Un ringraziamento particolare al Dr. Chiara M. Waterman per tutoraggio e le discussioni, Michelle Baird e Mike Davidson per fornire molti dei costrutti cDNA fluorescenti utilizzati in questi studi, e Kathryn Applegate e Gaudenz Danuser per lo sviluppo di software per l&#39;analisi plusTipTracker MT. Questo lavoro è stato sostenuto, in parte, da una sovvenzione di KAM dal National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) e il National Institutes of Health (NIH). (Grant: 4K22HL113069).

The authors declare that they have no competing financial interests.

Utilizzando HUVECs nella morfologia e migrazione esperimenti. live-cell imaging di dinamiche di crescita MT Eb3 marcato all&#39;interno HUVECs richiede condizioni di coltura delle cellule appropriate e riproducibili, al fine di misurare e valutare i cambiamenti nella crescita MT e HUVEC morfologia, tali da poter poi essere assegnati a uno spunto di segnalazione ECM. HUVECs rappresentano un ottimo modello per studiare la forma delle cellule e la motilità. Essi sono altamente suscettibili di trasfezione con cDNA fluorescenza marcata, essi mostrano morfologie drammatiche in risposta ad entrambi i segnali di segnalazione solubili e fisiche, e mantengono la capacità di organizzarsi in tubi vascolari quando fornito appropriate condizioni di coltura delle cellule 65-70. colture cellulari primarie, come HUVECs, richiedono attenta gestione e il monitoraggio del numero di passaggio di cellule al fine di garantire le cellule sono in buona salute e che si comporteranno normalmente durante la sperimentazione. Ad esempio, quando condurre esperimenti che indagano sul cytoskeleton e / o morfologia delle cellule, HUVECs non devono essere utilizzati per gli esperimenti oltre il decimo passaggio coltura cellulare, come HUVECs tipicamente iniziano a visualizzare morfologie non uniformi in tutto il passaggio dodici a quindici. densità delle cellule è anche un regolatore di salute critiche HUVEC e la proliferazione. HUVEC indagini ramificazione (vedi protocollo 10,1-10,4, sopra) utilizzano colture relativamente bassa densità cellulare in modo da fornire le cellule spazio fisico di interagire con l&#39;ECM ed estendere sporgenze ramificate. Al contrario, negli studi di migrazione ferita-edge (vedi protocollo 10,5-10,8), HUVECs sono cultura in un monostrato prima di ferimento. Come tale, HUVECs ferita-bordo mostrano una morfologia relativamente non-ramificato, estendere leader sporgenze bordo, ed esibire interazioni cellula-cellula con i loro vicini immediati quando migrano nella ferita. Avvertimenti e vantaggi di monitoraggio MT Dynamics in Living HUVECs. Spinning microscopia disco è un ottimo approccio perverificare ipotesi sperimentali che richiedono chiarezza di immagine confocale ad alta risoluzione temporale. Con il modulo telecamera e laser caso, questo approccio la microscopia è sensibile alle basse emissioni e di fluorescenza può aiutare a ridurre photobleaching rispetto ad altri tipi di microscopia a fluorescenza. È importante sottolineare che questo approccio è anche adatto per moderata a imaging ad alta risoluzione temporale come è richiesto per generare misurazioni complete della dinamica di crescita MT utilizzando l&#39;approccio di etichettatura EB3, in una varietà di tipi cellulari. Mentre la metodologia EB3 di etichettatura crescente MT plus-estremità presenta evidenti vantaggi rispetto ad altri metodi di etichettatura fluorescente MT, ha anche degli svantaggi unici. Ad esempio, vi è una percentuale della matrice MT che non cresce attivamente in un dato momento, comprendente sia la popolazione di MTS smontaggio e la popolazione di stabili, MTS non dinamici 71-74. EB3 non etichettare queste due popolazioni di MTS equindi il contributo di queste due popolazioni non sarebbe incluso nell&#39;analisi dei dati sperimentali. metodologie alternative per la valutazione l&#39;intero array MT si sono concentrati sulla espressione di tubulina fluorescenza marcata, che incorpora in tutte le popolazioni di MTS e consente l&#39;identificazione di crescere, restringimento e stabile MTS. Tuttavia, a causa della relativamente alta densità della matrice MT vicino al centro della cella e adiacente al microtubulo organizzare centrale (MTOC), etichettare l&#39;intero array MT crea uno svantaggio per eseguire l&#39;analisi di immagine di estremità MT che non sono vicino alla cella periferia 75-77. Gli esperimenti che utilizzano due colori di co-etichettatura di MTS con tubulina fluorescenti e EB3 fluorescente in cellule vive hanno rivelato, qualitativamente, che la stragrande maggioranza di MTS tubulina marcato sono anche EB3 marcato 78. Inoltre, non vi è stato un metodo efficiente di inseguimento automatico di MTS etichettati con tubulina fluorescente. Ciò significa che i dati Raccoltezione e le misure di dinamica MT in cellule che esprimono tubulina fluorescenti richiedono monitoraggio mano di singoli MT, un processo che è soggetto a errori e noioso. Di conseguenza, l&#39;analisi automatizzata computazionale di Eb3 marcato MTS è diventato il metodo preferito per la misura dinamica MT quanto può essere applicato a MT dinamica esperimenti in numerosi tipi di cellule e all&#39;interno di una varietà di regimi sperimentali 35,79. Collegamento MT dinamiche di crescita di HUVEC Morfologia e migrazione. Dal punto di vista di un investigatore del citoscheletro, un adattamento estremamente utile del plusTipTracker automatizzato di analisi di monitoraggio è la capacità di misurare e valutare entrambe le alterazioni cellulari e regionali interi nelle dinamiche di crescita MT. Il requisito per una cella di diventare polarizzata è un pre-requisito essenziale per la migrazione delle cellule direzionale. Come tale, stecche di segnalazione polarizzati sono da tempo noti come fattori di guida fondamentali per la migrazione delle cellule direzionale 30,31,51,54,56,80,81 </sup&gt;. Ad esempio, molecole di segnalazione solubili, come il VEGF induce polimerizzazione e la crescita MT verso lo spunto VEGF in tipi di cellule endoteliali 2,82-87. Inoltre, in risposta alle interazioni fisiche con l&#39;ECM (per esempio, il rispetto e la dimensionalità mechanosensing), HUVECs modulano le loro dinamiche MT dal livello locale regolando Maps per promuovere la crescita MT all&#39;interno allungamento sporgenze ramificati, e questo serve a guidare la migrazione HUVEC nella direzione della spunto 5,31,88. Così, la polarizzazione in risposta a segnali di segnalazione extracellulari mette in evidenza la necessità di una valutazione sperimentale delle variazioni localizzate nelle dinamiche del citoscheletro. live-cell imaging simultaneo della dinamica MT crescita (utilizzando l&#39;approccio EB3) e la migrazione delle cellule HUVEC è estremamente difficile da eseguire a causa MT crescono su una scala temporale di secondi, mentre le variazioni nella morfologia cellulare e la migrazione direzionale si verificano su una scala temporale di ore. Eppure entrambi i processi sono intimamente linked. Inoltre, continua, rapida imaging EB3 fluorescenza marcata sulla seconda scala temporale conduce photobleaching del segnale EB3. Tentativi di superare questo problema conducendo breve serie di immagini di EB3 (serie acquisizione 1-2 min) ogni 30 minuti hanno avuto successo, ma potrebbe essere realizzato solo in un piccolo numero di cellule endoteliali che aveva l&#39;espressione ottimale di EB3 e che non visualizzava negativo effetti alle illuminazione laser ripetuto 5. Un approccio alternativo che permette di interpretazioni di come le dinamiche di crescita MT contribuiscono ai cambiamenti nella morfologia cellulare e la migrazione è la Regione plusTipTracker di interesse (ROI) strumento 35 (vedi protocollo 6.6). Questa metodologia permette di tutta la crescita delle cellule MT tracce per essere suddivisa in regioni definite dall&#39;utente, da cui le tracce di crescita MT possono essere estratti e analizzati. Ad esempio, i confronti di &quot;ramificata&quot; contro &quot;non ramificati&quot; regioni della cellula hanno rivelato che MT crescono più sumile e più persistente all&#39;interno delle regioni ramificati rispetto alla non-ramificato periferia cellulare 5. In polarizzata ferita-edge HUVECs, confronti dei principali