E.G. Worst and A. Ott acknowledge financial support by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the collaborative research center SFB 1027 as well as Saarland University. E.G. Worst, A. Ott and V. Noireaux further acknowledge financial aid by the Human Frontiers Science Program Organization (HFSPO). The authors thank Tobias Baumann and Stefan Oehm (Institute of Chemistry, Technische Universit&#228;t Berlin) for critical reading.

The authors have nothing to disclose.

- 簡単に-する残基特異的タンパク質にncAAsを組み込むための実行可能な戦略として、無細胞発現系を使用して、提示されています。この目的のために、粗抽出物は、目的のタンパク質、エネルギーバッファ及び対応するアミノ酸のためのベクターDNAコードが補充されます。粗抽出物のアリコート量が粗抽出タンパク質濃度34に依存することに注意してください。無細胞発現効率は、ベクターDNA構築濃度に応じて最適化されます。エネルギーバッファ成分の体積は、無細胞発現モデルタンパク質の高い収量を可能にするために最適化されたMG-及びKグルタミン酸濃度の関数として変化します。 取り込み実験の予備的な評価は、未精製、無細胞反応媒体のSDS-PAGEを行うことにより得ることができます。より詳細な分析のために、HPLC-ESI質量分析は、完全な、残基特異的incorをチェックするための手段として提案されていますNCAAのポレーション。後者のための準備として、スピンカラムシステムは、Hisタグ精製を可能にし、私たちは、このプロトコルで使用する小容量との交流をバッファするために使用されています。 HPLC-ESI質量分析を含む、全体のプロトコルは、2日以内に行うことができます。これは、任意の特に重要なステップが含まれていません。しかし、MG-とK-グルタミン酸のと同様に、ベクターDNAの濃度の最適化は、モデルタンパク質の高収量を表現するために重要です。高効率発現ベクターpBEST-OR2-OR1-PR-UTR1-gene_of_model_protein-T500の使用を強くお勧めします。 Hisタグ付きタンパク質の溶出が原因で高濃度のイミダゾール（&gt; 150 mMの）および質量分光分析49における高いバックグラウンドノイズを発生する例えばNaH 2 PO 4（&gt; 300 mM）のまたはのNaCl（&gt; 50 mM）のような他の塩に通常であります。適切なタンパク質貯蔵緩衝液でこのような溶出緩衝液の交換は、モデルproteを安定化および大幅には、質量分光分析の間にバックグラウンドノイズを低減します。 その結果、モデルタンパク質内のすべての6つの位置でのArgを置き換えることができます。発現系では、何のArg残基は検出できません。これはさらに枯渇戦略29,30を必要とする他の発現系と比較してのArg類似体の残基特異的組み込みを簡素化します。提示された無細胞アプローチは、缶の毒性によるものであるin vivoでのアプローチの固有の制限、または単一のタンパク質の生産戦略24,31内のmRNA配列に強い依存性を回避します。 インビトロ系で採用に反して、缶のインビボでの切断はホモセリンするとヒドロキシグアニジンは、31を発生しません。 しかし、無細胞系は、HYLなどの類似体と競合するのLysの十分な量を保持しています。 HPLC-ESI質量分光分析は、C、モデルタンパク質の両方が含まれていることを示していますanonicalならびに異なる割合で非標準のアナログ。 Lysの残基特異的組込みは、一般的には可能ですが、ncAAsの認識のために最適化された完全な置換、さらに枯渇戦略、または特別に設計さのaaRSとtRNAのために開発される必要があります。 私たちは、正規のものと同じ濃度でNCAAを追加することにより、無細胞発現し、修正されたモデルタンパク質の優れた収率を達成しました。取り込み効率が組み込まれるNCAAの性質に依存します。さらに高い収率はまだNCAAの濃度を最適化することにより実現可能であるかもしれません。 提示された結果であれば、それらは標準的な内因性翻訳システムによって受け入れられるようncAAsの残基特異的組み込みのための採用システムの適用可能性を実証します。類似CAA disturの残基場合に、特定ncAAsの残基特異的取り込み、一つのさらなるニーズをチェックします発現系B。 無細胞転写翻訳系は、異なる要求54に応答するために、異なる生物から操作することができます。すべてのE.ここで紹介する無細胞系の大腸菌転写-翻訳機械は、バクテリオファージの使用を有効にしてE.大腸菌プロモーターは、それらは並行してまたは連続してカスケード55に作用することができます。一般的な適用性と使いやすさは、メソッドのアミノ酸の毒性および治療用途でのさらなる研究のための強力なツールとなっています。

