E.G. Worst and A. Ott acknowledge financial support by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the collaborative research center SFB 1027 as well as Saarland University. E.G. Worst, A. Ott and V. Noireaux further acknowledge financial aid by the Human Frontiers Science Program Organization (HFSPO). The authors thank Tobias Baumann and Stefan Oehm (Institute of Chemistry, Technische Universit&#228;t Berlin) for critical reading.

The authors have nothing to disclose.

Bir kolay-Kalıntı spesifik proteinler halinde NCAAs birleştirmek için uygun bir strateji olarak hücre içermeyen sentezleme sistemi kullanmak sunulmuştur. Bu amaçla, ham ekstre ilgi protein enerji tamponu ve mukabil amino asitleri için, vektör kodlayan DNA ile takviye edilmektedir. Ham özü kısım hacmi ham özüt protein konsantrasyonu 34 bağlı olduğunu unutmayın. hücre içermeyen ifade verimliliği vektör DNA inşaat konsantrasyonuna bağlı olarak optimize edilmiştir. Enerji tamponu bileşenlerin hacimleri hücresiz ifade model protein yüksek verim sağlamak üzere optimize Mg- ve K-glutamat konsantrasyonları fonksiyonu olarak değişir. dahil deney bir ön değerlendirmesi saflaştırılmamış hücre içermeyen reaksiyon ortamının SDS-PAGE gerçekleştirerek elde edilebilir. Daha ayrıntılı bir analiz için HPLC-ESI kütle spektroskopisi tam Tortu, spesifik yanış kontrol etmek için bir araç olarak önerilmiştirNCAA ve gözeneklendirme. ikincisi için bir hazırlık olarak, spin kolon sistemleri His-etiketi saflaştırma etkinleştirmek ve biz bu protokolü kullanan küçük hacimleri ile tampon değişimine kullanılır. HPLC-ESI-kütle spektroskopisi dahil olmak üzere tüm protokol, 2 gün içerisinde yapılabilir. Bu, herhangi bir özellikle önemli adımları içermez. Ancak, konsantrasyon Mg- ve K-glutamat optimizasyonlar yanı sıra vektörü olarak DNA modeli proteinin yüksek verim ifade etmek için çok önemlidir. yüksek verimli ifade vektörü kullanımı pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-gene_of_model_protein-T500 şiddetle tavsiye edilir. His-etiketli proteinlerin elüsyon bağlı imidazol yüksek yoğunluklarda (&gt; 150 mm) ve NaH 2 gibi başka tuzları, genellikle kütle spektroskopik analizi 49, yüksek bir zemin gürültüsü elde PO4 (&gt; 300 mm) ya da NaCI (&gt; 50 mm) . uygun bir protein depolama tamponu ile bu tür taşıma tamponlarının Değişim modeli prote stabilizeve büyük ölçüde kütle spektroskopik analizi sırasında arka plan gürültüsünü azaltır. Bunun bir sonucu olarak, bir model protein olan altı pozisyonlarında Arg yerine edebilir. sentezleme sisteminde, herhangi bir Arg kalıntısı tespit edilebilir. Bu da tükenme stratejileri 29,30 gerektiren diğer sentezleme sistemleri ile karşılaştırıldığında, Arg analoglarının Tortu özgü dahil kolaylaştırır. Sunulan hücre içermeyen bir yaklaşım Can toksisite nedeniyle in vivo yaklaşımların doğasında sınırlamalar veya tek bir protein üretim stratejileri 24,31 mRNA dizisi güçlü bağımlılık circumvents. Vitro sistemde kullanılan aksine, Can in vivo yarılma homoserin ve Hidroksiguanidini 31 meydana gelmez. Bununla birlikte, hücresiz sistem, hyl olarak analogları ile rekabet Lys yeterli bir miktarını muhafaza etmektedir. HPLC-ESI kütle spektroskopik analizi modeli proteinin her ikisi de, c içerdiğini göstermektediranonical yanı sıra, farklı oranlarda kuralsız benzeri. Lys Tortu özgü dahil, genel olarak mümkün olmakla birlikte, NCAAs tanınması için optimize edilmiş komple bir ikame, daha fazla azalmasını stratejileri, veya özel olarak tasarlanmış AARS ve tRNA için geliştirilmiş olması gerekir. Kanonik olanlar aynı konsantrasyonda Ncaa ekleyerek hücresiz ifade değişik bir modeli proteinlerin iyi verimler elde. dahil verimliliği dahil edilmesi Ncaa doğasına bağlıdır. Daha yüksek verimler hala NCAA konsantrasyonunu optimize ederek gerçekleşebilir olabilir. Sunulan sonuçlar sürece kanonik endojen translasyon sistemi tarafından kabul edildiği gibidir NCAAs kalıntısıdır özgü dahil için kullanılan sistemin uygulanabilirliğini göstermektedir. Belirli NCAAs kalıntısı özgü dahil edilmesinin, bir başka ihtiyaçları kontrol etmek için, eğer benzer bir CAA distur kalıntılarıifade sistemini b. Hücresiz transkripsiyon yapıldı sistemleri farklı taleplere 54 yanıt farklı organizmalardan tasarlanabilir. Tüm E. Burada sunulan hücre içermeyen sistemin coli transkripsiyon-çeviri makine bakteriyofaj ve E. kullanımını sağlamak E. coli destekleyiciler ve onlar paralel ya da art arda kaskadlar 55 hareket edebilir. Genel uygulanabilirlik ve kullanılabilirlik yöntemi amino asit toksisite ve tedavi uygulamasında daha fazla araştırma için güçlü bir araç haline getirmektedir.

