E.G. Worst and A. Ott acknowledge financial support by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the collaborative research center SFB 1027 as well as Saarland University. E.G. Worst, A. Ott and V. Noireaux further acknowledge financial aid by the Human Frontiers Science Program Organization (HFSPO). The authors thank Tobias Baumann and Stefan Oehm (Institute of Chemistry, Technische Universit&#228;t Berlin) for critical reading.

The authors have nothing to disclose.

An-einfach zu zellfreien Expressionssystem als eine tragfähige Strategie verwenden, um Rest-spezifisch NCAAs in Proteine ​​einzubauen, wird präsentiert. Zu diesem Zweck wird der Rohextrakt mit Vektor-DNA, die für das interessierende Protein ergänzt, den Energiepuffer und den entsprechenden Aminosäuren. Beachten Sie, dass Volumen des aliquoten Teils auf dem Rohextrakt Proteinkonzentration 34 Rohextrakt abhängt. Der zellfreie Expressionseffizienz in Abhängigkeit von der Konzentration-Vektor-DNA Konstruktion optimiert. Die Volumina der Energiepufferkomponenten variieren als Funktion der optimierten Mg- und K-Glutamat-Konzentrationen, um hohe Ausbeuten an zellfreien ausgedrückt Modellprotein zu ermöglichen. Eine vorläufige Auswertung des Einbaus Experiment kann durch Durchführen der SDS-PAGE des gereinigten zellfreien Reaktionsmedium erhalten werden. Für eine detailliertere Analyse, HPLC-ESI-Massenspektroskopie wird als ein Mittel vorgeschlagen, für eine vollständige, rückstandsspezifischen incor zu überprüfenFungs der NCAA. Als Vorbereitung für die letzteren sind spin column Systemen verwendet His-tag Reinigung und Pufferaustausch mit den kleinen Volumina, die in diesem Protokoll verwenden, zu ermöglichen. Einschließlich HPLC-ESI-Massenspektroskopie kann das gesamte Protokoll innerhalb von 2 Tagen durchgeführt werden. Es enthält keine besonders kritischen Schritte. Allerdings Konzentration Optimierungen von Mg- und K-Glutamat sowie von Vektor-DNA sind von entscheidender Bedeutung, um hohe Ausbeuten des Modellproteins zu exprimieren. Die Verwendung des hocheffizienten Expressionsvektor pBEST-OR2-Or1-Pr-UTR1-gene_of_model_protein-T500 wird dringend empfohlen. Elution von His-markierten Proteinen ist in der Regel wegen der hohen Konzentration an Imidazol (&gt; 150 mM) und andere Salze wie NaH 2 PO 4 (&gt; 300 mm) oder NaCl (&gt; 50 mm) , die hohe Hintergrundrauschanalyse in massenspektroskopische erzeugen 49 . Austausch solcher Elutionspuffer mit einem geeigneten Protein-Speicherpuffer stabilisiert das Modell Protein und drastisch reduziert Hintergrundgeräusche während der massenspektroskopischen Analyse. Als Ergebnis kann Arg innerhalb des Modellproteins an allen sechs Positionen ersetzt. In dem Expressionssystem, können keine Arg Rückstände festgestellt werden. Dies vereinfacht die rückstandsspezifischen Einbau Arg - Analoga im Vergleich zu anderen Expressionssystemen , die weitere Abreicherung Strategien 29,30 erfordern. Die präsentierten zellfreien Ansatz umgeht die inhärenten Einschränkungen von in - vivo - Ansätze , die zu Can Toxizität zurückzuführen sind, oder die starke Abhängigkeit von mRNA - Sequenz in einzelne Proteinproduktionsstrategien 24,31. Im Gegensatz, in vivo Spaltung kann , um die in - vitro - System verwendet , um Homoserin und Hydroxyguanidin 31 auftritt. Jedoch behält das zellfreie System eine ausreichende Menge an Lys mit Analoga wie Hyl zu konkurrieren. Die HPLC-ESI-Massenspektroskopie-Analyse zeigt, dass das Modell Protein enthält sowohl die canonical sowie die nicht-kanonischen analog in unterschiedlichen Anteilen. Der Rückstand spezifischen Einbau von Lys ist möglich, in der Regel aber für eine vollständige Substitution, weitere Abreicherung Strategien oder speziell entwickelten aaRS und tRNA für die Anerkennung von NCAAs optimiert müssen entwickelt werden. Wir erzielten ausgezeichnete Ausbeuten von zellfreien ausgedrückt, modifizierte Modell Proteine, die durch die NCAA in der gleichen Konzentration wie die kanonische hinzufügen. Die Einbaueffizienz hängt von der Art des ncaa aufzunehmen. Noch höhere Ausbeuten durch die Optimierung der Konzentration des NCAA könnte noch realisierbar sein. Die vorgestellten Ergebnisse zeigen die Anwendbarkeit des verwendeten Systems für die rückstandsspezifischen Einbau NCAAs solange sie durch die kanonische endogene Translationssystem akzeptiert werden. Für den Rest spezifischen Einbau von spezifischen NCAAs, einen weiteren Bedarf zu prüfen, ob die Rückstände des analogen CAA Stöb des Expressionssystems. Die zellfreien Transkriptions-Translationssysteme können aus verschiedenen Organismen gentechnisch verändert werden 54 unterschiedliche Anforderungen reagieren zu können . Die alle E. coli Transkriptions-Translations - Maschinerien der hier vorgestellten zellfreies System ermöglichen die Verwendung von Bakteriophagen und E. coli - Promotoren, und sie können 55 parallel oder nacheinander in Kaskaden handeln. Die allgemeine Anwendbarkeit und Benutzerfreundlichkeit machen das Verfahren ein wirksames Instrument für die weitere Forschung in der Aminosäure-Toxizität und therapeutische Anwendung.

