plusTipTracker MT analiz yazılımı geliştirmek için rehberlik ve bu çalışmalarda kullanılan floresan cDNA yapıları birçok sağlamak için tartışmalar, Michelle Baird ve Mike Davidson Dr. Clare M. Waterman ve Kathryn Applegate ve Gaudenz Danuser özel teşekkürler. Bu eser dan KAM bir hibe ile kısmen desteklenmiştir Ulusal Kalp Akciğer ve Kan Enstitüsü (NHLBI) ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH). (Grant: 4K22HL113069).

The authors declare that they have no competing financial interests.

Morfoloji ve Göç Denemelerde HUVECler kullanma. HUVEC içinde EB3 etiketli MT büyüme dinamiklerinin Canlı hücre görüntüleme daha sonra bir ECM sinyal işaret atanabilir şekilde MT büyüme ve HUVEC morfolojisi değişiklikleri ölçmek ve değerlendirmek amacıyla uygun ve tekrarlanabilir hücre kültürü koşulları gerektirir. HUVECler hücre şekli ve hareketliliği incelemek için mükemmel bir model oluşturmaktadır. Onlar hem çözülebilir hem de fiziksel bir sinyal uyaranlara yanıt olarak dramatik morfolojileri sergileyen, floresan etiketli cDNA transfeksiyon son derece uygundurlar ve, uygun hücre kültürü koşullarının 65-70 Resim vasküler tüplere kendilerini düzenleme yeteneğini korur. Böyle HUVEC olarak primer hücre kültürleri, hücreler sağlıklı olmasını sağlamak amacıyla ve deney sırasında normal davranacaktır dikkatli kullanım ve hücre geçiş sayısının izlenmesini gerektirmektedir. Örneğin, cytoskele araştıran deneylerHUVECler, tipik olarak on beş geçiş on yaklaşık eşit olmayan morfolojilerini görüntülemek için başlarken ton ve / veya hücre morfolojisi, HUVECler, onuncu hücre kültür geçişi ötesinde deneyler için kullanılmamalıdır. Hücre yoğunluğu HUVEC sağlık ve çoğalmasının kritik bir düzenleyicisidir. HUVEC dallanma araştırmalar (yukarıdaki protokole 10,1-10,4 bakınız) hücreler ECM ile etkileşim fiziksel alan sağlamak ve dallı uzantıların uzatmak için, nispeten düşük hücre yoğunluğu kültürleri kullanmak. Buna karşılık, yara-kenar göç çalışmalarında, HUVECler önce yaralama bir tek tabaka kültürü (Protokol 10,5-10,8 bakınız). Bu tür, yara-kenar HUVECler nispeten un-dallı morfolojisi görüntüler gibi, kenar çıkıntıları önde gelen genişletmek ve onlar yara içine göç olarak yakın komşuları ile hücre-hücre etkileşimleri sergiler. Uyarılar ve Yaşam HUVEC içinde Takibi MT Dynamics Avantajları. Disk mikroskobu Spinning için mükemmel bir yaklaşımdıryüksek zaman çözünürlüklü konfokal görüntü netliği gerektiren deneysel hipotezleri test. Uygun kamera ve lazer modülü ile, bu mikroskopi yaklaşım düşük emisyonlu floresan duyarlı ve floresan mikroskobu diğer türlerine oranla azalmış photobleaching yardımcı olabilir. Farklı hücre tipleri çok çeşitli, EB3 etiketleme yaklaşımı kullanılarak MT büyüme dinamiği kapsamlı ölçümler oluşturmak için gerekli olduğu gibi da önemlisi, bu yaklaşım aynı zamanda da yüksek zaman çözünürlüklü görüntüleme orta için uygundur. etiketleme EB3 metodolojisi MT artı uçları büyürken floresan etiketleme MTS diğer yöntemlere göre belirgin avantajları vardır, o da benzersiz dezavantajları vardır. Örneğin, aktif sökülmesi MTS nüfus ve stabil olmayan, dinamik MTS 71-74 nüfusu hem de dahil olmak üzere herhangi bir zamanda büyümemesi MT dizisinin bir bölümü vardır. EB3 MTS bu iki popülasyonlarının etiket olmaz veBu nedenle bu iki nüfus katkısı deneysel veri analizi dahil olmaz. Tüm MT diziyi değerlendirmek için alternatif yöntemler floresan etiketli MTS tüm toplumlarda içine birleştirir ve büyüyen küçülen tanımlanması için izin veren tubulin, ve durağan MTS ifadesi üzerine odaklanmıştır. Bununla birlikte, tüm MT dizi etiketleme mikrotübül organizasyon merkezi, (MTOC) hücrenin merkezi ve bitişik Mt tadını nispeten yüksek yoğunluğu hücre civarındaki MT uçlarının görüntü analizi bir dezavantaj yaratmaktadır periferi 75-77. Canlı hücrelerde floresan tubulin ve floresan EB3 ile MTS iki renkli ko-etiketleme kullanarak deneyler tübülin etiketli MTS büyük çoğunluğu da EB3 etiketli 78 olduğunu, niteliksel, ortaya koymuştur. Buna ek olarak, floresan tubulin ile etiketlenmiş MTS otomatik izleme etkili bir yöntem olmamıştır. Bu, araştırmada veri toplama demektiryon ve floresan tubulin ifade eden hücrelerde MT dinamiklerinin ölçümleri, hata eğilimli ve sıkıcı bir süreç bireysel MTS el izleme gerektirir. Bunun bir sonucu olarak, EB3 etiketli MTS otomatik hesaplama analizi, çok sayıda hücre türleri arasında ve deneysel rejimleri 35,79 çeşitli olan MT dinamikleri deney tatbik edilebilir MT dinamiklerini ölçmek için tercih edilen bir yöntem haline gelmiştir. HUVEC Morfolojisi ve Göç MT Büyüme Dinamikleri Bağlama. Bir iskelet araştırmacı açısından bakıldığında, plusTipTracker otomatik izleme analiz biri son derece yararlı adaptasyon ölçmek ve MT büyüme dinamikleri hem tam hücre ve bölgesel değişiklikleri değerlendirmek için yeteneğidir. Bir hücre polarize olmak şartı yönlü hücre göçü için önemli bir ön koşuldur. Böyle, polarize sinyal ipuçları uzun yönlü hücre migrasyonu 30,31,51,54,56,80,81 için önemli itici faktörleri olarak bilinmektedir olarak </&gt; Sup. Örneğin, VEGF gibi çözünebilir sinyal molekülleri endotel hücre tipleri 2,82-87 VEGF cue doğru aktin polimerizasyonu MT büyümesini teşvik. Buna ek olarak, (örneğin, uyum ve boyut mechanosensing için) ECM ile fiziksel etkileşim yanıt olarak, HUVECler yerel MAP dallı uzantıların uzatılması olan MT büyümesini teşvik etmek için regüle ederek MT dinamiklerini modüle eden ve bu yönünde, HUVEC göçünün kılavuzlanmasına yarar işaret 5,31,88. Böylece, hücre dışı bir sinyal uyaranlara yanıt olarak polarizasyon iskelet dinamikleri lokalize değişikliklerin deneysel değerlendirilmesi gerekliliğini vurgulamaktadır. (EB3 yaklaşımını kullanarak) MT büyüme dinamikleri ve HUVEC hücre göçü eşzamanlı canlı hücre görüntüleme MTS saniyelik bir zaman ölçeğinde büyümeye çünkü hücre morfolojisi ve yön göç değişiklikler saatlik bir zaman ölçeğinde meydana ederken, gerçekleştirmek son derece zordur. Oysa her iki süreç yakından linke vardırd. Ayrıca, ikinci kez ölçekte floresan etiketli EB3 sürekli, hızlı görüntüleme EB3 sinyalinin photobleaching yol açar. EB3 (1-2 dk edinme serisi) her 30 dakikada başarılı olmuş kısa görüntüleme serisi yaparak bu sorunu aşmak için çalışır, ancak sadece EB3 optimal ifade vardı EC küçük bir sayıda başarılı olabilir ve bu olumsuz görüntüler vermedi tekrarlanan lazer aydınlatma 5 etkileri. MT büyüme dinamikleri hücre morfolojisi ve göç değişikliklere nasıl katkıda yorumlarıyla sağlayan alternatif bir yaklaşım Faiz (ROI) aracı 35 (Protokol 6.6 bakınız) plusTipTracker Bölgesidir. tüm hücre MT büyümesi alt bölünmüş MT büyüme parça daha sonra ayıklanır ve analiz edilebileceği kullanıcı tanımlı bölgeler, içine olmak izler Bu metodoloji sağlar. Örneğin, hücrenin &quot;dallı olmayan&quot; bölgelerde karşı &quot;dallı&quot; karşılaştırmaları MTs daha s büyümek olduğunu ortaya koymuşturaşağı ve daha fazla sürekli kollara ayrılmış bölgelerde dallanmamış hücre kenarına 5 ile karşılaştırıldığında. polarize yara kenarı HUVEC olarak, kenarı ve arka kenarı MT büyüme dinamiği