Genetik kod biyosfer için evrenseldir. Bazen selenosistein 1 veya PYRROLYSINE 2 uzar 20 standart amino asit arasında bir dizi için kodlar. Bu proteinlerin içine kat amino asit zincirlerinin içine tRNAs yardımıyla genetik kodunu çevirir ribozom olduğunu. Kanonik amino asit fonksiyonel grupları, translasyon sonrası modifikasyonlar ile kombinasyon halinde, protein fonksiyonlarının 3,4 derece geniş katkıda bulunur. Prensip olarak, bağlı kanonik amino asitler yalnızca belirli fonksiyonel kısıtlamalar daha içeren aşılabilir, yeni kimyasal maddeler ve yeni işlevler 3,4 olanak kuralsız amino asitler (NCAAs). sitesi-ya da artık özel dahil: NCAAs birleştirmek için iki tamamlayıcı yaklaşım vardır. Eski yöntem aminoasil-tRNA-synth kanonik seti beri, önemli teknik zorluklar gerektiriretases (AARS) ve tRNA endojen için makine ile etkileşim olmamalıdır bir ortogonal AARS-tRNA çift genişletilmelidir. Dikkatli mühendisliğine dayalı bu yaklaşım, istenen protein sitelerinde tek nokta mutasyonlar gibi NCAAs içermektedir. NCAAs site-spesifik birleşme genetik bir kanonik bir amino asit (CAA), 5-9 kodon genellikle durdurmak için atanmamış bir kodon tarafından kodlanmıştır. Bu yöntem, oldukça bütün protein 10-13 arasında daha belirli bir yerde fonksiyon değişiklikleri gerektirir. Buna karşılık, artık madde özgü dahil standart nakil mekanizması tarafından kuralsız amino asidin hatalı tanıma dayanır. dahil nedeniyle AARS substrat özgünlüğü olmadığı için ortaya çıkar. Cohen ve arkadaşları 14 çalışmaları üzerine inşa NCAAs kalıntı özgü katılması, aralarında önemli uygulamalar 3,10, proteinlerin biyolojik dik etiketleme 15-17 yol açmıştırX-ışını kristalografisi 18 protein ve yapısının açıklanması,. Doğal AARS genellikle in vivo kalıntı özel kuruluş verimli bir İzostrüktürel NCAA üzerindeki aynı kökten amino asidi, tercih ettiğimiz gibi genellikle NCAA kanonik analog sentezleme yeteneğine sahip değildir bir auxotrophic ifade barındırma gerektirir. konakçı hücreler, benzer CAA sadece düşük bir konsantrasyon sağlar büyüme ortamında yetiştirilir. NCAA ile ardışık takviyesi ile birlikte kendi tükenme birden, canonically öngörülen yerlerde modeli proteine ​​NCAA dahil etmek ifade ana zorlar. Site özel yaklaşımına zıt olarak, bu, genellikle büyük ölçüde protein 19,20 fiziksel ve kimyasal özelliklerini modifiye giden tüm protein yapısı üzerinde derin bir etkiye sahiptir. Bunlar diğer prot dahil edilir Ancak NCAAs en ifade konakçısı 3 büyüme inhibitörleri,rekombinant gen ekspresyonu ne yönelik olanlar yanı sıra, Eins. Bu açık bir şekilde, in vivo yaklaşımı sınırlar. Toksik olan veya protein yapısı üzerinde güçlü bir etkiye sahip olan amino asitlerin in vivo olarak eklenmesi özellikle zor olmaya devam etmektedir. Ancak, bu moleküllerin olağanüstü fonksiyonları ile proteinleri mühendisi en umut arasındadır. Bunun bir örneği, toksik kuralsız, doğal olarak oluşan L-kanavanin (CAN), L-arginin (Arg) bir analogudur. Bu etkiler ve blok ilgili düzenleyici ve katalitik tepkime yolları Arg ve canlı hücrede varlığı ani ölümün 3,21-23 yol açabilir. Arginin pozisyonlarda proteinlerin içine birleşme proteini istikrarı 21-23 azaltabilir. Nedeniyle ortaya çıkan toksisite, Escherichia coli (E. coli) ve diğer ortak ifade hosts proteinleri içeren canavanine ifadesi bir sorun olmaya devam etmektedir. Bu nedenlerden ötürü, komple bir in vivo ITüm Arg pozisyonlarında Can ncorporation uygun bir özenli, tek bir protein üretim sistemi kullanılarak, bir kez 24 teyit edilmiştir. Bununla birlikte, bir anti-kanser madde 25-27 olarak önerilen ve insanlarda 28 otoimmün hastalıklar için bir uyarıcısı edilmiştir. Buna ek olarak, anti-metabolik, antibakteriyel, antifungal, çeşitli çalışmalar ve antiviral özelliklere 25 bağlıdır. Bu özellikler bir talep yükseltmek verimli ve kolay gerçekleştirmek Eczacılık, tıbbi ve fonksiyonel çalışmalar için proteinler içeren Can ifade yöntemleri. In vivo üretimi ile bağlantılı birçok problem hücresiz sentezleme sistemleri kullanılarak atlatılabilir rağmen, nitro tortu, özel yaklaşımlarda çok zayıf araştırılmıştır. L-triptofan analog 29 ve birden fazla NCAAs 30 hücresiz Tortu özgü dahil bildirilmiştir. Bu yöntemler, yüksek effic dayanırsağ- lasa T7 RNA polimerazı. T7 RNA polimerazı, böylece endojen transkripsiyon göre genetik özelliğe azaltarak bakteriyofaj gibi transkripsiyon gerektirmektedir. Tüm Arg pozisyonlarında bir model protein olarak Can tam Tortu özgü dahil en son hücresiz sentezleme sistemi 32 kullanılarak, 31 bildirilmiştir. Aynı sistemin bir hafif bir değişiklik bastırma 33 durdurma kodonu ile bir model protein, farklı PYRROLYSINE analoglarının alana özgü dahil sağladı. Kullanılan hücresiz sistem 31-33 hepsi E. dayanır E. coli transkripsiyon çeviri sistemi. Orijinal transkripsiyon için modüler kadar koruyarak, - (yeniden birleştirici protein 1 mg / ml, 0.5) 32 Bununla birlikte, bu şekilde etkili bir şekilde mevcut bakteriyofaj sistemleri gibi protein ifadesini sağlar. Bu çalışmada, detaylı bir protokol kadar artığı sağlanırNCAAs UE-özgü katılımına bu her E. kullanılarak gerçekleştirilebilir coli hücre-free sistemi 32. Buna ek olarak, HPLC-ESI-kütle spektroskopisi ile uygun bir değerlendirme için ifade edilen proteinlerin hazırlanması için başka adımlar da önerilmiştir. Bu hücre içermeyen sistemin özelliklerini genişletmek için, bu çalışmaları sadece Can 31 yayınlanan dahil bakın, aynı zamanda kuralsız L-lisin analog L-hidroksi-lizin ile ilgili yeni verileri sunmaktadır değildir. NCAAs kalıntı özel katılması için aşağıdaki protokol son zamanlarda Jüpiter 34 yılında yayınlanan bir protokolün bir uyarlamasıdır. İkinci protokol standart amino asitler ile yüksek verimli hücre serbestçe ifade gerçekleştirmek açıklamaktadır. Ayrıca, ham hücre serbest ekstresinin hazırlanması, bir amino asit çözeltisi, enerji hazır çözelti ve bu yaklaşımda kullanılan bir enerji tamponu sunulur. Aşağıdaki protokol önceki p göre modifiye adımlar üzerinde duruluyoramacıyla rotocol NCAAs kalıntı özgü dahil sağlamaktır. Kalibre edilmiş pipetler, düşük bağlanma pipet uçları ve mikro santrifüj tüplerine hazırlanması tavsiye edilmektedir. Aşağıda, amino asitler için IUPAC kısaltmalar kullanılmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protective eyewear</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>Z758841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves (size S)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>Z768960</td>