Der genetische Code ist in die Biosphäre universal. Es kodiert für einen Satz von 20 kanonischen Aminosäuren, die manchmal durch selenocysteine ​​1 oder Pyrrolysin 2 verlängert wird. Es ist das Ribosom, das mit Hilfe von tRNAs in Ketten von Aminosäuren, die in Proteine ​​falten den genetischen Code übersetzt. Die funktionellen Gruppen der kanonischen Aminosäuren in Kombination mit posttranslationalen Modifikationen beitragen, zu einem außergewöhnlich breites Spektrum von Proteinfunktion 3,4. Grundsätzlich funktionellen Einschränkungen aufgrund der begrenzten Anzahl von kanonischen Aminosäuren können durch den Einbau von weiteren, nicht - kanonischen Aminosäuren (NCAAs) , die ermöglichen , neue chemische Zusammensetzungen und neue Funktionalitäten 3,4 überwunden werden. Es gibt zwei sich ergänzende Ansätze für die Einbeziehung von NCAAs: die orts- oder der Rest spezifischen Einbau. Die erste Methode ist mit erheblichen technischen Schwierigkeiten, da die kanonische Satz von Aminoacyl-tRNA-Synthesizeretases (aaRS) und tRNAs müssen durch eine orthogonale aaRS-tRNA-Paar erweitert werden, die nicht mit dem endogenen Translationsmaschinerie interagieren müssen. Basierend auf einer sorgfältigen Engineering, beinhaltet dieser Ansatz die NCAAs als einzelne Punktmutationen an den gewünschten Proteinstellen. Ortsspezifischen Einbau von NCAAs genetisch durch ein Codon codiert wird, die nicht auf eine kanonische Aminosäure (CAA) zugeordnet ist, in der Regel einem Stopcodon 5-9. Dieses Verfahren beinhaltet Änderungen in Funktion an einer bestimmten Stelle , anstatt über das gesamte Protein 10-13. Im Gegensatz dazu Rückstand spezifischen Einbau stützt sich auf eine fehlerhafte Erkennung der nicht-kanonische Aminosäure durch die kanonische Translationsmaschinerie. Die Einarbeitung erfolgt aufgrund des Fehlens der Substratspezifität der aaRS. Der Rückstand spezifischen Einbau von NCAAs, auf der Arbeit von Cohen gebaut und Mitarbeiter 14, hat zu wichtigen Anwendungen geführt 3,10, darunter bioorthogonalen Kennzeichnung 15-17 von Proteinenoder Strukturaufklärung von Proteinen in der Röntgenkristallographie 18. Als natürliche aaRS im Allgemeinen ihre verwandten Aminosäure über eine isostruktureller NCAA, effizient in vivo Rückstand spezifischen Einbau bevorzugen erfordert in der Regel einen auxotrophen Expressionswirt nicht in der Lage die kanonische Analogon der NCAA zu synthetisieren. Die Wirtszellen werden in Wachstumsmedium kultiviert, die nur eine geringe Konzentration des analogen CAA liefert. Seine Erschöpfung in Kombination mit der laufenden Ergänzung mit der NCAA zwingt den Expressionswirt der NCAA in das Modellprotein an mehreren, kanonisch vorgeschriebenen Websites zu integrieren. Im Gegensatz zu den standortspezifischen Ansatz, dies hat in der Regel einen großen Einfluss auf die gesamte Proteinstruktur, was zu einer physikalischen und chemischen Eigenschaften von Proteinen 19,20 erheblich modifiziert. Allerdings sind die meisten der NCAAs sind Wachstumsinhibitoren für den Expressionswirt 3, wie sie in vielen anderen prot eingebaut sindeins neben denen von Interesse während der rekombinanten Genexpression. Dies zeigt deutlich begrenzt die in - vivo - Ansatz. Die in - vivo - Einbau von Aminosäuren, die toxisch sind oder starken Einfluss auf die Proteinstruktur bleibt besonders anspruchsvoll . Allerdings sind diese Moleküle zu den vielversprechendsten Proteine ​​mit außergewöhnlichen Funktionen zu konstruieren. Ein Beispiel ist die toxische, nicht-kanonische, natürlich vorkommenden L-Canavanin (Can), einem Analogon von L-Arginin (Arg). Es wirkt sich und blockiert Arg assoziierte regulatorische und katalytische Reaktionswege, und seine Präsenz in der lebenden Zelle kann zum sofortigen Tod 3,21-23 führen. Sein Einbau in Proteine ​​an Arginin Positionen kann die Proteinstabilität 21-23 reduzieren. Aufgrund der resultierenden Toxizität Expression von Canavanin Proteine ​​in Escherichia coli (E. coli) und andere übliche Expressionswirte enthält bleibt eine Herausforderung. Aus diesen Gründen vollständig in vivo incorporation von Can an allen Arg Positionen hat in geeigneter Weise nur einmal 24, unter Verwendung eines erarbeiteten Einzelproteinproduktionssystem bestätigt. Jedoch wurde als Antikrebsmittel 25-27 und als Stimulator für Autoimmunerkrankungen bei Menschen 28 vorgeschlagen. Darüber hinaus ist es Gegenstand verschiedener Studien über seine anti-metabolischen, antibakterielle, antimykotische und antivirale Eigenschaften 25. Diese Eigenschaften erhöhen die Nachfrage nach effizienten und einfach zu führen Methoden zum Ausdruck bringen können Proteine ​​für pharmazeutische, medizinische und funktionelle Studien enthalten. Obwohl viele Probleme , die zellfreie Expression in vivo - Produktion verbunden sind , unter Verwendung von Systemen umgangen werden kann, wurden in vitro Rückstand spezifische Ansätze nur bisher schlecht erforscht. Der zellfreie rückstandsspezifischen Einbau eines L-Tryptophan Analog 29 und mehrere NCAAs 30 berichtet. Diese Verfahren basieren auf der hoch efficient T7 RNA-Polymerase. Die T7-RNA-Polymerase beinhaltet bakteriophagenspezifischer wie Transkription, wodurch genetische Funktionalität im Vergleich zu endogenen Transkription reduzieren. Der komplette Rest spezifischen Einbau in ein Modellprotein in allen Arg Positionen wurde vor kurzem 31 berichtet, 32 eine zellfreie Expressionssystem. Eine leichte Modifikation des gleichen Systems ortsspezifischen Einbau verschiedener Pyrrolysin Analoga in ein Modell Protein über Stop - Codon Unterdrückung 33 aktiviert. Die verwendete zellfreies System 31-33 basiert auf einer ganzen E. coli Transkriptions-Translations - System. Dennoch ermöglicht es die Proteinexpression so effizient wie in gegenwärtigen Systemen Bakteriophagen (0,5-1 mg / ml von rekombinantem Protein) 32, während ein Großteil der Original - Transkriptions-Translations - Modularität beibehalten wird . In dieser Arbeit wird ein detailliertes Protokoll zur Verfügung gestellt, wie die residue spezifischen Einbau von NCAAs realisiert werden, indem diese alle E. coli zellfreien System 32. Darüber hinaus weitere Schritte, um die exprimierten Proteine ​​für entsprechende Auswertung mittels HPLC-ESI-Massenspektroskopie vorgeschlagen vorzubereiten. Um die Eigenschaften