遺伝コードは、生物圏に普遍的です。その時々セレノシステイン1またはピロリジン2によって拡張される20正規アミノ酸のセットをコードします。それは、タンパク質に折り畳まれるアミノ酸のチェーンへのtRNAの助けを借りて、遺伝コードを変換するリボソームです。標準的なアミノ酸の官能基は、翻訳後修飾と組み合わせて、タンパク質機能3,4の非常に広い範囲に寄与する。原理的には、標準的なによるアミノ酸の限定されたセットに機能的な制限は、さらに新たな化学および新しい機能3,4を可能にする非標準アミノ酸（ncAAs）を組み込むことによって克服することができます。 部位特異的または残基特異的組み込み：ncAAsの取り込みのための2つの相補的なアプローチがあります。前者の方法は、アミノアシルtRNAシンセのカノニカル集合ので、かなりの技術的な困難を伴いますetases酵素（aaRS）とtRNAが内在性翻訳機構と相互作用してはならない直交のaaRS-tRNAのペアによって拡張されなければなりません。慎重な工学に基づいた、このアプローチは、所望のタンパク質部位での単一点突然変異としてncAAsを内蔵しています。 ncAAsの部位特異的組み込みを遺伝子操作して、標準的なアミノ酸（CAA）、5-9コドン通常停止に割り当てられていないコドンによってコードされています。このメソッドは、指定されたサイトではなく、全体タンパク質10-13全体の機能の変化を伴います。 これとは対照的に、残基特異的組み込みは、標準的な翻訳機構によって非標準アミノ酸の誤認識に依存しています。混入が原因のaaRSの基質特異性の欠如が原因で発生します。コーエンと同僚14のワーク上に構築されたncAAsの残基特異的組込みは、それらの中で重要なアプリケーション3,10、タンパク質のバイオ直交ラベリング15-17につながっていますX線結晶18中のタンパク質のまたは構造解明。 天然のaaRSは、一般的に同形NCAA上で、それらの同族アミノ酸を好むように、 生体内残留物特異的組み込みで効率的には、通常、NCAAの標準的なアナログを合成することができない栄養要求性発現宿主を必要とします。宿主細胞は、類似CAAのみ低濃度を実現し、増殖培地中で培養されます。 NCAAでの連続補充と組み合わせて、その枯渇は、複数の正準規定の部位でのモデルタンパク質にNCAAを組み込むために発現宿主を強制します。部位特異的なアプローチとは対照的に、これは、一般にかなりタンパク質19,20の物理的および化学的性質を改変するためにつながる、タンパク質全体の構造に深い影響を与えます。それらは、他の多くのPROTに組み込まれているしかし、ncAAsのほとんどは、発現宿主3の成長阻害剤であります組換え遺伝子発現の間の関心のもの以外にもアインス。これは明らかに、in vivoでのアプローチを制限します。毒性であるか、またはタンパク質の構造に強い影響を有するアミノ酸のin vivo組込みは、特に困難なままです。しかし、これらの分子は、異常な機能を有するタンパク質を設計するために最も有望なの一つです。 一つの例は、毒性、非標準、天然に存在するL-カナバニン（CAN）、L-アルギニン（アルギニン）のアナログです。これは、影響し、ブロックのArg関連する規制や触媒反応経路を、そして生きた細胞中のその存在は即死3,21-23につながることができます。アルギニンの位置で、タンパク質への取り込みは、タンパク質の安定性21-23を低減することができます。得られた毒性、 大腸菌 （E. coli）および他の一般的な発現宿主中のタンパク質を含むカナバニンの発現が課題です。これらの理由から、完全なin vivoでの私すべてのArg位置で缶のncorporation適宜詳述単一タンパク質産生系を使用して、一度だけ24が確認されました。しかし、缶は、抗癌剤25-27として提案し、ヒト28における自己免疫疾患のための刺激としてれています。さらに、それは、その抗代謝、抗菌、抗真菌および抗ウイルス特性に関する種々の研究25の対象です。これらの特性は、効率的かつ簡単に行う表現する方法は、薬用医療・機能研究のためのタンパク質を含むことができますの需要を高めます。 インビボでの生産に接続されている多くの問題は、無細胞発現系を用いて回避することができるが、 インビトロでの残基特異的なアプローチは、不十分に検討されています。 L-トリプトファンアナログ29と複数のncAAs 30の無細胞残基特異的組み込みが報告されています。これらのメソッドは非常にefficに基づいていますT7 RNAポリメラーゼをient。 T7 RNAポリメラーゼは、それによって内因性の転写と比較して遺伝子の機能を低下させる、バクテリオファージのような転写を伴います。 すべてのArg位置でのモデルタンパク質への缶の完全な残基特異的組み込みは、最近、無細胞発現系32を使用して、31を報告しました。同じシステムのわずかな変更は、終止コドン抑制33を介してモデルタンパク質に異なるピロリジン類似体の部位特異的組み込みを可能にしました。採用無細胞系31から33 は、すべての E.に基づいています大腸菌転写-翻訳システム。オリジナルの転写-翻訳モジュールの多くを保持しながら、 - （組換えタンパク質の1mg / mlの0.5）32にもかかわらず、それは、効率的に、現在のバクテリオファージシステムのようなタンパク質の発現を可能にします。 この作業では、詳細なプロトコルがどのように残油に設けられています。ncAAsのUE固有の取り込みは、このすべてのEを使用して、実現することができます大腸菌無細胞系32。さらに、HPLC-ESI質量分析を介した適正な評価のために発現されたタンパク質を調製するためのさらなるステップが提案されています。この無細胞系の特性を展開するには、この作業は缶31の公開取り込みを参照してくださいだけでなく、非標準L-リジンアナログL-ヒドロキシリジンに関連する新たなデータを提供しません。 ncAAsの残基特異的組み込みのための以下のプロトコルは、最近Joveの34で発表されたプロトコルの適応です。後者のプロトコルは、標準アミノ酸で高効率な無細胞発現を実行する方法について説明します。また、粗無細胞抽出物、アミノ酸溶液、エネルギー原液と、このアプローチで使用されるエネルギーバッファの準備を示します。以下のプロトコルは、前のPと比較して変更されたステップに焦点を当てncAAsの残基特異的取り込みを可能にするためにrotocol。較正されたピペット、低結合ピペットチップおよびマイクロ遠心管を調製するために推奨されています。以下では、アミノ酸のIUPACの略語が使用されます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protective eyewear</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>Z758841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves (size S)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>Z768960</td>
			<td>Catalog numbers other sizes: Z768979 for M, Z768987 for L and Z768995 for XL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 ml (PCR clean)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>30123.328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbalance Discovery DV114CM</td>
			<td>Ohaus, Greifensee, Switzerland</td>
			<td>80104140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspatula (L 6 5/8 in., stainless steel, rod diam. 0.09 in.)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>Z243213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Canavanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>C9758</td>
			<td>Acute toxicity: wear eyeshields, dust mask, protective gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylysine (racemic mixture)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>H0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-gloves (size S, water resistent)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>Z183490</td>
			<td>Catalog numbers other sizes: Z183512 for M, Z183520 for L and Z183539 for XL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>Biotechrabbit, Hennigsdorf, Germany</td>
			<td>BR1401801</td>
			<td>For homemade preparation of amino acid stock solutions, follow this protocol35 and use the solid amino acid kit LAA21-1KT, L-proline (81709-25G), L-cysteine (30089-25G), L-histidine (53319-25G) and L-lysine (L5501-5G)&#160; (all from Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>H6147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>Affymetrix, Santa Clara, USA</td>
			<td>14121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Affymetrix, Santa Clara, USA</td>