bordo e finali dinamiche di crescita bordo MT rivelato che MCAK indotta MT smontaggio è inibita in particolare all&#39;interno del bordo d&#39;attacco, ma non il bordo d&#39;uscita. la valutazione regionale di iniziali e finali dinamiche di crescita bordo MT in HUVECs esprimono Rac1 e / o mutanti di fosforilazione di MCAK inoltre rivelato che l&#39;attivazione Rac1-indotta di Aurora-A-chinasi specifica e localmente inibisce l&#39;attività MCAK all&#39;interno del bordo d&#39;attacco di guidare HUVEC polarizzazione e la migrazione direzionale 31. Pertanto, la combinazione di automatizzato di monitoraggio delle dinamiche di crescita MT e la valutazione regionale della dinamica di crescita MT all&#39;interno delle sporgenze ramificati e / o il bordo della ferita-edge HUVECs ci ha permesso di collegare dinamiche di crescita MT a HUVEC morfologia e la migrazione. I protocolli descritti sono designed per fornire una metodologia di solito, semplice e altamente ripetibile per la cultura HUVEC e indagine sperimentale. Tuttavia, molti dei dettagli del protocollo sono complesse e richiedono tempo, che, a sua volta, fornisce possibilità di errori o difficoltà nella conduzione della metodologia sperimentale. Mentre si è cercato di affrontare i problemi potenziali in tutto il protocollo, qui viene fornito ulteriori, la risoluzione dei problemi dettagliata dei potenziali problemi che sono meno comuni o in altro modo abbreviato come note all&#39;interno dei protocolli di metodologia. Relativi a lamelle di rivestimento con i substrati di poliacrilammide (protocollo 2.2), un problema comune che si pone è la natura complessa di attivare vetrino, accoppiando poliacrilammide al vetro, attivando poliacrilammide, e quindi l&#39;accoppiamento ECM alla poliacrilammide. Uno particolarmente difficile e potenzialmente problematico passo è la coltura HUVECs sul gel fibronectina / poliacrilammide in seguito all&#39;esposizione del Polyacoprioggetto crylamide rivestite a 2 mm solfo-SANPAH (step 2.2.2.6, sopra). E &#39;fondamentale per il successo della coltura HUVECs su questi substrati che solfo-SANPAH essere completamente rimosso dal sistema sperimentale seguente ECM coniugazione. Questo può essere meglio raggiunto mediante lavaggio con DDH 2 O e incubando i coprioggetti in DDH 2 O su un agitatore durante la notte. Se le cellule in coltura sulle ECM poliacrilammide non sopravvivono, o se la vitalità è inferiore al previsto, è aumentata e ha ripetuto il lavaggio di solfo-SANPAH dopo coniugazione di fibronectina (passo 2.2.2.9) si raccomanda di potenzialmente alleviare questo problema. Correlate al protocollo 3 (cDNA trasfezione e cultura HUVEC su un vetrino), una grande influenza per il successo della procedura di elettroporazione è la gestione delle HUVEC sia durante tripsinizzazione delle cellule per rimuoverli dal recipiente di plastica, e dopo la conclusione di l&#39;elettroporazione (passi 3.3-3.4, sopra). E &#39;fondamentale per la curapienamente monitorare il HUVECs mentre in tripsina, e non superare il tempo necessario per le celle a &quot;round-up&quot; sulla superficie del pallone (tipicamente 1-2 min). tempo eccessivo in tripsina è una delle principali cause di HUVEC morte, che non è in genere realizzato fino a quando le cellule sono placcati su vetrini fibronectina rivestite (punto 3.4) e quindi non riescono a collegare al substrato. Altrettanto importante, HUVECs (e la maggior parte dei tipi di cellule primarie) non se la passano bene quando sospeso per lunghi tempi nel buffer elettroporazione. Durante gli esperimenti larga scala, per esempio, in cui l&#39;utente ha cinque o più condizioni che richiedono elettroporazione, è meglio mantenere le cellule pellet in singoli tubi (1 tubo per trasfezione) e mescolarli, one-at-a-time , nel buffer elettroporazione immediatamente prima elettroporazione. Questo approccio riduce al minimo il tempo di incubazione in tampone elettroporazione e massimizzare la sopravvivenza HUVEC. Inoltre, il salvataggio immediato in terreni di coltura completo è anche critical dopo l&#39;elettroporazione. ritardi di salvataggio di un minuto o più dopo l&#39;elettroporazione può provocare vicino alla morte completa HUVEC e, quindi, dovrebbe essere evitato. Correlate assay migrazione cellulare (protocollo 9), la tecnica di coltura HUVECs ad altissima densità dipende da una modifica critica (descritto nel passaggio 9.2) della metodologia coltura cellulare tradizionale HUVEC (descritto nel protocollo 3) che richiede essiccazione della rivestito fibronectina coprioggetto al fine di consentire la cultura HUVEC in un&#39;area molto piccola del coprioggetto. Spesso, se il vetrino non è completamente asciugato o se la prima rivestimento del vetrino con fibronectina (i punti 2.1 o 2.2) non era efficiente, le cellule multimediali contenenti che è posto sul vetrino perderà la sua tensione superficiale ed espandere la bordi del vetrino, riducendo la densità delle cellule sul vetrino. Un metodo per risolvere questo potenziale problema è quello di aspirare il contenuto del vetrino e poiposizionare il coprioggetto (ancora nel suo piatto 35 mm) nella parte posteriore del cabinet biosicurezza per 5-10 min. Questo adattamento può aiutare a permettere il flusso d&#39;aria all&#39;interno dell&#39;armadio per assistere essiccazione del piatto. Se qualsiasi liquido visibile rimane sul vetrino dopo l&#39;asciugatura all&#39;aria, aspirare le macchie di liquido e di nuovo lasciare asciugare all&#39;aria per 5-10 minuti supplementari nell&#39;armadio biosicurezza. È importante notare che non vi è alcun modo per evitare completamente questo potenziale problema, ma non diventa un problema minore con pratica ripetuta del protocollo. E &#39;anche una raccomandazione guasti che quando si prepara lamelle per il saggio migrazione cellulare (o qualsiasi test, in generale), per preparare coprioggetto supplementari e hanno HUVECs supplementari ready-to-go in caso di problemi lungo la strada. Con queste considerazioni la risoluzione dei problemi in mente, è anche importante sottolineare l&#39;utilità dei protocolli discussi e le loro implicazioni in futuro la ricerca biologia cellulare. L&#39;applicabilità alla polyacrapproccio ylamide è ampia, e comprende non solo gli studi bidimensionali di impegno cellula-ECM (sopra descritta), ma anche le indagini tridimensionali 5. Questa applicazione è fondamentale per aumentare la nostra comprensione di come HUVECs regolano la forma delle cellule e la migrazione in ambienti fisiologici e dovrebbe fornire gli investigatori una conoscenza di base di come i cambiamenti morfologici sono coordinati con i cambiamenti del citoscheletro. Mentre i protocolli descritti qui si concentrano su misure della dinamica di crescita MT, la maggior parte dei protocolli può e deve essere adattato a misurare qualsiasi numero di altri aspetti microscopicamente misurabili di interazioni cellula-ECM. Per quanto riguarda la dinamica MT, ci sono numerose mappe, di cui almeno 14 famiglie di kinesins 89, ciascuno con un ruolo potenziale nel contribuire alla HUVEC polarità e la migrazione diretta, e ognuno dei quali può essere studiati utilizzando i protocolli presentati. Future indagini dovrebbe unLSO essere mirati al coinvolgimento cellula-ECM in normale contro gli stati malati. protocolli HUVEC qui presentati sono applicabili alle indagini delle normali processi omeostatici vascolari, nonché di stati patologici, tra cui le malattie cardiache, la retinopatia, la crescita del tumore e metastasi, per citarne alcuni. Coniugando visibilmente trasparenti ECM e poliacrilammide substrati di conformità suscettibili di studi microscopici permetterà cellula-ECM studi impegno tale che l&#39;angiogenesi vascolare endoteliale può essere monitorato con elevata risoluzione spaziale e temporale. Questi tipi di approcci sperimentali hanno già cominciato a rivelare importanti differenze di forma delle cellule endoteliali, la polarità, la migrazione e gli effetti delle proteine ​​che regolano questi processi 5,31,90. Gli sforzi futuri devono mirare ad identificare come la combinazione di conformità ECM e dimensionalità mechanosensing può servire a livello locale proteine ​​di controllo che prendono di mira e regolano la dinamica del citoscheletro.