dieser zellfreien System zu erweitern, geht diese Arbeit nicht nur beziehen sich auf die veröffentlichten Einbau von 31 , sondern auch neue Daten im Zusammenhang mit der nicht - kanonischen L-Lysinanalogon L-Hydroxy-Lysin. Das folgende Protokoll für die rückstandsspezifischen Einbau NCAAs ist eine Anpassung eines Protokolls kürzlich in JoVE 34 veröffentlicht. Letzteres Protokoll beschreibt, wie hocheffiziente zellfreien Expression mit Standard-Aminosäuren durchzuführen. Außerdem stellt es die Herstellung des rohen zellfreien Extrakt, die Aminosäurelösung, die Energie-Stammlösung und der Energiepuffer in diesem Ansatz verwendet. Das folgende Protokoll konzentriert sich auf die veränderten Schritte im Vergleich zum vorherigen protokoll, um den Rückstand spezifischen Einbau von NCAAs zu ermöglichen. Kalibrierte Pipetten, schwach bindende Pipettenspitzen und Mikrozentrifugenröhrchen werden zur Herstellung empfohlen. Im Folgenden IUPAC-Abkürzungen für die Aminosäuren verwendet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protective eyewear</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>Z758841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves (size S)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>Z768960</td>
			<td>Catalog numbers other sizes: Z768979 for M, Z768987 for L and Z768995 for XL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 ml (PCR clean)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>30123.328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbalance Discovery DV114CM</td>
			<td>Ohaus, Greifensee, Switzerland</td>
			<td>80104140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspatula (L 6 5/8 in., stainless steel, rod diam. 0.09 in.)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>Z243213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Canavanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>C9758</td>
			<td>Acute toxicity: wear eyeshields, dust mask, protective gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylysine (racemic mixture)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>H0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-gloves (size S, water resistent)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>Z183490</td>
			<td>Catalog numbers other sizes: Z183512 for M, Z183520 for L and Z183539 for XL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>Biotechrabbit, Hennigsdorf, Germany</td>
			<td>BR1401801</td>
			<td>For homemade preparation of amino acid stock solutions, follow this protocol35 and use the solid amino acid kit LAA21-1KT, L-proline (81709-25G), L-cysteine (30089-25G), L-histidine (53319-25G) and L-lysine (L5501-5G)&#160; (all from Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>H6147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>Affymetrix, Santa Clara, USA</td>
			<td>14121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Affymetrix, Santa Clara, USA</td>
			<td>16800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>Affymetrix, Santa Clara, USA</td>
			<td>23160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (from E. coli, pack size 100 mg)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>10109541001</td>
			<td>Catalog number for pack size of 500 mg is 10109550001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>C4282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD (from yeast )</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>N6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>A9501&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>F7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>G1149&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500</td>
			<td>Addgene, Cambridge, USA</td>
			<td>Plasmid #40019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20 % precast Tris-Glycine Gels (10 cm x 10 cm x 1 mm, 10 courses)</td>
			<td>Anamed Elektrophorese, Gro&#223;-Bieberau / Rodau, Germany</td>
			<td>TG 81610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS running buffer (10 x concentrate, 5000 ml)</td>
			<td>Anamed Elektrophorese, Gro&#223;-Bieberau / Rodau, Germany</td>
			<td>TG 50001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS loading buffer (2 x concentrate, 50 ml)</td>
			<td>Anamed Elektrophorese, Gro&#223;-Bieberau / Rodau, Germany</td>
			<td>TG 05002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unstained protein marker, broad range (2-212 kDa)</td>
			<td>New England Biolabs, Ipswich, USA</td>
			<td>P7702S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1060091011</td>
			<td>Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed: wear protective gloves and work under fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid (99.8 %)</td>
			<td>VWR International, Darmstadt, Germany</td>
			<td>20104.447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Blue G-250 (10 g)</td>
			<td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany</td>
			<td>902120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-Spin Protein Miniprep kit</td>
			<td>Zymo Research Europe, Freiburg, Germany</td>
			<td>P2002</td>
			<td>Product also distributed by Zymo Research Corporation, Irvine, USA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol, 99 %</td>
			<td>VWR International, Darmstadt, Germany</td>
			<td>24397.296DB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CentriPure Z25 mini spin columns</td>
			<td>Genaxxon bioscience, Ulm, Germany</td>
			<td>CP-0205-Z100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrator 5301</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>5301 000.210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2xYT</td>
			<td>MP biomedicals, Santa Ana, USA</td>
			<td>113012032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Agar</td>
			<td>BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead-beating tubes (polypropylene microvials)</td>
			<td>Biospec, Bartlesville, USA</td>
			<td>522S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads, 0.1mm dia.</td>
			<td>Biospec, Bartlesville, USA</td>
			<td>11079101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>71402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford BSA protein assay Kit</td>
			<td>Bio-Rad, M&#252;nchen, Germany</td>
