. Dependendo do tecido de interesse, no entanto, pode ser um desafio para segmentar previsivelmente células do doador para o tecido desejado (por exemplo, sangue) 1-3, 7-9. Geneticistas rato há muito utilizados métodos cirúrgicos parabiótica para gerar organismos siameses com uma circulação compartilhada 10-14. Porque os animais parabiótica compartilhar uma corrente sanguínea comum, as interações entre células que se originou a partir de um animal com células do outro animal de um fundo genético diferente podem ser estudadas 10-16. Recentemente, o grupo de Karima Kissa demonstraram elegantemente a capacidade de crecomeu embriões de peixe-zebra siameses e depois usar este sistema para estudar tronco hematopoiéticas e células progenitoras (HSPC) a migração 15. Além disso, parabiosis peixe-zebra foi recentemente utilizado para investigar o papel da caderina endotelial 5 em células-tronco hematopoiéticas (HSC) emergência e migração, 16 e estudar o papel das células do estroma no nicho HSPC durante o desenvolvimento do peixe-zebra 17. Ao contrário dos ratos, os embriões de peixe-zebra são transparentes e permitir a visualização directa das células durante o desenvolvimento parabiótica, tornando o sistema único e poderoso. O utilitário de parabiosis no peixe-zebra, no entanto, é limitada por uma curva de aprendizagem, e cirurgia parabiótica sobre os embriões delicados pode ser tecnicamente desafiadora, sem instruções detalhadas e demonstração visual. O objetivo deste protocolo é fornecer um conjunto de instruções claras, passo-a-passo para acompanhar tutoriais em vídeo sobre como gerar embriões de peixe-zebra parabiótica para estudartemporal de células-intrínseca, ou funções das células-extrínseca de um gene (s) candidato por fusão cirúrgica de desenvolver blástulas tetra. modificações importantes e recomendações adicionais para aumentar a sobrevida parabiont e novas aplicações experimentais estão incluídos.

<table><tbody><tr><td>Methyl cellulose</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Individual components for E3/HCR:</td><td></td><td>For 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 1,99g MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (Sodium chloride)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>KCl (Potassium chloride)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (Calcium chloride dihydrate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (Magnessium sulfate heptahydrate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (1M ) buffer solution</td><td>ThermoFisher</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibiotics:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>gibco by Life technologies</td><td>15140-120</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin sodium salt</td><td>Sigma Life Science</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus</td><td>Sigma Life Science</td><td>K1377</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>50 mg/ml Pronase from Streptomyces griseus</td><td>Roche</td><td>11459643001</td><td></td></tr><tr><td>capillary glass used for needles (Capillary Glass &amp;amp; Filaments)</td><td>Sutter Instrument</td><td>ITEM#: BF 100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Teasing needles with wooden handles</td><td>Fisher Scientific</td><td>S07894</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipettes</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor)</td><td>Novatech International</td><td>F37898-0000</td><td></td></tr><tr><td>100 mm diameter/ 20 mm deep plastic petri dishes (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS,&lt;br/&gt; HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG )</td><td>Greiner Bio-one</td><td>664102</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td><td>ThermoFisher</td><td>D-1976</td><td></td></tr><tr><td>PTU. working stock is 0.003% (50x is 0.15%). for 500 ml, 0.75 g N-Phenylthiourea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S)</td><td>Western Chemical Inc</td><td>MS 222</td><td></td></tr><tr><td>LMP agarose (Ultrapure LMP agarose)</td><td>Invitrogen</td><td>16520100</td><td></td></tr><tr><td>plastic transfer pipette (just the wide ended one I think)</td><td>Fisherbrand</td><td>137115AM</td><td></td></tr><tr><td>Glass-bottom 6-well plates used for imaging</td><td>MatTek</td><td>P06G1.5-20-F</td><td></td></tr><tr><td>plastic western gel loading tip fixed on the end of a wood-handled dissecting needle (GELoader tips)</td><td>Eppendorf</td><td>22351656</td><td></td></tr><tr><td>glass cover slips, slides and vacuum grease if mounting for an upright microscope:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vaccum grease ( Dow Corning&amp;reg; high-vacuum silicone grease&lt;br/&gt; colorless, weight 5.3 oz (tube) )</td><td>Dow Corning</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>Glass cover slips</td><td>Corning Life Sciences</td><td>2960-244</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of parabiotic zebrafish embryos by surgical fusion of developing blastulae

parabiosis cirúrgica de dois animais de diferentes origens genéticas cria um cenário único para estudar células-intrínseca contra papéis de células-extrínseca para genes candidatos de interesse, comportamentos migratórios de células e sinais de secretada em configurações genéticas distintas. Porque os animais parabiótica compartilhar uma circulação comum, qualquer sangue ou fator transmitidas pelo sangue de um animal serão trocadas com o seu parceiro e vice-versa. Assim, as células e os factores moleculares derivadas de um fundo genético pode ser estudado no contexto de um segundo fundo genético. Parabiose de ratinhos adultos tem sido amplamente utilizado para a pesquisa do envelhecimento, cancro, diabetes, obesidade, e desenvolvimento do cérebro. Mais recentemente, parabiose de embriões de peixe-zebra foi usado para estudar a biologia do desenvolvimento da hematopoiese. Em contraste com os ratinhos, a natureza transparente de embriões de peixe-zebra permite a visualização directa das células no contexto parabiótica, tornando-se um método único e poderoso para a investigação de fmecanismos celulares e moleculares undamental. A utilidade desta técnica, no entanto, é limitado por uma curva de aprendizagem para gerar os embriões de peixe-zebra parabiótica. Este protocolo fornece um método passo-a-passo sobre como cirurgicamente fundir o blástulas de dois embriões de peixe-zebra de diferentes origens genéticas para investigar o papel de genes candidatos de interesse. Além disso, os embriões de peixe-zebra parabiótica são tolerantes ao choque térmico, tornando o controlo temporal da expressão do gene possível. Este método não requer um sofisticado set-up e tem amplas aplicações para estudar a migração de células, especificação de destino, e diferenciação in vivo durante o desenvolvimento embrionário.

