Um agradecimento especial ao Dr. Clare M. Waterman para orientação e discussões, Michelle Baird e Mike Davidson para fornecer muitas das construções de cDNA fluorescentes utilizadas nestes estudos, e Kathryn Applegate e Gaudenz Danuser para o desenvolvimento de software de análise de plusTipTracker MT. Este trabalho foi apoiado, em parte, por uma concessão para KAM from the Heart, Lung Blood Institute (NHLBI) e os Institutos Nacionais de Saúde (NIH) Nacional. (Grant: 4K22HL113069).

The authors declare that they have no competing financial interests.

Usando HUVECs na morfologia e Migração Experiências. processamento de imagem de células vivas da dinâmica de crescimento MT marcado com EB3 dentro HUVECs requer condições de cultura de células adequadas e reprodutíveis, a fim de medir e avaliar alterações no crescimento e morfologia MT HUVEC, de tal forma que eles podem ser atribuídos a uma sugestão ECM sinalização. HUVECs representam um excelente modelo para estudar a forma da célula e a motilidade. Eles são altamente passíveis de transfecção com cDNAs fluorescente marcado, eles exibem morfologias dramáticas em resposta a ambas as pistas de sinalização solúveis e físicos, e eles manter a capacidade de organizar-se em tubos vasculares quando fornecido condições de cultura de células apropriadas 65-70. culturas de células primárias, tais como HUVECs, requerem um tratamento e acompanhamento de passagem número de células cuidado para assegurar que as células são saudáveis ​​e que eles vão se comportar normalmente durante a experimentação. Por exemplo, quando a realização de experiências que investigam a cytoskeletonelada e / ou a morfologia das células, células HUVEC não devem ser utilizados em experiências para além da décima passagem de cultura de células, como células HUVEC tipicamente começam a apresentar morfologias não-uniforme em torno passagem doze a quinze. A densidade celular é também um regulador crítico de saúde HUVEC e a proliferação. investigações ramificação HUVEC (ver Protocolo de 10,1-10,4, acima) utilizar culturas de células de densidade relativamente baixa, a fim de fornecer as células de espaço físico para interagir com a sua ECM e estender as saliências ramificada. Em contraste, nos estudos de migração ferida de ponta (ver Protocolo 10,5-10,8), células HUVEC são cultura numa monocamada antes do ferimento. Como tal, as células HUVEC ferida de ponta exibir uma morfologia relativamente não-ramificado, levando saliências se estendem da borda, e exibem interacções célula-célula com os seus vizinhos imediatos à medida que migram para dentro da ferida. Advertências e vantagens do rastreamento MT Dynamics em viver HUVECs. Spinning microscopia de disco é uma excelente abordagem paratestar hipóteses experimentais que requerem clareza de imagem confocal com tempo de resolução. Com o módulo da câmara e do laser apropriado, esta abordagem é sensível a microscopia de fluorescência de baixa emissão e pode ajudar na fotodegradação reduzida em comparação com outros tipos de microscopia de fluorescência. Mais importante, esta abordagem é também adequada para moderada a imagem de alta resolução de tempo, como é necessário para a geração de medições abrangentes da dinâmica do crescimento MT utilizando a abordagem de marcação EB3, em uma variedade de diferentes tipos de células. Embora a metodologia de rotulagem EB3 crescente MT-Plus extremidades tem vantagens distintas em relação a outros métodos de marcação fluorescente MTS, que também tem desvantagens únicas. Por exemplo, há uma proporção da matriz MT que não está a crescer activamente, em qualquer momento dado, incluindo a população de Mts desmontagem e a população de Stábile MT não dinâmicos 71-74. EB3 não rotular essas duas populações de MTs ePor conseguinte, a contribuição destas duas populações não seria incluído na análise de dados experimentais. metodologias alternativas para avaliar a matriz MT todo têm-se centrado sobre a expressão da tubulina marcada com fluorescência, que incorpora em todas as populações de MTs e permite a identificação de crescimento, encolhimento e estável MTs. No entanto, devido à densidade relativamente elevada da matriz MT perto do centro da célula e adjacente ao centro do organizador de microtúbulos (MTOC), etiquetagem, a matriz MT toda cria uma desvantagem na realização de análise de imagem de extremidades MT que não estão perto da célula periferia 75-77. Experimentos usando co-rotulagem de duas cores de MTs com a tubulina fluorescentes e EB3 fluorescente em células vivas têm revelado, qualitativamente, que a grande maioria das MTs marcado com tubulina também são 78 marcados com EB3. Além disso, não tem sido um método eficiente de seguimento automatizado de Mts marcadas com fluorescente tubulina. Isto significa que os dados Collecção e as medidas de dinâmica de MT em células expressando tubulina fluorescentes requerem acompanhamento mão do MTs individuais, um processo que é propenso a erros e tedioso. Como resultado, a análise computacional automatizado de EB3 MT marcado tornou-se a metodologia preferida para a medição dinâmica MT, uma vez que pode ser aplicada a MT dinâmica experiências em vários tipos de células e dentro de uma variedade de regimes experimentais 35,79. Ligando MT Crescimento Dynamics para HUVEC Morfologia e Migração. Do ponto de vista de um pesquisador do citoesqueleto, uma adaptação extremamente útil na análise de rastreamento plusTipTracker automatizado é a capacidade de medir e avaliar ambas as alterações celulares e regionais inteiros na dinâmica de crescimento MT. A exigência de uma célula para se tornar polarizada é um pré-requisito essencial para migração de células direcional. Como tal, os sinais de sinalização polarizados têm sido conhecidos como fatores determinantes fundamentais para a migração de células direcional 30,31,51,54,56,80,81 </sup&gt;. Por exemplo, as moléculas de sinalização solúveis em água tais como VEGF induzir a polimerização de actina e crescimento MT para a sinalização de VEGF em tipos de células endoteliais 2,82-87. Além disso, em resposta às interações físicas com a ECM (por exemplo, conformidade e mechanosensing dimensionalidade), HUVECs modular a sua dinâmica MT regulando localmente mapas para promover o crescimento MT dentro alongando saliências ramificados, e isso serve para orientar a migração HUVEC na direção do cue 5,31,88. Assim, a polarização em resposta às sugestões de sinalização extracelulares destaca a necessidade de uma avaliação experimental de alterações localizadas na dinâmica do citoesqueleto. processamento de imagem de células vivas simultânea de dinâmica MT de crescimento (utilizando a abordagem EB3) e a migração de células HUVEC é extremamente difícil de realizar, porque MT crescer numa escala de tempo de segundos, ao passo que as alterações na morfologia celular e migração direccional ocorre numa escala de tempo de horas. No entanto, ambos os processos estão intimamente Linked. Além disso, imagiologia contínua, rápida de EB3 marcado com fluorescência na segunda escala de tempo conduz a fotodegradação do sinal EB3. As tentativas para superar este problema através da realização de séries de imagens com falta de EB3 (séries aquisição 1-2 min) a cada 30 minutos foram bem sucedidos, mas só poderia ser realizado em um pequeno número de ECs que teve expressão ideal de EB3 e que não exibir adverso para efeitos de iluminação laser foi repetida 5. Uma abordagem alternativa que permite interpretações de como a dinâmica de crescimento MT contribuir para alterações na morfologia celular e migração é a Região plusTipTracker de Interesse (ROI) da ferramenta 35 (ver Protocol 6.6). Esta metodologia permite o crescimento de células MT toda faixas para ser sub-dividido em regiões definidas pelo utilizador, a partir do qual MT faixas de crescimento podem em seguida ser extraídos e analisados. Por exemplo, comparações de &quot;ramificado&quot; versus regiões &quot;não-ramificados&quot; da célula revelaram que MTs crescer mais spequenos e mais persistente no interior das regiões ramificadas em relação à