Onu teknik yardım için Bayan Lailey;; ve insan kordon sağlamak için Calgary, AB içinde Foothills Hastanesi&#39;nde 51 birim Biz Dr Pina Colarusso görüntüleme ve görüntü analizi ile yardım için Canlı Hücre Görüntüleme Tesis teşekkür ederim. Dr KD Patel bir Alberta yenilikler yaratır şudur: Sağlık Çözümleri Scientist. Bu çalışma, Yenilikçilik ve Alberta Bilim ve Araştırma Kurumu için Kanada Vakfı Sağlık Araştırma ve altyapı ve ekipman hibeleri için Kanada Enstitüleri bir işletme hibesi tarafından desteklenmiştir.

1. İnsan Vasküler Endotelyal Hücre İzolasyonu ve Bakım <ol><li> Insan kan ve doku çalışırken Düzey 2 biyogüvenlik prosedürleri kullanılmalıdır. Kullanımı makas plasenta kablosunu kesip sonra yakından kan pıhtılaşması ve doğum sırasında kordon sıkma kaynaklanan zararlar için kordon inceleyin. Kes ve kordon bu kısımlarını atın. </li><li> 50 mg Kollajenaz içeren bir tüp içine sıcak kord tampon 50 ml dökülerek 1 mg / ml taze kollajenaz çözeltisi hazırlayın. </li><li> Steril eldiven içine değiştirin ve sterilize künt kanüller, kordon kelepçeler, makas, üç yollu dur-musluklar ve laminer akış kaputu gazlı bez içeren bir otoklavlanmış alet tepsisine açın. </li><li> Iki arter ve kablosunu tek ven mevcut tanımlayın. Arterler küçük ve büyük damar ve kanüle kolay iken, sıkı dar olma eğilimindedir. Damardan kan temizlemek için hafifçe bağlı iki yollu bir kanül takın ipozisyonda sıkıca tutmak için kanül etrafında mengene ven ve yer nGoogle&#39;a bir ucunu. Ven yoluyla kablosunu tampon serpmek. Akış netleşene kadar tekrarlayın ve sonra kablosunun ucunu kelepçe. </li><li> Damar içine yayma kollajenaz, musluk kapatın, 10 dakika boyunca ılık kablosu tampon ve inkübe içeren bir behere kablosunu yerleştirin. 10 dakika sonra, kordon kaldırın ve yavaşça ven lümeni gelen endotel hücreleri gevşetmek için kordon masaj yapın. Endotel hücre ortam (ECM) içeren tüp içine akmasını çözeltisi. Iki kez kalan hücreleri çıkarmak için kordon tampon ile yıkayın. Aynı tüpe çözüm boşaltın. </li><li> Pelet 10 dakika endotel hücreleri için 350 xg&#39;de hücreleri santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı ve pelet için ECM 10 ml ekleyin. Yavaşça ECM içinde tekrar süspansiyon hücreleri, daha sonra% 0.2 jelatin ile önceden kaplanmış bir şişeye T75 hücre transfer. Jelatin ile ön-kaplama 37 ° C&#39;de en az 1 saat süreyle yapılmıştır 37 de hücrelerin büyümesine ve 5 ° C% 2 CO. </li><li> Ertesi gün, yavaşça herhangi bir kırmızı kan hücreleri daha sonra süpernatant kaldırmak ve sıcak Hank&#39;in dengeli tuz solüsyonu (HBSS) ile yıkayın çıkarmak için şişeyi sallayın. HBSS çıkartın ve ılık ECM 10 ml ile hücreleri besler. Kırmızı kan hücreleri çıkarıldı emin olmak için, hücreleri mikroskopta inceleyin. Endotel hücreleri birleştiği ve morfoloji derecesini değerlendirin. Bu aşamada endotel hücreleri vakuollerinin belirtisi uzamış olmalıdır. </li><li> Hücreler 1 mM EDTA içeren tripsin bir% 0.08 çözümünü kullanarak konfluense, sonra bölmek hücreleri ulaşana kadar üç günde ortamı değiştirmek için devam edin. İstediğiniz yemekleri Plaka endotel hücreleri% 0.2 jelatin ile önceden kaplanmıştır. Hücreler 3-6 gün izdiham ulaşmalıdır. </li><li> % 0,2 jelatin ile her odası ibidi odaları, ön kat kullanırken. Kaldırmak aşırı 1,5 X haznesine ECM içinde süspansiyon endotel hücreleri 10 6 / ml ilave sonra jelatin ve fibronektin ve. Her gün medya değiştirin c kadaronfluent. Hücreler kord bağlı olarak 2-3 gün konfluent olmalıdır. </li></ol> 2. Nötrofiller hazırlanması <ol><li> Nötrofiller yoğunluğu santrifüj kullanılarak sağlıklı gönüllü insanların periferik kandan izole edilmiştir. Nötrofil izolasyonu için görsel bir gösteri ile ayrıntılı bir protokol, bu derginin 6 önceki sayısında bulunabilir. % 0.5 &#39;i, insan albumin içeren HBSS içinde 1x10 6 / mL&#39; lik bir konsantrasyonda bir kez izole, Pastör pipetiyle nötrofiller. </li></ol> 3. Ibidi Odası ayarlama <ol><li> Bir jelatin kaplı ibidi odasında endotel hücreleri büyümek. Onlar sıkıca konfluent olana kadar faz kontrast mikroskopi kullanılarak her gün bunları inceleyin. </li><li> Yapışma ve aktivasyon moleküllerinin ifadesi arttırmak için endotel hücreleri uyarır. Bu protokolün amaçları için, endotel hücreleri, 37, dört saat boyunca 10 ng / rekombinant TNF-α mL ile stimüle edildi ° C&#39;de ve% 5 CO <sub&gt; 2 önceki akış koşullarında görüntüleme için ibidi odası kurma. </li><li> Mikroskobu ve görsel olarak boş bir ibidi odalarını kullanarak Wiese ve arkadaşları 11 tarafından açıklandığı gibi şırınga pompası hazırlayın. </li><li> Bu protokol ve Wiese prosedür arasında önemli farklar ön dolum, hava endotelyal hücrelerin maruziyeti önlemek için hortum 37 tampon muhafaza ° C sıcaklık kaybetme tampon tutmak için PharMed tüp kullanarak ve kullanarak, bir su banyosu kullanarak farklı dahil faz kontrast ve flüoresan ile olsa görüntüleme bağlı mikroskop hedefler. </li><li> Mikroskop kurmak ve boru yakın HBSS, tüm stopcocks dolu ve boş ibidi odasına çıkarın sonra. </li><li> TNF-α içeren ibidi odasına hortuma endotel hücreleri uyarılır bağlayın. </li></ol> 4. Nötrofil İşe Alım