			<td>16800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>Affymetrix, Santa Clara, USA</td>
			<td>23160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (from E. coli, pack size 100 mg)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>10109541001</td>
			<td>Catalog number for pack size of 500 mg is 10109550001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>C4282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD (from yeast )</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>N6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>A9501&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>F7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>G1149&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500</td>
			<td>Addgene, Cambridge, USA</td>
			<td>Plasmid #40019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20 % precast Tris-Glycine Gels (10 cm x 10 cm x 1 mm, 10 courses)</td>
			<td>Anamed Elektrophorese, Gro&#223;-Bieberau / Rodau, Germany</td>
			<td>TG 81610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS running buffer (10 x concentrate, 5000 ml)</td>
			<td>Anamed Elektrophorese, Gro&#223;-Bieberau / Rodau, Germany</td>
			<td>TG 50001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS loading buffer (2 x concentrate, 50 ml)</td>
			<td>Anamed Elektrophorese, Gro&#223;-Bieberau / Rodau, Germany</td>
			<td>TG 05002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unstained protein marker, broad range (2-212 kDa)</td>
			<td>New England Biolabs, Ipswich, USA</td>
			<td>P7702S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1060091011</td>
			<td>Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed: wear protective gloves and work under fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid (99.8 %)</td>
			<td>VWR International, Darmstadt, Germany</td>
			<td>20104.447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Blue G-250 (10 g)</td>
			<td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany</td>
			<td>902120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-Spin Protein Miniprep kit</td>
			<td>Zymo Research Europe, Freiburg, Germany</td>
			<td>P2002</td>
			<td>Product also distributed by Zymo Research Corporation, Irvine, USA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol, 99 %</td>
			<td>VWR International, Darmstadt, Germany</td>
			<td>24397.296DB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CentriPure Z25 mini spin columns</td>
			<td>Genaxxon bioscience, Ulm, Germany</td>
			<td>CP-0205-Z100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrator 5301</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>5301 000.210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2xYT</td>
			<td>MP biomedicals, Santa Ana, USA</td>
			<td>113012032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Agar</td>
			<td>BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead-beating tubes (polypropylene microvials)</td>
			<td>Biospec, Bartlesville, USA</td>
			<td>522S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads, 0.1mm dia.</td>
			<td>Biospec, Bartlesville, USA</td>
			<td>11079101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>71402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford BSA protein assay Kit</td>
			<td>Bio-Rad, M&#252;nchen, Germany</td>
			<td>500-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes, 1.5ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>14-955-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad, M&#252;nchen, Germany</td>
			<td>732-6204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 384-well optical bottom plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>142761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc sealing tape</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>232701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-8000</td>
			<td>Promega, Madison, USA</td>
			<td>V3011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>P8584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>P8709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer dialysis cassettes, 10k MWCO (Kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>66382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>85558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1L centrifuge bottle</td>
			<td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td>
			<td>A98813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4L Erlenmeyer flask</td>
			<td>Kimble Chase, Vineland (NJ), USA</td>
			<td>26500-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-26XP centrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td>
			<td>393127</td>
			<td>Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 1 l bottles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma 480 orbital shaker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>480</td>
			<td>Or shaker equivalent being able to shake chest-size 6 x 4 L .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JLA-8.1000 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td>
			<td>363688</td>
			<td>Or 5000 x g rotor equivalent for above centrifuge equivalent being able to centrifuge 1L-bottles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Beadbeater-1</td>
			<td>Biospec, Bartlesville, USA</td>
			<td>3110BX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge 22R refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td>
			<td>368831</td>
			<td>Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 2 ml reaction tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block HLC HBT 130</td>
			<td>Labexchange, Burladingen, Germany</td>
			<td>24465</td>
			<td>Or heating block equivalent being able to heat samples in reaction tubes up to 100 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf MiniSpin centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>5452000018</td>
			<td>Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 2 ml reaction tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKA Vortex 3 (4 mm orbital shaker diameter, 0 - 2500 rpm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>Z654760</td>
			<td>Or vortex equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotsman AF103 ice flaker machine</td>
			<td>K&#228;lte-Berlin, Berlin, Germany</td>
			<td>AF103</td>
			<td>Or ice flaker machine equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyTemp mini digital incubator</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>Z763314</td>
			<td>Or incubator equivalent being able to heat samples at 29 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoCell electrophoresis cell / chamber</td>
			<td>Anamed Elektrophorese, Gro&#223;-Bieberau / Rodau, Germany</td>
			<td>AN12005</td>
			<td>Or electrophoresis chamber equivalent being able to perform vertical gel electrophoresis with above precast gels or other used gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power-phor power supply for electrophoresis cell / chamber</td>
			<td>Anamed Elektrophorese, Gro&#223;-Bieberau / Rodau, Germany</td>
			<td>AN12001</td>
			<td>Or power supply equivalent being able to supply above used electrophoresis cell / chamber with power</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 1</td>
			<td>VWR International, Darmstadt, Germany</td>
			<td>613-5278</td>
			<td>Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 2</td>
			<td>VWR International, Darmstadt, Germany</td>
			<td>613-5279</td>
			<td>Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman Tips Diamond D10ST (0.1 - 10 &#181;l)</td>
			<td>Gilson, Middleton, USA</td>
			<td>F171101</td>
			<td>Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman Tips Diamond D200ST (2 - 200 &#181;l)</td>
			<td>Gilson, Middleton, USA</td>
			<td>F171301</td>
			<td>Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman Tips Diamond D1000ST (100 - 1000 &#181;l)</td>
			<td>Gilson, Middleton, USA</td>
			<td>F171501</td>
			<td>Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile)</td>
			<td>VWR International, Darmstadt, Germany</td>
			<td>50-0156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile)</td>
			<td>VWR International, Darmstadt, Germany</td>
			<td>525-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 ml polypropylene tubes (round bottom, two-position vent stopper, sterile)</td>
			<td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>187262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC Column (3 &#181;m particle size, L x I.D. 10 cm x 2.1 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>567227-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 HPLC machine&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies, Santa Clara, USA</td>
			<td>G1312B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6500 Series Accurate-Mass Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) LC/MS</td>
			<td>Agilent Technologies, Santa Clara, USA</td>
			<td>G6530BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>270717</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar Omega microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech, Ortenberg, Germany</td>
			<td>415-101</td>
			<td>Or microplate reader equivalent being able to measure the fluorescence of the expressed model protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanna Checker pH meter</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>Z351091&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid eluent additive for LC-MS</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>56302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

residue-specific incorporation of noncanonical amino acids into model proteins using an escherichia coli cell-free transcription-translation system

アミノ酸の標準セットは、タンパク質機能の非常に広い範囲につながります。それにもかかわらず、残基のセットは、まだ潜在的なタンパク質の用途に制限を課しています。非標準アミノ酸の組み込みは、この範囲を拡大することができます。非標準アミノ酸の組込みのための2つの相補的アプローチがあります。部位特異的組み込みのために、内因性の標準的な翻訳機械に加えて、直交アミノアシルtRNAシンテターゼ-tRNAのペアは正規のものと相互作用しないように提供されなければなりません。したがって、標準的なアミノ酸、通常は終止コドンに割り当てられていないコドンは、また、必要とされます。この遺伝コードの拡張は、タンパク質内の単一の、所与の部位での非標準アミノ酸の取り込みを可能にします。ここで紹介する作品は、遺伝コードは、内因性翻訳システム内で再割り当てされ残基特異的取り込みを説明します。翻訳機械Aすなわち正準規定の場所でそれを組み込むための代理として非標準アミノ酸をccepts、タンパク質中の標準的なアミノ酸のすべてのオカレンスは、非標準1で置き換えられます。非標準アミノ酸の組み込みは、かなり変更された物理的および化学的特性を引き起こし、タンパク質の構造を変更することができます。それらは内因性タンパク質を修飾するため、非標準アミノ酸類似体は、多くの場合、 生体内のタンパク質産生を制限する、発現宿主のための細胞増殖抑制剤として作用する。タンパク質への毒性非標準アミノ酸のin vivo組込みは特に困難なままです。ここでは、非標準アミノ酸L-カナバニンによるL-アルギニンの完全な交換のための無細胞アプローチが提示されています。これは、in vivo発現の固有の困難を回避します。また、マススペクトル分析のための標的タンパク質を調製するためのプロトコルが含まれています。 L-リジン、L-ヒドロキシリジンで置き換えることができることが示されています低い効率ではあるが。原則的に、任意の非標準アミノ酸類似体であれば、内因性のインビトロ翻訳システムがそれを認識するように提示された方法を用いて組み込むことができます。

このプロトコルは、モデルタンパク質へncAAsの無細胞残基特異的取り込みを介して案内します。これは、取り込み実験及び適切なHPLC-ESI質量分光分析のためのモデルタンパク質を調製するためのさらなる工程の予備的評価のためにSDS-PAGEを提案しています。 ここでは、代表のArgアナログの無細胞残基特異的取り込みの結果することができ、同様のLysアナログL-ヒドロキシリジン（HYL）が提示されています。異なるアミノ酸溶液、エネルギーバッファは、モデルタンパク質との無細胞反応のためのベクターDNAコードは、上述のように調製されます。基準無細胞反応は、20 CAASからなるアミノ酸溶液が設けられています。各実験では、陰性対照の無細胞反応は、問題のNCAAの標準的なアナログを欠くアミノ酸溶液が供給されます。各APPRのためoachは、一つのセルの無反応がCAAは、非標準アナログにより置換されたアミノ酸溶液、の存在下でのモデルタンパク質を発現します。 Hisタグ精製、緩衝液交換およびHPLC-ESI質量分析は、上記のプロトコルに従って実行されます。 モデルタンパク質は、C末端Hisタグ付きdeGFP 32、EGFP 53の短縮版です。その一文字アミノ酸配列は、（補足資料2）に見出すことができます。このモデルタンパク質は、6 ArgおよびLysの18位が含まれ、 それぞれの発現ベクターは、pBEST-OR2-OR1-PR-UTR1-deGFP-T500です。 NCAAの完全な取り込みの場合、1は20 CAASの1が欠落しているので、ネガティブコントロール反応は、deGFPを発現しないと仮定することができます。反対に、deGFPは、他の2つの反応において検出可能でなければなりません：REFEでネイティブ1無細胞反応とNCAAが設けられている無細胞反応で修飾されたタンパク質をrence。 図1Aは、CAN取り込み実験の予備的なSDS-PAGEの評価を示します。基準無細胞反応は、最高deGFP発現レベルを有します。缶を備えている無細胞反応において、deGFPは、わずかに低い濃度で発現されます。いいえdeGFP発現は陰性対照中で検出することができません。このSDS-PAGEの結果は、標的タンパク質deGFPに缶の成功取り込みのための良好な指標です。 、deGFPに図1Bに視覚化精製されたモデルタンパク質の両方を缶の仮定の完全な組み込みを証明するために、HPLC-ESI質量分析により分析される。 図1Cは、精製deGFP分子のデコンボリューションした質量スペクトルを示します。 DEGFのデコンボリューションした質量<html>基準無細胞反応で発現されるPは26,192.8ダあります。 deGFPについて26202.5ダの質量が表示され、無細胞反応を含む缶で表現。完全に缶に置き換えられネイティブdeGFP6ArgおよびArgを有する改変deGFP6Canの予想質量はそれぞれ、26193ダおよび26204ダです。 deGFP6Can 1.5ダの質量差は、スペクトルのデコンボリューションの誤差の範囲内です。したがって、すべての6のArg位置でdeGFPに缶の完全な取り込みが確認されました。 減少強度の2つのピークは、ネイティブdeGFP6Argとその成熟した蛍光団を達成しませんでした修正deGFP6Canに対応しています。フルオロフォアは、自己触媒的酸化に続いて、H 2 O分子の脱離により生成されます。これは、このプロセスを続行しない場合は20ダ増加質量をもたらします。 PG &quot;/&gt; 無細胞発現させ、精製deGFP分子の取り込みができます実験およびHPLC-ESI質量分析の 図1. SDS-PAGE評価。（A）SDS-PAGEを使用して組み込むことができ、実験の予備的評価。左から右へ：タンパク質標準、基準の無細胞反応、陰性対照との無細胞反応缶の代わりにアルギニンの提供。 （B）Hisタグ精製後のSDS-PAGEおよび発現deGFP分子の緩衝液交換。左から右へ：タンパク質標準、基準反応から精製deGFP、反応を含む缶から精製deGFP。 （C）HPLC-ESI質量分光法による缶の完全な取り込みの確認。完全に缶に置き換えネイティブdeGFPおよびArgを有する改変deGFPの予想される質量は、それぞれ、26193ダおよび26204ダです。各スペクトルは、最も高い強度（カウント）に正規化されます。ピーク位置は、示されていますダインチ可視化のために、ゲルのレーンはゲル画像から抽出され、一緒に結合し、グレースケールフォーマットに変換され、サイズが最適化され、コントラスト並びに輝度が向上します。オリジナルゲルのレーンは、補足資料3に示されている<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig1large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図2Aは、HYLの取り込み実験の予備的なSDS-PAGEの評価を示します。 HYLが設けられている無細胞反応において、deGFPが表現されます。最初の実験とは対照的に、弱いdeGFPバンドは陰性対照反応で観察することができます。これは、無細胞反応でのLys残基が原因である可能性があります。これは、LysもHYLどちらが追加されている負の対照反応、中にかすかなdeGFP表現を可能にします。 Hの場合<html> PLC-ESI質量分析、HYLを備えた無細胞反応のdeGFP分子が精製され、バッファが（ 図2B）で交換されます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54273/54273fig2.jpg" /> HYL取り込み実験の 図2 のSDS-PAGEの評価 （A）左から右へ：HYLおよびタンパク質標準を含有する陰性対照の無細胞反応、無細胞反応。 （B）Hisタグ精製後のSDS-PAGEおよび発現deGFP分子の緩衝液交換。 HYL含む反応およびタンパク質標準から精製deGFP：左から右へ。可視化のために、ゲルのレーンはゲル画像から抽出され、一緒に結合し、グレースケールフォーマットに変換され、サイズが最適化され、コントラスト並びに輝度が向上します。オリジナルゲルのレーンは、補足資料3に示されています。F = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig2large.jpg&quot;ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図3は、精製deGFP分子のデコンボリューションした質量スペクトルを示す。 図3Aは、無細胞反応中に既に存在するLys残基の仮説を確認します。スペクトルの優勢なピークがネイティブdeGFP（：26193ダ予想質量）に対応しています。再び、それらのフルオロフォアを発症しなかった20ダより高い質量のdeGFP分子を検出することができます。リジン残基が優先的にネイティブdeGFP18Lysの高発現レベルにつながるリジルtRNAをシンテターゼによりtRNAのLysの上にロードされています。 HYL及びLys間の質量差は16ダです。原因（すべての可能なdeGFP種が生成されるのLys残基に競争の中でdeGFP18HylあるHYLの存在に、deGFP17Hly + 1Lys、...、deGFP16Hyl + 2Lys）（ 図3B）。確かに、deGFP1Hyl + 17Lysのピークは、そのフルオロフォア（ 図3A）と、いくつかのピークの質量が予想される質量から2つ以上のダを異なる点を生じなかったネイティブdeGFPのピークと重なっています。これらの質量差は、deGFP種の少量に高いノイズに起因することができます。しかし、HYLは一般的に無細胞系として援用されます。更なる改善は、無細胞反応でのLys残基を廃止するために行われなければなりません。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54273/54273fig3.jpg" /> （成熟フルオロフォア26213ダことなく、フルオロフォア26193ダと予想される質量を）HYLを含有する無細胞反応の精製deGFP分子の 図3 HPLC-ESI質量分析 （A）ネイティブdeGFP18Lysは、主に検出されます。 （B）倍率は、すべての可能なdeGFP種（deGFP18Hyl、deGFP17Hly + 1Lys、deGFP16Hyl + 2Lys、...、deGFP1Hyl + 17Lys）の存在を明らかにしています。それらの予想される質量26193ダ+ Nは、16 DA（N = 1、...、18）×ています。スペクトルは、その最高強度（カウント）に正規化されます。ピークの位置はダに示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig1.jpg" /> 補足資料1.計算テンプレート。セクション2では、エネルギーバッファマスターミックスの調製は、30μlの最適MG-それぞれ3 mMのと30mmのK-グルタミン酸濃度の粗抽出物のアリコートを用いて例示されています。この例では、3つのエネルギーバッファのアリコートをもたらすマスターミックス量をもたらします。秒でション3、無細胞反応の調製は、無細胞反応で10nmの最適なベクターDNA濃度につながる90 nmのDNAストック溶液を用いて例示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/cell-free_calculations_JoVE_11.03.2016_final.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> 粗抽出量：28μlを、最適のMg-グルタミン酸：2 mMの、最適なK-グルタミン酸：40 mMの、多数の適切なトレーサビリティのために、計算テンプレートの使用は、上記の例とは異なるこれらの典型的な値を挿入することによって例示されます100、無細胞反応における最適ベクトル濃度：8 nMで、DNAベクター原液：150 nMの必要なバッファーのアリコートの。 まず最初のテンプレート部分のオレンジ色のフィールドに粗抽出量として28μLを入力します。そして、第2のテンプレートセクションに2 mMの入力最適なMG-とオレンジフィールドにK-グルタミン酸濃度をd 40 mMの。考慮すると、最適なMG-とK-濃度、15μlのエネルギー緩衝液の組成、ならびに対応する、スケールアップ16μlのアリコートが計算されます。以下は、それに応じてエネルギーバッファアリコート（16μl）を、所望の数として100を入力します。 100 mMのMgをグルタミン酸ストック溶液の204μlの、3 M K-グルタミン酸ストック溶液の136μlを、14倍のエネルギーソリューションの728.73μlを、510μlの：テンプレートには、次のように1700μlのマスターミックスのための異なる緩衝液成分のボリュームを適応させます40％のPEG-8000および121.27μlの滅菌のddH 2 O最後に、第3テンプレートセクションで、無細胞反応は、それぞれ、ベクターDNAストック溶液濃度の最適ベクトル濃度として8 nmおよび150 nMのを入力してください。テンプレートには、90μlに調製を完成させるために粗抽出物の28μlに添加しなければならないさまざまなコンポーネントのボリュームを適応させます無細胞反応を次のようにエネルギーバッファ15μlの、3異なる合成アミノ酸溶液の1の15μlを、ベクターDNA溶液（150 nM）をの4.80μlの、および無菌のddH 2 Oの27.20μLを<img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig2.jpg" /> モデルタンパク質deGFPの補足資料2つの文字のアミノ酸配列。このモデルタンパク質は、6 Argおよび18 Lysの位置が含まれています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273supfig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig3.jpg" /> 補足資料3.全長、各個人の中で提示されたゲルの写真を提示し、図1及び2に対応する修正されていないゲルのレーンのゲルのレーン<html> ubfigureは同じSDSポリアクリルアミドゲルから抽出されます。 図1及び図2において、これらのレーンは、プレゼンテーションのために一緒に結合されました。タンパク質標準のバンドの分子量は、図の横に示されています。 （A.1） 図1Aのuncroppedのゲルのレーン。左から右へ：タンパク質標準、基準の無細胞反応、陰性対照との無細胞反応缶の代わりにアルギニンの提供。 （A.2） 図1Bのuncroppedのゲルのレーン。左から右へ：タンパク質標準、基準反応から精製deGFP、反応を含む缶から精製deGFP。 （B.1） 図2Aのuncroppedのゲルのレーン。陰性対照の無細胞反応、HYLおよびタンパク質標準を含有する無細胞反応：左から右へ。 （B.2） 図2Bのuncroppedのゲルのレーン。 HYL含む反応およびタンパク質標準から精製deGFP：左から右へ。D / 54273 / 54273supfig3large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

An easy-to-use, cell-free expression protocol for the residue-specific incorporation of noncanonical amino acid analogs into proteins, including downstream analysis, is presented for medical, pharmaceutic, structural and functional studies.

使用モデルタンパク質への非標準アミノ酸の残基特異的取り込み<em&gt;エシェリヒア・コリ</em&gt;無細胞転写翻訳システム

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes ...

residue-specific-incorporation-noncanonical-amino-acids-into-model

Research

JoVE Journal

Biology

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

15.9K ビュー.  Saarland University. An easy-to-use, cell-free expression protocol for the residue-specific incorporation of noncanonical amino acid analogs into proteins, including downstream analysis, is presented for medical, pharmaceutic, structural and functional studies.

ビデオ: Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

人間のDNA修復タンパク質の遺伝的研究は、モデルシステムとして酵母を使用

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

生物学

One-step Metabolomics: Carbohydrates, Organic and Amino Acids Quantified in a Single Procedure

Every infant born in the US is now screened for up to 42 rare genetic disorders called "inborn errors of metabolism". The screening method is based on tandem mass spectrometry and quantifies acylcarnitines as a screen for organic acidemias and also measures amino acids. All states also perform enzymatic testing for carbohydrate disorders such as galactosemia. Because the results can be non-specific, follow-up testing of positive results is required using a more definitive method. The present report describes the "urease" method of sample preparation for inborn error screening. Crystalline urease enzyme is used to remove urea from body fluids which permits most other water-soluble metabolites to be dehydrated and derivatized for gas chromatography in a single procedure. Dehydration by evaporation in a nitrogen stream is facilitated by adding acetonitrile and methylene chloride. Then, trimethylsilylation takes place in the presence of a unique catalyst, triethylammonium trifluoroacetate. Automated injection and chromatography is followed by macro-driven custom quantification of 192 metabolites and semi-quantification of every major component using specialized libraries of mass spectra of TMS derivatized biological compounds. The analysis may be performed on the widely-used Chemstation platform using the macros and libraries available from the author. In our laboratory, over 16,000 patient samples have been analyzed using the method with a diagnostic yield of about 17%--that is, 17% of the samples results reveal findings that should be acted upon by the ordering physician. Included in these are over 180 confirmed inborn errors, of which about 38% could not have been diagnosed using previous methods.

The urease method of sample preparation for GC/MS analysis of intermediary metabolites is presented by its inventor. The method allows one-step follow-up of newborn screening for inborn errors by tandem mass spectrometry by quantifying carbohydrates, organic and amino acids all in a single process.

ワンステップのメタボロミクス：炭水化物、1つの手続きが定量化された有機とアミノ酸

Every infant born in the US is now screened for up to 42 rare genetic disorders called "inborn errors of metabolism". The screening method is based on ...

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

の活性を測定するアッセイ大腸菌誘導性リジンDecarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

における真菌エンドグルカナーゼ活性のハイスループットスクリーニング大腸菌</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

Microbes have complex metabolic pathways that can be investigated using biochemistry and functional genomics methods. One important technique to examine cell central metabolism and discover new enzymes is 13C-assisted metabolism analysis 1. This technique is based on isotopic labeling, whereby microbes are fed with a 13C labeled substrates. By tracing the atom transition paths between metabolites in the biochemical network, we can determine functional pathways and discover new enzymes. 
As a complementary method to transcriptomics and proteomics, approaches for isotopomer-assisted analysis of metabolic pathways contain three major steps 2. First, we grow cells with 13C labeled substrates. In this step, the composition of the medium and the selection of labeled substrates are two key factors. To avoid measurement noises from non-labeled carbon in nutrient supplements, a minimal medium with a sole carbon source is required. Further, the choice of a labeled substrate is based on how effectively it will elucidate the pathway being analyzed. Because novel enzymes often involve different reaction stereochemistry or intermediate products, in general, singly labeled carbon substrates are more informative for detection of novel pathways than uniformly labeled ones for detection of novel pathways3, 4. Second, we analyze amino acid labeling patterns using GC-MS. Amino acids are abundant in protein and thus can be obtained from biomass hydrolysis. Amino acids can be derivatized by N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) before GC separation. TBDMS derivatized amino acids can be fragmented by MS and result in different arrays of fragments. Based on the mass to charge (m/z) ratio of fragmented and unfragmented amino acids, we can deduce the possible labeled patterns of the central metabolites that are precursors of the amino acids. Third, we trace 13C carbon transitions in the proposed pathways and, based on the isotopomer data, confirm whether these pathways are active 2. Measurement of amino acids provides isotopic labeling information about eight crucial precursor metabolites in the central metabolism. These metabolic key nodes can reflect the functions of associated central pathways.
13C-assisted metabolism analysis via proteinogenic amino acids can be widely used for functional characterization of poorly-characterized microbial metabolism1. In this protocol, we will use Cyanothece 51142 as the model strain to demonstrate the use of labeled carbon substrates for discovering new enzymatic functions.

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

13C-isotope labeling is a useful technique for determining the cell central metabolism for various types of microorganisms. After cells have been cultured with a specific labeled substrate, GC-MS measurement can reveal functional metabolic pathways based on unique labeling patterns in proteinogenic amino acids.

スルー代謝経路の確認と発見 13</supタンパク質構成アミノ酸の> C標識

Microbes have complex metabolic pathways that can be investigated using biochemistry and functional genomics methods. One important technique to examine ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング<em&gt;大腸菌</em&gt;合成遺伝子配列を用いて

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

エレクトロ作成のための迅速なプロトコル<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt;と<em&gt;コレラ菌</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

実装するためのプロトコル<em&gt;エシェリヒア·コリ</em合成生物学のための&gt;に基づくTX-TLの無細胞発現系

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

ライブの検出<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt; O157：PMA-qPCRによりH7細胞

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

からのペプチドおよびタンパク質との組換えエラスチン様ポリペプチドおよびその融合の非クロマトグラフィー精製<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...