periferia da célula não-ramificado 5. Em polarizada ferida de ponta HUVECs, as comparações dos principais borda e de fuga dinâmica de crescimento borda MT revelou que induzida por MCAK desmontagem MT é inibida especificamente dentro do bordo de ataque, mas não a bordo de fuga. avaliação de ataque e de fuga dinâmica de crescimento borda MT em HUVECs expressando Rac1 e / ou mutantes de fosforilação de MCAK Regional revelou ainda que a ativação induzida por Rac1 da Aurora-A cinase especificamente e localmente inibe a atividade MCAK dentro da ponta para conduzir HUVEC polarização e migração direcional 31. Assim, a combinação de monitoramento automatizado da dinâmica de crescimento MT e avaliação regional da dinâmica de crescimento MT dentro das saliências ramificados e / ou o bordo de ataque da ferida de ponta HUVECs nos permitiu ligar dinâmica de crescimento MT à morfologia HUVEC e migração. Os protocolos descritos são designed para fornecer uma metodologia geralmente simples e altamente repetível para a cultura HUVEC e investigação experimental. No entanto, muitos dos pormenores de protocolos são complexos e morosos, o que, por sua vez, proporciona uma oportunidade para erros ou dificuldades em conduzir a metodologia experimental. Embora tenha sido tentado resolver problemas potenciais ao longo do protocolo, aqui é fornecida solução de problemas adicionais, detalhado de potenciais problemas que são menos comuns ou de outra forma abreviada como notas dentro dos protocolos de metodologia. Relacionado com lamelas de revestimento com substratos de poliacrilamida (Protocolo de 2,2), um problema comum que se levanta é a natureza complexa da activação de lamelas de vidro, o acoplamento de poliacrilamida para o vidro, a activação de poliacrilamida, e depois acoplamento ECM para a poliacrilamida. Um passo particularmente difícil e potencialmente problemática é a cultura de células HUVEC sobre o gel de f ibronectina / poliacrilamida após a exposição do poliAlamelas revestidas com crylamide a 2 mM de sulfo-SANPAH (passo 2.2.2.6, supra). É crítico para o sucesso da cultura de células HUVEC sobre estes substratos que sulfo-SANPAH ser completamente removido do sistema experimental que se segue conjugação ECM. Isto pode ser melhor conseguida por lavagem com ddH2O e incubando as lamelas em ddH2O num agitador durante a noite. Se as células cultivadas sobre as ECMs poliacrilamida não sobrevivem, ou se a viabilidade é menor do que o esperado, o aumento e a lavagem repetida da sulfo-SANPAH após conjugação a fibronectina (passo 2.2.2.9) é recomendado para potencialmente aliviar este problema. Relacionadas com Protocol 3 (transfecção cDNA e da cultura HUVEC em uma lamela), uma grande influência para o sucesso do processo de eletroporação é a manipulação das HUVECs tanto durante tripsinização das células para removê-los do frasco de plástico, e após a conclusão da a electroporação (passos 3,3-3,4, supra). É crítico para cuidarmonitorar completamente o HUVEC enquanto em tripsina, e não deve exceder o tempo necessário para que as células &quot;round-up&quot; na superfície do balão (normalmente 1-2 minutos). tempo excessivo em tripsina é uma das principais causas de morte de HUVEC, que normalmente não é realizada até que as células são plaqueadas em lamelas revestidas com fibronectina (passo 3.4) e, em seguida, deixar de anexar ao substrato. De importância semelhante, HUVECs (ea maioria dos tipos de células primário) não se saem bem quando suspenso por longos períodos no buffer de eletroporação. Durante as experiências em maior escala, por exemplo, onde o utilizador tem cinco ou mais condições que requerem a electroporação, é preferível manter as células sedimentadas em tubos individuais (um tubo por transfecção) e misturá-los, uma-a-uma-vez , no tampão de electroporação imediatamente antes da electroporação. Esta aproximação minimiza o tempo de incubação em tampão de electroporação e sobrevivência HUVEC maximizada. Além disso, o salvamento imediato em meios de cultura completos é também Critical Após a electroporação. atrasos de resgate de mais uma sequência eletroporação minuto ou pode resultar em quase morte completa HUVEC e, portanto, deve ser evitado. Relacionado ensaio de migração de células (Protocolo 9), a técnica de cultura de HUVEC a extremamente alta densidade depende de uma modificação crítica (descrito no passo 9.2) da metodologia de cultura celular tradicional HUVEC (descrito no Protocolo 3) que requer a secagem da lamela fibronectina revestido , a fim de permitir que a cultura de HUVEC a uma área muito pequena da lamela. Muitas vezes, se a lamela não é completamente seca ou se o revestimento antes de a lamela com fibronectina (passos 2.1 ou 2.2) não foi eficaz, as células contendo meios de comunicação que é colocada sobre a lamela irá perder a sua tensão superficial e expandir-se para o arestas da lamela, reduzindo assim a densidade de células na lamela. Um método para resolver este problema potencial é para aspirar a mídia da lamela e, em seguida,colocar a lamela (ainda na sua placa de 35 mm) para a parte de trás do armário de segurança biológica durante 5-10 min. Esta adaptação pode ajudar a permitir que o fluxo de ar dentro do armário para ajudar na secagem do prato. Se qualquer líquido visível permanece sobre a lamela depois de secagem ao ar, aspirar os pontos líquidos e novamente deixar secar ao ar durante 5-10 minutos adicionais na cabine de segurança biológica. É importante notar que não há nenhuma maneira de evitar completamente este problema potencial, mas torna-se menos de um problema com a prática repetida do protocolo. É também uma recomendação solução de problemas que, na preparação para o ensaio de lamelas migração de células (ou de qualquer ensaio, em geral), para preparar lamelas adicionais e tem HUVECs extras pronto-a-go em caso de problemas ao longo do caminho. Com estas considerações de resolução de problemas em mente, também é importante destacar a utilidade dos protocolos discutidos e suas implicações na investigação em biologia celular futuro. A aplicabilidade ao polyacrabordagem carboxílico é amplo, e inclui não apenas estudos bidimensionais de engajamento célula-ECM (descrito acima), mas também investigações tridimensionais 5. Esta aplicação é fundamental para aumentar a nossa compreensão de como HUVECs regular a forma e migração celular em ambientes fisiológicos e deve fornecer aos investigadores uma compreensão básica de como as mudanças morfológicas são coordenadas com as alterações do citoesqueleto. Embora os protocolos descritos aqui estão focados nas medições da dinâmica do crescimento MT, a maioria dos protocolos pode e deve ser adaptado para medir qualquer número de outros aspectos microscopicamente mensuráveis ​​de interacções célula-ECM. Com relação à dinâmica MT, há inúmeros mapas, incluindo pelo menos 14 famílias de kinesins 89, cada um com um papel potencial na contribuição para HUVEC polaridade e migração dirigida, e tudo o que pode ser investigadas utilizando os protocolos apresentados. futuras investigações deve umlso ser alvo de envolvimento célula-ECM no normal versus estados doentes. HUVEC protocolos aqui apresentados são aplicáveis ​​para investigações de processos homeostáticos vasculares normais, bem como para estados de doença, incluindo doença cardíaca, a retinopatia, o crescimento de tumores e metástases, para citar alguns. Conjugando visivelmente transparentes ECM e poliacrilamida substratos de conformidade receptivo com os estudos microscópicos permitirá estudos de noivado célula-ECM tais que a angiogênese vascular endotelial pode ser monitorada com alta resolução espacial e temporal. Estes tipos de abordagens experimentais já começaram a revelar diferenças importantes na forma da célula endotelial, polaridade, a migração e os efeitos de proteínas que regulam estes processos 5,31,90. Os futuros esforços devem visar a identificação como a combinação de conformidade ECM e mechanosensing dimensionalidade pode servir para localmente proteínas de controle que têm como alvo e regulam a dinâmica do citoesqueleto.