karşılaştırmalar MCAK kaynaklı MT sökme arka kenarı kenarı olan spesifik inhibe değil, ortaya koymuştur. lider ve Rac1 ve / veya MCAK fosforilasyonu mutantlar ifade HUVEC kenar MT büyüme dinamiklerini firar Bölgesel değerlendirme ayrıca Aurora-A kinaz Rac1 kaynaklı aktivasyon özellikle ve yerel HUVEC kutuplaşma ve yön göç sürücü ön kenarında içinde MCAK aktivitesini inhibe ortaya 31. Böylece, MT büyüme dinamikleri ve dallı çıkıntılar ve / veya yara kenar HUVEC ön kenarına içinde MT büyüme dinamikleri bölgesel değerlendirilmesi otomatik izleme kombinasyonu bize HUVEC morfolojisi ve göç MT büyüme dinamiklerini bağlamak için izin verdi. açıklanan protokoller designe vardırd HUVEC kültür ve deneysel araştırma için genellikle basit ve son derece tekrarlanabilir bir metodoloji sağlamaktır. Bununla birlikte, iletişim kuralı detayların bir çok da, deney yöntemi yapma hataları ya da zorluklar olanağı sağlayan, karmaşık ve zaman alıcı bir iştir. protokol boyunca potansiyel sorunları çözmek için teşebbüs ederken, burada daha az yaygın ya da başka yöntem protokolleri içinde notlar olarak kısaltılır potansiyel problemlerin ek, ayrıntılı sorun giderme sağlanır. poliakrilamid yüzeylerde ile kaplama lamelleri (Protokol 2.2), cam lamelleri aktive cam poliakrilamid bağlanması, poliakrilamid aktive ve daha sonra poliakrilamid için ECM bağlanması karmaşık doğası doğar ortak sorunu ile ilgili. Bir özellikle zor ve potansiyel olarak sorunlu bir adım Polya maruz kalmasını takiben fibronektin / poliakrilamid jel üzerine HUVECler kültürleme olduğunu2 mM sülfo-SANPAH için crylamide kaplı lamelleri (yukarıda adım 2.2.2.6). Bu yüzeylerde HUVECler kültürleme başarısı için kritik öneme sahiptir sülfo-SANPAH tamamen ECM birleştikten sonra deneysel sistemden çıkarılmalıdır. Bu en iyi GKD 2 O ile yıkama ve gece boyunca bir karıştırıcıda GKD 2 O lamelleri inkübe edilmesi ile gerçekleştirilebilir. poliakrilamid ECMs kültüre hücreleri hayatta değilse canlılığı, beklenen artış ve fibronektin (adım 2.2.2.9) konjugasyon sonra sülfo-SANPAH yıkanması tekrarlanan küçükse potansiyel bu sorunu hafifletmek veya tavsiye edilir. Protokolün 3 (a lamel cDNA transfeksiyonu ve HUVEC kültür) İlgili, elektroporasyon prosedürün başarısı için büyük bir etkisi hücrelerinin trypsinization sırasında hem HUVEC&#39;lerin ele tamamlanmasının ardından plastik şişeden bunları kaldırmak ve etmektir elektroporasyon (yukarıda, 3.3-3.4 adım). Bakım için kritik öneme sahiptirtripsin ve şişeye (genellikle 1-2 dakika) yüzeyi üzerinde &quot;yuvarlak-up&quot; hücreleri için gereken zamanı aşmayacak şekilde ise, tam HUVECler izler. Tripsin Aşırı zaman hücreleri fibronektin kaplı lamelleri (3.4 adım) üzerine kaplama ve daha sonra yüzeye tutunur başarısız kadar genellikle fark edilmez HUVEC ölüm, önemli bir nedenidir. elektroporasyon tamponunda uzun süre askıya zaman benzer öneme sahip, HUVECler (ve çoğu primer hücre tipleri) iyi ücret yoktur. daha büyük ölçekli deneyler esnasında, kullanıcı elektroporasyon gerektiren beş veya daha fazla koşulu vardır, örneğin, tek-a-zaman, tek tek tüpler içinde pelet hücreleri (transfeksiyon başına 1 tüp) tutmak ve bunları karıştırmak için daha da elektroporasyon hemen önce elektroporasyon tamponu içinde. Bu yaklaşım elektroporasyon tampon ve en üst düzeyde HUVEC hayatta kalma kuluçka süresini en aza indirir. Ayrıca, tam bir kültür ortamında acil kurtarma de cr olduğunuitical Elektroporasyondan. Bir dakika ya da daha fazla, aşağıdaki elektroporasyon kurtarma gecikme tam HUVEC ölüme yakın neden olabilir ve bu nedenle kaçınılmalıdır. İlgili hücre göçü deneyi (Protokol 9), son derece yüksek bir yoğunlukta HUVECler kültür tekniği fibronektin kaplı lamel kurutma gerektirir (protokol 3&#39;te tarif edilmiştir), geleneksel HUVEC hücre kültürü metodolojisi (aşama 9.2&#39;de anlatıldığı gibi) kritik bir değişiklik bağlıdır lamel çok küçük bir alana HUVEC kültürü sağlamak için. lamel tamamen kurutulur edilmemiştir ya da fibronektin ile lamel ön kaplama (adım 2.1 veya 2.2) halinde etkin değildi Çoğu zaman, örtücü kısım üzerine yerleştirilmiştir ortam ihtiva eden hücreler, yüzey gerilimini kaybeder ve genişleyecektir böylece lamel hücrelerin yoğunluğunu azaltarak, lamel kenarları. bu potansiyel sorunu gidermek için bir yöntem lamel ve ardından ortamı aspire etmektir5-10 dakika biyogüvenlik kabini arkasına (hala 35mm çanak) lamel yerleştirin. Bu uyarlama çanak kurutmaya yardımcı olmak için kabin içinde hava akışına izin vermek için yardımcı olabilir. gözle görülür sıvı hava kuruduktan sonra lamel kalırsa, sıvı noktalar aspire ve tekrar biyogüvenlik kabini 5-10 ek dakika kurumaya bırakın. Tamamen bu olası sorunu önlemek için bir yol olduğuna dikkat etmek önemlidir, ancak bu protokolün tekrarlanan uygulama ile bir sorun daha az hale gelir. Aynı zamanda hücre göçü deneyi (ya da genel olarak herhangi bir tahlil,) için lamelleri hazırlarken, ekstra lamelleri hazırlamak ve ekstra HUVECler hazır-to-go yol boyunca sorunları durumunda sahip olduğu bir sorun giderme öneridir. Akılda bu sorun giderme hususlar ile, tartışılan protokoller ve gelecekteki hücre biyolojisi araştırmalarında onların etkileri faydasını vurgulamak için de önemlidir. polyacr uygulanabilirliğiilamid yaklaşım, geniş, ve (yukarıda tarif edilen) hücre-ECM angajman iki boyutlu çalışmalar, aynı zamanda, üç-boyutlu bir inceleme 5 de içerir. Bu uygulama HUVECler fizyolojik ortamlarda hücre şekli ve göçü düzenleyen nasıl anlayışımızı artırarak için kritik öneme sahiptir ve araştırmacılar, hücre iskeleti değişikliklerle koordine nasıl morfolojik değişiklikler temel bir anlayış sağlamalıdır. Burada anlatılan protokoller MT büyüme dinamikleri ölçümleri odaklanmış olsa da, protokollerin çoğunluğu ve hücre-ECM etkileşimleri diğer mikroskobik ölçülebilir yönleriyle herhangi bir sayı ölçmek için adapte edilmelidir olabilir. MT dinamikleri açısından, sunulan protokolleri kullanarak incelenebilir en az 14 kinesinlerin 89 ailelerine, HUVEC kutupluluk ve yönetmenliğini göç katkıda potansiyel rolü olan her ve tüm dahil, çok sayıda haritalar bulunmaktadır. Gelecekteki araştırmalar gereken birLSO hastalıklı devletlerin karşı normal hücre ECM angajman hedeflenmelidir. Burada sunulan HUVEC protokolleri normal vasküler homeostatik süreçlerin soruşturmalara uygulanabilir yanı sıra birkaç isim, kalp hastalığı, retinopati, tümör büyümesi ve metastazı da dahil olmak üzere hastalık durumlarıyla vardır. endotel hücre vasküler anjiyojenez, yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe ile izlenebilir şekilde hücre ECM birleştirme çalışmaları için sağlayacak mikroskopik çalışmaları ile müsait uyumu gözle saydam ECM ve poliakrilamid substratlar konjüge. Deneysel yaklaşımlara Bu tür zaten önemli endotel hücre şekli, polarite, göç farklılıkları ve bu süreçleri 5,31,90 düzenleyen proteinlerin etkilerini ortaya çıkarmak için başladı. Gelecek çabalar ECM uyum ve çok boyutluluk mechanosensing kombinasyonu hedef ve iskelet dinamiklerini düzenleyen yerel kontrol proteinlerine hizmet edebilir nasıl tespit hedeflemelidir.