L&#39;angiogenesi è innescata da segnali extracellulari di segnalazione che promuovono le cellule endoteliali (ECS) di polarizzare, migrare con la specificità direzionale, e formare nuovi vasi nei tessuti che richiedono apporto di sangue. fattori che contribuiscono pensato di guidare angiogenesi sono segnali dalla matrice extracellulare (ECM). In risposta a stimoli fisici, EC estendere nuove filiali con specificità direzionale per guidare movimento direzionale nella formazione del 1,2 rete vascolare. L&#39;architettura della morfologia CE e la ramificazione è definita dal regolamento localizzata del citoscheletro microtubuli (MT) in un modo che è coordinata con la regolazione del acto-miosina contrattilità 3. Al fine di rami CE per formare, miosina-II deve essere localmente downregulated, con conseguente sporgenze membrana localizzate 4. Allo stesso tempo e nella stessa posizione all&#39;interno della cellula, dinamiche di crescita MT diventano modificati con conseguente crescita lenta e persistente MT promuovere ramo Elongazione e stabilità 5. Questo regolamento del citoscheletro coordinata permette EC di polarizzare la loro morfologia per facilitare la migrazione direzionale. Lo sviluppo di una morfologia cellulare polarizzata richiede il montaggio polarizzata MT 6. In migrazione delle cellule epiteliali, MT crescono lentamente e persistentemente specificamente al bordo anteriore della cella 7-9; mentre nei neuroni, l&#39;apertura e l&#39;allungamento degli assoni o dendriti richiede che MT non solo sono presenti, ma che sono dinamicamente sottoposti ai processi di montaggio e smontaggio 10-15. In questo modo, il controllo localizzata di dinamiche di crescita MT determina l&#39;architettura della cellula e permette una rapida rimodellamento della morfologia cellulare ECS navigare attraverso il loro ECM. dinamiche di crescita MT sono regolati da famiglie di proteine ​​motrici molecolari e proteine ​​non motori, chiamati microtubuli proteine ​​associate o microtubuli proteine ​​interagenti (d&#39;ora in poi refeRred come MAP). Le mappe possono essere localmente attivato o inattivato, in genere attraverso la segnalazione cascate avviate a livello di interfaccia cellula-ECM 16,17. Una volta attiva la funzione, mappe legandosi al MT e alterare la cinetica della MT montaggio e smontaggio; funzionante in tal modo di regolare a livello locale dinamiche MT al fine di promuovere la forma delle cellule e la polarità 18-20. Mitotico Centromere Associated Kinesin (MCAK) è un Kinesin-13 MAP famiglia che si lega a fini MT e coppie idrolisi dell&#39;ATP per MT smontaggio 21-23. Questo ruolo funzionale MCAK si caratterizza per essere critici ai mitotico mandrino 24-28, così come durante l&#39;interfase 29,30. All&#39;interno interphase EC, MCAK mediata smontaggio MT è regolata da localizzato Aurora-A fosforilazione indotta MCAK in risposta a ferita-bordo di attivazione indotta della piccola GTPasi Rac1. Il risultato di questa cascata di segnalazione è l&#39;inibizione della MCAK all&#39;avanguardia di EC, con conseguente crescita MT polarizzata verso leading bordo e MCAK indotta MT smontaggio a bordo di uscita della migrazione EC 31. metodologie tradizionali per la misurazione dinamica di crescita MT sono tipicamente utilizzati monitoraggio mano di uno tubulina fluorescenza marcata o, più recentemente, fluorescenza marcata MT Fine binding protein 1 o 3 (EB1 o EB3, rispettivamente). L&#39;approccio tubulina fluorescente ha il vantaggio di etichettatura dell&#39;intero array MT. Tuttavia, poiché la maggior parte dei tipi di cellule mitotiche mantenere un allineamento radiale di MTS durante l&#39;interfase 8,32,33, MTs vicino centrosoma sono molto denso, e come risultato, il monitoraggio della crescita MT e smontaggio con la tubulina fluorescente è generalmente limitata alla periferica regioni della cellula. A causa di queste limitazioni, l&#39;utilizzo delle proteine ​​EB fluorescenza marcata (EB1 o Eb3) è stato l&#39;approccio più comune per misurare la dinamica MT. Perché EBs etichetta solo le crescenti più-end di MTS, appaiono come piccole (1-3 micron), fluorescenza brillante venirets, fornendo così un marcatore facilmente distinguibile di MT polimerizzazione con sfondo molto limitata fluorescenza di 34-37. Mentre il fatto che EBs etichetta solo un sottoinsieme della matrice MT rappresenta un importante forza dell&#39;approccio EB, evidenzia anche una limitazione importante, che MTs non-maturazione non sono etichettati dall&#39;approccio EB3. Tuttavia, la capacità di misurare e monitorare le comete Eb3 nel corso del tempo e di visualizzare la crescita MT nelle regioni sub-cellulari rendono questo approccio ideale per applicazioni che richiedono la valutazione regionale di organizzazione MT. Un altro limite critico delle metodologie tradizionali per la misurazione dinamica di crescita mt è stata molto grandi insiemi di dati e il tempo necessario per l&#39;analisi dei dati. Questa limitazione deriva dalla necessità di monitoraggio mano di centinaia di comete EB ad elevata risoluzione temporale. Inoltre, queste misurazioni devono essere fatte in un numero statisticamente significativo di cellule e anche effettuato sotto una varietà di controllo e experimecondizioni ntale. Recentemente, questi vincoli sono state superate attraverso tecniche di analisi computazionale specificamente dirette a comete monitoraggio Eb3 usando la microscopia time-lapse in cellule viventi 35. Se usato in modo appropriato, questo approccio computazionale serve sia per limitare il potenziale di errore umano associato mano-tracking, oltre a fornire un metodo ad elevata capacità di misurare MT polimerizzazione. Analisi computazionale della dinamica MT che utilizzano il pacchetto software MatLab-based, plusTipTracker, consente la misurazione della crescita MT di monitoraggio comete Eb3 fluorescenza marcata 5,31,35,38. Inoltre, il software plusTipTracker permette per i calcoli di eventi catastrofali MT (aka smontaggio) basati sulla scomparsa di comete Eb3 all&#39;interno di un brano MT in crescita, e consente l&#39;analisi sub-cellulare (aka regionale) di dinamiche di crescita MT nelle regioni definite dall&#39;utente di interesse . Per i nostri studi, la dinamica di crescita MT sono stati confrontati all&#39;internoregioni ramificati rispetto a regioni non ramificati, o entro leader contro bordi d&#39;uscita delle celle. Uscita dati da software plusTipTracker può anche essere usato per generare codice colore overlay binario per le singole celle e regioni sub-cellulari. Qui si descrive la metodologia utilizzata per studiare il ruolo di MCAK nella modulazione dinamiche di crescita MT e il contributo di questo MT depolymerase alla regolazione della CE ramificazione morfologia e la migrazione direzionale. Il nostro approccio utilizzato una linea primaria cellule umane, cellule endoteliali ombelicale Vena umana (HUVEC), che sono facilmente colto e altamente suscettibili di elettroporazione indotta, trasfezione transiente di plasmide cDNA. Abbiamo poi utilizzato ad alta risoluzione, time-lapse microscopia a fluorescenza di HUVECs trasfettate con MT Fine binding protein 3 (EB3) e Mitotic centromero Associated Kinesin (MCAK) cDNA SPECIFICI costruisce per valutare gli effetti sulle dinamiche MT transfettate HUVECs. analisi delle immagini computazionale PlusTipTracker a base di EB3MT -labeled più estremi è stato quello di misurare la velocità di crescita MT e vite di crescita MT in time-lapse immagini, per misurare e confrontare gli effetti delle manipolazioni sperimentali su dinamiche di crescita MT. Questa metodologia consente lo studio della dinamica MT e l&#39;identificazione di come regolazione localizzata della dinamica MT nelle regioni subcellulari contribuisce ai processi angiogenici di CE ramificazione e migrazione. Queste tecniche sono applicabili alle indagini di qualsiasi mappa che può essere fluorescente ed espressi in cellule vive.