A angiogênese é desencadeada por sinais extracelulares de sinalização que promovem células endoteliais (ECS) para polarizar, migrar com especificidade direcional, e formam nova vasculatura em tecidos que exigem fornecimento de sangue. Os factores contributivos pensados ​​para conduzir a angiogénese são sinais a partir da matriz extracelular (ECM). Em resposta a estímulos físicos, ECs conceder novos ramos com especificidade direcional para guiar o movimento direcional na formação do 1,2 rede vascular. A arquitetura da morfologia CE e ramificação é definida por regulamento localizada do citoesqueleto de microtúbulos (MT) de uma forma que é coordenado com o regulamento da OTCA-miosina contratilidade 3. Para que ramos da CE para formar, miosina-II deve ser localmente reprimidos, resultando em saliências membrana localizadas 4. Ao mesmo tempo e no mesmo local no interior da célula, a dinâmica de crescimento tornam-se MT modificado resultando em crescimento lento MT e persistente para promover elon ramogação e estabilidade 5. Este regulamento do citoesqueleto coordenado permite ECs para polarizar sua morfologia para facilitar a migração direcional. O desenvolvimento de uma morfologia celular polarizada requer montagem MT polarizada 6. Na migração células epiteliais, o MTS crescer lentamente e persistentemente especificamente no bordo de ataque da célula 7-9; enquanto nos neurónios, o início e o alongamento dos axónios ou dendritos requer que o MTS não só estão presentes, mas que estão a ser sujeitos dinamicamente os processos de montagem e desmontagem de 10-15. Desta forma, o controlo da dinâmica de crescimento localizada MT determina a arquitectura da célula e permite a rápida remodelação da morfologia celular como ECs navegar através da sua ECM. dinâmica de crescimento MT são regulados por famílias de proteínas motor molecular e proteínas não-motorizado, denominado microtúbulos Proteínas Associadas ou microtúbulos proteínas que interagem (doravante referred como mapas). Os mapas podem ser localmente activado ou inactivado, normalmente através de cascatas de sinalização iniciadas na interface célula-ECM 16,17. função, mapas Uma vez ativo através da ligação à MT e alterando a cinética de montagem e desmontagem MT; funcionando assim para localmente regular a dinâmica MT, a fim de promover a forma da célula e polaridade 18-20. Mitótico Centromere Associated Cinesina (MCAK) é um mapa família Cinesina-13 que se liga a extremidades MT e casais hidrólise do ATP para MT desmontagem 21-23. Este papel funcional de MCAK é conhecido por ser crítico dentro do fuso mitótico 24-28, bem como durante a interfase 29,30. Dentro interfase ECs, desmontagem MT mediada por MCAK é regulada por localizada Aurora-A fosforilação induzida de MCAK em resposta a ferida de ponta a ativação induzida da pequena GTPase Rac1. O resultado desta cascata de sinalização é a inibição de MCAK no bordo de ataque de células endoteliais, resultando em crescimento MT polarizada para o leading borda e desmontagem MT induzida por MCAK no bordo de fuga de migrar ECs 31. metodologias tradicionais para medir a dinâmica de crescimento MT têm tipicamente usado rastreamento mão de qualquer tubulina fluorescente marcado ou, mais recentemente, fluorescente marcado com proteína de ligação MT End 1 ou 3 (EB1 ou EB3, respectivamente). A abordagem tubulina fluorescentes tem a vantagem de rotular a matriz MT inteiro. No entanto, porque a maioria dos tipos de células mitóticas manter um agregado radial de Mts durante a interfase 8,32,33, Mts perto do centrossoma são muito denso, e, como resultado, o crescimento de rastreamento MT e desmontagem da tubulina com fluorescente é geralmente limitada ao periférico regiões da célula. Devido a essas limitações, a utilização de proteínas EB marcado com fluorescência (EB1 ou EB3) tem sido a abordagem mais comum para avaliar a dinâmica MT. Porque EBs única rotular as crescentes mais-extremidades dos MTs, eles aparecem como pequenos (1-3 mm), fluorescente brilhantemente vemts, proporcionando assim um marcador facilmente discernível de MT polimerização com fundo muito limitado de fluorescência 34-37. Embora o facto de que a EBS etiqueta apenas um subconjunto da matriz MT representa uma grande força da abordagem EB, também realça uma limitação importante, que o MTS não-crescimento não são rotulados pela abordagem EB3. No entanto, a capacidade de medir e controlar cometas EB3 ao longo do tempo e visualizar o crescimento MT dentro das regiões sub-celular que esta abordagem seja ideal para aplicações que requerem avaliação regional da organização MT. Outra limitação crítica das metodologias tradicionais de medição dinâmica de crescimento MT tem sido muito grandes conjuntos de dados e o tempo necessário para a análise de dados. Essa limitação decorre da necessidade de acompanhamento lado de centenas de cometas EB na resolução temporal alta. Além disso, estas medições devem ser feitas num número estatisticamente significativo de células e também realizada sob uma variedade de controlo e experimecondições ntal. Recentemente, estas restrições foram superados através de técnicas de análise computacional especificamente dirigidas a cometas rastreamento EB3 meio de microscopia de lapso de tempo em células vivas 35. Quando usado adequadamente, esta abordagem computacional serve tanto para restringir a possibilidade de erro humano associado com a mão-de rastreamento, além de fornecer um método de alto rendimento de medição MT polimerização. Análise computacional da dinâmica MT utilizando o pacote de software baseado em MatLab, plusTipTracker, permite medições de crescimento MT por rastreamento cometas EB3 fluorescente-etiquetados 5,31,35,38. Além disso, o software plusTipTracker permite cálculos de eventos catastróficos MT (aka desmontagem) com base no desaparecimento de cometas EB3 dentro de uma faixa MT crescendo, e permite a análise de sub-celular (aka regional) da dinâmica de crescimento MT dentro de regiões definidas pelo usuário de interesse . Para os nossos estudos, a dinâmica de crescimento MT foram comparadas dentroregiões ramificada contra regiões não ramificados, ou dentro de líder em relação à direita bordas celulares. A saída de dados a partir de software plusTipTracker também pode ser usado para gerar sobreposições de pista com código de cores para células individuais e as regiões sub-celulares. Aqui nós descrevemos a metodologia utilizada para investigar o papel do MCAK na modulação da dinâmica de crescimento MT e a contribuição deste depolimerase MT para a regulamentação da EC ramificação morfologia e migração direcional. A nossa abordagem utilizada uma linha celular humana primária, Células Endoteliais da Veia Umbilical Humana (HUVECs), que são facilmente cultivadas e altamente passível de induzida por electroporação, transfecção transiente de ADNc de plasmídeo. Em seguida, usamos de alta resolução, microscopia de fluorescência de lapso de tempo de HUVECs transfectadas com MT End Binding Protein 3 (EB3) e cDNA especï¿½ico mitótico Centromere Associated Cinesina (MCAK) constrói para avaliar os efeitos sobre a dinâmica MT transfectadas HUVECs. análise de imagem com base computacional de PlusTipTracker-EB3MT marcado com mais extremidades foi medir as velocidades de crescimento MT e vidas de crescimento MT em imagens de lapso de tempo, para medir e comparar os efeitos das manipulações experimentais sobre a dinâmica de crescimento MT. Esta metodologia permite o estudo da dinâmica de MT e a identificação de como a regulação da dinâmica MT localizada dentro de regiões sub-celulares contribui para os processos angiogénicos CE de ramificação e a migração. Estas técnicas são aplicáveis ​​às investigações de qualquer mapa que podem ser marcados com fluorescência e expressos em células vivas.