			<td>Catalog numbers other sizes: Z768979 for M, Z768987 for L and Z768995 for XL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 ml (PCR clean)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>30123.328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbalance Discovery DV114CM</td>
			<td>Ohaus, Greifensee, Switzerland</td>
			<td>80104140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspatula (L 6 5/8 in., stainless steel, rod diam. 0.09 in.)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>Z243213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Canavanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>C9758</td>
			<td>Acute toxicity: wear eyeshields, dust mask, protective gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylysine (racemic mixture)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>H0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-gloves (size S, water resistent)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>Z183490</td>
			<td>Catalog numbers other sizes: Z183512 for M, Z183520 for L and Z183539 for XL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>Biotechrabbit, Hennigsdorf, Germany</td>
			<td>BR1401801</td>
			<td>For homemade preparation of amino acid stock solutions, follow this protocol35 and use the solid amino acid kit LAA21-1KT, L-proline (81709-25G), L-cysteine (30089-25G), L-histidine (53319-25G) and L-lysine (L5501-5G)&#160; (all from Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>H6147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>Affymetrix, Santa Clara, USA</td>
			<td>14121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Affymetrix, Santa Clara, USA</td>
			<td>16800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>Affymetrix, Santa Clara, USA</td>
			<td>23160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (from E. coli, pack size 100 mg)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>10109541001</td>
			<td>Catalog number for pack size of 500 mg is 10109550001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>C4282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD (from yeast )</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>N6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>A9501&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>F7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>G1149&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500</td>
			<td>Addgene, Cambridge, USA</td>
			<td>Plasmid #40019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20 % precast Tris-Glycine Gels (10 cm x 10 cm x 1 mm, 10 courses)</td>
			<td>Anamed Elektrophorese, Gro&#223;-Bieberau / Rodau, Germany</td>
			<td>TG 81610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS running buffer (10 x concentrate, 5000 ml)</td>
			<td>Anamed Elektrophorese, Gro&#223;-Bieberau / Rodau, Germany</td>
			<td>TG 50001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS loading buffer (2 x concentrate, 50 ml)</td>
			<td>Anamed Elektrophorese, Gro&#223;-Bieberau / Rodau, Germany</td>
			<td>TG 05002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unstained protein marker, broad range (2-212 kDa)</td>
			<td>New England Biolabs, Ipswich, USA</td>
			<td>P7702S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1060091011</td>
			<td>Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed: wear protective gloves and work under fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid (99.8 %)</td>
			<td>VWR International, Darmstadt, Germany</td>
			<td>20104.447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Blue G-250 (10 g)</td>
			<td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany</td>
			<td>902120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-Spin Protein Miniprep kit</td>
			<td>Zymo Research Europe, Freiburg, Germany</td>
			<td>P2002</td>
			<td>Product also distributed by Zymo Research Corporation, Irvine, USA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol, 99 %</td>
			<td>VWR International, Darmstadt, Germany</td>
			<td>24397.296DB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CentriPure Z25 mini spin columns</td>
			<td>Genaxxon bioscience, Ulm, Germany</td>
			<td>CP-0205-Z100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrator 5301</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>5301 000.210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2xYT</td>
			<td>MP biomedicals, Santa Ana, USA</td>
			<td>113012032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Agar</td>
			<td>BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead-beating tubes (polypropylene microvials)</td>
			<td>Biospec, Bartlesville, USA</td>
			<td>522S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads, 0.1mm dia.</td>
			<td>Biospec, Bartlesville, USA</td>
			<td>11079101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>71402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford BSA protein assay Kit</td>
			<td>Bio-Rad, M&#252;nchen, Germany</td>
			<td>500-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes, 1.5ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>14-955-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad, M&#252;nchen, Germany</td>
			<td>732-6204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 384-well optical bottom plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>142761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc sealing tape</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>232701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-8000</td>