<table><tbody><tr><td>Aurora A Inhibitor I</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1451</td><td></td></tr><tr><td>2% Bis solution</td><td>Bio-Rad</td><td>1610142</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropyltrimethyloxysilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>40% acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>1610140</td><td></td></tr><tr><td>405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module</td><td>Agilent Technologies</td><td>99462</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>anti&amp;ndash;mouse IgG immunoprecipitation beads</td><td>TrueBlot Reagents; Rockland Inc.</td><td>88-1688-31</td><td></td></tr><tr><td>anti&amp;ndash;rabbit IgG immunoprecipitation beads</td><td>TrueBlot Reagents; Rockland Inc.</td><td>88-7788-31</td><td></td></tr><tr><td>ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET455/50m</td><td></td></tr><tr><td>ET525/36m Emission Filter</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET525/36m</td><td></td></tr><tr><td>ET605/70m Emission Filter</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET605/70m</td><td></td></tr><tr><td>ET700/75m Emission Filter</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET700/75m</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin Fraction V</td><td>RPI Products</td><td>A30075-100.0</td><td></td></tr><tr><td>Clara cooled charge-coupled device camera</td><td>Andor Technology</td><td>77026010</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 donkey anti-rabbit</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Dyelight 649 goat anti-rat</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>112-496-068</td><td></td></tr><tr><td>EGM-MV SingleQuot Supply &amp;amp; Growth Factors (contents shown below)</td><td>Lonza</td><td>CC-4143</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum 25 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine brain extract 2.0 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin sulfate 0.5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epidermal growth factor 0.5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone 0.5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/ml, 10,000 &amp;#181;g Strep/ml)&amp;nbsp; 10.0 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3884-100G</td><td></td></tr><tr><td>Electronic shutter</td><td>Sutter instrument</td><td>77016099</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>EMD Millipore</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S80026</td><td></td></tr><tr><td>HALT Protease inhibitor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI-78425</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>HRP goat anti-mouse</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-036-062</td><td></td></tr><tr><td>HRP goat anti-rabbit</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-036-045</td><td></td></tr><tr><td>Immuno-Blot PVDF Membrane</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0174</td><td></td></tr><tr><td>Lanolin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8006-54-0</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643-500G</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon TiE</td><td>MEA53100</td><td></td></tr><tr><td>Motorized stage</td><td>ASI Technologies</td><td>MS-2000</td><td></td></tr><tr><td>Mounting medium</td><td>Dako</td><td>CS70330-2</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-Aurora A</td><td>Abcam</td><td>ab130156</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab9484</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-MCAK</td><td>Abcam</td><td>ab50778</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-tubulin (DM1A)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3873S</td><td></td></tr><tr><td>Nail Polish</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements software</td><td>Nikon</td><td>MQS310000</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector Kit V</td><td>Lonza</td><td>VACA-1003</td><td>Contains the electroporation buffer</td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P31-500</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 IU Pen/ml, 10,000 &amp;#181;g Strep/ml)</td><td>MP Biomedicals</td><td>91670249</td><td></td></tr><tr><td>Petroleum jelly</td><td>Dow Corning</td><td>2021854-1113</td><td></td></tr><tr><td>Pipes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757-100G</td><td></td></tr><tr><td>plusTipTracker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti&amp;ndash;pT288&amp;ndash;Aurora A</td><td>Abcam</td><td>ab18318</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti&amp;ndash;&amp;alpha;-tubulin</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA78G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium borohydride</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>678-10</td><td></td></tr><tr><td>Spinning disk&amp;nbsp;</td><td>Andor Technology</td><td>Yokagawa CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI-22589</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Corning</td><td>MT25053CI</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP337</td><td></td></tr></tbody></table>