Anjiyogenezis, polarize yönlü özgüllük ile göç ve kan temini gerektiren dokularda yeni damar sistemini oluşturmak için endotel hücreleri (EC) teşvik hücre dışı bir sinyal ipuçları ile tetiklenir. anjiogenezisi sürücü düşünce katkıda bulunan faktörler ekstrasellüler matriks (ECM) gelen sinyaller bulunmaktadır. Fiziksel uyaranlara yanıt olarak, EC damar ağı 1,2 oluşumunda yönlü hareketini yönlendirmek için yönlendirme spesifikliği olan şube uzanır. AK morfolojisi ve dallanma mimari acto-miyozin kasılmasının 3 düzenlenmesi ile koordineli bir şekilde mikrotübül (MT) hücre iskeletinin lokalize yönetmelikle belirlenir. Oluşturmak için AT dalları için, miyozin II yerel bölgesel membran çıkıntılar 4 sonuçlanan aşağı regüle edilmesi gerekmektedir. Aynı zamanda ve hücre içinde aynı yerde, MT büyüme dinamikleri şube Elon teşvik etmek yavaş ve kalıcı MT büyüme ile sonuçlanan değiştirilmiş halinegasyon ve stabilite 5. Bu koordine iskelet düzenleme EC yönlü göç kolaylaştırmak için kendi morfolojisi polarize sağlar. Kutuplaşmış bir hücre morfolojisi gelişimi polarize MT takımını 6 gerektirir. Epitel hücreleri göç olarak, MTS hücrenin 7-9 öncü yavaş ve ısrarla özellikle büyümek; nöronlarda iken, akson veya dendrit başlaması ve uzama MTs sadece mevcut olmasını gerektirir, fakat onlar dinamik montaj ve demontaj 10-15 süreçlerini geçiyor. Bu şekilde, MT büyüme dinamiği lokalize kontrol hücre yapısını tespit eder ve EC bunların ECM gezinirken hücre morfolojisi hızla yeniden sağlar. MT büyüme dinamikleri moleküler motor protein ve non-motor proteinlerin aileleri tarafından düzenlenir, Mikrotubul İlişkili proteinler veya Mikrotubul Etkileşen Proteinler (bundan sonra refe olarak adlandırılan) MAP&#39;ler olarak rred. MAP yerel olarak, tipik olarak, hücre-ECM arayüzü 16,17 başlatılan sinyal basamaklarının ile, aktive edilmiş ya da inaktive edilebilir. MT bağlanarak ve MT montaj ve demontaj kinetik değiştirerek kez aktif MAP fonksiyonu; böylece lokal hücre şekli ve kutupları 18-20 teşvik etmek amacıyla MT dinamiklerini düzenleyen işleyen. Mitotik Sentromer İlişkili kinesin (MCAK) MT uçları ve çiftler MT sökme 21-23 ATP hidroliz bağlanan bir kinesin-13 aile MAP olduğunu. MCAK bu fonksiyonel rolü mitotik iğ 24-28 olan kritik olarak interfaz 29,30 ne olduğu bilinmektedir. interfaz EC içinde MCAK aracılı MT demontaj yara kenardan Rac1 küçük GTPaz indükte aktivasyonunu yanıt olarak MCAK lokalize Aurora-A indüklediği fosforilasyon ile düzenlenir. Bu sinyal akışının sonucu le doğru polarize MT büyümesi ile sonuçlanan, EC ön kenarında MCAK inhibisyonuECS 31 göç firar kenarında kenar ve MCAK kaynaklı MT sökme ading. MT büyüme dinamiği ölçmek için geleneksel yöntemler, tipik olarak floresan etiketli tübülin ya da daha yakın zamanda, floresan etiketli MT sonu bağlayıcı protein 1 ya da 3 (sırasıyla EB1 ve EB3) ya da el izleme kullandık. floresan tubulin yaklaşımı tüm MT dizi etiketleme avantajına sahiptir. Mitotik hücre türlerinin çoğunluğu interfaz 8,32,33 sırasında MTS radyal sırasını korumak için, ancak, sentrozom civarındaki MTS çok yoğundur ve sonuç olarak, flüoresan tubulin MT büyüme ve sökme izleme, genellikle çevre sınırlıdır hücrenin bölgeleri. Bu kısıtlamalar nedeniyle, floresan etiketli EB proteinlerin (EB1 veya EB3) kullanım MT dinamiklerini ölçmek için daha ortak bir yaklaşım olmuştur. EBS sadece MTS büyüyen artı uçları etiket çünkü onlar parlak floresan gelip, (1-3 mikron) küçük görünürts, son derece sınırlı eşiğe 34-37 MT polimerizasyon kolayca ayırt edilebilir işaretleyici sağlar. MT dizinin yalnızca bir alt kümesi EBS etiket EB yaklaşımının önemli bir gücü temsil olması, aynı zamanda önemli bir sınırlama vurgular iken, non-büyüyen MTS EB3 yaklaşımla etiketlenmiş değildir. Bununla birlikte, ölçmek ve zamanla EB3 kuyruklu izlemek ve alt-hücresel bölgelerindeki MT büyüme görselleştirmek için yeteneği MT örgütün bölgesel değerlendirme gerektiren uygulamalar için bu yaklaşım ideal kılar. Ölçüm MT büyüme dinamikleri açısından geleneksel yöntemlerin bir başka kritik sınırlama çok büyük veri setleri ve veri analizi için gereken zaman olmuştur. Bu sınırlama yüksek zaman çözünürlükte EB kuyruklu yüzlerce el izleme ihtiyacından kaynaklanıyor. Ayrıca, bu ölçümler hücrelerin istatistiksel olarak önemli sayıda yapılır ve aynı zamanda kontrol ve experime çeşitli altında gerçekleştirilmesi gerekenntal koşullar. Son zamanlarda, bu kısıtlamalar canlı hücreler 35 time-lapse mikroskopi kullanılarak özellikle izleme EB3 kuyrukluyıldızların yönelik hesaplama analiz teknikleriyle aşılmıştır. Uygun kullanıldığında, bu hesaplama yaklaşım hem MT polimerizasyonu ölçme yüksek verimli bir yöntem sağlamanın yanı sıra el-izleme ile ilişkili insan hatası potansiyelini sınırlamak için hizmet vermektedir. MatLab tabanlı yazılım paketi kullanarak MT dinamiklerinin hesaplama analizleri, plusTipTracker, floresan etiketli EB3 kuyruklu 5,31,35,38 izleme MT büyüme ölçümleri için izin verir. Ayrıca, plusTipTracker yazılım büyüyen MT parça içinde EB3 kuyruklu kayboluşu dayalı MT felaket olaylarının (aka demontaj) hesaplamalarına izin verir, ve ilgi kullanıcı tanımlı bölgeler içinde MT büyüme dinamikleri alt-hücresel (aka bölgesel) analizi için izin verir . Bizim çalışmaları için, MT büyüme dinamikleri içinde karşılaştırıldıdallanmamış bölgelerin karşı veya hücre kenarları arka karşılık gelen olan dallanmış bölgeleri. plusTipTracker yazılım veri çıkışı, aynı zamanda ayrı ayrı hücre ve hücre altı bölgelerde renk kodlu parça bindirmeleri oluşturmak için de kullanılabilir. Burada MT büyüme dinamikleri ve morfolojisi ve yön göç dallanma AT yönetmeliğine bu MT depolimeraz katkısını modüle MCAK rolünü araştırmak için kullanılan metodolojiyi açıklamaktadır. Yaklaşımımız kolaylıkla kültürlenebilir ve plazmid cDNA elektroporasyon ile indüklenen, geçici transfeksiyon oldukça uygundurlar primer insan hücre hattı, insan göbek damarı endotelial hücreleri (HUVECler) kullanılmıştır. Daha sonra yüksek çözünürlüklü kullanılan protein 3 (EB3) ve Mitotik Sentromer İlişkili kinesin (MCAK) &#39;e özgü cDNA Bağlama MT sonu ile transfekte HUVEC zaman atlamalı floresan mikroskopi MT dinamikleri üzerindeki etkileri HUVECler transfekte değerlendirmek oluşturur. EB3 ve PlusTipTracker tabanlı hesaplama görüntü analiz-etiketli MT artı uçları ölçmek ve MT büyüme dinamikleri üzerinde deneysel manipülasyon etkilerini karşılaştırmak için, zaman atlamalı görüntüler MT büyüme hızları ve MT büyüme ömürleri ölçmek oldu. Bu metodoloji MT dinamiklerinin çalışma ve alt-hücresel bölgelerindeki MT dinamiklerinin lokalize düzenleme AK dallanma ve göç anjiyogenik süreçlere nasıl katkıda tanımlanması için izin verir. Bu teknikler floresan canlı hücreler etiketli ve ifade edilebilir herhangi MAP soruşturma için de geçerlidir.