			<td>Promega, Madison, USA</td>
			<td>V3011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>P8584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>P8709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer dialysis cassettes, 10k MWCO (Kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>66382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>85558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1L centrifuge bottle</td>
			<td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td>
			<td>A98813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4L Erlenmeyer flask</td>
			<td>Kimble Chase, Vineland (NJ), USA</td>
			<td>26500-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-26XP centrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td>
			<td>393127</td>
			<td>Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 1 l bottles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma 480 orbital shaker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>480</td>
			<td>Or shaker equivalent being able to shake chest-size 6 x 4 L .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JLA-8.1000 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td>
			<td>363688</td>
			<td>Or 5000 x g rotor equivalent for above centrifuge equivalent being able to centrifuge 1L-bottles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Beadbeater-1</td>
			<td>Biospec, Bartlesville, USA</td>
			<td>3110BX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge 22R refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td>
			<td>368831</td>
			<td>Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 2 ml reaction tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block HLC HBT 130</td>
			<td>Labexchange, Burladingen, Germany</td>
			<td>24465</td>
			<td>Or heating block equivalent being able to heat samples in reaction tubes up to 100 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf MiniSpin centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>5452000018</td>
			<td>Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 2 ml reaction tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKA Vortex 3 (4 mm orbital shaker diameter, 0 - 2500 rpm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>Z654760</td>
			<td>Or vortex equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotsman AF103 ice flaker machine</td>
			<td>K&#228;lte-Berlin, Berlin, Germany</td>
			<td>AF103</td>
			<td>Or ice flaker machine equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyTemp mini digital incubator</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>Z763314</td>
			<td>Or incubator equivalent being able to heat samples at 29 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoCell electrophoresis cell / chamber</td>
			<td>Anamed Elektrophorese, Gro&#223;-Bieberau / Rodau, Germany</td>
			<td>AN12005</td>
			<td>Or electrophoresis chamber equivalent being able to perform vertical gel electrophoresis with above precast gels or other used gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power-phor power supply for electrophoresis cell / chamber</td>
			<td>Anamed Elektrophorese, Gro&#223;-Bieberau / Rodau, Germany</td>
			<td>AN12001</td>
			<td>Or power supply equivalent being able to supply above used electrophoresis cell / chamber with power</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 1</td>
			<td>VWR International, Darmstadt, Germany</td>
			<td>613-5278</td>
			<td>Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 2</td>
			<td>VWR International, Darmstadt, Germany</td>
			<td>613-5279</td>
			<td>Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman Tips Diamond D10ST (0.1 - 10 &#181;l)</td>
			<td>Gilson, Middleton, USA</td>
			<td>F171101</td>
			<td>Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman Tips Diamond D200ST (2 - 200 &#181;l)</td>
			<td>Gilson, Middleton, USA</td>
			<td>F171301</td>
			<td>Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman Tips Diamond D1000ST (100 - 1000 &#181;l)</td>
			<td>Gilson, Middleton, USA</td>
			<td>F171501</td>
			<td>Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile)</td>
			<td>VWR International, Darmstadt, Germany</td>
			<td>50-0156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile)</td>
			<td>VWR International, Darmstadt, Germany</td>
			<td>525-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 ml polypropylene tubes (round bottom, two-position vent stopper, sterile)</td>
			<td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>187262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC Column (3 &#181;m particle size, L x I.D. 10 cm x 2.1 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>567227-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 HPLC machine&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies, Santa Clara, USA</td>
			<td>G1312B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6500 Series Accurate-Mass Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) LC/MS</td>
			<td>Agilent Technologies, Santa Clara, USA</td>
			<td>G6530BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>270717</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar Omega microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech, Ortenberg, Germany</td>
			<td>415-101</td>
			<td>Or microplate reader equivalent being able to measure the fluorescence of the expressed model protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanna Checker pH meter</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>Z351091&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid eluent additive for LC-MS</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>56302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