high-resolution time-lapse imaging and automated analysis of microtubule dynamics in living human umbilical vein endothelial cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

cultura HUVEC per microscopia live-cell Live-cell imaging di HUVEC esprimono proteine ​​fluorescenti richiede che HUVEC sono mantenuti in un ambiente che è adatto per la normale crescita cellulare e la manutenzione, nonché espressione della proteina normale e funzione. La Figura 1 mostra una rappresentazione schematica del protocollo utilizzato per preparare una tamponata e sistema chiuso che mantiene ottimizzato caratteristiche ottiche per la raccolta di immagini time-lapse di cellule vive. Sottili strisce di nastro biadesivo sono posti su un vetrino (Figura 1A) e poi il vetrino contenente la coltura HUVECs è invertita sopra del nastro in modo tale che le cellule siano rivolti vetrino (Figura 1B). In questo modo, il nastro fornisce un piccolo spazio tra le due superfici di vetro, e crea uno spazio in cui le cellule possono essere bagnati in appositi mezzi di coltura cellulare (Figura 1C; vedi protocollo 4, sopra). iona passo finale, il vetrino di vetro è sigillato al vetrino con una vaselina: paraffina: lanolina (1: 1: 1 miscela, VALAP; Figura 1D) per stabilire un sistema chiuso. Questo approccio coltura cellulare è stato utilizzato sia per imaging breve sequenza temporale di comete Eb3 e per la sequenza di tempo maggiore ramificazione e esperimenti di migrazione. Inoltre, la consistenza simile alla cera di VALAP consente una facile rimozione dal vetrino e coprioggetto alla fine di un sistema di imaging sperimentare tale che approcci supplementari inclusi fissazione e immunolabelling (vedi protocollo 8), può essere effettuata sullo stesso vetrino e campione cellulare che è stato visualizzato utilizzando l&#39;approccio live-cell imaging. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig1.jpg" /> Figura 1:. Metodologia della cultura HUVEC per il live-cell immagini microscopiche (A) Tagliare 2 pezzi di nastro biadesivo in 0,65 cm x 2.50 cm strisce rettangolari e garantire un pezzo di nastro biadesivo orizzontalmente lungo il bordo superiore della diapositiva e l&#39;altro pezzo, lungo il bordo inferiore della diapositiva. È importante consentire una piccola quantità di spazio tra il nastro e il bordo scivolo per sigillare la camera come descritto in (D). (B) Utilizzando pinze rimuovere il vetrino contenente HUVECs e invertono il vetrino (lato della cella verso il basso) sulla parte superiore dei pezzi di nastro. (C) Usando una micropipetta, aggiungere 40 ml di mezzi di imaging (terreno completo basale endoteliale addizionato con 25 mM HEPES) tra il vetrino e il vetrino. Assicurarsi che lo spazio tra il vetrino e slitta è completamente riempito con i media di imaging e di evitare bolle. Utilizzare un aspiratore lungo il bordo del vetrino per rimuovere l&#39;eccesso supporto, se necessario. (D) Usare VALAP caldo (1: 1: 1 di vaselina: lanolina: paraffina) per sigillare intorno ai bordi del vetrino. Verificare la presenza di perdite di supporti di imagings spingendo intorno delicatamente sul vetrino. Utilizzare ulteriore VALAP per rimediare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig1large.jpg" target="_blank">Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> automatizzato di monitoraggio di EB3 fluorescenza marcata consente un&#39;analisi completa di tutto il cellulare e dinamiche di crescita MT regionali. La raccolta di immagini microscopiche chiare, distinte, e molto tempo e spazio risolta della proteina EB3 è essenziale per l&#39;analisi dei movimenti Eb3 all&#39;interno della cellula. HUVEC espressione di EB3 fluorescenza marcata varia ampiamente da cellula a cellula e l&#39;intensità di fluorescenza aumenta tipicamente all&#39;interno della stessa cella durante un periodo di ore. Pertanto, è importante considerare e monitorare questi cambiamenti nel profilo di espressione per identificare potenziali effetti di aumento di espressione EB sulle dinamiche di crescita MT. Questo è meglio raggiunto attraverso la valutazione a scala di grigi a fluorescenza intesitàprofili y per ogni cella ripreso e quindi limitando l&#39;analisi dei dati di quelle cellule che presentano un intervallo definito di profili di espressione in scala di grigi. Valutazione iniziale di set di dati profilo di espressione è critica e deve essere confrontato con MT dati dinamiche di crescita che si ottiene dal software plusTipTracker per ogni cella. profili di espressione possono essere rilevate in velocità di crescita MT e MT durata crescita per ogni cella all&#39;interno di un gruppo sperimentale, per determinare l&#39;intervallo desiderato di espressione scala di grigi e per identificare potenziali valori anomali. La figura 2 evidenzia una HUVEC coltivate su un substrato di fibronectina (vedi protocollo 2.1, sopra) e che esprimono nei pressi di livelli ottimali di EB3 Mapple marcato. Comete Eb3 fluorescenti sono mostrati in una serie temporale-lapse di immagini su un periodo di 12 sec (Figura 2A). Analisi delle comete Eb3 utilizzando il software plusTipTracker comporta un automatico, fotogramma per fotogramma EB3 cometa detection (punti verdi e gialli, Figura 2b). Le comete rilevati all&#39;interno di ciascun frame vengono quindi collegati, dipende dalla loro cambiamento di posizione da fotogramma a fotogramma, per generare tracce Eb3 e una sovrapposizione pista EB3 visivo (Figura 2C-F). sovrapposizioni pista sono codificati a colori e le distinzioni di colori possono essere determinati da parametri inseriti dall&#39;utente. Comunemente, queste distinzioni utilizzano la media globale della velocità di crescita MT e MT crescita durata 5,31 e quindi suddividere i dati in quattro gruppi: lenta e di breve durata (rosso), lento e longevi (giallo), veloce e breve vissuto (verde), e la crescita MT veloce e di lunga durata (blu; Figura 2G). monitoraggio PlusTipTracker-mediata di dinamiche di crescita MT Eb3 marcato consente inoltre Regioni definite dall&#39;utente di interesse (ROI). PlusTipTracker estrae i dati della traccia crescita MT all&#39;interno della ROI definito dall&#39;utente (Figura 2A, B e F), consentendo in tal modo per il confronto di MT crescita dynamics all&#39;interno di diverse regioni della stessa cella. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig2.jpg" /> Figura 2: rilevamento cometa EB3, il monitoraggio, e l&#39;uscita dei dati plusTipTracker (A) filmato time-lapse di un HUVEC esprimere Mapple EB3.. pannello di sinistra mostra una vista cellula intera e la maschera cellula intera (linea bianca) demarking i bordi delle celle. Casella rossa rappresenta la regione ingrandita mostrato nelle immagini time-lapse (pannelli a destra). pannelli di destra mostrano time-lapse immagini in scala di grigi prime di comete Eb3 in cornici per immagini successive (t = 0 sec - t = 12 sec). (B) la rilevazione plusTipTracker delle comete Eb3 dalle immagini mostrate in (A). pannello di sinistra mostra una vista di cella intera comete rilevati (punti gialli). Casella rossa rappresenta la regione ingrandita mostrato nelle immagini time-lapse (pannelli a destra). pannelli di destra evidenziano cinque comete Eb3 rilevati (frecce rosse) e ripercorrono quei cinque comete nel periodo di imaging 12 sec. verde<html> puntini rappresentano rilevati comete Eb3 che non esistevano (o non sono stati rilevati) nel precedente intervallo di tempo. (C) di proiezione massima intensità di 61 frame (2 min film) delle comete Eb3 mostrati in (A). (D) plusTipTracker MT traccia overlay degli stessi 61 fotogrammi (2 min film) indicati in (C). (E) Zoom di proiezione massima intensità (box rosso in C). (F) Zoom di plusTipTracker MT traccia overlay di proiezione massima intensità (box rosso in D). Leggenda per le sovrapposizioni di pista mostrate in (D) e (F) (G) con codice colore. Designazione come lento, veloce, di breve durata o di lunga durata si basa sul valore medio per tutte le tracce di crescita misurati in un gruppo di dieci Mapple-Eb3 HUVECs che esprimono. Per facilitare la visualizzazione, sovrapposizioni di pista a (D) e (F) sono generati utilizzando intensità dei pixel invertiti dell&#39;immagine cellule mostrato in (A). Barre di scala = 20 micron./files/ftp_upload/54265/54265fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. HUVEC ramificazione e modelli di migrazione sono sensibili al meccano-fisiche segnali dalla ECM. HUVECs sono ben noti a rispondere a vari tipi di segnali di segnalazione e, in tal modo, a subire alterazioni morfologiche che dettano una risposta cellulare adeguata al particolare spunto di segnalazione (s) 36,40-42. HUVECs coltivati ​​su substrati di vetro rivestito fibronectina (Figura 3a), o su rigide ECM poliacrilammide 2 dimensioni (55 kPa) tipicamente visualizzare un giro o morfologia allungata con poche sporgenze ramificate distinti (Figura 3B). Tuttavia, quando coltivate su molto morbidi ECM poliacrilammide 2-dimensionali (0,7 kPa), HUVECs visualizzare una morfologia molto ramificata che è noto per il risultato di conformità indotta verso il bassoregolazione della miosina-II contrattilità 4,5,31 (Figura 3C). Così, HUVECs regolano la loro morfologia cellulare attraverso ECM mechanosensing, e questo si realizza attraverso la modulazione localizzata di dinamiche MT e acto-miosina contrattilità. Poiché HUVECs visualizzare un&#39;ampia varietà di attributi morfologici, al fine di misurare HUVEC ramificazione è importante definire prima cosa una sporgenza ramificato è, quindi per definire come una sporgenza ramificato sarà misurato oggettivamente. Una tecnica utilizza un approccio in quattro fasi con cui un limite di cella o &quot;maschera&quot; viene generato a mano tracciando i bordi della cella utilizzando un&#39;immagine di una cellula che esprime un marcatore fluorescente del volume per definire i bordi delle celle (Figura 3D). Dopo generazione maschera, origini filiali sono definiti localizzando grande angolo di curvatura tra la protrusione ramificato e il corpo cellulare. Una linea è disegnata per Demark &quot;origine ramo&quot; (linee angolate viola; Figura 3E). Numero Branch è misurata semplicemente contando il numero di sportelli, con un ramo di origine definita (Figura 3F). Lunghezza Branch è misurata come la distanza dall&#39;origine ramo punta ramo distale (Figura 3G). Per evitare l&#39;inserimento di piccole proiezioni lamellipodial da analisi dei dati, criterio che si aggiunge richiede che i rami devono essere più lunghi ( &quot;lunghezza ramo&quot;) che larghi (presso l &#39; &quot;origine ramo&quot;), e che i rami devono essere almeno dieci micron di lunghezza 5 , 31. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig3.jpg" /> . Figura 3: Analisi di HUVEC ramificazione morfologia (A - C) esempi di immagini DIC di HUVECs coltivati ​​su rivestito fibronectina ECM di vetro (A) rigide (55 kPa) ECM poliacrilammide (B) e soft (0,7kPa) ECM poliacrilammide (C). Ramificazione è drammaticamente aumentato negli HUVECs coltivati ​​su 0,7 kPa ECM poliacrilammide (C) rispetto ai più rigidi ECM (A, B). (D). DIC immagine microscopica (immagine a sinistra) di un HUVEC trasfettate che esprimono un Mapple-C1 cDNA costruire (un marcatore volume cellulare; immagine a destra). (E) Definire l&#39;origine ramo individuando il massimo angolo di curvatura (cioè la posizione in cui la membrana visualizza la massima curvatura; linee color porpora) su entrambi i lati del ramo e quindi collegare gli angoli con una linea retta (linee blu) . (F) individuare e selezionare sporgenze ramificati che si estendono&gt; 10 micron dal &quot;origine ramo&quot; (definito in E). Contare il numero di sporgenze ramificati per ottenere il &quot;numero della filiale&quot;. (G) Misurare la distanza dal centro del &quot;origine ramo&quot; al most punto distale del ramo con lo strumento linea nella annotazioni e misurazioni applicazione di NIS elementi software per ottenere la &quot;lunghezza ramo.