<table><tbody><tr><td>Aurora A Inhibitor I</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1451</td><td></td></tr><tr><td>2% Bis solution</td><td>Bio-Rad</td><td>1610142</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropyltrimethyloxysilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>40% acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>1610140</td><td></td></tr><tr><td>405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module</td><td>Agilent Technologies</td><td>99462</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>anti&amp;ndash;mouse IgG immunoprecipitation beads</td><td>TrueBlot Reagents; Rockland Inc.</td><td>88-1688-31</td><td></td></tr><tr><td>anti&amp;ndash;rabbit IgG immunoprecipitation beads</td><td>TrueBlot Reagents; Rockland Inc.</td><td>88-7788-31</td><td></td></tr><tr><td>ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET455/50m</td><td></td></tr><tr><td>ET525/36m Emission Filter</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET525/36m</td><td></td></tr><tr><td>ET605/70m Emission Filter</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET605/70m</td><td></td></tr><tr><td>ET700/75m Emission Filter</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET700/75m</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin Fraction V</td><td>RPI Products</td><td>A30075-100.0</td><td></td></tr><tr><td>Clara cooled charge-coupled device camera</td><td>Andor Technology</td><td>77026010</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 donkey anti-rabbit</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Dyelight 649 goat anti-rat</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>112-496-068</td><td></td></tr><tr><td>EGM-MV SingleQuot Supply &amp;amp; Growth Factors (contents shown below)</td><td>Lonza</td><td>CC-4143</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum 25 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine brain extract 2.0 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin sulfate 0.5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epidermal growth factor 0.5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone 0.5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/ml, 10,000 &amp;#181;g Strep/ml)&amp;nbsp; 10.0 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3884-100G</td><td></td></tr><tr><td>Electronic shutter</td><td>Sutter instrument</td><td>77016099</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>EMD Millipore</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S80026</td><td></td></tr><tr><td>HALT Protease inhibitor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI-78425</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>HRP goat anti-mouse</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-036-062</td><td></td></tr><tr><td>HRP goat anti-rabbit</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-036-045</td><td></td></tr><tr><td>Immuno-Blot PVDF Membrane</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0174</td><td></td></tr><tr><td>Lanolin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8006-54-0</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643-500G</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon TiE</td><td>MEA53100</td><td></td></tr><tr><td>Motorized stage</td><td>ASI Technologies</td><td>MS-2000</td><td></td></tr><tr><td>Mounting medium</td><td>Dako</td><td>CS70330-2</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-Aurora A</td><td>Abcam</td><td>ab130156</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab9484</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-MCAK</td><td>Abcam</td><td>ab50778</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-tubulin (DM1A)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3873S</td><td></td></tr><tr><td>Nail Polish</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements software</td><td>Nikon</td><td>MQS310000</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector Kit V</td><td>Lonza</td><td>VACA-1003</td><td>Contains the electroporation buffer</td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P31-500</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 IU Pen/ml, 10,000 &amp;#181;g Strep/ml)</td><td>MP Biomedicals</td><td>91670249</td><td></td></tr><tr><td>Petroleum jelly</td><td>Dow Corning</td><td>2021854-1113</td><td></td></tr><tr><td>Pipes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757-100G</td><td></td></tr><tr><td>plusTipTracker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti&amp;ndash;pT288&amp;ndash;Aurora A</td><td>Abcam</td><td>ab18318</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti&amp;ndash;&amp;alpha;-tubulin</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA78G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium borohydride</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>678-10</td><td></td></tr><tr><td>Spinning disk&amp;nbsp;</td><td>Andor Technology</td><td>Yokagawa CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI-22589</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Corning</td><td>MT25053CI</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP337</td><td></td></tr></tbody></table>