residue-specific incorporation of noncanonical amino acids into model proteins using an escherichia coli cell-free transcription-translation system

Amino asitlerin kurallı dizi protein işlevselliği olağanüstü geniş yol açar. Bununla birlikte, kalıntıların kümesi hala potansiyel protein uygulamaları sınırlamalar getirmektedir. kuralsız amino asitin katılması bu kapsam büyütebilirsiniz. kuralsız amino asitler dahil etmek için iki tamamlayıcı yaklaşım vardır. alana özgü dahil, endojen kanonik çeviri makine ek olarak, bir dikey aminoasil-tRNA sentetaz-tRNA çifti standart olanlarla etkileşmediğini sağlanmalıdır. Sonuç olarak, bir standart bir amino asit, genellikle, bir durdurma kodonu atanmamış bir kodon, de gereklidir. Bu, genetik kod genişletme protein içinde tek, belirli bir yerde bir kuralsız amino asidin dahil edilmesi sağlar. Burada sunulan çalışma genetik kod endojen öteleme sistem içinde yeniden tortu özgü kullanılmasını anlatmaktadır. çeviri makine biryani kanonik öngörülen yerlerde, dahil etmek için bir vekil olarak kuralsız amino asidi ccepts, protein, bir kanonik amino asidin tüm oluşumları kuralsız bir değiştirilir. kuralsız amino asitin katılması önemli ölçüde modifiye edilmiş fiziksel ve kimyasal özelliklere yol açan, protein yapısını değiştirebilir. Onlar endojen proteinlerin değiştirmek beri kuralsız amino asit analogları genellikle in vivo Protein üretimi sınırlayıcı, ifade bilgisayarlar için hücre büyümesi inhibitörleri olarak hareket ederler. Proteinlere zehirli kuralsız amino asitler in vivo katılması özellikle zor kalır. Burada, kuralsız amino asit, L-canavanine L-arginin tam bir değişimi için hücresiz bir yaklaşım sunulmuştur. Bu, in vivo ifade özgü güçlükleri aşılmaktadır. Buna ek olarak, kitle spektral analizi için hedef proteinlerin hazırlanması için bir protokol dahildir. L-lizin, L-hidroksi-lisin ile ikame edilmiş olabilir gösterilmiştirdaha düşük bir randımanla. Prensip olarak, herhangi bir kuralsız amino asit analog sürece endojen in vitro çeviri sistemi tanıdığı olarak sunulan yöntemi kullanarak dahil edilebilir.