			<td>500-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes, 1.5ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>14-955-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad, M&#252;nchen, Germany</td>
			<td>732-6204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 384-well optical bottom plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>142761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc sealing tape</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>232701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-8000</td>
			<td>Promega, Madison, USA</td>
			<td>V3011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>P8584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>P8709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer dialysis cassettes, 10k MWCO (Kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>66382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>85558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1L centrifuge bottle</td>
			<td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td>
			<td>A98813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4L Erlenmeyer flask</td>
			<td>Kimble Chase, Vineland (NJ), USA</td>
			<td>26500-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-26XP centrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td>
			<td>393127</td>
			<td>Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 1 l bottles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma 480 orbital shaker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>480</td>
			<td>Or shaker equivalent being able to shake chest-size 6 x 4 L .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JLA-8.1000 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td>
			<td>363688</td>
			<td>Or 5000 x g rotor equivalent for above centrifuge equivalent being able to centrifuge 1L-bottles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Beadbeater-1</td>
			<td>Biospec, Bartlesville, USA</td>
			<td>3110BX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge 22R refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td>
			<td>368831</td>
			<td>Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 2 ml reaction tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block HLC HBT 130</td>
			<td>Labexchange, Burladingen, Germany</td>
			<td>24465</td>
			<td>Or heating block equivalent being able to heat samples in reaction tubes up to 100 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf MiniSpin centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>5452000018</td>
			<td>Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 2 ml reaction tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKA Vortex 3 (4 mm orbital shaker diameter, 0 - 2500 rpm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>Z654760</td>
			<td>Or vortex equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotsman AF103 ice flaker machine</td>
			<td>K&#228;lte-Berlin, Berlin, Germany</td>
			<td>AF103</td>
			<td>Or ice flaker machine equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyTemp mini digital incubator</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>Z763314</td>
			<td>Or incubator equivalent being able to heat samples at 29 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoCell electrophoresis cell / chamber</td>
			<td>Anamed Elektrophorese, Gro&#223;-Bieberau / Rodau, Germany</td>
			<td>AN12005</td>
			<td>Or electrophoresis chamber equivalent being able to perform vertical gel electrophoresis with above precast gels or other used gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power-phor power supply for electrophoresis cell / chamber</td>
			<td>Anamed Elektrophorese, Gro&#223;-Bieberau / Rodau, Germany</td>
			<td>AN12001</td>
			<td>Or power supply equivalent being able to supply above used electrophoresis cell / chamber with power</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 1</td>
			<td>VWR International, Darmstadt, Germany</td>
			<td>613-5278</td>
			<td>Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 2</td>
			<td>VWR International, Darmstadt, Germany</td>
			<td>613-5279</td>
			<td>Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman Tips Diamond D10ST (0.1 - 10 &#181;l)</td>
			<td>Gilson, Middleton, USA</td>
			<td>F171101</td>
			<td>Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman Tips Diamond D200ST (2 - 200 &#181;l)</td>
			<td>Gilson, Middleton, USA</td>
			<td>F171301</td>
			<td>Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman Tips Diamond D1000ST (100 - 1000 &#181;l)</td>
			<td>Gilson, Middleton, USA</td>
			<td>F171501</td>
			<td>Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile)</td>
			<td>VWR International, Darmstadt, Germany</td>
			<td>50-0156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile)</td>
			<td>VWR International, Darmstadt, Germany</td>
			<td>525-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 ml polypropylene tubes (round bottom, two-position vent stopper, sterile)</td>
			<td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>187262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC Column (3 &#181;m particle size, L x I.D. 10 cm x 2.1 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>567227-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 HPLC machine&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies, Santa Clara, USA</td>
			<td>G1312B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6500 Series Accurate-Mass Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) LC/MS</td>
			<td>Agilent Technologies, Santa Clara, USA</td>
			<td>G6530BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>270717</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar Omega microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech, Ortenberg, Germany</td>
			<td>415-101</td>
			<td>Or microplate reader equivalent being able to measure the fluorescence of the expressed model protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanna Checker pH meter</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>Z351091&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid eluent additive for LC-MS</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>56302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