high-resolution time-lapse imaging and automated analysis of microtubule dynamics in living human umbilical vein endothelial cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

cultura HUVEC para microscopia de células vivas Processamento de imagem de células vivas, de células HUVEC que expressam proteínas fluorescentes requer que HUVECs são mantidas num ambiente que é adequado para o crescimento normal das células e manutenção, bem como a expressão da proteína e a função normal. A Figura 1 mostra uma representação esquemática do protocolo utilizado para preparar um tamponada e sistema fechado que mantém otimizado características ópticas para a recolha de imagens de lapso de tempo de células vivas. Tiras finas de fita de face dupla são colocadas sobre uma lâmina de vidro (Figura 1A) e, em seguida, a lamela contendo a HUVEC cultivadas é invertido por cima da fita de modo a que as células estão virados para a lâmina (ver figura 1B). Desta forma, a fita fornece uma pequena diferença entre as duas superfícies de vidro, e cria um espaço no qual as células podem ser banhados em apropriado meios de cultura celular (Figura 1C; ver Protocolo 4, acima). Euna etapa final, a lamela de vidro é selada para a lâmina de vidro usando uma geleia de petróleo: cera de parafina: lanolina (1: 1: 1 mistura, valap; Figura 1D) para estabelecer um sistema fechado. Esta abordagem de cultura de células foi utilizado para ambos o mais curto tempo de imagiologia sequência cometas EB3 e para a sequência de tempo mais longo de ramificação e experiências de migração. Além disso, a consistência do tipo cera de valap permite a fácil remoção da lâmina de vidro e a lamela, no final de uma imagem experimentar tais que as abordagens complementares, incluindo fixação e imunomarcação (ver Protocolo 8), pode ser realizada no mesmo lamela e amostra de células que foi visualizada usando a abordagem de imagem de células vivas. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig1.jpg" /> Figura 1:. Metodologia da cultura HUVEC de imagens microscópicas de células vivas (A) Corte 2 pedaços de fita dupla face em 0,65 cm x 2.50 cm tiras rectangulares e garantir um pedaço de fita adesiva de dupla face na horizontal ao longo da borda superior da lâmina, e a outra peça, ao longo da borda inferior da lâmina. É importante para permitir que uma pequena quantidade de espaço entre a fita e a borda corrediça para vedar a câmara, tal como descrito em (D). (B) Utilizando uma pinça remover a lamela contendo células HUVEC e inverter a lamela (lado célula para baixo) na parte superior das tiras de fita. (C) Com uma micropipeta, adicione 40 mL de meios de imagem (meio basal endotelial completo suplementado com 25 mM HEPES) entre a lamela e a lâmina de vidro. Certifique-se de que o espaço entre as lamelas e slide é completamente preenchida com a mídia de imagem e evitar bolhas. Usar um aspirador ao longo da borda da lamela para remover o excesso de meios de comunicação, se necessário. (D) Use valap quente (1: 1: 1 de vaselina: lanolina: parafina) para vedar em torno das bordas da lamela. Verifique se há vazamento de mídia de imagems, empurrando ao redor suavemente sobre a lamela. Use valap adicional para remediar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> monitoramento automatizado de EB3 fluorescente marcado permite a análise abrangente de célula inteira e dinâmica de crescimento MT regionais. A recolha de claras e distintas e altamente tempo e resolvida no espaço imagens microscópicas da proteína EB3 é essencial para a análise dos movimentos EB3 dentro da célula. expressão de HUVEC EB3 fluorescentemente marcado varia amplamente de célula para célula e a intensidade da fluorescência aumenta tipicamente dentro da mesma célula ao longo de um período de horas. Assim, é importante considerar e monitorar essas mudanças no perfil de expressão, a fim de identificar os potenciais efeitos de aumento da expressão EB na dinâmica de crescimento MT. Isto é melhor realizado através da avaliação intensit fluorescência em escala de cinzay perfis para cada célula fotografada, e, em seguida, restringindo a análise de dados para as células que exibem uma variedade de perfis de expressão definido de escala de cinzentos. A avaliação inicial dos conjuntos de dados de perfil de expressão é crítica, e deverá ser comparado com dados de MT dinâmica de crescimento que é obtido pelo software plusTipTracker para cada célula. perfis de expressão pode ser registada em função da velocidade de crescimento MT e duração de crescimento MT para cada célula dentro de um grupo experimental, a fim de determinar o alcance desejado de expressão em escala de cinza e identificar potenciais valores atípicos. A Figura 2 destaca a HUVEC cultivadas em um substrato de fibronectina (ver protocolo 2.1, acima) e expressando perto dos níveis óptimos de EB3 Mapple marcado. Cometas EB3 fluorescentes são mostrados em uma série de lapso de tempo de imagens ao longo de um período de 12 segundos (Figura 2A). Análise de cometas EB3 usando software plusTipTracker envolve um, quadro-a-quadro EB3 cometa dete automatizadoction (pontos verdes e amarelos, Figura 2B). Cometas detectados dentro de cada quadro são, então, ligadas, dependente da sua mudança de posição de quadro-a-quadro, para gerar faixas EB3 e uma sobreposição de faixa EB3 visual (Figura 2C-F). sobreposições de faixa são e distinções de cor pode ser determinada por parâmetros introduzidos pelo utilizador com código de cores. Normalmente, estas distinções utilizar a média mundial de velocidade de crescimento MT e MT vida crescimento 5,31 e, assim, dividir os dados em quatro grupos: lenta e de curta duração (vermelho), lenta e longa duração (amarelo), rápidas e de curto viveu (verde), e crescimento MT rápido e longa vida (azul; Figura 2G). rastreamento PlusTipTracker mediada da dinâmica de crescimento MT marcado com EB3 também permite Regiões definidas pelo usuário de interesse (ROI). PlusTipTracker extrai os dados da faixa de crescimento MT de dentro do ROI definida pelo usuário (Figura 2A, B e F), permitindo assim comparações de DYNAM crescimento MTICS dentro de diferentes regiões da mesma célula. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig2.jpg" /> Figura 2: Detecção cometa EB3, controle e saída de dados plusTipTracker (A) filme de lapso de tempo de um HUVEC expressando Mapple EB3.. O painel esquerdo mostra uma vista de células inteiras e uma máscara de célula inteira (linha branca) demarcando os limites da célula. Caixa vermelha representa a região ampliada mostrado nas imagens de lapso de tempo (painéis da direita). painéis da direita mostram imagens de lapso de tempo em escala de cinza matérias de cometas EB3 em quadros de imagem sucessivos (t = 0 seg - t = 12 seg). (B) Detecção de cometas plusTipTracker EB3 das imagens apresentadas em (A). O painel esquerdo mostra uma vista de células inteiras de cometas detectados (pontos amarelos). Caixa vermelha representa a região ampliada mostrado nas imagens de lapso de tempo (painéis da direita). painéis da direita destacar cinco cometas EB3 detectados (setas vermelhas) e traçar esses cinco cometas durante o período de imagem 12 seg. verde<html> Os pontos representam detectado cometas EB3 que não existiam (ou não foram detectados) no intervalo de tempo anterior. (C) projeção de intensidade máxima de 61 quadros (2 min) de filme de cometas EB3 mostrado em (A). (D) plusTipTracker MT sobreposição de controle dos mesmos 61 quadros (2 min de filme) mostrados em (C). (E) Zoom de projeção de intensidade máxima (caixa vermelha na C). (F) Zoom de plusTipTracker MT sobreposição de controle de projeção de intensidade máxima (caixa vermelha na D). Legenda para as sobreposições de trilha mostrado em (D) e (F) (G) com código de cores. Designação como lento, rápido, de vida curta ou longa duração baseia-se no valor médio para todas as faixas de crescimento, medida em um grupo de HUVECs expressando dez Mapple-EB3. Para melhor visualização, sobreposições de pista em (D) e (F) são gerados usando intensidades de pixel da imagem invertida célula mostrado em (A). Barras de escala = 20 uM./files/ftp_upload/54265/54265fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. HUVEC ramificação e padrões de migração são sensíveis a mecano-físico sinais do ECM. HUVECs são bem conhecidos para responder aos diversos tipos de sinais de sinalização e, ao fazê-lo, se submeter a alterações morfológicas que determinam uma resposta celular apropriada para a sinalização sinalização específica (s) 36,40-42. HUVECs cultivadas em substratos de vidro revestidas com fibronectina (Figura 3a), ou em rígidas ECMs de poliacrilamida de 2 dimensões (55 kPa) tipicamente exibir uma morfologia redonda ou alongada com poucas protuberâncias ramificados distintos (Figura 3B). No entanto, quando cultivadas em muito suaves ECMs de poliacrilamida de 2 dimensões (0,7 kPa), HUVEC exibir uma morfologia altamente ramificada que se sabe resultar de cumprimento induzida para baixoregulação da miosina-II contractilidade 4,5,31 (Figura 3C). Assim, HUVECs regular sua morfologia celular através mechanosensing ECM, e isso é feito através da modulação localizada de dinâmica de MT e contratilidade acto-miosina. Porque HUVECs exibir uma ampla variedade de atributos morfológicas, de modo a medir a HUVEC ramificação é fundamental para o primeiro definir uma saliência é ramificado, e, em seguida, para definir uma saliência como ramificada será medido objectivamente. Uma técnica utiliza uma abordagem de quatro etapas, através da qual um limite de célula ou &quot;máscara&quot; é gerada pelo lado traçando as arestas da célula usando uma imagem de uma célula que expressa um marcador fluorescente de volume para definir as arestas de células (Figura 3D). Após geração de máscara, origens de ramo são definidas por localização maior ângulo de curvatura entre a saliência ramificado e o corpo da célula. A linha é desenhada para DEMArk a &quot;origem branch&quot; (linhas angulares roxas; Figura 3E). Número da agência é medida simplesmente pela contagem do número de agências com um ramo de origem definida (Figura 3F). Comprimento do ramo é medida como a distância a partir da origem ramo para a ponta ramo distal (Figura 3G). Para evitar a inclusão de pequenas projeções lamellipodial de análise de dados, critério adicional exigir das sucursais deve ser mais longo ( &quot;comprimento do ramo&quot;) do que eles são largas (na &quot;origem ramo&quot;), e que as sucursais devem ser pelo menos dez mícrons de comprimento 5 , 31. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig3.jpg" /> . Figura 3: Análise de HUVEC morfologia ramificação (A - C) Exemplos de imagem DIC HUVECs cultivadas em revestidas com fibronectina ECMs de vidro (A) rígidas (55 kPa) ECMs poliacrilamida (B) e moles (0,7kPa) ECMs poliacrilamida (C). Ramificante é aumentada drasticamente em células HUVEC cultivadas em 0,7 ECMs poliacrilamida kPa (C), em comparação com ECMs duras (A, B). (D). DIC imagem microscópica (imagem da esquerda) de um HUVEC transfectadas expressando um cDNA Mapple-C1 construir (um marcador volume celular, a imagem à direita). (E) Definir a origem ramo, localizando o maior ângulo de curvatura (isto é, a posição em que a membrana apresenta o maior curvatura; linhas de cor roxa) em ambos os lados do ramo e, em seguida, conectar os ângulos com uma linha reta (linhas azuis) . (F) Identificar e selecionar saliências ramificados que se estendem&gt; 10 mm a partir da &quot;origem branch&quot; (definido em E). Contar o número de saliências ramificada obter o &quot;número da agência.