<table><tbody><tr><td>Aurora A Inhibitor I</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1451</td><td></td></tr><tr><td>2% Bis solution</td><td>Bio-Rad</td><td>1610142</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropyltrimethyloxysilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>40% acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>1610140</td><td></td></tr><tr><td>405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module</td><td>Agilent Technologies</td><td>99462</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>anti&amp;ndash;mouse IgG immunoprecipitation beads</td><td>TrueBlot Reagents; Rockland Inc.</td><td>88-1688-31</td><td></td></tr><tr><td>anti&amp;ndash;rabbit IgG immunoprecipitation beads</td><td>TrueBlot Reagents; Rockland Inc.</td><td>88-7788-31</td><td></td></tr><tr><td>ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET455/50m</td><td></td></tr><tr><td>ET525/36m Emission Filter</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET525/36m</td><td></td></tr><tr><td>ET605/70m Emission Filter</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET605/70m</td><td></td></tr><tr><td>ET700/75m Emission Filter</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET700/75m</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin Fraction V</td><td>RPI Products</td><td>A30075-100.0</td><td></td></tr><tr><td>Clara cooled charge-coupled device camera</td><td>Andor Technology</td><td>77026010</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 donkey anti-rabbit</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Dyelight 649 goat anti-rat</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>112-496-068</td><td></td></tr><tr><td>EGM-MV SingleQuot Supply &amp;amp; Growth Factors (contents shown below)</td><td>Lonza</td><td>CC-4143</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum 25 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine brain extract 2.0 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin sulfate 0.5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epidermal growth factor 0.5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone 0.5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/ml, 10,000 &amp;#181;g Strep/ml)&amp;nbsp; 10.0 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3884-100G</td><td></td></tr><tr><td>Electronic shutter</td><td>Sutter instrument</td><td>77016099</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>EMD Millipore</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S80026</td><td></td></tr><tr><td>HALT Protease inhibitor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI-78425</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>HRP goat anti-mouse</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-036-062</td><td></td></tr><tr><td>HRP goat anti-rabbit</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-036-045</td><td></td></tr><tr><td>Immuno-Blot PVDF Membrane</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0174</td><td></td></tr><tr><td>Lanolin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8006-54-0</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643-500G</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon TiE</td><td>MEA53100</td><td></td></tr><tr><td>Motorized stage</td><td>ASI Technologies</td><td>MS-2000</td><td></td></tr><tr><td>Mounting medium</td><td>Dako</td><td>CS70330-2</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-Aurora A</td><td>Abcam</td><td>ab130156</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab9484</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-MCAK</td><td>Abcam</td><td>ab50778</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-tubulin (DM1A)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3873S</td><td></td></tr><tr><td>Nail Polish</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements software</td><td>Nikon</td><td>MQS310000</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector Kit V</td><td>Lonza</td><td>VACA-1003</td><td>Contains the electroporation buffer</td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P31-500</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 IU Pen/ml, 10,000 &amp;#181;g Strep/ml)</td><td>MP Biomedicals</td><td>91670249</td><td></td></tr><tr><td>Petroleum jelly</td><td>Dow Corning</td><td>2021854-1113</td><td></td></tr><tr><td>Pipes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757-100G</td><td></td></tr><tr><td>plusTipTracker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti&amp;ndash;pT288&amp;ndash;Aurora A</td><td>Abcam</td><td>ab18318</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti&amp;ndash;&amp;alpha;-tubulin</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA78G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium borohydride</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>678-10</td><td></td></tr><tr><td>Spinning disk&amp;nbsp;</td><td>Andor Technology</td><td>Yokagawa CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI-22589</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Corning</td><td>MT25053CI</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP337</td><td></td></tr></tbody></table>