residue-specific incorporation of noncanonical amino acids into model proteins using an escherichia coli cell-free transcription-translation system

Die kanonische Satz von Aminosäuren führt zu einer außergewöhnlich breites Spektrum von Protein-Funktionalität. Dennoch legt die Menge der Rückstände immer noch Beschränkungen auf mögliche Protein-Anwendungen. Der Einbau von nicht-kanonischen Aminosäuren können diesen Bereich vergrößern. Es gibt zwei sich ergänzende Ansätze für die Einbeziehung von nicht-kanonischen Aminosäuren. Für ortsspezifischen Einbau, zusätzlich zu den endogenen kanonische translationale Maschinen, eine orthogonale Aminoacyl-tRNA-Synthetase-tRNA-Paar muss zur Verfügung gestellt werden, die nicht mit den kanonischen in Wechselwirkung tritt. Folglich, die ein Codon nicht auf eine kanonische Aminosäure zugeordnet ist, in der Regel einem Stopcodon, ist ebenfalls erforderlich. Diese Erweiterung des genetischen Codes ermöglicht die Inkorporation eines nicht-kanonische Aminosäure an einer einzigen, gegebenen Stelle innerhalb des Proteins. Die hier vorgestellten Arbeit beschreibt Rückstand spezifischen Einbau, wo der genetische Code innerhalb des endogenen Translationssystem neu zugewiesen wird. Die Translationsmaschinerie einccepts die nicht - kanonische Aminosäure als Surrogat es kanonisch vorgeschriebenen Stellen zu übernehmen, dh alle Vorkommen einer kanonischen Aminosäure in dem Protein werden durch die nicht - kanonische ersetzt. Der Einbau von nicht-kanonischen Aminosäuren können die Proteinstruktur verändern, was zu erheblich veränderten physikalischen und chemischen Eigenschaften. Nichtkanonische Aminosäureanaloga wirken oft als Zellwachstumshemmer für Wirte Ausdruck , da sie endogene Proteine ​​zu modifizieren, in vivo Proteinproduktion zu begrenzen. In - vivo - Einbau von toxischen nichtkanonischer Aminosäuren in Proteine ​​besonders herausfordernd bleibt. Hier wird ein zellfreier Ansatz für einen vollständigen Ersatz von L-Arginin durch die nicht-kanonische Aminosäure L-Canavanin dargestellt. Es umgeht die inhärenten Schwierigkeiten der in - vivo - Expression. Darüber hinaus wird ein Protokoll Zielproteine ​​für die Massenspektralanalyse herzustellen ist im Preis enthalten. Es wird, dass L-Lysin dargestellt durch L-hydroxy-Lysin ersetzt sein können,wenn auch mit geringerer Effizienz. Im Prinzip kann jedes nicht - kanonische Aminosäure analog solange eingearbeitet werden , um die vorgestellte Methode unter Verwendung als das endogene in vitro - Translationssystem erkennt.