&quot; Barre di scala = 20 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Oltre al rispetto ECM sensing, HUVECs anche senso e rispondere all&#39;eliminazione dei contatti cellulari adiacenti indotta da zero ferimento. Nel saggio di migrazione, HUVECs coltivate in monostrato sono sottoposti ad una ferita zero e caratteristiche di migrazione sono misurati (vedi protocollo 9, sopra). Dopo l&#39;induzione della ferita grattando il monostrato, HUVECs ferita-bordo polarizzano sviluppando un bordo anteriore sporgente che si estende nella ferita (Figura 4A, t = 0 ore). Nel corso di un corso di tempo di 10-12 ore, polarizzati HUVECs ferita-edge migrano nella zona della ferita e riempire ilferita, stabilendo un nuovo monostrato confluente (Figura 4A, t = 11 ore). Come con HUVEC ramificazione, attuale evidenza suggerisce che la polarizzazione e la migrazione è critico dipende dalla coordinata riorganizzazione del citoscheletro di actina e MT 43-49. Questo risultato è ottenuto, in parte, attraverso l&#39;inibizione localizzata di MCAK indotta MT smontaggio all&#39;avanguardia, ma non al bordo posteriore della ferita bordo HUVECs 31. La sensibilità della dinamica MT per ferita indotta polarizzazione viene avviata dal Rac1 GTPasi, che si rivolge numerose proteine ​​regolatore a valle, tra cui Aurora-A-chinasi che fosforila e inibisce MCAK all&#39;avanguardia, e altre chinasi che sono in grado di inibire o attivando MAP localmente modulare la crescita MT e ritiro 18,31,36,48,50-53. Ampie prove sperimentali supporta la nozione che il coordinamento dei leader protrusione bordo di entrata e di uscita contrazione bordo è regolato attraverso cicli di attivazione di Rac1promuovere MT assemblaggio all&#39;avanguardia e l&#39;attivazione RhoA a acto-miosina contrattilità al bordo di uscita, in modo da guidare la motilità diretto 9,41,51,52,54-58. Ad oggi, non c&#39;è una metodologia stabilita per eseguire il monitoraggio automatico della migrazione cellulare. Questo è il risultato di difficoltà di analisi computazionalmente confini cellula-ECM che sono costantemente cambiando come cellule ferita punta polarizzano e migrano. Mentre molti programmi software sono in grado di tracciare cellule fluorescente 59-64, la popolazione di fluorescente HUVECs in esperimenti di migrazione ferita punta è circa il 30-40% della popolazione totale HUVEC, e quindi la maggior parte delle cellule ferita tagliente può essere visualizzati da contrasto di fase o l&#39;imaging DIC. Inoltre, è importante quando si misura la migrazione ferita bordo per valutare le cellule fluorescenti e non fluorescenti all&#39;interno della stessa ferita per individuare specificoeffetti di espressione crea sia all&#39;interno di gruppi di studio sperimentali e tra i gruppi di studio sperimentali. Attualmente, il metodo migliore per misurare la migrazione HUVEC è di utilizzare un approccio inseguimento mano in cui una cella ferita bordo è identificato e poi il nucleo e nucleolo sono identificati (Figura 4B). Il nucleolo viene usata come posizione determinante per il monitoraggio delle cellule causa della sua densità dispersione luce alta e relativamente piccole dimensioni. Queste due caratteristiche del nucleolo rendono più facile identificare e ridurre errori di misurazione limitando l&#39;area in cui l&#39;utente può inserire singole posizioni di traccia. tracce di migrazione HUVEC sono poi generati cliccando sul nucleolo in successive fotogrammi di immagini time-lapse. Infine, velocità di migrazione e distanza di migrazione all&#39;origine sono misurati ed analizzati per il controllo e gruppi di cellule sperimentali (Figura 4B). <img alt="Figura 4"src = &quot;/ files / ftp_upload / 54265 / 54265fig4.jpg&quot; /&gt; Figura 4: Analisi di HUVECs ferita-edge e il monitoraggio della migrazione immagini (A) 20X a contrasto di fase di un time-lapse serie di imaging 11 ore di zero ferita bordo HUVECs (alias &quot;Migration Assay&quot;).. La ferita e la direzione della migrazione sono indicati in pannello t = 0 hr. HUVEC sono presenti per attraversare la ferita bordo e avanzare nella ferita fino a formare un monostrato di cellule (t = 3,5 hr - t = 11 h). (B) Analisi del dosaggio migrazione dell&#39;imaging time lapse (come indicato in A) richiede innanzitutto l&#39;identificazione di un tracciabili HUVEC ferita bordo in base alla posizione delle cellule (cioè le cellule fisicamente ai margini della ferita) e profilo di espressione (i .e. , selezionare una cella bordo della ferita verde se l&#39;esperimento comporta espressione di GFP). Usando l&#39;immagine a contrasto di fase, identificare il nucleo e il nucleolo. Mano traccia nucleolo in time-lapse immagini successive utilizzando l&#39;unanotazioni e misurazioni applicazione nel software NIS elementi per determinare la velocità di migrazione e la distanza alla loro origine. Scala bar = 100 micron (A), 20 micron (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Ad alta risoluzione Time-lapse imaging e analisi automatizzata dei microtubuli Dynamics in Living ombelicale umano cellule endoteliali Vena