ve Transmigration <ol><li> Microsc alan endotel hücre monolayer görselleştirin10x faz kontrast objektif kullanarak ope. </li><li> Istenilen kayma gerilmesi de HBSS akışını (genellikle 0.5 ila 2 dyn / cm 2 arasında) çekme ve başlamak için şırınga pompası ayarlayın. </li><li> Üç-yollu durdur-horoz çevirerek izole nötrofiller (1x10 6 / mL) ile HBSS gelen giriş tarafına, anahtarı. </li><li> Bir DVD kaydedici ya bağlı veya doğrudan bilgisayara bağlı bir CCD kamera ile kayıt başlayın. Nötrofiller odası girdiğinizde zamanlayıcı başlayın. Dört dakika nötrofillerin serpmek. Nötrofil süspansiyon 3 mL toplam tek bir deney için yeterli olur. </li><li> Dört dakika sonra, yeni nötrofillerin eki önlemek HBSS geri dönün. Toplam etkileşimleri, haddeleme ve sağlam yapışma için veri istenirse, 10 saniye her biri için görüntü 6 rasgele alanları dakika 4 ile 5 arasında bir 10x faz kontrast objektif kullanarak. </li><li> Bir 40x objektif geçin ve 5 ile 10 dakika arasında bir görüş tek bir alan kaydedin. 10 dakika, toplamakbakış rastgele alanları 5 ila 10. </li><li> Akışını durdurun ve sonraki odasına taşıyın. </li></ol> 5.. Bir Ibidi Odası kullanarak Akım Altında Floresan Görüntüleme <ol><li> Bir ilgi floresan prob ile Etiket Gerek endotel hücreleri veya nötrofil. Örneğin, Alexa-[547] ile konjuge edilmiş anti-ve-cadherin antikoru endotel hücre eklemleri canlandırmak için kullanılabilir. </li><li> Diferansiyel girişim kontrast (DIC) ve floresan özellikleri olan bir mikroskop ibidi odası birleştirin. Biz bir kazanı olan bir FluoView 1000 konfokal (Olympus) kullanın. DIC ve floresan iş için tasarlanmış bir objektif kullanarak odaklanın. </li><li> Bölüm 4&#39;te açıklandığı zaman ders takip ederken satıcı tarafından verilen yazılım ile eş zamanlı DIC ve floresan resim al. </li></ol> 6. Nötrofil İşe Analizi <ol><li> Hücreleri, haddeleme ve etkileşim analizi Wiese ark 11 tarafından tarif edilir. </li&gt; <li> Endotel tek tabakalı 5 saniyelik bir süre içinde birden fazla hücre çapı taşındı nötrofil sayıları saymak yuvarlanarak nötrofillerin yüzdesini ölçmek için. Haddeleme hücrelerin yüzdesi belirlemek için alanda lökositlerin toplam sayısı ile bu sayı böler. Uzantısı olarak, kalan hücreler sıkıca yapışık olarak kabul edilir. </li><li> Nötrofil belirli bir süre içinde gitti ve sonra saniyeler içinde o zaman da bölünerek mesafeyi hesaplayarak nötrofil haddeleme hızı ölçün. </li><li> Hicret şekli değişti ve tek tabakalı 10 altında göç etmiş nötrofil sayısını sayarak belirlenir. Bunlar nötrofiller onlar faz olmanın parlak değiştirmek gerçeği ile tespit zaman zaman tek tabakalı 10 altında faz karanlık olmasının tek tabaka üstüne. Nakledildi hücrelerin sayısı görüş alanı içindeki toplam hücrelerin yüzdesi olarak ya da ham bir uyuşmuş olarak ifade edilebilirbirim alan başına nakledildi hücrelerin er. Bu model sistem olarak, nötrofillerin tipik olarak% 50 10 dakika sonra göçmek. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar Unstimulated endotelyal hücreler nötrofil göçünü desteklemez. Buna karşılık, nötrofil haddeleme, firma yapışma ve geçişe TNF-α sonuçları ile endotel hücreleri uyarmak. Bu verilerin bir örneği, Şekil 1 ve 2 &#39;de gösterilmiştir. Şekil 1A TNF-α-uyarılmış endotel hücreleri ile etkileşen nötrofiller gösterir. Bu etkileşimler endotel hücreleri ile etkileşim nötrofil sayısı gibi (Şekil 2) sıkıca yapışık veya nakledildi, haddeleme nötrofil sayısı açığa ölçülebilir. Nötrofil göçü hücre kavşaklarda veya endotel hücreleri kendileri aracılığıyla oluşabilir. Bu iki durum arasında ayrım yapmak, endotelyal hücreler bir anti-VE-c ile etiketlenir<html> adherin antikor ve hicret (Şekil 1B ve C) paracellularly veya transcellularly meydana olarak kaydedilecektir. Bu modelde, hemen hemen tüm âlemden 7 paracellular olduğunu. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4032/4032fig1.jpg" /> Şekil 1. Bir ibidi odalarını kullanarak akış koşullarında Eşzamanlı DIC ve floresan görüntüleme. (A) DIC görüntü taze insan umbilikal ven endotel hücreleri arasında göç eden insan nötrofil izole. Sarı ok ucu yapışık, nötrofil gösterir; beyaz ok ucu bir transmigrating nötrofil gösterir. (B) endotel hücre kavşaklar Alexa-[547] ve görüntülü konjuge anti-VE-cadherin antikor ile boyandı. (C) Kanal A ve B bu model neredeyse tüm transmigrating paracellular olduğunu ifşa yerleşim gösterir. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4032/4032fig1large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . _content &quot;&gt; <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4032/4032fig2.jpg" /> Şekil 2. Endotel hücreleri unstimulated bırakılan veya TNF-α 10 ng / ml ile uyarıldı. 4 saat sonra, paralel bir plaka akış odası toplandı ve nötrofiller 1 dyn / cm 2 azından boyunca perfüze edilmiştir. (A) Nötrofil etkileşimleri incelenmiş ve NIH ImageJ yazılımı kullanılarak ölçüldü. Toplam etkileşen hücreleri (B) haddeleme, sıkıca yapışık veya (C) transmigrating olarak karakterize edilmiştir. Veri 3 ila 5 deneyler ortalama + SEM temsil eder. Paneller A ve C kontrolü ve TNF arasındaki fark anlamlıydı (p &lt;0,001).