Bu protokol modeli protein halinde NCAAs hücresiz Tortu özgü dahil edilmesi yoluyla yönlendirir. Bu kuruluş deney ve uygun bir HPLC-ESI kütle spektroskopik analizi için bir model protein hazırlamak için daha fazla çaba bir ön değerlendirmesi için SDS-PAGE önermektedir. Burada, Arg analog Can hücresiz Tortu özgü dahil, hem de Lys analog L-hidroksi-lizin (-metil) temsil edici sonuçları sunulmaktadır. farklı bir amino asit çözeltileri, enerji tamponu, model protein ve hücre içermeyen reaksiyonlar için vektör DNA kodlaması, yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanır. Referans hücresiz Reaksiyon 20 caas oluşan bir amino asit çözeltisi ile sağlanır. Her deney için, negatif kontrol hücre içermeyen Reaksiyon, söz konusu Ncaa kanonik analog yoksun amino asit çözeltisi ile birlikte verilir. Her yakl içinoach bir hücresiz Reaksiyon CAA kuralsız analog ile ikame edilmiş amino asit çözeltisi mevcudiyetinde model protein ifade eder. His-etiketi saflaştırma, tampon değişimi ile HPLC-ESI kitle spektrometrik analiz, yukarıda tarif edilen protokol uyarınca yürütülür. Model protein deGFP 32, EGFP 53 kesik bir versiyonu His ile etiketlenmiş Cı-terminaldir. Bu tek harfli amino asit sekansı (ek malzemenin 2) &#39;de bulunabilir. Bu model, bir protein 6 Arg ve 18 Lys numaralıktır sırasıyla. Ekspresyon vektörü pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 olup. Ncaa tam ekleme durumunda, tek bir negatif kontrol Reaksiyon eksik 20 caas biri yana deGFP ifade etmez varsayabiliriz. Aksine, deGFP Diğer iki reaksiyonlarda saptanabilir olmalıdır: Refe yerli birhücresiz reaksiyon ve Ncaa ile sağlanan hücre içermeyen reaksiyonda değiştirilmiş protein Rence. Şekil 1A Can kuruluş deney ön SDS-PAGE değerlendirmesini gösterir. Referans hücresiz reaksiyon, en yüksek deGFP ekspresyon seviyesine sahiptir. Can ile sağlanan hücre içermeyen reaksiyonda, deGFP biraz daha düşük bir konsantrasyonda ifade edilir. Resim deGFP sentezleme negatif kontrol tespit edilebilir. Bu SDS-PAGE sonucu hedef protein deGFP içine Can başarılı bir şekilde dahil edilmesi için iyi bir göstergedir. , DeGFP içine Şekil 1B görüntülendi saflaştırılmış modeli proteinleri, hem Can hipotez tam birleşme kanıtlamak için, HPLC-ESI kütle spektroskopisi ile analiz edilmiştir. Şekil 1C saflaştırılmış deGFP moleküllerinin deconvoluted kitle spektrumlarını göstermektedir. degF ve deconvoluted kütlesi<html> Referans hücresiz reaksiyonda ifade P 26,192.8 Da&#39;dır. deGFP için 26202,5 ​​Da&#39;lık kütle görünür hücresiz reaksiyonu içeren kap olarak ifade edilmiştir. Tam Can yerini yerli deGFP6Arg ve Arg ile modifiye deGFP6Can için beklenen kitleler sırasıyla 26.193 Da ve 26204 Da vardır. deGFP6Can için 1.5 Da kütle farkı spektrumu Dekonvolüsyonun hatası içindedir. Böylece, 6 Arg pozisyonlarında deGFP içine Can tam katılması onaylandı. düşük şiddetteki iki tepe onların olgun fluorofor elde etmediler yerli deGFP6Arg ve modifiye deGFP6Can karşılık gelmektedir. Fluorofor otokatalitik oksidasyon takip bir H2O molekülünün ortadan kaldırılması ile oluşturulur. Bu, bu süreç devam etmezse 20 Da arttı kitle yol açar. pg &quot;/&gt; Hücresiz eksprese edilmiş ve saflaştırılmış deGFP moleküllerinin katılması, deney ve HPLC-ESI-kütle spektroskopisi Şekil 1. SDS-PAGE değerlendirilmesi. (A), SDS-PAGE kullanılarak katılması, deney ön değerlendirmesi. Soldan sağa: Protein standart referans hücresiz reaksiyon, negatif kontrol hücre içermeyen reaksiyon Can yerine Arg sağlar. (B) His-etiketi saflaştırma sonrası, SDS-PAGE ve ifade deGFP moleküllerinin tampon değişimine. Can içeren reaksiyondan deGFP saflaştırılmış protein standardı, referans reaksiyonu saflaştırılmış deGFP: Soldan sağa. HPLC-ESI kütle spektroskopisi ile Can tam dahil (C) Onay. Tam Can yerini yerli deGFP ve Arg ile modifiye deGFP beklenen kitleler sırasıyla 26.193 Da ve 26204 Da vardır. Her spektrum en yüksek yoğunluğu (kere) normalize edilir. Tepe pozisyonları gösterilmiştirDa. görselleştirme amacıyla, jel şerit jel resimlerden ayıklanır, birlikte katıldı, gri skala biçimine dönüştürülür, boyut optimize edilmiştir ve kontrast yanı sıra parlaklık geliştirilmiştir. Orijinal jel şerit Ltd. Malzeme 3. sunulmuştur <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Şekil 2A HYL kuruluş deney ön SDS-PAGE değerlendirmesini gösterir. Hyl ile sağlanan hücre içermeyen reaksiyonda, deGFP ifade edilir. İlk deneyde aksine, zayıf deGFP bandı negatif kontrol reaksiyonda görülmektedir. Bu hücresiz reaksiyonlarda Lys kalıntıları bağlı olabilir. Bu Lys ne HYL ne eklenir negatif kontrol reaksiyonu, bir soluk deGFP ifadesini sağlar. H için<html> PLC ESI kütle spektroskopisi -mctil ile sağlanan hücre içermeyen reaksiyon deGFP molekülleri saflaştırılmış ve tampon (Şekil 2B) değiştirilir. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54273/54273fig2.jpg" /> HYL kuruluş deney Şekil 2. SDS-PAGE değerlendirme (A) Soldan sağa:. Negatif kontrol hücre içermeyen reaksiyon, HYL ve protein standardı içeren hücre içermeyen reaksiyon. (B) His-etiketi saflaştırma sonrası, SDS-PAGE ve ifade deGFP moleküllerinin tampon değişimine. HYL elde edilen saflaştırılmış deGFP reaksiyonu ve protein standardı içeren: Soldan sağa. görselleştirme amacıyla, jel şerit jel resimlerden ayıklanır, birlikte katıldı, gri skala biçimine dönüştürülür, boyut optimize edilmiştir ve kontrast yanı sıra parlaklık geliştirilmiştir. Orijinal jel şerit ek malzemenin 3&#39;te sunulmaktadır.