high-resolution time-lapse imaging and automated analysis of microtubule dynamics in living human umbilical vein endothelial cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

canlı hücre mikroskopi için HUVEC kültürü Floresan proteinleri eksprese HUVEC&#39;lerin canlı hücre görüntüleme HUVECler normal hücre büyümesi ve bakımı, hem de normal bir protein ekspresyonu ve işlevi için uygun olan bir ortamda muhafaza gerektirir. 1 protokolünün şematik bir biçimde göstermektedir tamponlanmış hazırlamak için kullanılan göstermektedir ve kapalı sistem canlı hücrelerin zaman atlamalı görüntüleri toplamak için optik özelliklerini optimize koruduğunu. Çift taraflı bant ince şeritler, bir cam slayt (Şekil 1A) üzerine yerleştirilir ve daha sonra kültüre HUVECler içeren lamel hücreleri slayt (Şekil 1B) bakacak şekilde, bandın üzerine ters çevrilir. Bu şekilde, şerit iki cam yüzeyleri arasında küçük bir boşluk içerir ve hücreler, uygun bir hücre kültür ortamı içinde banyo edilebilir bir alan oluşturur (Şekil 1C, yukarıda, Protokolü 4). benkapalı bir sistem oluşturmak için (Şekil 1D 1 karışımı, valap 1: 1): lanolin: parafin na son adım, cam lamel bir vazelin ile cam slayt kapatılır. Bu hücre kültürü yaklaşımı kısa zaman dizisi EB3 kuyruklu yıldızların görüntüleme ve daha uzun dallanma zaman dizisi ve göç deneyleri için her ikisi için de kullanılmıştır. Ayrıca, valap balmumu benzeri tutarlılık sabitleme ve immüno dahil tamamlayıcı yaklaşımlar (Protokol 8) böyle deney, bir görüntüleme sonunda cam slayt ve lamel kolay çıkarılması için izin verir, aynı lamel ve hücre numunesi üzerinde yapılabilir bu canlı hücre görüntüleme yaklaşımı kullanılarak görselleştirildi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig1.jpg" /> Şekil 1:. Canlı hücre mikroskopik görüntüleme için HUVEC kültürünün Metodolojisi (A) 0.65 cm x 2 içine çift taraflı bant 2 adet kesin.50 cm dikdörtgen şeritler ve slayt alt kenarı boyunca bir yatay slayt üst kenarı boyunca çift taraflı bant parçası ve diğer parça, sabitleyin. (D) &#39;de tarif edildiği gibi haznesi sızdırmaz kılınması için bant ve slayt kenarı arasındaki boşluk küçük bir miktar sağlamak için önemlidir. (B) forseps HUVECler içeren lamel kaldırmak ve bant parçaları üstündeki lamel (aşağı hücre tarafı) ters kullanma. Bir mikropipet kullanarak (C), lamel ve cam slayt ile (25 uM HEPES ile desteklenmiş tam endotel bazal ortamı) görüntüleme ortamı 40 ul ekle. lamel ve slayt arasındaki boşluk tamamen görüntüleme ortamı ile dolu olduğundan emin olun ve kabarcıkları önlemek. Gerekirse, aşırı ortamı çıkarmak için lamel kenarı boyunca bir aspiratör kullanın. (D) sıcak valap kullanın (1: 1: 1 vazelin: lanolin: parafin) lamel kenarlarında mühür. görüntüleme medya sızıntı olup olmadığını kontrol edinlamel yavaşça etrafında iterek s. Düzeltmek için ek valap kullanın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> floresan etiketli EB3 otomatik izleme tüm hücre ve bölgesel MT büyüme dinamiklerinin kapsamlı bir analiz sağlar. EB3 protein açık tat ve son derece zaman ve mekan çözülmüş mikroskopik görüntü toplama hücresi içinde EB3 hareketleri analiz için esastır. floresan etiketli EB3 bir HUVEC sentezleme hücre ve floresan yoğunluğu, tipik olarak saatlik bir süre boyunca, aynı hücre içinde artar hücreye büyük farklılıklar gösterir. Nedenle, düşünün ve MT büyüme dinamikleri üzerinde artan EB ifade potansiyel etkilerini belirlemek amacıyla ifade profilinde bu değişiklikleri takip etmek önemlidir. Bu en iyi değerlendiren gri skala floresan intensit gerçekleştirilirY, her bir görüntülü hücre için profiller ve daha sonra, gri ölçekli ekspresyon profilleri tanımlanmış bir dizi sergileyen diğer hücrelere veri analizi sınırlayan. sentezleme profili veri setlerinin ilk değerlendirme kritiktir ve her hücre için plusTipTracker yazılım tarafından elde edilen MT büyüme dinamiği verileri ile karşılaştırılmalıdır. İfade profilleri için gri ölçekli ifadesi istenen aralığını belirlemek ve potansiyel outliers belirlemek için, MT büyüme hızı ve bir deney grubu içindeki her hücre için MT büyüme ömrü karşı çizilebilir. Bir HUVEC bir fibronektin substrat üzerinde kültüre Şekil 2 vurgular (yukarıda Protokolü 2.1, bakınız) ve MAPPLE etiketli EB3 optimal düzeylerde yakın dile getirdi. Floresan EB3 kuyruklu 12 sn (Şekil 2A) bir süre boyunca bir görüntü zaman atlamalı seri gösterilmiştir. plusTipTracker yazılımını kullanarak EB3 kuyruklu analizi otomatik bir, kare-kare EB3 kuyruklu yıldız DETE içerirction (yeşil ve sarı noktalar, Şekil 2B). Her çerçevesinde tespit edilen kuyruklu yıldızlar daha sonra EB3 parçaları ve görsel EB3 parça bindirme (Şekil 2C-F) üretmek için, çerçeve-kasa gelen pozisyonda kendi değişim bağımlı, bağlantılıdır. Parça bindirmeleri renk kodlu ve renk ayrımları kullanıcı tarafından girilen parametrelere göre belirlenebilir vardır. Genellikle, bu ayrımlar MT büyüme hızı ve MT büyüme ömür boyu 5,31 küresel ortalama kullanabilir ve böylece dört gruba veri split: yavaş ve kısa süreli (kırmızı), yavaş ve uzun ömürlü (sarı), hızlı ve kısa (yeşil) yaşamış, hızlı ve uzun ömürlü MT büyüme (mavi; Şekil 2G). EB3 etiketli MT büyüme dinamiklerinin PlusTipTracker aracılı izleme ayrıca İlgi (ROI) kullanıcı tanımlı Bölgeler sağlar. PlusTipTracker böylece MT büyüme dynam karşılaştırmalar için izin, kullanıcı tanımlı ROI (Şekil 2A, B ve F) içinden MT büyüme iz veri ayıklayanAynı hücrede farklı bölgeleri içinde ics. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig2.jpg" /> Şekil 2: EB3 kuyruklu algılama, izleme ve plusTipTracker veri çıkışı bir HUVEC ifade MAPPLE EB3 (A) time-lapse film.. Sol paneli hücre sınırları demarking bir bütün hücre görünümü ve tüm hücre maskesi (beyaz çizgi). Kırmızı kutu zaman atlamalı görüntüleri (sağ paneller) &#39;de gösterilen büyütülmüş bölgeyi temsil eder. Sağ paneller ardışık görüntüleme çerçeveleri (- t = 12 sn t = 0 sn) EB3 kuyruklu yıldızların ham gri skala zaman atlamalı görüntüleri göstermek. (A) gösterilen görüntülerden EB3 kuyruklu (B) plusTipTracker algılama. Sol panel tespit kuyruklu (sarı nokta) &#39;in bir tam hücre görünümünü göstermektedir. Kırmızı kutu zaman atlamalı görüntüleri (sağ paneller) &#39;de gösterilen büyütülmüş bölgeyi temsil eder. Sağ paneller beş algılandı EB3 kuyruklu (kırmızı oklar) vurgulamak ve 12 sn görüntüleme süresi boyunca bu beş kuyruklu iz. Yeşil<html> noktalar önceki zaman aralığında yoktu (ya da tespit edilmedi) EB3 kuyruklu tespit temsil eder. (C) (A) gösterilen EB3 kuyruklu 61 kare (2 dk film) maksimum yoğunluk projeksiyonu. (D) (C) gösterilen aynı 61 kare (2 dk film) ve plusTipTracker MT parça kaplaması. Maksimum intensite projeksiyon (E) Zoom (C kırmızı kutu). Maksimum yoğunluk projeksiyon plusTipTracker MT iz bindirme (F) Zoom (D kırmızı kutu). (G) parça (D) &#39;de gösterilen bindirmeleri ve (F) için efsane renk kodlu. Tanım olarak yavaş, hızlı, kısa süreli veya uzun ömürlü on MAPPLE-EB3 ifade HUVEC bir grup ölçülen tüm büyüme parçalar için ortalama değeri dayanmaktadır. kolay görselleştirme için, (D) ve (F) &#39;de parça bindirmeleri (A)&#39; da gösterilen hücre görüntünün ters piksel yoğunlukları kullanılarak oluşturulur. Ölçek çubukları 20 mikron =./files/ftp_upload/54265/54265fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. HUVEC dallanma ve göç yolları ECM gelen sinyalleri fiziksel Mechano duyarlıdır. HUVECler iyi belirli bir sinyal işaret (ler) 36,40-42 uygun bir hücresel yanıt dikte morfolojik değişiklikler geçmesi, bunu yaparken, sinyalizasyon ipuçları çeşitli cevap ve bilinmektedir. HUVECler fibronektin kaplı cam yüzeylerde (Şekil 3A) kültüre, ya da sert 2-boyutlu poliakrilamid ECMs üzerinde (55 kPa), tipik olarak birkaç farklı dallı çıkıntılar (Şekil 3B) ile bir yuvarlak veya uzun morfolojiye sahiptir. Bununla birlikte, kültürlendiğinde çok yumuşak 2 boyutlu poliakrilamit ECMlerin (0.7 kPa) üzerinde HUVECler kaynaklandığı bilinen bir çok dallı morfolojiye sahiptir aşağı uygun kaynaklımiyozin II kontraktilite 4,5,31 (Şekil 3C) düzenlenmesi. Bu nedenle, HUVECler ECM mechanosensing yoluyla hücresel morfoloji düzenler ve bu MT dinamikleri ve akto-miyozin kontraktilite lokalize modülasyonu yoluyla gerçekleştirilir. HUVECler dallanma HUVEC ölçmek amacıyla, morfolojik nitelikleri geniş bir yelpazede görüntüler Çünkü ilk dallı bir çıkıntı ne olduğunu tanımlamak ve sonra bir dallı çıkıntı objektif ölçülecektir nasıl tanımlamak için kritik öneme sahiptir. Bir teknik, bir hücre sınırı veya &quot;maske&quot; Hücre kenarlarını (Şekil 3D) tanımlamak için bir flüoresan birim işaretleyici ifade eden bir hücrenin bir görüntü kullanılarak hücrenin kenarlarını takip el ile elde edildiği bir dört aşamalı bir yaklaşım kullanılır. Maske nesil sonra, şube kökenleri dallı çıkıntı ve hücre gövdesi arasındaki eğrilik en büyük açı bulmak ile tanımlanır. Bir çizgi dema çekilirrk &quot;şube kökenli&quot; (mor açılı hatları Şekil 3E). Branch numarası tanımlanan şube kökenli (Şekil 3F) dalların sayısının sayılmasıyla basit ölçülür. Dal uzunluğu uzak kolu ucuna (Şekil 3G) şube kökenli mesafe olarak ölçülür. Veri analizi küçük lamellipodial projeksiyonlar dahil önlemek için, ek kriter onlar ( &quot;şube kökenli&quot; at) geniş daha dalları ( &quot;dal uzunluğu&quot;) daha uzun olmalıdır gerektirir ve dalları uzunluğunda 5 en az on mikron olması gerektiğini 31. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54265/54265fig3.jpg" /> . Şekil 3: HUVEC dallara ayırma morfolojisi analizi (A - C) HUVEC DIC görüntü örnekleri fibronektin kaplı cam ECMlerin (A) katı (55 kPa) poliakrilamid ECM&#39;ler (B) ve yumuşak bir kültüre (0.7kPa) poliakrilamid ECM&#39;ler (C). Sert ECMlerin (A, B) ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde 0,7 kPa poliakrilamid ECMlerin (C) kültürlenmiş HUVEC artar dallanma. (D). Bir MAPPLE-C1 cDNA inşa ifade eden bir transfekte HUVEC DIC mikroskobik görüntü (sol resim) (hücre hacmi işaretleyici, sağ resim). (Membran büyük eğrilik gösterir pozisyonda yani, mor renkli çizgiler) (E) eğrilik en büyük açı bularak şube kökeni tanımlayın düz bir çizgi ile açıları bağlamak ardından şube her iki tarafında ve (mavi çizgiler) . (F) belirlenmesi ve (E tanımlanan) &quot;dal kökenli&quot; dan&gt; 10 mikron uzatmak dallı çıkıntıları seçilmesi. elde etmek için dallı çıkıntılar sayısını &quot;şube sayısını.