<ol>
	<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).</li><li>Diacovo, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+rolling,+arrest,+and+transmigration+across+activated,+surface-adherent+platelets+via+sequential+action+of+P-selectin+and+the+beta+2-integrin+CD11b/CD18.">Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-adherent platelets via sequential action of P-selectin and the beta 2-integrin CD11b/CD18.</a> Blood. 88, 146-157 (1996).</li><li>Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Petri, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+LSP1+is+involved+in+endothelial+dome+formation,+minimizing+vascular+permeability+changes+during+neutrophil+transmigration+in+vivo.">Endothelial LSP1 is involved in endothelial dome formation, minimizing vascular permeability changes during neutrophil transmigration in vivo.</a> Blood. 117, 942-952 (2011).</li><li>Chavakis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+junctional+adhesion+molecule-C+promotes+neutrophil+transendothelial+migration+in+vitro+and+in+vivo.">The junctional adhesion molecule-C promotes neutrophil transendothelial migration in vitro and in vivo.</a> J. Biol. Chem. 279, 55602-55608 (2004).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Isolation+Protocol.">Neutrophil Isolation Protocol.</a> J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).</li><li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+leukocyte+transmigration:+cell+surface+interactions+and+signaling+events.">Regulation of leukocyte transmigration: cell surface interactions and signaling events.</a> J. Immunol. 172, 7-13 (2004).</li><li>Alcaide, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+under+shear+flow:+it's+all+about+endothelial+cell+rings+and+gaps.">Neutrophil recruitment under shear flow: it's all about endothelial cell rings and gaps.</a> Microcirculation. 16, 43-57 (2009).</li><li>Jutila, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+neutrophil+adhesion+under+conditions+mimicking+blood+flow.">Measurement of neutrophil adhesion under conditions mimicking blood flow.</a> Neutrophil Methods and Protocols. 412, 239-256 (2007).</li><li>Cuvelier, S. L., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+leukocyte+rolling+and+adhesion+in+vitro+under+flow+conditions.">Studying leukocyte rolling and adhesion in vitro under flow conditions.</a> Basic Cell Culture Protocols. 290, 331-342 (2005).</li><li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Physiologic+E-Selectin-Mediated+Leukocyte+Rolling+on+Microvascular+Endothelium.">Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium.</a> J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).</li><li>Petzelbauer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+dermal+microvascular+endothelial+cell+antigen+expression+and+cytokine+responsiveness+in+situ+and+in+cell+culture.">Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture.</a> J. Immunol. 151, 5062-5072 (1993).</li><li>Bonder, C. S., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+leukocyte+recruitment+to+splanchnic+organs+to+reduce+inflammation.">Modulating leukocyte recruitment to splanchnic organs to reduce inflammation.</a> Am J Phys - Gastrointestinal and Liver Phys. 284, G729-G733 (2003).</li><li>Cuvelier, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eosinophil+adhesion+under+flow+conditions+activates+mechanosensitive+signaling+pathways+in+human+endothelial+cells.">Eosinophil adhesion under flow conditions activates mechanosensitive signaling pathways in human endothelial cells.</a> J. Exp. Med. 202, 865-876 (2005).</li><li>Massia, S. P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+endothelial+cell+interactions+with+surface-coupled+adhesion+peptides+on+a+nonadhesive+glass+substrate+and+two+polymeric+biomaterials.">Human endothelial cell interactions with surface-coupled adhesion peptides on a nonadhesive glass substrate and two polymeric biomaterials.</a> J. Biomed. Mat. Res. 25, 223-242 (1991).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