&quot; (L) Medir a distância a partir do centro do &quot;ramo de origem&quot; para o MOponto distal st do ramo usando a ferramenta de linha na anotações e medições aplicação do NIS Elements Software para obter o &quot;comprimento do ramo.&quot; Barras de escala = 20 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Para além do cumprimento ECM detecção, HUVECs também perceber e responder à eliminação de contactos celulares adjacentes como induzidas por zero ferimento. No ensaio de migração, HUVECs cultivadas numa monocamada são submetidos a uma ferida zero e características de migração são medidas (ver Protocolo 9, acima). Após a indução da ferida por raspagem da monocamada, HUVECs ferida de ponta polarizar através do desenvolvimento de um bordo de ataque de protrusão que se estende para dentro da ferida (Figura 4A, t = 0 h). Ao longo de um curso de tempo de 10-12 horas, HUVECs ferida de ponta polarizadas migram para a área da ferida e encher oferida, que estabelece uma nova monocamada confluente (Figura 4A, t = 11 h). Tal como acontece com HUVEC ramificação, a evidência atual sugere que a polarização e migração é criticamente dependente da re-organização coordenada do MT e citoesqueleto de actina 43-49. Isto é conseguido, em parte, através da inibição localizada da desmontagem MT induzida por MCAK no bordo de ataque, mas não no bordo de fuga da ferida de ponta 31 de HUVECs. polarização é iniciada pela Rac1 GTPase, que tem como alvo várias proteínas reguladoras a jusante, incluindo Aurora-A cinase que fosforila e inibe MCAK no bordo de ataque, e outras quinases que sejam capazes de inibir ou activar mapeia a sensibilidade da dinâmica do MT para induzida ferida localmente modular o crescimento MT e encolhimento 18,31,36,48,50-53. evidência experimental extensa apoia a noção de que a coordenação de contração líder protrusão de ponta e bordo de fuga é regido por ciclos de activação Rac1para promover a montagem MT na vanguarda e ativação RhoA a contratilidade acto-miosina no bordo de fuga, aumentando assim a motilidade dirigido 9,41,51,52,54-58. Até à data, não há uma metodologia estabelecida para a realização de seguimento automatizado de migração celular. Este é um resultado da dificuldade em analisar computacionalmente limites célula-ECM que são constantemente mudando à medida que as células ferida de ponta polarizar e migrar. Enquanto muitos programas de software são capazes de rastrear as células marcadas com fluorescência 59-64, a população de células HUVEC marcado por fluorescência em experiências de migração ferida de ponta é de cerca de 30-40% da população total de HUVEC, e, por conseguinte, a maioria das células de feridas-aresta deve ser visualizado por contraste de fase ou imagem DIC. Além disso, é importante quando se mede a migração ferida de ponta para avaliar células fluorescentes e não fluorescentes dentro da mesma ferida, a fim de identificar específicaefeitos de construções de expressão tanto dentro dos grupos experimentais e de estudo entre os dois grupos de estudo experimentais. Actualmente, a melhor abordagem para medir a migração de HUVEC é a utilização de uma abordagem de rastreamento de mão em que uma célula de ferida de ponta é identificado pela primeira vez e, em seguida, o núcleo e o nucléolo são identificados (Figura 4B). O nucléolo é utilizado como determinante para a posição de seguimento de células, devido à sua densidade de dispersão de luz elevada e o tamanho relativamente pequeno. Estas duas características do nucléolo torná-lo mais fácil de identificar e reduzir os erros de medição, limitando a área em que o usuário pode colocar posições de faixas individuais. HUVEC faixas de migração são, então, gerado clicando no nucléolo em sucessivos quadros de imagem time-lapse. Finalmente, a velocidade de migração e distância de migração de origem são medidos e analisados ​​por grupos de células experimentais (Figura 4B) e controle de. <img alt="Figura 4"src = &quot;/ files / ftp_upload / 54265 / 54265fig4.jpg&quot; /&gt; Figura 4: Análise das HUVECs ferida de ponta e rastreamento de migração imagens (A) 20X de contraste de fase de uma série de imagens de lapso de tempo de 11 horas de zero ferida de ponta HUVECs (aka &quot;Migration Assay&quot;).. A ferida e direção da migração são indicados no painel t = 0 h. HUVECs são mostrados para atravessar a ferida de ponta e avançar para dentro da ferida até que uma monocamada de células é formada (T = 3,5 h - t = 11 h). (B) Análise do ensaio de migração de imagem lapso de tempo (como se mostra em A), exige primeiro a identificação de um HUVEC ferida de ponta rastreável com base no local de célula (ou seja, células fisicamente na borda da ferida) e perfil de expressão (i .e. , selecione uma célula borda da ferida verde se o experimento envolve a expressão de GFP). Usando a imagem de contraste de fase, identificar o núcleo e nucléolo. Mão acompanhar o nucléolo em imagens com lapso de tempo sucessivas usando a umnotações e medições aplicação em software NIS Elements para determinar a velocidade de migração e distância à origem. Barras de escala = 100 mm (A), 20 mm (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