Dieses Protokoll führt durch die zellfreien Rückstand spezifischen Einbau von NCAAs in Modellproteine. Er schlägt vor, SDS-PAGE für eine vorläufige Bewertung des Einbaus Experiment und weitere Schritte, um die Modellproteine ​​für eine geeignete HPLC-ESI-Massenspektroskopie-Analyse vorzubereiten. Hier sind repräsentative Ergebnisse der zellfreien Rückstand spezifischen Einbau des Arg Analogon kann, sowie die Lys analoge L-Hydroxy-Lysin (Hyl) vorgestellt. Die verschiedenen Aminosäurelösungen, die Energiepuffer, der Vektor DNA kodierend für das Modellprotein und zellfreien Reaktionen werden wie oben beschrieben hergestellt. Der Referenzzellfreie Reaktion wird mit der Aminosäurelösung zur Verfügung gestellt, bestehend aus den 20 Caas. Für jedes Experiment wird eine negative Kontrolle zellfreie Reaktion mit der Aminosäurelösung zugeführt, die die kanonischen Analogon der ncaa in Frage fehlt. Für jede ca.oach, einer zellfreien Reaktions drückt das Modellprotein in Gegenwart der Aminosäure-Lösung, bei der CAA durch die nicht-kanonische analog substituiert ist. His-tag Reinigung, Pufferaustausch und HPLC-ESI massenspektrometrische Analyse werden entsprechend ausgeführt zu dem oben beschriebenen Protokoll. Das Modell - Protein ist das C-terminale deGFP 32 His-tagged, eine verkürzte Version von EGFP 53. Seine eine Buchstaben-Aminosäuresequenz kann in (Supplemental Material 2) gefunden werden. Dieses Modell Protein enthält 6 Arg und Lys 18 - Positionen, respectively. Der Expressionsvektor ist pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500. Im Falle der vollständigen Einbeziehung der NCAA, kann man davon ausgehen, dass die negative Kontrollreaktion drückt nicht deGFP, da einer der 20 CaaS fehlt. die native eine in der Refe: Im Gegensatz, in den beiden anderen Reaktionen nachweisbar sein deGFP müssenrenz zellfreie Reaktion und das modifizierte Protein in dem zellfreien Reaktion, die mit der NCAA vorgesehen ist. Figur 1A zeigt die vorläufige SDS-PAGE Auswertung des Can Inkorporation experiment. Die Referenzzellfreie Reaktion hat die höchste deGFP Expressionsniveau. In dem zellfreien Reaktion, die mit vorgesehen ist, wird deGFP bei etwas niedrigeren Konzentration ausgedrückt. Kein deGFP Expression kann in der negativen Kontrolle nachgewiesen werden. Dieses SDS-PAGE Ergebnis ist ein guter Indikator für eine erfolgreiche Integration von Can in das Zielprotein deGFP. Um die Hypothese aufgestellt , die völlige Eingliederung von Can in deGFP sowohl gereinigte Modellproteinen, visualisiert in 1B beweisen, werden durch HPLC-ESI - Massenspektroskopie analysiert. 1C zeigt die entfalteten Massenspektren der gereinigten deGFP Molekülen. Die entfalteten Masse von DEGF<html> P, die in der Referenzzelle freien Reaktions ausgedrückt ist 26,192.8 Da. Für deGFP ausgedrückt in der Dose enthalten, zellfreie Reaktion eine Masse von 26202,5 ​​Da erscheint. Die erwarteten Massen für den nativen deGFP6Arg und dem modifizierten deGFP6Can mit Arg vollständig von Can sind 26.193 Da und 26.204 Da bzw. ersetzt werden. Die Massendifferenz von 1,5 Da für deGFP6Can ist innerhalb der Fehler des Spektrums Entfaltungs. Somit ist die vollständige Einbeziehung von Can in deGFP bei allen 6 Arg Positionen bestätigt. Die beiden Spitzen der reduzierten Intensität entsprechen dem nativen deGFP6Arg und modifizierte deGFP6Can, die nicht ihre reifen Fluorophor erreichen. Der Fluorophor ist autokatalytisch durch Abspaltung eines H 2 O - Molekül erzeugt wird , gefolgt von einer Oxidation. Dies führt zu einer Masse von 20 Da erhöht, wenn dieser Prozess nicht abläuft. pg &quot;/&gt; Abbildung 1. SDS-PAGE Auswertung des Experiments Einarbeitung kann und HPLC-ESI - Massenspektroskopie der zellfreien exprimiert und gereinigt deGFP Molekülen. (A) Vorläufige Bewertung des Can SDS-PAGE Einverleibung Experiment verwendet wird . Von links nach rechts: Protein-Standard, Referenz zellfreie Reaktion, negative Kontrolle und zellfreie Reaktion Bereitstellung anstelle von Arg Can. (B) SDS-PAGE nach His-Tag Reinigung und Pufferaustausch der exprimierten deGFP Molekülen. Von links nach rechts: Protein-Standard, gereinigt deGFP aus der Referenzreaktion gereinigt deGFP aus der Dose enthält Reaktion. (C) Bestätigung der vollständigen Einbeziehung kann durch HPLC-ESI - Massenspektroskopie. Die erwarteten Massen des nativen deGFP und dem modifizierten deGFP mit Arg vollständig durch Can ersetzt sind 26.193 Da und 26.204 Da auf. Jedes Spektrum wird normiert auf die höchste Intensität (counts). Spitzenpositionen werden angezeigtin Da. Für die Visualisierung werden die Gel-Bahnen aus dem Gel Bilder extrahiert, miteinander verbunden sind, werden in Grauskala-Format umgewandelt wird Größe optimiert und Kontrast sowie Helligkeit verbessert werden. Original - Gel Fahrspuren in ergänzendes Material präsentiert 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 2A zeigt die vorläufige SDS-PAGE Auswertung des Hyl Inkorporation experiment. In dem zellfreien Reaktion, die mit Hyl vorgesehen ist, wird deGFP ausgedrückt. Im Gegensatz zu dem ersten Experiment wurde eine schwache deGFP Band kann in der negativen Kontrollreaktion zu beobachten. Dies könnte zu Lys-Reste in den zellfreien Reaktionen beruhen. Dies ermöglicht einen leichten deGFP Expression in der negativen Kontrollreaktion, wo weder noch Lys Hyl zugegeben. Für H<html> PLC-ESI - Massenspektroskopie, die deGFP Moleküle der zellfreien Reaktion bereitgestellt mit Hyl werden gereinigt und der Puffer ausgetauscht wird (2B). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54273/54273fig2.jpg" /> Abbildung 2. SDS-PAGE Auswertung des Hyl Einverleibung Experiment (A) Von links nach rechts:. Negative Kontrolle zellfreie Reaktion, zellfreie Reaktion , die Hyl und Proteinstandard. (B) SDS-PAGE nach His-Tag Reinigung und Pufferaustausch der exprimierten deGFP Molekülen. Von links nach rechts: Gereinigte deGFP aus der Hyl enthaltenden Reaktions und Proteinstandard. Für die Visualisierung werden die Gel-Bahnen aus dem Gel Bilder extrahiert, miteinander verbunden sind, werden in Grauskala-Format umgewandelt wird Größe optimiert und Kontrast sowie Helligkeit verbessert werden. Original-Gel Fahrspuren in ergänzendes Material 3 dargestellt.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Figur 3 zeigt den entfalteten Massenspektrum von gereinigtem deGFP Molekülen. 3A die Hypothese bereits Lys - Reste in den zellfreien Reaktionen bestätigt. Die vorherrschende Spitze des Spektrums entspricht der nativen deGFP (erwartete Masse: 26.193 Da). deGFP Moleküle einer 20 Da höhere Masse, die nicht ihre Fluorophor entwickeln kann wieder erkannt werden. Die Lys - Reste werden bevorzugt auf die tRNA Lys geladen durch Lysyl-tRNA-Synthetase zu einem hohen Expressionsniveau der einheimischen deGFP18Lys führt. Die Massendifferenz zwischen Hyl und Lys 16 Da. Aufgrund des Vorhandenseins von Hyl, die an die Lys-Reste alle möglichen deGFP Spezies erzeugt werden, in Konkurrenz (deGFP18Hyl,deGFP17Hly + 1Lys, ..., deGFP16Hyl + 2Lys) (3B). Zugegeben, überlappt die Spitze des deGFP1Hyl + 17Lys mit der Spitze des nativen deGFP, die nicht seine Fluorophore (3A) und die Masse von einigen Spitzen erzeugen unterscheidet sich mehr als 2 Da von der erwarteten Masse. Diese Massendifferenzen können aufgrund der geringen Mengen der deGFP Spezies zu hohen Lärm zurückzuführen. Jedoch wird Hyl allgemein durch das zellfreie System eingebaut. Weitere Verbesserungen haben getan werden Lys-Reste in den zellfreien Reaktionen abzuschaffen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54273/54273fig3.jpg" /> . Abbildung 3. HPLC-ESI - Massenspektroskopie der gereinigten deGFP Moleküle der zellfreien Reaktion , die Hyl (A) Die nativen deGFP18Lys wird überwiegend nachgewiesen (erwartete Massen: mit Fluorophor 26.193 Da, ohne reife Fluorophor 26.213 Da). (B)Vergrößerung offenbart die Existenz aller möglichen deGFP Arten (deGFP18Hyl, deGFP17Hly + 1Lys, deGFP16Hyl + 2Lys, ..., deGFP1Hyl + 17Lys). Ihre erwarteten Massen sind 26.193 Da + N x 16 Da (N = 1, ..., 18). Das Spektrum wird normiert auf die höchste Intensität (counts). Spitzenpositionen in Da angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig1.jpg" /> Ergänzendes Material 1. Berechnung Vorlage. In Abschnitt 2 wird die Vorbereitung des Master - Mix Energiepuffer wird mit Rohextrakt Aliquots von 30 &amp; mgr; l beispielhaft und optimale Mg- und K-Glutamat - Konzentrationen von jeweils 3 mm und 30 mm. Dieses Beispiel führt zu einem Master-Mix Volumen, das 3 Energiepuffer Aliquots ergibt. in section 3 wird die Herstellung der zellfreien Reaktion beispielhaft auf einen optimalen Vektor - DNA - Konzentration von 10 nM in der zellfreien Reaktion eine 90 nM DNA - Stammlösung führt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/cell-free_calculations_JoVE_11.03.2016_final.xlsx" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/cell-free_calculations_JoVE_11.03.2016_final.xlsx" target="_blank">diese Datei herunterzuladen.</a> Für eine geeignete Rückverfolgbarkeit, die Verwendung der Berechnungsvorlage wird durch Einsetzen dieser typischen Werte veranschaulicht, die von dem obigen Beispiel abweichen: Rohextrakt Volumen: 28 &amp; mgr; l, optimal Mg-glutamat: 2 mM, optimaler K-Glutamat: 40 mm, Anzahl der gewünschten Puffer Aliquots: 100, optimale Vektor-Konzentration in zellfreien Reaktion: 8 nM, DNA-Vektor-Stammlösung: 150 nM. Zunächst 28 &amp; mgr; l als Rohextrakt Volumen in den orangefarbenen Bereich des ersten Abschnitts Vorlage eingeben. Geben Sie dann in die zweite Schablonenabschnitt 2 mM eined 40 mM als optimal Mg- und K-Glutamat-Konzentrationen in den orangefarbenen Feldern. Unter Berücksichtigung der optimalen Mg- und K-Konzentrationen, die Zusammensetzung einer 15 ul Energiepuffer, sowie eine entsprechende, vergrößert 16 &amp; mgr; l-Aliquot wird berechnet. Unten geben Sie entsprechend 100 als gewünschte Anzahl von Energiepuffer Aliquots (16 ul). Die Vorlage passt die Volumina der verschiedenen Pufferkomponenten für die 1.700 &amp; mgr; l Master-Mix, wie folgt: 204 ul 100 mM Mg-glutamat-Stammlösung, 136 ul 3 M K-Glutamat-Stammlösung, 728,73 &amp; mgr; l 14x Energielösung, 510 ul von 40% PEG-8000 und 121,27 ul steriles ddH 2 O. Schließlich wird in der dritten Schablonenabschnitt, geben Sie 8 nM und 150 nM als optimale Vektor-Konzentration in der zellfreien Reaktion und jeweils Vektor-DNA-Stammlösung Konzentration. Die Vorlage passt die Mengen der verschiedenen Komponenten, die zu den 28 &amp; mgr; l Rohextrakt zugegeben werden müssen, die Herstellung einer 90 &amp; mgr; l zu finalisierenzellfreie Reaktion wie folgt: 15 ul Energiepuffer, 15 ul einer der drei unterschiedlich zusammengesetzte Lösungen Aminosäure, 4,80 ul Vektor - DNA - Lösung (150 nM) und 27,20 &amp; mgr; l sterilem ddH 2 O. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig2.jpg" /> Ergänzendes Material 2. Ein - Buchstaben - Aminosäuresequenz des Modellproteins deGFP. Dieses Modell Protein enthält 6 Arg und 18 Lys Positionen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273supfig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273supfig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig3.jpg" /> Ergänzendes Material 3. In voller Länge und nicht modifizierten Gelspuren , die in jedem einzelnen s präsentiert die Gelt Bilder präsentiert Abbildung 1 und 2. Die Gelspuren entsprechen<html> ubfigure aus demselben SDS-Polyacrylamidgel extrahiert. In Abbildung 1 und 2 dieser Bahnen wurden zusammen für Präsentationszwecke verbunden. Molekulargewichte der Proteinstandard Bänder neben den Figuren angedeutet. (A.1) Unkupierte Gelspuren von 1A. Von links nach rechts: Protein-Standard, Referenz zellfreie Reaktion, negative Kontrolle und zellfreie Reaktion Bereitstellung anstelle von Arg Can. (A.2) Unkupierte Gelspuren von 1B. Von links nach rechts: Protein-Standard, gereinigt deGFP aus der Referenzreaktion gereinigt deGFP aus der Dose enthält Reaktion. (B.1) Unkupierte Gelspuren von 2A. Von links nach rechts: Negative Kontrolle zellfreie Reaktion, zellfreie Reaktion, die Hyl und Proteinstandard. (B.2) Unkupierte Gelspuren von 2B. Von links nach rechts: Gereinigte deGFP aus der Hyl enthaltenden Reaktions und Proteinstandard.d / 54273 / 54273supfig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