<html> Araştırmacılar rutin nötrofil göçünü ve hicret incelemek için farklı vasküler yatak endotel hücreleri kullandık. Örnekleri arasında, bunlarla dermal mikrovasküler endotel hücreleri 12, insan göbek ven 10 den karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri 13 ve endotelyal hücreler, bunlarla sınırlı değildir. Aralarında HUVEC çünkü izolasyon ve durumu kendi göreceli kolaylığı geniş popülerlik kazandı. HUVEC in vivo olarak ortaya çıkan birçok e...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif ve Ekipmanları </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Kollajenaz Tip 1 </td><td> Worthington </td><td> 4197 </td><td></td></tr><tr><td> Kordon tampon </td><td></td><td></td><td> Kompozisyon: 7.4 pH&#39;da 1mM NaH 2 PO 4/2 Na HPO 4 tampon 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-glukoz </td></tr><tr><td> Endotel Hücre Medya (ECM) </td><td></td><td></td><td> Penisilin 100 adet streptomisin 100 mikrogram ve L-glutamine/ml 0,3 mg% 16 insan serumu kartal tuzları ile M199 </td></tr><tr><td> M199 </td><td> GIBCO </td><td> 31100-035 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin Streptomisin Glutamat (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 10378-016 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Ibidi odaları </td><td> Ibidi </td><td> 80606 </td><td></td></tr><tr><td> TNF-α </td><td> Prepro Tech </td><td> 300-01A </td><td></td></tr><tr><td> Human Albumin% 20 çözüm </td><td> İkizler Bioproducts </td><td> 800120050 </td><td></td></tr><tr><td> + Ve Mg 2 Ca 2 olmadan HBSS + </td><td> Sigma </td><td> H2487-10X </td><td></td></tr><tr><td> Ca 2 + ve Mg 2 + HBSS </td><td> Sigma </td><td> H1387-10X </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions

Nötrofiller beyaz kan hücresi en bol türüdür. Bunlar doğuştan gelen bağışıklık sistemi 1 önemli bir parçasını oluştururlar. Akut iltihap süresince, nötrofiller yaralanma siteye geçirmek için ilk enflamatuvar hücreler. Arasında nötrofil üçüncü, haddeleme, yapışma ve hicret, ikinci, mikrovasküler yapısal değişiklikler ve kan dolaşımından plazma proteinlerine kaçmasını önlemek için; bir yaralanma siteye nötrofil alımı kan akışını arttırmak için kan damarları, ilk dilatasyon içeren bir basamaklı bir işlemdir endotel; yaralanma 2,3 yerinde nötrofil ve dördüncü birikimi. In vivo ve in vitro geniş bir dizi bu işlemler 4 çalışma sağlamak için gelişmiştir. Bu yöntem, insan endotel hücreleri arasında nötrofil göçü üzerinde duruluyor. Nötrofil göçü rol oynayan moleküler süreçleri inceleyerek Bir popüler yöntemi, insan n kullanırbirincil insan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC) 5 ile etkileşim eutrophils. Nötrofil izolasyon başka bir yerde 6 görsel olarak tarif edilmiştir, dolayısıyla bu makalenin HUVEC izolasyonu için yöntem gösterecektir. Izole edilip birleştiği yetiştirilen, endotel hücreleri yapışma ve aktivasyon moleküllerinin uyarılması sonucu aktive edilir. Örneğin, artan E-selektin ve IL-8 ifadesi 7 TNF-α sonuçları gibi sitokinler ile endotel hücrelerinin aktivasyonu. E-selektin aracılık nötrofiller ve IL-8 aracılık aktivasyonu ve nötrofil firma yapışma yakalama ve haddeleme. Yapışma nötrofiller göçmek sonra. Âlemden (endotelyal hücre kendisi üzerinden) transcellularly paracellularly oluşabilir (endotelyal hücre kavşak aracılığıyla) veya. Çoğu durumda, bu etkileşimlerin damar 7,8 bulundu akış koşullarda oluşur. Paralel plakalı akışı odası yaygın olarak kullanılan bir sistem olduğunu mihidrodinamik kayma in vivo ve in vitro bulundu 9,10 akış koşullarında nötrofil işe alınma çalışması sağlar. stresleri mikrofon Bazı şirketler paralel plakalı akışı odaları üretmek ve her avantaj ve dezavantajları var. Flüoresan görüntüleme gerekli ise, cam veya optik olarak benzer bir polimerin kullanılması gerekmektedir. Endotel hücreleri cam üzerinde iyi büyümez. Burada hızlı yapışma ve insan endotel hücrelerinin büyümesini destekler ve karşılaştırılabilir optik niteliklere sahip bir polimer düşük hacimli ibidi kanalı slayt kullanarak nötrofil göçü faz-kontrast, DIC ve floresan görüntüleme için kolay ve hızlı bir yöntem sunmak cam. Bu yöntemde, endotel hücreleri yetiştirildi ve bir ibidi μslide uyarılmış. Nötrofiller akış koşullarında tanıtıldı ve hicret değerlendirildi. Kavşaklarından Floresan görüntüleme karşı paracellular ölçüde gerçek zamanlı belirlenmesi etkintranssellüler âlemden.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions at JoVE.com