Consistente com os estudos anteriormente publicados 15, parabiótica fusão bem sucedida de embriões de peixe-zebra depende do armazenamento temporário e da orientação dos dois embriões e a concentração de metilcelulose. Com apenas alguns simples, ferramentas de baixo custo, blástulas tetra desenvolvimento cirurgicamente fundidos foram gerados que cresceu em embriões parabiótica com circulação compartilhada. Estas ferramentas incluída uma pipeta Pasteur modificado...

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Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.

Geração de parabiótica embriões Zebrafish por Fusion cirúrgica de Desenvolvimento blástulas

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

generation-parabiotic-zebrafish-embryos-surgical-fusion-developing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.5K visualizações.  Boston Children’s Hospital. This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.

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Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead Implantação no embrião de peixe-zebra

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Biologia do Desenvolvimento

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

A criação de embriões quiméricos Zebrafish por Transplante

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Biologia

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

Tecido alvo quimeras embrionárias: Zebrafish celular Gástrula Transplante

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Transecção medular nos larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Neurociência

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

Transplante de GFP-expressando Blastômeros for Imaging ao vivo de Desenvolvimento da retina e do cérebro em embriões Zebrafish Quimérico

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

Um dispositivo de transplante simples e eficaz para embriões de zebrafish

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

Generation of Na&#239;ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. However, because of the complexity and redundancy of embryonic signals, it can be challenging to discern the complete role of any single signal during early embryogenesis. By explanting the animal region of the zebrafish blastoderm, relatively na&#239;ve clusters of embryonic cells are generated that can be easily cultured and manipulated ex vivo. By introducing a gene of interest by RNA injection before explantation, one can assess the effect of this molecule on gene expression, cell behaviors, and other developmental processes in relative isolation. Furthermore, cells from embryos of different genotypes or conditions can be combined in a single chimeric explant to examine cell/tissue interactions and tissue-specific gene functions. This article provides instructions for generating zebrafish blastoderm explants and demonstrates that a single signaling molecule - a Nodal ligand - is sufficient to induce germ layer formation and extension morphogenesis in otherwise na&#239;ve embryonic tissues. Due to their ability to recapitulate embryonic cell behaviors, morphogen gradients, and gene expression patterns in a simplified ex vivo system, these explants are anticipated to be of great utility to many zebrafish researchers.

Zebrafish blastoderm explants are generated by isolating embryonic cells from endogenous signaling centers within the early embryo, producing relatively na&#239;ve cell clusters easily manipulated and cultured ex vivo. This article provides instructions for making such explants and demonstrates their utility by interrogating roles for Nodal signaling during gastrulation.

Geração de Explantes de Blastoderm ingênuos de Embriões de Zebrafish

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. ...

<meta charset="utf8"></head><body>Transplante robusto de células de peixe-zebra para pesquisa de regeneração e desenvolvimento

High-resolution Cell Transplantation in Embryonic and Larval Zebrafish

Development and regeneration occur by a process of genetically encoded spatiotemporally dynamic cellular interactions. The use of cell transplantation between animals to track cell fate and to induce mismatches in the genetic, spatial, or temporal properties of donor and host cells is a powerful means of examining the nature of these interactions. Organisms such as chick and amphibians have made crucial contributions to our understanding of development and regeneration, respectively, in large part because of their amenability to transplantation. The power of these models, however, has been limited by low genetic tractability. Likewise, the major genetic model organisms have lower amenability to transplantation. 
The zebrafish is a major genetic model for development and regeneration, and while cell transplantation is common in zebrafish, it is generally limited to the transfer of undifferentiated cells at the early blastula and gastrula stages of development. In this article, we present a simple and robust method that extends the zebrafish transplantation window to any embryonic or larval stage between at least 1 and 7 days post fertilization. The precision of this approach allows for the transplantation of as little as one cell with near-perfect spatial and temporal resolution in both donor and host animals. While we highlight here the transplantation of embryonic and larval neurons for the study of nerve development and regeneration, respectively, this approach is applicable to a wide range of progenitor and differentiated cell types and research questions.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Mapeando a conectividade celular no sistema nervoso do peixe-zebra durante o desenvolvimento e regeneração

Here we present a protocol to transplant cells with high spatial and temporal resolution in zebrafish embryos and larvae at any stage between at least 1 and 7 days post fertilization.

Transplante de células de alta resolução em peixe-zebra embrionário e larval

Development and regeneration occur by a process of genetically encoded spatiotemporally dynamic cellular interactions. The use of cell transplantation ...

Geração de parabiótica embriões Zebrafish por Fusion cirúrgica de Desenvolvimento blástulas

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