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.0K Views.  University of the Sciences in Philadelphia. Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed. 

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Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

Isolamento di cellule umane endoteliali della vena ombelicale (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Ricerca

Biologia

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Isolamento di cellule umane endoteliali della vena ombelicale e il loro uso nello studio della trasmigrazione dei neutrofili in condizioni di flusso

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Immunologia e infezioni

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

In tempo reale Imaging del endoteliali giunzioni cellula-cellula Durante neutrofili Trasmigrazione Sotto fisiologico flusso

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning e montaggio dei microvasi 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Bioingegneria

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

Esteso Time-lapse Imaging intravitale del Real-time multicellulare Dynamics nel microambiente tumorale

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

Medicina

Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow in Microvasculature

Changes in blood flow velocity and distribution are vital in maintaining tissue and organ perfusion in response to varying cellular needs. Further, appearance of defects in microcirculation can be a primary indicator in the development of multiple pathologies. Advances in optical imaging have made intravital microscopy (IVM) a practical approach, permitting imaging at the cellular and subcellular level in live animals at high-speed over time. Yet, despite the importance of maintaining adequate tissue perfusion, spatial and temporal variability in capillary flow is seldom documented. In the standard approach, a small number of capillary segments are chosen for imaging over a limited time. To comprehensively quantify capillary flow in an unbiased way we developed Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow (STAFF), a macro for FIJI open-source&#160;image analysis software. Using high-speed image sequences of full fields of blood flow within capillaries, STAFF produces&#160;images that represent motion over time called kymographs for every time interval for every vascular segment. From the kymographs STAFF calculates velocities from the distance that red blood cells move over time, and outputs the velocity data as a sequence of color-coded spatial maps for visualization and tabular output for quantitative analyses. In normal mouse livers, STAFF analyses quantified profound differences in flow velocity between pericentral and periportal regions within lobules. Even more unexpected are the differences in flow velocity seen between sinusoids&#160;that are side by side and fluctuations seen within individual vascular segments over seconds. STAFF is a powerful new tool capable of providing novel insights by enabling measurement of the complex spatiotemporal dynamics of capillary flow.

To quantify microvascular flow from high speed capillary flow image sequences, we developed STAFF (Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow) software. Across the full image field and over time, STAFF evaluates flow velocities and generates a sequence of color-coded spatial maps for visualization and tabular output for quantitative analyses.

Analisi spaziale temporale del flusso Fieldwise nella microvascolatura

Changes in blood flow velocity and distribution are vital in maintaining tissue and organ perfusion in response to varying cellular needs. Further, ...

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles has emerged as an effective method to transiently and locally increase the permeability of the BBB, facilitating para- and transcellular transport of drugs across the BBB. Imaging the vasculature during ultrasound-microbubble treatment will provide valuable and novel insights on the mechanisms and dynamics of ultrasound-microbubble treatments in the brain.
Here, we present an experimental procedure for intravital multiphoton microscopy using a cranial window aligned with a ring transducer and a 20x objective lens. This set-up enables high spatial and temporal resolution imaging of the brain during ultrasound-microbubble treatments. Optical access to the brain is obtained via an open-skull cranial window. Briefly, a 3-4 mm diameter piece of the skull is removed, and the exposed area of the brain is sealed with a glass coverslip. A 0.82 MHz ring transducer, which is attached to a second glass coverslip, is mounted on top. Agarose (1% w/v) is used between the coverslip of the transducer and the coverslip covering the cranial window to prevent air bubbles, which impede ultrasound propagation. When sterile surgery procedures and anti-inflammatory measures are taken, ultrasound-microbubble treatments and imaging sessions can be performed repeatedly over several weeks. Fluorescent dextran conjugates are injected intravenously to visualize the vasculature and quantify ultrasound-microbubble induced effects (e.g., leakage kinetics, vascular changes). This paper describes the cranial window placement, ring transducer placement, imaging procedure, common troubleshooting steps, as well as advantages and limitations of the method.

This protocol describes the surgical and technical procedures that enable real-time in vivo multiphoton fluorescence imaging of the rodent brain during focused ultrasound and microbubble treatments to increase blood-brain barrier permeability.

Microscopia multifotonica intravitale in tempo reale per visualizzare trattamenti a ultrasuoni e microbolle focalizzati per aumentare la permeabilità della barriera emato-encefalica

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...

Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the dynamic properties of the cytoskeleton. This protocol offers a technique for human primary fibroblast transfection, which can be difficult because of the specifics of primary cell cultivation conditions. Additionally, cytoskeleton dynamic property maintenance requires a low level of transfection to obtain a good signal-to-noise ratio without causing microtubule stabilization. It is important to take measures to protect the cells from light-induced stress and fluorescent dye fading. In the course of our work, we tested different transfection methods and protocols as well as different vectors to select the best combination of conditions suitable for human primary fibroblast studies. We analyzed the resulting time-lapse videos and calculated microtubule dynamics using ImageJ. The dynamics of microtubules' plus-ends in the different cell parts are not similar, so we divided the analysis into subgroups - the centrosome region, the lamella, and the tail of fibroblasts. Notably, this protocol can be used for in vitro analysis of cytoskeleton dynamics in patient samples, enabling the next step towards understanding the dynamics of the various disease development.

This protocol is dedicated to the microtubule plus-end visualization by EB3 protein transfection to study their dynamic properties in primary cell culture. The protocol was implemented on human primary skin fibroblasts obtained from Huntington's disease patients.

Visualizzazione dinamica plus-end dei microtubuli nel modello della malattia di Huntington basato sui fibroblasti cutanei primari umani

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

Analisi automatizzata del Dynamic Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Segnali in sequenze di immagini

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Sviluppo e caratterizzazione di<em&gt; In Vitro</em&gt; Microvasi Rete e misurazioni quantitative di endoteliale [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; E ossido nitrico Produzione

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Ad alta risoluzione Time-lapse imaging e analisi automatizzata dei microtubuli Dynamics in Living ombelicale umano cellule endoteliali Vena

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