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 3, arıtılmış, deGFP moleküllerinin deconvoluted kütle spektrumunu gösterir. Şekil 3A, hücresiz reaksiyonlarda zaten mevcut Lys kalıntılarının hipotezini teyit etmektedir. spektrumu baskın pik yerel deGFP (: ​​26.193 Da beklenen kütle) karşılık gelir. Yine bunların fluorofor gelişmedi 20 Da daha yüksek kütle deGFP molekülleri tespit edilebilir. Lys kalıntıları tercihen doğal deGFP18Lys yüksek ekspresyon düzeyine gelen lisil-tRNA sentetaz tarafından tRNA Lys üzerine yüklenir. HYL ve Lys arasındaki kütle farkı 16 Da olduğunu. Nedeniyle (tüm olası deGFP türleri oluşturulacak Lys kalıntısı elde etmek, rekabet deGFP18Hyl olan hyl varlığına bağlı olarak,deGFP17Hly + 1Lys, ..., deGFP16Hyl + 2Lys) (Şekil 3B). Kuşkusuz, deGFP1Hyl + 17Lys pik olarak flüorofor (Şekil 3A) ve bazı piklerin kütle beklenen miktar fazla 2 da farklıdır vermedi nativ deGFP zirve ile çakışmaktadır. Bu kütle farkı nedeniyle deGFP türlerinin düşük miktarlarda, yüksek gürültü atfedilebilir. Bununla birlikte, genel olarak hyl hücresiz sistem olarak alınmıştır. Diğer gelişmeler, hücresiz reaksiyonlarda Lys kalıntıları ortadan kaldırmak için yapılması gerekir. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54273/54273fig3.jpg" /> . (: Olgun fluorofor 26.213 Da olmadan florofor 26.193 Da olan beklenen kitle) hyl içeren hücresiz reaksiyon saflaştırılmış deGFP moleküllerinin Şekil 3. HPLC-ESI Kütle Spektroskopisi (A), ana deGFP18Lys ağırlıklı tespit edilir. (B)Büyütme tüm olası deGFP türlerinin (deGFP18Hyl, deGFP17Hly + 1Lys, deGFP16Hyl + 2Lys, ..., deGFP1Hyl + 17Lys) varlığını ortaya çıkarır. Onların beklenen kitlelerdir 26193 Da + N 16 Da (N = 1, ..., 18) x. tayfı en yüksek yoğunluğu (kere) normalize edilir. Tepe pozisyonları Da belirtilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig1.jpg" /> Yan Ürün 1. Hesaplama şablonu. Bölüm 2, enerji tamponu ana karışımı hazırlanması ham öz alikotları 30 ul ve en iyi Mg- sırasıyla 3 mM K-glutamat konsantrasyonları ve 30 mM kullanılarak örneklenmiştir. Bu örnek 3 enerji tampon alikotları veren bir master miks hacmine yol açar. sntion 3, hücre içermeyen reaksiyon hazırlık hücre içermeyen reaksiyon 10 nM optimal vektör DNA konsantrasyonu lider bir 90 nM DNA stok solüsyonu kullanılarak örneklenmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/cell-free_calculations_JoVE_11.03.2016_final.xlsx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.</a> Ham ekstrakt hacmi: 28 ul, uygun Mg-glutamat: 2 mm, en iyi, K-glutamat: 40 mM, sayısı uygun bir izlenebilirliği için, hesaplama şablonu kullanımı yukarıdaki örnekten farklı olan bu tipik değerler sokulması ile örneklendirilir 100, hücresiz reaksiyonunda uygun vektör konsantrasyonu: 8 nM DNA vektörü stok çözeltisi: 150 nM istenilen tampon alikotları. İlk ilk şablon bölümünün turuncu alana ham ekstrakt hacmi olarak 28 ul girin. Sonra, ikinci şablon bölümü içine 2 mM bir girind 40 mM optimal Mg- ve portakal alanlarına K-glutamat konsantrasyonları. göz önüne alınarak uygun Mg- ve K-konsantrasyonu, 15 | il bir enerji tamponu bileşimi gibi bir tekabül eden, yukarı ölçeklenmiş 16 ul alikosu hesaplanır. Aşağıda, bu doğrultuda enerji tampon alikotları istenen sayıda (16 ul) olarak 100 girin. 100 mM Mg-glutamat stok solüsyonu 204 ul, 3 M K-glutamat stok solüsyonu 136 ul, 14x enerji solüsyonu 728,73 ul, 510 ul: şablon aşağıdaki gibi 1700 ul ana karışımı için farklı tampon bileşenleri hacimleri uyarlar % 40 PEG-8000 ve 121,27 ul steril GKD 2 O. Son olarak, üçüncü bir şablon bölümüne, 8 nM ve hücre içermeyen bir reaksiyon için optimum vektör konsantrasyonu 150 nM ve sırasıyla vektör DNA, stok çözeltisi konsantrasyonu girin. Şablon, 90 ul hazırlanmasını tamamlamak için ham özüt 28 ul eklenmesi gereken farklı bileşenlerin hacimleri adaptehücre içermeyen reaksiyon şöyledir: enerji tampon 15 ul, 3 farklı besteledi amino asit çözümlerinden birinin 15 ul, vektör DNA solüsyonu (150 nM) 4.80 ul ve steril GKD 2 O. 27.20 ul <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig2.jpg" /> Model protein deGFP Tamamlayıcı Malzeme 2. Tek harfli amino asit dizisi. Bu model, protein 6 Arg ve 18 Lys pozisyonları içerir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273supfig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig3.jpg" /> Her s sunulan Ltd. Malzeme 3. Tam boy ve jel resimlere karşılık değiştirilmemiş jel şerit sunulan Şekil 1 ve 2 jel şerit<html> ubfigure aynı SDS poliakrilamid jelinden ekstre edilmiştir. Şekil 1 ve 2, bu şerit sunum amaçlı bir araya katıldı. Protein standart bandın molekül ağırlıkları şekiller yanında gösterilmiştir. (A.1) Şekil 1A uncropped jel şerit. Soldan sağa: Protein standart referans hücresiz reaksiyon, negatif kontrol hücre içermeyen reaksiyon Can yerine Arg sağlar. (A.2) Şekil 1B uncropped jel şerit. Can içeren reaksiyondan deGFP saflaştırılmış protein standardı, referans reaksiyonu saflaştırılmış deGFP: Soldan sağa. (B.1) Şekil 2A uncropped jel şerit. Negatif kontrol hücresiz reaksiyon -mctil ve protein standardı içeren hücresiz reaksiyonu: Soldan sağa. (B.2) Şekil 2B uncropped jel şerit. HYL elde edilen saflaştırılmış deGFP reaksiyonu ve protein standardı içeren: Soldan sağa.d / 54273 / 54273supfig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Watch this Scientific Journal Video about Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System at JoVE.co