&quot; (G) mo için &quot;şube kökenli&quot; merkezine uzaklığı ölçünelde etmek için NIS Elements Yazılım açıklamalar ve ölçümler uygulamasında satırı aracını kullanarak şube st uzak nokta &quot;şube uzunluğu.&quot; Ölçek çubukları 20 mikron =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> algılama ECM uyulmasının yanı sıra, HUVECler da hissedebilir ve çizik yaralama tarafından uyarılan bitişik hücresel kişileri ortadan kaldırılmasına tepki. göç deneyde, HUVECler bir tek tabaka kültüre bir çizik yaraya maruz ve göç özellikleri (yukarıda, Protokol 9) ölçülür. Tek tabaka kazıyarak yara indüksiyon sonrası, yara-kenar HUVECler yara (Şekil 4A, t = 0 saat) içine uzanan bir çıkıntılı öncü geliştirerek polarize. 10-12 saatlik bir zaman süresi boyunca, polarize yara kenarı HUVECler yara bölgesine göç ve dolguyara, yeni bir konfluent tek tabaka oluşturulması (Şekil 4A, t 11 saat =). HUVEC dallanma olduğu gibi, mevcut delil kutuplaşma ve göç MT koordineli yeniden örgütlenme ve aktin cytoskeletons 43-49 üzerine eleştirel bağımlı olduğunu göstermektedir. Bu, ancak yara kenarı HUVECler 31 arka kenarında, ön kenarda MCAK kaynaklı MT sökme lokalize inhibisyonu yoluyla, kısmen, elde edilir. MT dinamiklerinin hassasiyet, yara ile indüklenen Aurora-A fosforilleyen ve ön kenarında MCAK inhibe kinaz ve MAP inhibe edilmesi veya aktive edebilen diğer kinazlar dahil olmak üzere çok sayıda alt-düzenleyici proteinleri, hedef Rac1 GTPaz tarafından başlatılır polarizasyon yerel MT büyümesini modüle eden ve 18,31,36,48,50-53 büzülme. Kapsamlı deneysel kanıtlar kenar çıkıntısı ön ve arka kenar daralma koordinasyonu Rac1 aktivasyonu döngüleri yoluyla idare olduğu görüşünü desteklemektedirböylece yönlendirilmiş hareketliliği 9,41,51,52,54-58 sürüş firar kenarında acto-miyozin kontraktilite için öncü MT montaj ve RhoA aktivasyonunu teşvik etmek. Bugüne kadar, hücre göçü otomatik izleme gerçekleştirmek için kurulmuş bir yöntem mevcut değildir. Bu hesaplama yara kenar hücreleri polarize ve göç olarak sürekli değişiyor hücre ECM sınırlarını analiz zorluk bir sonucudur. Birçok yazılım programları floresan etiketli hücreler 59-64 izleme yeteneğine sahip olmakla birlikte, yara kenarı taşıma deneylerinde HUVECler floresan etiketli yığın toplamı HUVEC nüfusun yaklaşık% 30-40, ve bu nedenle yara kenarı hücrelerin çoğunluğu gerekir faz-kontrast ya da DIC görüntüleme tarafından görüntülenmiştir. Ayrıca, yara-kenar göç ölçme belirli belirlenmesi için aynı yara içinde floresan ve floresan olmayan hücrelerin değerlendirilmesi zaman önemlidirİfade etkileri deneysel çalışma grupları dahilinde ve deneysel çalışma grupları arasında hem oluşturur. Şu anda, HUVEC göç ölçmek için en iyi yaklaşım, bir yara kenar hücresi ilk olarak tespit edilir ve daha sonra çekirdek ve nükleolus (Şekil 4B) tespit edildiği bir el izleme yaklaşımının kullanılmasıdır. Çekirdekçik nedeniyle yüksek ışık saçılması yoğunluğu ve göreceli olarak küçük bir boyuta hücre takibi için konum belirleyici olarak kullanılır. Çekirdekçiğin Bu iki özellik daha kolay tespit etmek ve kullanıcı bireysel parça pozisyonları yerleştirebilirsiniz hangi bölgeyi sınırlayarak ölçüm hatalarını azaltmak için yapmak. HUVEC göç parça daha sonra art arda time-lapse görüntü çerçevelerinde çekirdekçik tıklayarak oluşturulur. Son olarak, kökeni göç hızı ve göç mesafesi ölçüldü ve deney ve kontrol gruplarının hücre (Şekil 4B) için analiz edilir. <img alt="Şekil 4,"src = &quot;/ files / ftp_upload / 54265 / 54265fig4.jpg&quot; /&gt; Şekil 4: yara-kenar HUVEC ve göç izleme analizi çizik yara kenar HUVEC&#39;lere (aka &quot;Göç Deneyi&quot;) bir 11 saat zaman atlamalı görüntüleme serisinin (A) 20X faz-kontrast görüntüler.. Göç yara ve yönü paneli t = 0 saatte belirtilmiştir. hücrelerin tek bir tabakası oluşuncaya kadar HUVECler yaraya bir yara kenar ve önceden çapraz gösterilmiştir (t = 3.5 saat - T 11 saat =). (B) geçiş deneyi zaman atlamalı görüntüleme analizi, (A &#39;de gösterildiği gibi), ilk hücre yere göre bir izlenebilir yara kenarı HUVEC kimlik (fiziksel yara kenarında, yani hücreleri) ve sentezleme profili (mekanizması doğrultusuyla satmaya gerektirir. deney GFP ifadesini içeriyorsa,) yeşil yara kenar hücreyi seçin. Faz kontrastlı görüntü kullanılarak, çekirdeği ve nükleolusa tanımlar. El, kullanarak ardışık time-lapse görüntüleri nükleolusa izlemekNIS Elements yazılımı gösterimler ve ölçümleri uygulama kökenli göç hızı ve mesafeyi belirlemek için. Ölçek çubukları = 100 mikron (A), 20 mikron (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells at JoVE.com