De alta resolução de imagem Time-lapse e análise automatizada de microtúbulos Dynamics em Viver umbilical humano Células Endoteliais da Veia

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

high-resolution-time-lapse-imaging-automated-analysis-microtubule

Research

JoVE Journal

Biology

11.0K visualizações.  University of the Sciences in Philadelphia. Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed. 

Vídeo: High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

Isolamento de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Biologia

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Isolamento de Células endoteliais da veia umbilical humana e sua utilização no estudo de transmigração de Neutrófilos sob condições de fluxo

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Imunologia e Infecção

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

Imagens em tempo real de endoteliais junções célula-célula durante Neutrophil Transmigração Sob Fisiológica Fluxo

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning e Montagem de microvasos 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Bioengenharia

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

Estendida Time-lapse Imagem intravital do Real-time multicelular Dynamics no microambiente tumoral

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

Medicina

Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow in Microvasculature

Changes in blood flow velocity and distribution are vital in maintaining tissue and organ perfusion in response to varying cellular needs. Further, appearance of defects in microcirculation can be a primary indicator in the development of multiple pathologies. Advances in optical imaging have made intravital microscopy (IVM) a practical approach, permitting imaging at the cellular and subcellular level in live animals at high-speed over time. Yet, despite the importance of maintaining adequate tissue perfusion, spatial and temporal variability in capillary flow is seldom documented. In the standard approach, a small number of capillary segments are chosen for imaging over a limited time. To comprehensively quantify capillary flow in an unbiased way we developed Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow (STAFF), a macro for FIJI open-source&#160;image analysis software. Using high-speed image sequences of full fields of blood flow within capillaries, STAFF produces&#160;images that represent motion over time called kymographs for every time interval for every vascular segment. From the kymographs STAFF calculates velocities from the distance that red blood cells move over time, and outputs the velocity data as a sequence of color-coded spatial maps for visualization and tabular output for quantitative analyses. In normal mouse livers, STAFF analyses quantified profound differences in flow velocity between pericentral and periportal regions within lobules. Even more unexpected are the differences in flow velocity seen between sinusoids&#160;that are side by side and fluctuations seen within individual vascular segments over seconds. STAFF is a powerful new tool capable of providing novel insights by enabling measurement of the complex spatiotemporal dynamics of capillary flow.

To quantify microvascular flow from high speed capillary flow image sequences, we developed STAFF (Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow) software. Across the full image field and over time, STAFF evaluates flow velocities and generates a sequence of color-coded spatial maps for visualization and tabular output for quantitative analyses.

Análise Temporal Espacial do Fluxo de Campo na Microvasculatura

Changes in blood flow velocity and distribution are vital in maintaining tissue and organ perfusion in response to varying cellular needs. Further, ...

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles has emerged as an effective method to transiently and locally increase the permeability of the BBB, facilitating para- and transcellular transport of drugs across the BBB. Imaging the vasculature during ultrasound-microbubble treatment will provide valuable and novel insights on the mechanisms and dynamics of ultrasound-microbubble treatments in the brain.
Here, we present an experimental procedure for intravital multiphoton microscopy using a cranial window aligned with a ring transducer and a 20x objective lens. This set-up enables high spatial and temporal resolution imaging of the brain during ultrasound-microbubble treatments. Optical access to the brain is obtained via an open-skull cranial window. Briefly, a 3-4 mm diameter piece of the skull is removed, and the exposed area of the brain is sealed with a glass coverslip. A 0.82 MHz ring transducer, which is attached to a second glass coverslip, is mounted on top. Agarose (1% w/v) is used between the coverslip of the transducer and the coverslip covering the cranial window to prevent air bubbles, which impede ultrasound propagation. When sterile surgery procedures and anti-inflammatory measures are taken, ultrasound-microbubble treatments and imaging sessions can be performed repeatedly over several weeks. Fluorescent dextran conjugates are injected intravenously to visualize the vasculature and quantify ultrasound-microbubble induced effects (e.g., leakage kinetics, vascular changes). This paper describes the cranial window placement, ring transducer placement, imaging procedure, common troubleshooting steps, as well as advantages and limitations of the method.

This protocol describes the surgical and technical procedures that enable real-time in vivo multiphoton fluorescence imaging of the rodent brain during focused ultrasound and microbubble treatments to increase blood-brain barrier permeability.

Microscopia Multifotol Intravital em Tempo Real para visualizar tratamentos focados de ultrassom e microbolhas para aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...

Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the dynamic properties of the cytoskeleton. This protocol offers a technique for human primary fibroblast transfection, which can be difficult because of the specifics of primary cell cultivation conditions. Additionally, cytoskeleton dynamic property maintenance requires a low level of transfection to obtain a good signal-to-noise ratio without causing microtubule stabilization. It is important to take measures to protect the cells from light-induced stress and fluorescent dye fading. In the course of our work, we tested different transfection methods and protocols as well as different vectors to select the best combination of conditions suitable for human primary fibroblast studies. We analyzed the resulting time-lapse videos and calculated microtubule dynamics using ImageJ. The dynamics of microtubules' plus-ends in the different cell parts are not similar, so we divided the analysis into subgroups - the centrosome region, the lamella, and the tail of fibroblasts. Notably, this protocol can be used for in vitro analysis of cytoskeleton dynamics in patient samples, enabling the next step towards understanding the dynamics of the various disease development.

This protocol is dedicated to the microtubule plus-end visualization by EB3 protein transfection to study their dynamic properties in primary cell culture. The protocol was implemented on human primary skin fibroblasts obtained from Huntington's disease patients.

Visualização da dinâmica plus-end de microtúbulo no modelo de doença de Huntington baseado em fibroblastos de pele primárias humanas

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

Automated Análise de Ca dinâmico<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sinais em seqüências de imagens

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Desenvolvimento e Caracterização de<em&gt; In Vitro</em&gt; Rede de microvasos e medições quantitativas de endotelial [ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; E óxido nítrico Produção

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

De alta resolução de imagem Time-lapse e análise automatizada de microtúbulos Dynamics em Viver umbilical humano Células Endoteliais da Veia

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