An easy-to-use, cell-free expression protocol for the residue-specific incorporation of noncanonical amino acid analogs into proteins, including downstream analysis, is presented for medical, pharmaceutic, structural and functional studies.

Rückstands spezifische Einbau nichtkanonischer Aminosäuren in Modellproteine ​​eine Verwendung<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Zellfreie Transkription-Translation-System

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes ...

residue-specific-incorporation-noncanonical-amino-acids-into-model

Research

JoVE Journal

Biology

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

15.9K Aufrufe.  Saarland University. An easy-to-use, cell-free expression protocol for the residue-specific incorporation of noncanonical amino acid analogs into proteins, including downstream analysis, is presented for medical, pharmaceutic, structural and functional studies.

Serie: Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

Genetic Studies of Human DNA-Reparatur-Proteinen unter Verwendung von Hefe als Modellsystem

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Forschung

Biologie

One-step Metabolomics: Carbohydrates, Organic and Amino Acids Quantified in a Single Procedure

Every infant born in the US is now screened for up to 42 rare genetic disorders called "inborn errors of metabolism". The screening method is based on tandem mass spectrometry and quantifies acylcarnitines as a screen for organic acidemias and also measures amino acids. All states also perform enzymatic testing for carbohydrate disorders such as galactosemia. Because the results can be non-specific, follow-up testing of positive results is required using a more definitive method. The present report describes the "urease" method of sample preparation for inborn error screening. Crystalline urease enzyme is used to remove urea from body fluids which permits most other water-soluble metabolites to be dehydrated and derivatized for gas chromatography in a single procedure. Dehydration by evaporation in a nitrogen stream is facilitated by adding acetonitrile and methylene chloride. Then, trimethylsilylation takes place in the presence of a unique catalyst, triethylammonium trifluoroacetate. Automated injection and chromatography is followed by macro-driven custom quantification of 192 metabolites and semi-quantification of every major component using specialized libraries of mass spectra of TMS derivatized biological compounds. The analysis may be performed on the widely-used Chemstation platform using the macros and libraries available from the author. In our laboratory, over 16,000 patient samples have been analyzed using the method with a diagnostic yield of about 17%--that is, 17% of the samples results reveal findings that should be acted upon by the ordering physician. Included in these are over 180 confirmed inborn errors, of which about 38% could not have been diagnosed using previous methods.

The urease method of sample preparation for GC/MS analysis of intermediary metabolites is presented by its inventor. The method allows one-step follow-up of newborn screening for inborn errors by tandem mass spectrometry by quantifying carbohydrates, organic and amino acids all in a single process.

Ein-Schritt-Metabolomics: Kohlenhydrate, organische und Aminosäuren in einem einzigen Verfahren Quantifizierte

Every infant born in the US is now screened for up to 42 rare genetic disorders called "inborn errors of metabolism". The screening method is based on ...

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Ein Assay zur Messung der Aktivität von Escherichia coli Inducible Lysin Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

High Throughput Screening von Fungal Endoglucanaseaktivität in Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

Microbes have complex metabolic pathways that can be investigated using biochemistry and functional genomics methods. One important technique to examine cell central metabolism and discover new enzymes is 13C-assisted metabolism analysis 1. This technique is based on isotopic labeling, whereby microbes are fed with a 13C labeled substrates. By tracing the atom transition paths between metabolites in the biochemical network, we can determine functional pathways and discover new enzymes. 
As a complementary method to transcriptomics and proteomics, approaches for isotopomer-assisted analysis of metabolic pathways contain three major steps 2. First, we grow cells with 13C labeled substrates. In this step, the composition of the medium and the selection of labeled substrates are two key factors. To avoid measurement noises from non-labeled carbon in nutrient supplements, a minimal medium with a sole carbon source is required. Further, the choice of a labeled substrate is based on how effectively it will elucidate the pathway being analyzed. Because novel enzymes often involve different reaction stereochemistry or intermediate products, in general, singly labeled carbon substrates are more informative for detection of novel pathways than uniformly labeled ones for detection of novel pathways3, 4. Second, we analyze amino acid labeling patterns using GC-MS. Amino acids are abundant in protein and thus can be obtained from biomass hydrolysis. Amino acids can be derivatized by N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) before GC separation. TBDMS derivatized amino acids can be fragmented by MS and result in different arrays of fragments. Based on the mass to charge (m/z) ratio of fragmented and unfragmented amino acids, we can deduce the possible labeled patterns of the central metabolites that are precursors of the amino acids. Third, we trace 13C carbon transitions in the proposed pathways and, based on the isotopomer data, confirm whether these pathways are active 2. Measurement of amino acids provides isotopic labeling information about eight crucial precursor metabolites in the central metabolism. These metabolic key nodes can reflect the functions of associated central pathways.
13C-assisted metabolism analysis via proteinogenic amino acids can be widely used for functional characterization of poorly-characterized microbial metabolism1. In this protocol, we will use Cyanothece 51142 as the model strain to demonstrate the use of labeled carbon substrates for discovering new enzymatic functions.

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

13C-isotope labeling is a useful technique for determining the cell central metabolism for various types of microorganisms. After cells have been cultured with a specific labeled substrate, GC-MS measurement can reveal functional metabolic pathways based on unique labeling patterns in proteinogenic amino acids.

Stoffwechselweg der Firmung und der Entdeckung durch 13 C-Kennzeichnung von proteinogenen Aminosäuren

Microbes have complex metabolic pathways that can be investigated using biochemistry and functional genomics methods. One important technique to examine ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Mapping Bakterielle Functional Netzwerke und Pathways in<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Verwendung von Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

Rapid-Protokoll für die Herstellung von Elektrokompetente<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Und<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

Protokolle für die Implementierung einer<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Basierend TX-TL Zellfreie Expression System für Synthetische Biologie

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

Erkennung von Live-<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7-Zellen durch PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

Nicht-chromatographischen Reinigung von rekombinantem Elastin-ähnliche Polypeptide und deren Fusionen mit Peptiden und Proteinen aus<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Rückstands spezifische Einbau nichtkanonischer Aminosäuren in Modellproteine ​​eine Verwendung

Rückstands spezifische Einbau nichtkanonischer Aminosäuren in Modellproteine eine Verwendung