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

high-resolution-time-lapse-imaging-automated-analysis-microtubule

Research

JoVE Journal

Biology

11.0K Görüntüleme.  University of the Sciences in Philadelphia. Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed. 

Video: High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

İnsan umbilikal ven endotel hücreleri İzolasyon (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Biyoloji

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Akış Koşullarında İnsan umbilikal ven endotel hücreleri ve nötrofil Transmigration Çalışmaları Kullanılması İzolasyonu

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

Nötrofil Hicret altında Fizyolojik Akış sırasında endotel hücre-hücre Eklemlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning ve 3D mikrodamarlar Meclisi

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Biyomühendislik

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

Tümör mikroçevresinde Gerçek zamanlı Multisellüler Dynamics Genişletilmiş Time-lapse intravital Görüntüleme

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

Tıp

Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow in Microvasculature

Changes in blood flow velocity and distribution are vital in maintaining tissue and organ perfusion in response to varying cellular needs. Further, appearance of defects in microcirculation can be a primary indicator in the development of multiple pathologies. Advances in optical imaging have made intravital microscopy (IVM) a practical approach, permitting imaging at the cellular and subcellular level in live animals at high-speed over time. Yet, despite the importance of maintaining adequate tissue perfusion, spatial and temporal variability in capillary flow is seldom documented. In the standard approach, a small number of capillary segments are chosen for imaging over a limited time. To comprehensively quantify capillary flow in an unbiased way we developed Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow (STAFF), a macro for FIJI open-source&#160;image analysis software. Using high-speed image sequences of full fields of blood flow within capillaries, STAFF produces&#160;images that represent motion over time called kymographs for every time interval for every vascular segment. From the kymographs STAFF calculates velocities from the distance that red blood cells move over time, and outputs the velocity data as a sequence of color-coded spatial maps for visualization and tabular output for quantitative analyses. In normal mouse livers, STAFF analyses quantified profound differences in flow velocity between pericentral and periportal regions within lobules. Even more unexpected are the differences in flow velocity seen between sinusoids&#160;that are side by side and fluctuations seen within individual vascular segments over seconds. STAFF is a powerful new tool capable of providing novel insights by enabling measurement of the complex spatiotemporal dynamics of capillary flow.

To quantify microvascular flow from high speed capillary flow image sequences, we developed STAFF (Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow) software. Across the full image field and over time, STAFF evaluates flow velocities and generates a sequence of color-coded spatial maps for visualization and tabular output for quantitative analyses.

Mikrovaskülüste AlanSal Akışın Mekansal Zamansal Analizi

Changes in blood flow velocity and distribution are vital in maintaining tissue and organ perfusion in response to varying cellular needs. Further, ...

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles has emerged as an effective method to transiently and locally increase the permeability of the BBB, facilitating para- and transcellular transport of drugs across the BBB. Imaging the vasculature during ultrasound-microbubble treatment will provide valuable and novel insights on the mechanisms and dynamics of ultrasound-microbubble treatments in the brain.
Here, we present an experimental procedure for intravital multiphoton microscopy using a cranial window aligned with a ring transducer and a 20x objective lens. This set-up enables high spatial and temporal resolution imaging of the brain during ultrasound-microbubble treatments. Optical access to the brain is obtained via an open-skull cranial window. Briefly, a 3-4 mm diameter piece of the skull is removed, and the exposed area of the brain is sealed with a glass coverslip. A 0.82 MHz ring transducer, which is attached to a second glass coverslip, is mounted on top. Agarose (1% w/v) is used between the coverslip of the transducer and the coverslip covering the cranial window to prevent air bubbles, which impede ultrasound propagation. When sterile surgery procedures and anti-inflammatory measures are taken, ultrasound-microbubble treatments and imaging sessions can be performed repeatedly over several weeks. Fluorescent dextran conjugates are injected intravenously to visualize the vasculature and quantify ultrasound-microbubble induced effects (e.g., leakage kinetics, vascular changes). This paper describes the cranial window placement, ring transducer placement, imaging procedure, common troubleshooting steps, as well as advantages and limitations of the method.

This protocol describes the surgical and technical procedures that enable real-time in vivo multiphoton fluorescence imaging of the rodent brain during focused ultrasound and microbubble treatments to increase blood-brain barrier permeability.

Kan-Beyin Bariyer Geçirgenliğini Artırmak için Odaklanmış Ultrason ve Mikrobubble Tedavilerini Görselleştirmek için Gerçek Zamanlı Intravital Multifotoğraf Mikroskopisi

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...

Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the dynamic properties of the cytoskeleton. This protocol offers a technique for human primary fibroblast transfection, which can be difficult because of the specifics of primary cell cultivation conditions. Additionally, cytoskeleton dynamic property maintenance requires a low level of transfection to obtain a good signal-to-noise ratio without causing microtubule stabilization. It is important to take measures to protect the cells from light-induced stress and fluorescent dye fading. In the course of our work, we tested different transfection methods and protocols as well as different vectors to select the best combination of conditions suitable for human primary fibroblast studies. We analyzed the resulting time-lapse videos and calculated microtubule dynamics using ImageJ. The dynamics of microtubules' plus-ends in the different cell parts are not similar, so we divided the analysis into subgroups - the centrosome region, the lamella, and the tail of fibroblasts. Notably, this protocol can be used for in vitro analysis of cytoskeleton dynamics in patient samples, enabling the next step towards understanding the dynamics of the various disease development.

This protocol is dedicated to the microtubule plus-end visualization by EB3 protein transfection to study their dynamic properties in primary cell culture. The protocol was implemented on human primary skin fibroblasts obtained from Huntington's disease patients.

İnsan Primer Cilt Fibroblastlarına Dayalı Huntington Hastalık Modelinde Mikrotübül Artı-Uç Dinamikleri Görselleştirmesi

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

Dinamik Ca Otomatik Analizi<sup&gt; 2 +</supGörüntü Dizilerinde&gt; Sinyaller

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Gelişim ve karakterizasyonu<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mikrodamar Ağ ve Endotel kantitatif ölçümleri [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; I</sub&gt; Ve Nitrik Oksit Üretimi

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler