E.G. Worst and A. Ott acknowledge financial support by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the collaborative research center SFB 1027 as well as Saarland University. E.G. Worst, A. Ott and V. Noireaux further acknowledge financial aid by the Human Frontiers Science Program Organization (HFSPO). The authors thank Tobias Baumann and Stefan Oehm (Institute of Chemistry, Technische Universit&#228;t Berlin) for critical reading.

The authors have nothing to disclose.

An-fácil de usar sistema de expressão livre de células como uma estratégia viável ao resíduo especificamente incorporar NCAAs em proteínas, é apresentado. Para este fim, o extracto em bruto é suplementado com codificação de ADN do vector para a proteína de interesse, o acumulador de energia e os aminoácidos correspondentes. Note-se que o volume da alíquota de extracto em bruto depende da concentração de proteína extracto em bruto 34. A eficiência de expressão isento de células é optimizado dependendo da concentração construção de ADN vector. Os volumes dos componentes do tampão de energia variam em função da optimizado Mg- e concentrações de K-glutamato a fim de permitir rendimentos elevados da proteína expressa modelo livre de células. Uma avaliação preliminar da experiência de incorporação pode ser obtida através da realização de SDS-PAGE do meio reaccional isento de células não purificado. Para uma análise mais detalhada, espectroscopia de massa HPLC-ESI é proposto como um meio para verificar se há incor completa, específica do resíduoporação da NCAA. Como preparação para o último, sistemas de colunas de spin são utilizados para permitir a purificação His-tag e troca de tampão com os pequenos volumes que usamos neste protocolo. Incluindo espectroscopia de massa de HPLC-ESI, todo o protocolo pode ser realizado no prazo de 2 dias. Ele não inclui quaisquer medidas particularmente críticos. No entanto, optimizações concentração de Mg e K-glutamato, bem como de um vector de ADN são cruciais, de modo a expressar altos rendimentos de proteína modelo. A utilização do vector de expressão altamente eficiente pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-gene_of_model_protein-T500 é fortemente recomendado. Eluição de marcadas com His proteínas é geralmente devido à alta concentração de imidazol (&gt; 150 mm) e outros sais, tais como NaH 2 PO 4 (&gt; 300 mm) ou NaCl (&gt; 50 mM) que geram alto ruído de fundo na análise espectroscópica de massa 49 . Intercâmbio desses buffers de eluição com um tampão de armazenamento de proteína adequado estabiliza o modelo protee reduz drasticamente o ruído de fundo durante a análise espectroscópica de massa. Como resultado, é possível substituir Arg na todas as seis posições dentro do modelo de proteína. No sistema de expressão, não há resíduos de Arg pode ser detectada. Isto simplifica a incorporação específica do resíduo de Arg análogos em comparação com outros sistemas de expressão que necessitam de novas estratégias de depleção 29,30. A abordagem livre de células apresentou contorna as limitações inerentes in vivo abordagens que são devido à toxicidade Can, ou a forte dependência da sequência de mRNA em estratégias de produção única de proteínas 24,31. Contrariamente à empregada no sistema in vitro, a clivagem in vivo de Can para homosserina e hydroxyguanidine ocorre 31. No entanto, o sistema isento de células retém uma quantidade suficiente de Lys para competir com análogos tais como Hyl. A análise de espectroscopia de massa de HPLC-ESI mostra que a proteína modelo contém ambos, a Canonical, bem como o análogo não-canônico em diferentes proporções. A incorporação específica do resíduo de Lys é possível em geral, mas por substituição completa, novas estratégias de esgotamento, ou RAA especialmente projetados e ARNt optimizado para o reconhecimento de NCAAs precisa ser desenvolvida. Obtivemos excelentes rendimentos de proteínas expressas, modelo modificados isentos de células por adição do NCAA na mesma concentração que os canónicas. A eficácia de incorporação depende da natureza do NCAA a ser incorporados. Mesmo rendimentos mais elevados ainda pode ser realizável através da optimização da concentração da NCAA. Os resultados apresentados demonstram a aplicabilidade do sistema utilizado para a incorporação específica do resíduo de NCAAs enquanto eles são aceitos pelo sistema translacional endógena canônico. Para a incorporação específica do resíduo de NCAAs específicos, mais um necessidades para verificar se os resíduos da distur CAA análogaB, o sistema de expressão. Sistemas de transcrição-tradução isentos de células podem ser manipuladas de diferentes organismos que respondem a diferentes exigências 54. O toda E. coli mecanismos de transcrição-tradução do sistema isento de células aqui apresentadas permitir a utilização do bacteriófago e E. os promotores de E. coli, e que pode actuar em paralelo ou consecutivamente nas cascatas de 55. A aplicabilidade geral e usabilidade tornar o método uma potente ferramenta para futuras pesquisas em toxicidade de aminoácidos e aplicação terapêutica.

O código genético é universal para a biosfera. Ele codifica para um conjunto de 20 aminoácidos canónicos, que às vezes é prorrogado por selenocisteína 1 ou 2 pyrrolysine. É o que se traduz ribossoma do código genético, com a ajuda de ARNt em cadeias de aminoácidos que se dobram em proteínas. Os grupos funcionais dos aminoácidos canónicos, em combinação com modificações pós-tradução, contribuem para uma gama excepcionalmente ampla de 3,4 a função da proteína. Em princípio, as limitações funcionais devido ao conjunto limitado de aminoácidos canónicos pode ser superado mediante a incorporação de mais, aminoácidos não-canónicos (NCAAs) que permitem novos produtos químicos e novas funcionalidades 3,4. Existem duas abordagens complementares para a incorporação de: a NCAAs site- ou a incorporação específica do resíduo. O primeiro método implica dificuldades técnicas consideráveis, uma vez que o conjunto de canônica de aminoacil-tRNA-synthetases (RAA) e tRNAs deve ser expandido por um par RAA-ARNt ortogonal que não deve interagir com o endógena máquinas de tradução. Com base em engenharia cuidadosa, esta abordagem incorpora os NCAAs como mutações pontuais nos locais de proteína desejada. Incorporação específica do local de NCAAs é geneticamente codificado por um codão que não é atribuído a um ácido amino canónica (CAA), normalmente um codão de terminação a 5-9. Este método implica alterações na função em um determinado site, em vez de ao longo de toda a proteína 10-13. Em contraste, a incorporação específica do resíduo baseia-se no reconhecimento erróneo do aminoácido não-canônico pela maquinaria de tradução canónica. A incorporação ocorre devido à falta de especificidade para o substrato das RAA. A incorporação específica do resíduo de NCAAs, construída sobre o trabalho de Cohen e colegas de trabalho de 14, levou a aplicações importantes 3,10, entre eles rotulagem bio-ortogonal 15-17 de proteínasou elucidação da estrutura de proteínas em cristalografia de raios X 18. Como RAA naturais geralmente preferem sua aminoácido cognato mais de uma NCAA isoestrutural, eficientes na incorporação específica do resíduo vivo geralmente requer um hospedeiro de expressão auxotrï¿½ica não é capaz de sintetizar o analógico canônica da NCAA. As células hospedeiras são cultivadas em meio de crescimento, que proporciona apenas uma baixa concentração do análogo CAA. Seu esgotamento em combinação com a suplementação consecutivo, com a NCAA força o hospedeiro de expressão para incorporar o NCAA na proteína modelo em vários locais, canonicamente prescritos. Em contraste com a abordagem de local específico, este geralmente tem um profundo impacto sobre toda a estrutura da proteína, conduzindo a modificado consideravelmente as propriedades físicas e químicas de proteínas 19,20. No entanto, a maior parte do NCAAs são inibidores do crescimento para o hospedeiro de expressão a 3, em que são incorporados em muitos outros Proteins, além daqueles de interesse durante a expressão do gene recombinante. Isto limita claramente a abordagem in vivo. A incorporação in vivo de aminoácidos que são tóxicos ou têm uma forte influência sobre a estrutura da proteína permanece um desafio especial. No entanto, estas moléculas estão entre os mais promissores para a engenharia de proteínas com funções extraordinárias. Um exemplo é o tóxico, não-canônico, que ocorrem naturalmente L-canavanina (CAN), um análogo da L-arginina (Arg). Ela afeta e blocos Arg caminhos de reação de regulação e catalíticos associados, e sua presença na célula viva pode levar a morte imediata 3,21-23. A sua incorporação em proteínas nas posições de arginina pode reduzir a estabilidade da proteína 21-23. Devido à toxicidade resultante, a expressão de proteínas contendo canavanina em Escherichia coli (E. coli) e outros hospedeiros de expressão comum continua a ser um desafio. Por estas razões, completo in vivo, incorporation de Can em todas as posições Arg foi adequadamente confirmada apenas uma vez 24, utilizando um sistema de produção de single-proteína elaborado. No entanto, pode tem sido proposta como um agente anti-cancro 25-27, e como um estimulador de doenças autoimunes em seres humanos 28. Além disso, é objecto de vários estudos sobre a sua actividade anti-metabólica, antibacteriano, antifúngico e as propriedades antivirais 25. Estas propriedades levantar uma demanda por eficiente e fácil de executar métodos para expressar Pode contendo proteínas para farmácias e estudos funcionais. Apesar de muitos problemas que estão ligados à produção in vivo pode ser contornado usando sistemas de expressão livre de células, nas abordagens específicas de resíduos in vitro só foram pouco explorados. A incorporação específica do resíduo isento de células de um análogo de L-triptofano e 29 múltiplos NCAAs 30 têm sido relatados. Estes métodos baseiam-se no altamente effictário polimerase de ARN de T7. A polimerase de ARN T7 de bacteriófago implica a transcrição semelhante, reduzindo assim a funcionalidade genético em comparação com a transcrição endógena. A incorporação específica do resíduo completo de lata em um modelo de proteína em todas as posições Arg Recentemente, foi relatado 31, utilizando um sistema de expressão isento de células 32. Uma ligeira modificação do mesmo sistema permitiu a incorporação específica do local de diferentes análogos de pirrolisina em um modelo de proteína através de codão de terminação de supressão de 33. O sistema livre de células empregadas 31-33 é baseado em um todo E. coli sistema de transcrição-tradução. No entanto, permite a expressão da proteína de forma tão eficiente como nos sistemas actuais de bacteriófagos (0,5 - 1 mg / ml de proteína recombinante) 32, enquanto retém a maior parte do original modularidade de transcrição-tradução. Neste trabalho, um protocolo detalhada é fornecida sobre a forma como o residincorporação de UE específicos de NCAAs pode ser realizado, utilizando tudo isto E. sistema livre de células coli 32. Além disso, são propostas novas medidas para preparar as proteínas expressas para avaliação adequada via espectroscopia de massa HPLC-ESI. Para expandir as propriedades deste sistema isento de células, este trabalho não se refere apenas à incorporação publicada de Can 31, mas também apresenta novos dados relacionados com a não-canônico L-lisina analógico L-hidroxi-lisina. O protocolo seguinte para a incorporação específica do resíduo de NCAAs é uma adaptação de um protocolo recentemente publicado em 34 JoVE. O último protocolo descreve como realizar a expressão isento de células altamente eficiente com aminoácidos padrão. Além disso, apresenta-se a preparação do extracto em bruto livre de células, a solução de amino ácido, a solução de reserva de energia e o tampão de energia utilizada nesta abordagem. O protocolo seguinte concentra-se em passos modificados em comparação com o anterior Protocolo, a fim de permitir a incorporação específica do resíduo de NCAAs. pipetas calibradas, dicas de ligação baixas pipetas e tubos de micro-centrífuga são recomendados para a preparação. No que se segue, as abreviaturas IUPAC para os aminoácidos são utilizados.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protective eyewear</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>Z758841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves (size S)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>Z768960</td>
			<td>Catalog numbers other sizes: Z768979 for M, Z768987 for L and Z768995 for XL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 ml (PCR clean)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>30123.328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbalance Discovery DV114CM</td>
			<td>Ohaus, Greifensee, Switzerland</td>
			<td>80104140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspatula (L 6 5/8 in., stainless steel, rod diam. 0.09 in.)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>Z243213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Canavanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>C9758</td>
			<td>Acute toxicity: wear eyeshields, dust mask, protective gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylysine (racemic mixture)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>H0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-gloves (size S, water resistent)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>Z183490</td>
			<td>Catalog numbers other sizes: Z183512 for M, Z183520 for L and Z183539 for XL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>Biotechrabbit, Hennigsdorf, Germany</td>
			<td>BR1401801</td>
			<td>For homemade preparation of amino acid stock solutions, follow this protocol35 and use the solid amino acid kit LAA21-1KT, L-proline (81709-25G), L-cysteine (30089-25G), L-histidine (53319-25G) and L-lysine (L5501-5G)&#160; (all from Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>H6147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>Affymetrix, Santa Clara, USA</td>
			<td>14121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Affymetrix, Santa Clara, USA</td>
			<td>16800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>Affymetrix, Santa Clara, USA</td>
			<td>23160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (from E. coli, pack size 100 mg)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>10109541001</td>
			<td>Catalog number for pack size of 500 mg is 10109550001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>C4282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD (from yeast )</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>N6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>A9501&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>F7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>G1149&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500</td>
			<td>Addgene, Cambridge, USA</td>
			<td>Plasmid #40019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20 % precast Tris-Glycine Gels (10 cm x 10 cm x 1 mm, 10 courses)</td>
			<td>Anamed Elektrophorese, Gro&#223;-Bieberau / Rodau, Germany</td>
			<td>TG 81610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS running buffer (10 x concentrate, 5000 ml)</td>
			<td>Anamed Elektrophorese, Gro&#223;-Bieberau / Rodau, Germany</td>
			<td>TG 50001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS loading buffer (2 x concentrate, 50 ml)</td>
			<td>Anamed Elektrophorese, Gro&#223;-Bieberau / Rodau, Germany</td>
			<td>TG 05002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unstained protein marker, broad range (2-212 kDa)</td>
			<td>New England Biolabs, Ipswich, USA</td>
			<td>P7702S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1060091011</td>
			<td>Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed: wear protective gloves and work under fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid (99.8 %)</td>
			<td>VWR International, Darmstadt, Germany</td>
			<td>20104.447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Blue G-250 (10 g)</td>
			<td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany</td>
			<td>902120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-Spin Protein Miniprep kit</td>
			<td>Zymo Research Europe, Freiburg, Germany</td>
			<td>P2002</td>
			<td>Product also distributed by Zymo Research Corporation, Irvine, USA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol, 99 %</td>
			<td>VWR International, Darmstadt, Germany</td>
			<td>24397.296DB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CentriPure Z25 mini spin columns</td>
			<td>Genaxxon bioscience, Ulm, Germany</td>
			<td>CP-0205-Z100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrator 5301</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>5301 000.210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2xYT</td>
			<td>MP biomedicals, Santa Ana, USA</td>
			<td>113012032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Agar</td>
			<td>BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead-beating tubes (polypropylene microvials)</td>
			<td>Biospec, Bartlesville, USA</td>
			<td>522S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads, 0.1mm dia.</td>
			<td>Biospec, Bartlesville, USA</td>
			<td>11079101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>71402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford BSA protein assay Kit</td>
			<td>Bio-Rad, M&#252;nchen, Germany</td>
			<td>500-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes, 1.5ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>14-955-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad, M&#252;nchen, Germany</td>
			<td>732-6204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 384-well optical bottom plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>142761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc sealing tape</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>232701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-8000</td>
			<td>Promega, Madison, USA</td>
			<td>V3011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>P8584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>P8709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer dialysis cassettes, 10k MWCO (Kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>66382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>85558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1L centrifuge bottle</td>
			<td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td>
			<td>A98813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4L Erlenmeyer flask</td>
			<td>Kimble Chase, Vineland (NJ), USA</td>
			<td>26500-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-26XP centrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td>
			<td>393127</td>
			<td>Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 1 l bottles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma 480 orbital shaker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>480</td>
			<td>Or shaker equivalent being able to shake chest-size 6 x 4 L .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JLA-8.1000 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td>
			<td>363688</td>
			<td>Or 5000 x g rotor equivalent for above centrifuge equivalent being able to centrifuge 1L-bottles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Beadbeater-1</td>
			<td>Biospec, Bartlesville, USA</td>
			<td>3110BX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge 22R refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td>
			<td>368831</td>
			<td>Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 2 ml reaction tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block HLC HBT 130</td>
			<td>Labexchange, Burladingen, Germany</td>
			<td>24465</td>
			<td>Or heating block equivalent being able to heat samples in reaction tubes up to 100 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf MiniSpin centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>5452000018</td>
			<td>Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 2 ml reaction tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKA Vortex 3 (4 mm orbital shaker diameter, 0 - 2500 rpm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>Z654760</td>
			<td>Or vortex equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotsman AF103 ice flaker machine</td>
			<td>K&#228;lte-Berlin, Berlin, Germany</td>
			<td>AF103</td>
			<td>Or ice flaker machine equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyTemp mini digital incubator</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>Z763314</td>
			<td>Or incubator equivalent being able to heat samples at 29 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoCell electrophoresis cell / chamber</td>
			<td>Anamed Elektrophorese, Gro&#223;-Bieberau / Rodau, Germany</td>
			<td>AN12005</td>
			<td>Or electrophoresis chamber equivalent being able to perform vertical gel electrophoresis with above precast gels or other used gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power-phor power supply for electrophoresis cell / chamber</td>
			<td>Anamed Elektrophorese, Gro&#223;-Bieberau / Rodau, Germany</td>
			<td>AN12001</td>
			<td>Or power supply equivalent being able to supply above used electrophoresis cell / chamber with power</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 1</td>
			<td>VWR International, Darmstadt, Germany</td>
			<td>613-5278</td>
			<td>Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 2</td>
			<td>VWR International, Darmstadt, Germany</td>
			<td>613-5279</td>
			<td>Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman Tips Diamond D10ST (0.1 - 10 &#181;l)</td>
			<td>Gilson, Middleton, USA</td>
			<td>F171101</td>
			<td>Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman Tips Diamond D200ST (2 - 200 &#181;l)</td>
			<td>Gilson, Middleton, USA</td>
			<td>F171301</td>
			<td>Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman Tips Diamond D1000ST (100 - 1000 &#181;l)</td>
			<td>Gilson, Middleton, USA</td>
			<td>F171501</td>
			<td>Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile)</td>
			<td>VWR International, Darmstadt, Germany</td>
			<td>50-0156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile)</td>
			<td>VWR International, Darmstadt, Germany</td>
			<td>525-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 ml polypropylene tubes (round bottom, two-position vent stopper, sterile)</td>
			<td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>187262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC Column (3 &#181;m particle size, L x I.D. 10 cm x 2.1 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>567227-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 HPLC machine&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies, Santa Clara, USA</td>
			<td>G1312B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6500 Series Accurate-Mass Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) LC/MS</td>
			<td>Agilent Technologies, Santa Clara, USA</td>
			<td>G6530BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>270717</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar Omega microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech, Ortenberg, Germany</td>
			<td>415-101</td>
			<td>Or microplate reader equivalent being able to measure the fluorescence of the expressed model protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanna Checker pH meter</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>Z351091&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid eluent additive for LC-MS</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>56302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

residue-specific incorporation of noncanonical amino acids into model proteins using an escherichia coli cell-free transcription-translation system

O conjunto canónico de aminoácidos leva a uma excepcionalmente ampla gama de funcionalidades proteína. No entanto, o conjunto de resíduos ainda impõe limitações sobre os pedidos de proteínas potenciais. A incorporação de aminoácidos noncanonical pode ampliar este âmbito. Existem duas abordagens complementares para a incorporação de aminoácidos não-canónicos. Para a incorporação específica do local, para além dos mecanismos endógenos de translação canónicos, um par aminoacil-ARNt-sintetase-ARNt ortogonal deve ser desde que não interage com os canónicas. Por conseguinte, um codão que não é atribuído a um aminoácido canónica, geralmente um codão de terminação, também é necessário. Esta expansão código genético permite a incorporação de um aminoácido não-canônico a uma única, dado local no interior da proteína. O trabalho aqui apresentado descreve a incorporação específica do resíduo onde o código genético é transferido dentro do sistema translacional endógeno. A maquinaria de tradução umccepts o aminoácido não-canônico como um substituto para incorporá-lo em locais canonicamente prescrita, ou seja, todas as ocorrências de um aminoácido na proteína canónica são substituídos por um não-canônico. A incorporação de aminoácidos noncanonical pode alterar a estrutura da proteína, fazendo com que as propriedades físicas e químicas consideravelmente modificadas. Análogos de aminoácidos noncanonical muitas vezes actuam como inibidores de crescimento de células de hospedeiros de expressão, uma vez que modificar proteínas endógenas, o que limita na produção de proteínas in vivo. In vivo, a incorporação de aminoácidos em proteínas tóxicas noncanonical permanece um desafio especial. Aqui, é apresentada uma abordagem isenta de células para uma completa substituição de L-arginina por o aminoácido L-canavanina não-canônico. Isso evita as dificuldades inerentes de expressão in vivo. Além disso, um protocolo para a preparação de proteínas alvo para a análise de espectro de massa está incluído. Mostra-se que a L-lisina pode ser substituída por L-hidroxi-lisina,embora com menor eficiência. Em princípio, qualquer análogo de aminoácido não-canônico podem ser incorporados utilizando o método apresentado enquanto o endógena in vitro sistema de tradução que reconhece.

Este protocolo orienta através da incorporação específica do resíduo livre de células de NCAAs em proteínas modelo. Propõe SDS-PAGE para uma avaliação preliminar do experimento constituição e novas medidas para preparar as proteínas modelo para uma análise espectroscópica de massa HPLC-ESI adequada. Aqui, os resultados representativos da incorporação específica do resíduo isento de células do análogo Arg Can, bem como o análogo de L-Lys hidroxi-lisina (Hyl) são apresentados. As soluções de aminoácidos diferentes, o acumulador de energia, o ADN que codifica para o vector de proteína modelo e reacções livres de células são preparados como descrito acima. A reacção isento de células de referência é fornecida com a solução de amino ácidos consistindo de 20 CAA. Para cada experiência, uma reacção isento de células de controlo negativo é fornecido com a solução de aminoácido que não possui o análogo canónica do NCAA em questão. Para cada aproxoach, uma reacção isento de células exprime a proteína modelo na presença da solução de aminoácidos, em que a CAA é substituído por o análogo não-canônico. His-marcador de purificação, a troca de tampão e a análise por espectrometria de massa de HPLC-ESI são executadas de acordo com o protocolo descrito acima. A proteína é o modelo do terminal C marcada com His deGFP 32, uma versão truncada da EGFP 53. A sua carta uma sequência de aminoácidos podem ser encontradas em (material suplementar 2). Esta proteína contém 6 ​​modelo Arg e Lys 18 posições, respectivamente. O vector de expressão é pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500. No caso de incorporação completa da NCAA, pode-se supor que a reacção de controlo negativo não expressa deGFP, uma vez que um dos 20 CaaS está faltando. Contrariamente, deve ser deGFP detectável nas outras duas reacções: a uma nativa na referência de reacção isento de células e a proteína modificada na reacção isento de células que é fornecido com o NCAA. A Figura 1A mostra a avaliação preliminar de SDS-PAGE da experiência de incorporação pode. A reacção isento de células de referência tem o nível de expressão mais elevado deGFP. Na reacção isento de células que é fornecido com Can, deGFP é expresso na concentração ligeiramente inferior. Nenhuma expressão deGFP pode ser detectado no controlo negativo. Este resultado SDS-PAGE é uma boa indicação para uma incorporação bem sucedida de Can no deGFP proteína alvo. Para provar a incorporação completa hipótese de lata em deGFP, ambas as proteínas purificadas modelo, visualizados na Figura 1B, são analisadas através de espectroscopia de massa HPLC-ESI. Figura 1C mostra o espectro de massa deconvoluídos das moléculas deGFP purificados. A massa deconvoluídos de degF<html> P, que é expresso na reacção isento de células de referência é 26,192.8 Da. Para deGFP expresso na lata contendo reacção livre de células de uma massa de 26202,5 ​​Da aparece. As massas esperado para o deGFP6Arg nativo eo deGFP6Can modificado com Arg ser totalmente substituída por Can são 26.193 Da e 26204 Da, respectivamente. A diferença de massa de 1,5 Da para deGFP6Can está dentro do erro de desconvolução espectro. Assim, a incorporação plena da lata em deGFP em todas as posições 6 Arg é confirmada. Os dois picos de intensidade reduzida correspondem ao deGFP6Arg nativa e deGFP6Can modificadas que não atingiram os seus fluoróforo maduro. O fluoróforo é autocataliticamente gerado por eliminação de uma molécula de H2O, seguido de oxidação. Isto leva a uma massa aumentada por 20 Da Se este processo não prossiga. pg &quot;/&gt; Figura 1. A avaliação de SDS-PAGE da experiência é possível a incorporação e espectroscopia de massa de HPLC-ESI das moléculas deGFP expressos e purificados isentos de células. (A) Avaliação Preliminar do experimento pode incorporação utilizando SDS-PAGE. Da esquerda para a direita: padrão de proteína, reação livre de células de referência, de controlo negativo e reação livre de células fornecer pode, em vez de Arg. (B) SDS-PAGE após His-tag purificação e troca de tampão das moléculas deGFP expressas. Da esquerda para a direita: padrão de proteína, deGFP purificada a partir da reação de referência, purificado deGFP a partir da reação Can contendo. (C) A confirmação da plena incorporação de Can por espectroscopia de massa HPLC-ESI. As massas esperados do deGFP nativo eo deGFP modificado com Arg totalmente substituída por Can são 26.193 Da e 26204 Da, respectivamente. Cada espectro é normalizado para a sua maior intensidade (contagem). as posições dos picos são indicadasem Da. Para efeitos de visualização, as pistas de gel são extraídos a partir das imagens do gel, unidas entre si, são convertidos em formato de escala cinzenta, tamanho é optimizada e de contraste, assim como brilho são reforçadas. Pistas de gel originais são apresentados no material suplementar 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> A Figura 2A mostra a avaliação preliminar de SDS-PAGE da experiência incorporação Hyl. Na reacção isento de células que é fornecido com Hyl, deGFP é expresso. Contrariamente ao primeiro experimento, uma banda deGFP fraco pode ser observado na reacção de controlo negativo. Isto pode ser devido à presença de resíduos Lys nas reacções isentos de células. Isso permite que uma expressão deGFP fraco na reacção de controlo negativo, onde nem Lys nem Hyl são adicionados. para H<html> Espectroscopia de massa-ESI PLC, as moléculas deGFP da reacção isento de células fornecidos com Hyl são purificadas e o tampão é trocado (Figura 2B). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54273/54273fig2.jpg" /> Figura avaliação 2. SDS-PAGE do experimento incorporação Hyl (A) Da esquerda para a direita:. Reacção livre de células de controlo negativo, a reação livre de células contendo Hyl e padrão de proteína. (B) SDS-PAGE após His-tag purificação e troca de tampão das moléculas deGFP expressas. Da esquerda para a direita: Purified deGFP do Hyl contendo reação e padrão de proteína. Para efeitos de visualização, as pistas de gel são extraídos a partir das imagens do gel, unidas entre si, são convertidos em formato de escala cinzenta, tamanho é optimizada e de contraste, assim como brilho são reforçadas. pistas de gel originais são apresentados no material suplementar 3.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. A Figura 3 mostra o espectro de massa de moléculas deconvoluídos deGFP purificadas. A Figura 3A confirma a hipótese de os resíduos de Lys já presentes nas reacções isentos de células. O pico predominante do espectro corresponde ao nativo (massa esperada: 26,193 Da) deGFP. Mais uma vez, as moléculas de um deGFP Da maior massa 20 que não desenvolvem a sua fluoróforo pode ser detectada. Os resíduos Lys são preferencialmente carregadas no ARNt Lys pela lisil-ARNt-sintetase que conduz a um nível de expressão elevado dos deGFP18Lys nativas. A diferença de massa entre Hyl e Lys é de 16 Da. Devido à presença de Hyl que está em competição com os resíduos de Lys todas as espécies deGFP possíveis são gerados (deGFP18Hyl,deGFP17Hly + 1Lys, ..., deGFP16Hyl 2Lys +) (Figura 3B). É certo que, o pico de deGFP1Hyl + 17Lys sobrepõe-se com o pico do deGFP nativo que não produzem a sua fluoróforo (Figura 3A) e a massa de alguns picos difere mais do que 2 Da da massa esperada. Estas diferenças de massa pode ser atribuída à alta ruído devido aos baixos valores da espécie deGFP. No entanto, Hyl é geralmente incorporado por o sistema isento de células. Outras melhorias têm de ser feitas para abolir resíduos Lys nas reações livre de células. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54273/54273fig3.jpg" /> . Figura 3. A HPLC-ESI espectroscopia de massa das moléculas deGFP purificadas da reacção isento de células contendo Hyl (A) Os deGFP18Lys nativas é detectada predominantemente (massas esperadas com fluoróforo: 26193 Da, sem fluoróforo madura 26213 Da). (B)Ampliação revela a existência de todas as espécies deGFP possíveis (deGFP18Hyl, deGFP17Hly + 1Lys, deGFP16Hyl + 2Lys, ..., deGFP1Hyl + 17Lys). Suas massas são esperados 26.193 Da + N x 16 Da (N = 1, ..., 18). O espectro é normalizado para a sua maior intensidade (contagem). As posições dos picos são indicadas em Da. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig1.jpg" /> Material Suplementar 1. modelo de cálculo. Na seção 2, a preparação da mistura principal tampão de energia é exemplificado utilizando alíquotas de extrato bruto de 30 ul e óptima MG- e concentrações K-glutamato de, respectivamente, 3 mm e 30 mm. Este exemplo conduz a um volume de mistura principal que produz 3 aliquotas acumulador de energia. no secção 3, a preparação da reacção livre de células é exemplificado usando uma solução de 90 estoque DNA nM levando a uma concentração de DNA vector ideal de 10 nM na reacção livre de células. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/cell-free_calculations_JoVE_11.03.2016_final.xlsx" target="_blank">Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.</a> Para obter uma rastreabilidade adequado, a utilização do modelo de cálculo é exemplificado por inserção destes valores típicos que diferem do exemplo acima: em bruto de volume de extracto: 28? L, óptima de Mg-glutamato: 2 mm, óptima K-glutamato: 40 mm, Número de alíquotas de amortecimento desejadas: 100, concentração ideal do vetor em reação livre de células: 8 nM, DNA solução de stock vector: 150 nM. Primeiro entre 28 ul como o volume de extrato bruto no campo de laranja da primeira seção do modelo. Em seguida, entrar na segunda seção do modelo 2 mM umd 40 mM como ideal Mg e concentrações de K-glutamato nos campos de laranja. Tendo em conta o óptimo Mg e K-as concentrações, a composição de um acumulador de energia 15 ul, bem como um correspondente, ampliados alíquota de 16 uL é calculado. A seguir, em conformidade entrar 100 como número desejado de alíquotas de acumulador de energia (16 ul). O molde adapta-se os volumes dos diferentes componentes do tampão para a mistura principal de 1700 uL como se segue: 204 uL de solução de estoque de 100 mM de Mg-glutamato, 136 ul de solução de reserva 3 M K-glutamato, 728.73 ul de solução de energia 14x, 510 ul de 40% de PEG-8000 e 121.27 ul estéril DDH 2 O. Finalmente, na terceira secção de molde, entre 8 nM e 150 nM de concentração óptima no vector de reacção isento de células e, respectivamente, o ADN do vector de concentração da solução. O molde adapta-se os volumes dos diferentes componentes que devem ser adicionados aos 28 ul de extracto bruto para finalizar a preparao de um 90 ulreacção isento de células como se segue: 15 uL de tampão de energia, 15 ul de uma das 3 soluções de aminoácidos compostas de maneira diferente, 4,80 ml ​​de solução de ADN do vector (150 nM), e 27.20 ul de ddH 2 O. estéril <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig2.jpg" /> Material suplementar 2. Uma carta sequência de aminoácidos da proteína modelo deGFP. Esta proteína modelo contém 6 ​​Arg e 18 posições de Lys. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273supfig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig3.jpg" /> Material suplementar 3. comprimento e pistas de gel não modificados que correspondem às imagens gel apresentou completa Figura 1 e 2. As pistas de gel apresentados em cada s individuais<html> ubfigure são extraídos a partir do mesmo gel de poliacrilamida SDS. Na Figura 1 e 2 estas pistas foram unidas para fins de apresentação. Os pesos moleculares das bandas de proteínas padrão está indicado ao lado das figuras. (A.1) pistas de gel não cortadas da figura 1A. Da esquerda para a direita: padrão de proteína, reação livre de células de referência, de controlo negativo e reação livre de células fornecer pode, em vez de Arg. (A.2) pistas de gel não cortadas da Figura 1B. Da esquerda para a direita: padrão de proteína, deGFP purificada a partir da reação de referência, purificado deGFP a partir da reação Can contendo. (B.1) pistas de gel não cortadas da Figura 2A. Da esquerda para a direita: reacção livre de células de controlo negativo, a reação livre de células contendo Hyl e padrão de proteína. (B.2) pistas de gel não cortadas da figura 2B. Da esquerda para a direita: Purified deGFP do Hyl contendo reação e padrão de proteína.d 54273 / 54273supfig3large.jpg &quot;target =&quot; / _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

An easy-to-use, cell-free expression protocol for the residue-specific incorporation of noncanonical amino acid analogs into proteins, including downstream analysis, is presented for medical, pharmaceutic, structural and functional studies.

Incorporação específico de resíduos de não-canônicos Aminoácidos em proteínas modelo Usando um<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Sistema de transcrição-tradução livre-Cell

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes ...

residue-specific-incorporation-noncanonical-amino-acids-into-model

Research

JoVE Journal

Biology

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

15.9K visualizações.  Saarland University. An easy-to-use, cell-free expression protocol for the residue-specific incorporation of noncanonical amino acid analogs into proteins, including downstream analysis, is presented for medical, pharmaceutic, structural and functional studies.

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Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

Estudos genéticos de proteínas de reparo do DNA Humano Utilizando Levedura como um sistema modelo

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Biologia

One-step Metabolomics: Carbohydrates, Organic and Amino Acids Quantified in a Single Procedure

Every infant born in the US is now screened for up to 42 rare genetic disorders called "inborn errors of metabolism". The screening method is based on tandem mass spectrometry and quantifies acylcarnitines as a screen for organic acidemias and also measures amino acids. All states also perform enzymatic testing for carbohydrate disorders such as galactosemia. Because the results can be non-specific, follow-up testing of positive results is required using a more definitive method. The present report describes the "urease" method of sample preparation for inborn error screening. Crystalline urease enzyme is used to remove urea from body fluids which permits most other water-soluble metabolites to be dehydrated and derivatized for gas chromatography in a single procedure. Dehydration by evaporation in a nitrogen stream is facilitated by adding acetonitrile and methylene chloride. Then, trimethylsilylation takes place in the presence of a unique catalyst, triethylammonium trifluoroacetate. Automated injection and chromatography is followed by macro-driven custom quantification of 192 metabolites and semi-quantification of every major component using specialized libraries of mass spectra of TMS derivatized biological compounds. The analysis may be performed on the widely-used Chemstation platform using the macros and libraries available from the author. In our laboratory, over 16,000 patient samples have been analyzed using the method with a diagnostic yield of about 17%--that is, 17% of the samples results reveal findings that should be acted upon by the ordering physician. Included in these are over 180 confirmed inborn errors, of which about 38% could not have been diagnosed using previous methods.

The urease method of sample preparation for GC/MS analysis of intermediary metabolites is presented by its inventor. The method allows one-step follow-up of newborn screening for inborn errors by tandem mass spectrometry by quantifying carbohydrates, organic and amino acids all in a single process.

Um passo-metabolômica: carboidratos, ácidos orgânicos e aminoácidos quantificados em um procedimento único

Every infant born in the US is now screened for up to 42 rare genetic disorders called "inborn errors of metabolism". The screening method is based on ...

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Um ensaio para medir a atividade do Escherichia coli Induzível Lisina Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

High Throughput Screening da atividade endoglucanase de fungos em Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

Microbes have complex metabolic pathways that can be investigated using biochemistry and functional genomics methods. One important technique to examine cell central metabolism and discover new enzymes is 13C-assisted metabolism analysis 1. This technique is based on isotopic labeling, whereby microbes are fed with a 13C labeled substrates. By tracing the atom transition paths between metabolites in the biochemical network, we can determine functional pathways and discover new enzymes. 
As a complementary method to transcriptomics and proteomics, approaches for isotopomer-assisted analysis of metabolic pathways contain three major steps 2. First, we grow cells with 13C labeled substrates. In this step, the composition of the medium and the selection of labeled substrates are two key factors. To avoid measurement noises from non-labeled carbon in nutrient supplements, a minimal medium with a sole carbon source is required. Further, the choice of a labeled substrate is based on how effectively it will elucidate the pathway being analyzed. Because novel enzymes often involve different reaction stereochemistry or intermediate products, in general, singly labeled carbon substrates are more informative for detection of novel pathways than uniformly labeled ones for detection of novel pathways3, 4. Second, we analyze amino acid labeling patterns using GC-MS. Amino acids are abundant in protein and thus can be obtained from biomass hydrolysis. Amino acids can be derivatized by N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) before GC separation. TBDMS derivatized amino acids can be fragmented by MS and result in different arrays of fragments. Based on the mass to charge (m/z) ratio of fragmented and unfragmented amino acids, we can deduce the possible labeled patterns of the central metabolites that are precursors of the amino acids. Third, we trace 13C carbon transitions in the proposed pathways and, based on the isotopomer data, confirm whether these pathways are active 2. Measurement of amino acids provides isotopic labeling information about eight crucial precursor metabolites in the central metabolism. These metabolic key nodes can reflect the functions of associated central pathways.
13C-assisted metabolism analysis via proteinogenic amino acids can be widely used for functional characterization of poorly-characterized microbial metabolism1. In this protocol, we will use Cyanothece 51142 as the model strain to demonstrate the use of labeled carbon substrates for discovering new enzymatic functions.

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

13C-isotope labeling is a useful technique for determining the cell central metabolism for various types of microorganisms. After cells have been cultured with a specific labeled substrate, GC-MS measurement can reveal functional metabolic pathways based on unique labeling patterns in proteinogenic amino acids.

Confirmação via metabólica e descoberta através 13 C-rotulagem de proteinogénicos Aminoácidos

Microbes have complex metabolic pathways that can be investigated using biochemistry and functional genomics methods. One important technique to examine ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Mapeamento bacterianas redes funcionais e vias<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Usando sintéticos matrizes genéticas

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

Protocolo Rápido para Preparação de electrocompetentes<em&gt; Escherichia coli</em&gt; E<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

Protocolos para implementação de uma<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Com base TX-TL Expression System-Free Cell para Biologia Sintética

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

Detecção de Vivo<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 Células por PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

A purificação cromatográfica do não-polipéptidos recombinantes Elastina semelhantes e suas fusões com Peptídeos e Proteínas de<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Incorporação específico de resíduos de não-canônicos Aminoácidos em proteínas modelo Usando um

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Estudos genéticos de proteínas de reparo do DNA Humano Utilizando Levedura como um sistema modelo

Um passo-metabolômica: carboidratos, ácidos orgânicos e aminoácidos quantificados em um procedimento único

Um ensaio para medir a atividade do Escherichia coli Induzível Lisina Decarboxyase

High Throughput Screening da atividade endoglucanase de fungos em Escherichia coli

Confirmação via metabólica e descoberta através¹³ C-rotulagem de proteinogénicos Aminoácidos

Mapeamento bacterianas redes funcionais e vias

Protocolo Rápido para Preparação de electrocompetentes

Protocolos para implementação de uma

Detecção de Vivo

A purificação cromatográfica do não-polipéptidos recombinantes Elastina semelhantes e suas fusões com Peptídeos e Proteínas de