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Bu makale ilk umblikal damarlar, insan endotel hücreleri izole etmek için bir yordam açıklanır ve sonra akış koşullarında nötrofil göçü incelemek için bu hücreleri nasıl kullanılacağını gösterir. Camın optik karakteristikler ile bir polimer elde edilen bir düşük hacimli akış odası kullanılarak, nadir hücre popülasyonlarının canlı-hücre flüoresan görüntüleme da mümkündür.

Akış Koşullarında İnsan umbilikal ven endotel hücreleri ve nötrofil Transmigration Çalışmaları Kullanılması İzolasyonu

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

isolation-human-umbilical-vein-endothelial-cells-their-use-study

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.0K Görüntüleme.  University of Calgary. Bu makale ilk umblikal damarlar, insan endotel hücreleri izole etmek için bir yordam açıklanır ve sonra akış koşullarında nötrofil göçü incelemek için bu hücreleri nasıl kullanılacağını gösterir. Camın optik karakteristikler ile bir polimer elde edilen bir düşük hacimli akış odası kullanılarak, nadir hücre popülasyonlarının canlı-hücre flüoresan görüntüleme da mümkündür.

Video: Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Nicel<em&gt; In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir&gt; Testi

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Kayma Stres İnsan Karaciğer Sinüzoidal Endoteline altında Koşullarına Lökositer İşe Alım Eğitim için Bir Akış Adezyon Deneyi

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

İnsan nötrofil Akış odası Yapışma Deneyi

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

Nötrofil Hicret altında Fizyolojik Akış sırasında endotel hücre-hücre Eklemlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In Vitro ve İn Vivo Modeli Gemi Duvar Altında Akış Koşulları Bakteriyel Yapışma Eğitim için

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

Akış Sitometrinin Kullanımı T Hücrelerinde Kromatin Devleti değerlendirmek için

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

Monosit altgrupları Vitro akışında altında alımı eş zamanlı çalışma

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Nötrofil kütle sitometri analizi için tüm kemik Iliği hazırlanması-Lineage hücreler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...