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

An easy-to-use, cell-free expression protocol for the residue-specific incorporation of noncanonical amino acid analogs into proteins, including downstream analysis, is presented for medical, pharmaceutic, structural and functional studies.

Bir Kullanarak Modeli Proteinler içine Kuralsız Amino Asit kalıntı özgü Ortaklığın<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Hücre içermeyen Transkripsiyon-çeviri Sistemi

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes ...

residue-specific-incorporation-noncanonical-amino-acids-into-model

Research

JoVE Journal

Biology

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

15.9K Görüntüleme.  Saarland University. An easy-to-use, cell-free expression protocol for the residue-specific incorporation of noncanonical amino acid analogs into proteins, including downstream analysis, is presented for medical, pharmaceutic, structural and functional studies.

Video: Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

İnsan DNA Onarım Proteinler Genetik Araştırmalar Maya Model Sistemi olarak kullanma

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Biyoloji

One-step Metabolomics: Carbohydrates, Organic and Amino Acids Quantified in a Single Procedure

Every infant born in the US is now screened for up to 42 rare genetic disorders called "inborn errors of metabolism". The screening method is based on tandem mass spectrometry and quantifies acylcarnitines as a screen for organic acidemias and also measures amino acids. All states also perform enzymatic testing for carbohydrate disorders such as galactosemia. Because the results can be non-specific, follow-up testing of positive results is required using a more definitive method. The present report describes the "urease" method of sample preparation for inborn error screening. Crystalline urease enzyme is used to remove urea from body fluids which permits most other water-soluble metabolites to be dehydrated and derivatized for gas chromatography in a single procedure. Dehydration by evaporation in a nitrogen stream is facilitated by adding acetonitrile and methylene chloride. Then, trimethylsilylation takes place in the presence of a unique catalyst, triethylammonium trifluoroacetate. Automated injection and chromatography is followed by macro-driven custom quantification of 192 metabolites and semi-quantification of every major component using specialized libraries of mass spectra of TMS derivatized biological compounds. The analysis may be performed on the widely-used Chemstation platform using the macros and libraries available from the author. In our laboratory, over 16,000 patient samples have been analyzed using the method with a diagnostic yield of about 17%--that is, 17% of the samples results reveal findings that should be acted upon by the ordering physician. Included in these are over 180 confirmed inborn errors, of which about 38% could not have been diagnosed using previous methods.

The urease method of sample preparation for GC/MS analysis of intermediary metabolites is presented by its inventor. The method allows one-step follow-up of newborn screening for inborn errors by tandem mass spectrometry by quantifying carbohydrates, organic and amino acids all in a single process.

Bir adım metabolomik: Karbonhidratlar, Tek Bir Usul Sayısallaştırılmış Organik ve Amino Asitler

Every infant born in the US is now screened for up to 42 rare genetic disorders called "inborn errors of metabolism". The screening method is based on ...

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Etkinlik Ölçüm Bir Testi Escherichia coli Lizin Decarboxyase Đndüklenebilir

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

Mantar Endoglucanase Faaliyet Yüksek Verimli Tarama Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

Microbes have complex metabolic pathways that can be investigated using biochemistry and functional genomics methods. One important technique to examine cell central metabolism and discover new enzymes is 13C-assisted metabolism analysis 1. This technique is based on isotopic labeling, whereby microbes are fed with a 13C labeled substrates. By tracing the atom transition paths between metabolites in the biochemical network, we can determine functional pathways and discover new enzymes. 
As a complementary method to transcriptomics and proteomics, approaches for isotopomer-assisted analysis of metabolic pathways contain three major steps 2. First, we grow cells with 13C labeled substrates. In this step, the composition of the medium and the selection of labeled substrates are two key factors. To avoid measurement noises from non-labeled carbon in nutrient supplements, a minimal medium with a sole carbon source is required. Further, the choice of a labeled substrate is based on how effectively it will elucidate the pathway being analyzed. Because novel enzymes often involve different reaction stereochemistry or intermediate products, in general, singly labeled carbon substrates are more informative for detection of novel pathways than uniformly labeled ones for detection of novel pathways3, 4. Second, we analyze amino acid labeling patterns using GC-MS. Amino acids are abundant in protein and thus can be obtained from biomass hydrolysis. Amino acids can be derivatized by N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) before GC separation. TBDMS derivatized amino acids can be fragmented by MS and result in different arrays of fragments. Based on the mass to charge (m/z) ratio of fragmented and unfragmented amino acids, we can deduce the possible labeled patterns of the central metabolites that are precursors of the amino acids. Third, we trace 13C carbon transitions in the proposed pathways and, based on the isotopomer data, confirm whether these pathways are active 2. Measurement of amino acids provides isotopic labeling information about eight crucial precursor metabolites in the central metabolism. These metabolic key nodes can reflect the functions of associated central pathways.
13C-assisted metabolism analysis via proteinogenic amino acids can be widely used for functional characterization of poorly-characterized microbial metabolism1. In this protocol, we will use Cyanothece 51142 as the model strain to demonstrate the use of labeled carbon substrates for discovering new enzymatic functions.

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

13C-isotope labeling is a useful technique for determining the cell central metabolism for various types of microorganisms. After cells have been cultured with a specific labeled substrate, GC-MS measurement can reveal functional metabolic pathways based on unique labeling patterns in proteinogenic amino acids.

Sayesinde Metabolik Pathway Onay ve Keşif 13</supAminoasittir> C-etiketleme

Microbes have complex metabolic pathways that can be investigated using biochemistry and functional genomics methods. One important technique to examine ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Sentetik Genetik Diziler kullanarak

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

Elektrokompetan Hazırlanması için hızlı Protokolü<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Ve<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

Bir uygulama için Protokoller<em&gt; Escherichia coli</emSentetik Biyoloji&gt; Tabanlı TX-TL Hücre-Özgür İfade Sistemi

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

Live Algılama<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: PMA-qPCR H7 Hücreler

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

Peptidler ve proteinler ile rekombinant Elastin gibi Polipeptitlerin ve Fusions olmayan kromatografik saflaştırma<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...