Name: imaging cleared embryonic and postnatal hearts at single-cell resolution
Uploaded: 2016-10-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution at JoVE.com

We thank M.W. laboratory members for scientific discussion. This work is supported by AHA [13SDG16920099] to M.W., and by National Heart, Lung, and Blood Institute grants [R01HL121700] to M.W. Images were captured in the Imaging Core Facility at the Albany Medical College.

Tüm hayvan deneyleri Bakımı NIH Kılavuzu&#39;na ve Laboratuvar Hayvanları Kullanımı göre Albany Medical College Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve gerçekleştirilmiştir. 1. solüsyon preparasyonlarda NOT: Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Konfeti 16, αMHC-Cre 17 ve Rosa26-mTmG (mTmG) 20 fare hatları ticari satın alındı cTnT-Cre 18 Alabama Üniversitesi&#39;nden Dr. Jiao bir hediye oldu Nfatc1-Cre.. Tıp 19 Albert Einstein College of Dr. Bin Zhou bir hediye oldu. Fareler bilateral torakotomi kesilerek ya da servikal bozma ile ölüm doğrulama fiziksel yollarla ve ardından en az 60 saniye boyunca kapalı bir odada, karbon dioksit inhalasyonu ile ötenazi uygulandı. <ol><li> Tamoksifen hazırlayın. ayçiçeği oi, 10 ml Tamoksifen 10 mg çözülürl. -20 ° C de tamamen çözüldükten sonra, kısım ve mağaza. </li><li> Fosfat tamponlu tuz (PBS) hazırlayın. Na 2 HPO 4 (1,41960 g), KH 2 PO 4 (0,24496 g), NaCl (8,0669 g) ve damıtılmış su, 1 L KCl (0,20129 g) çözülür ve pH 7.4 ayarlanır. </li><li> PBST hazırlanması:% 0.1 Tween-20 çözeltisi PBS içinde PBS, 100 ml Tween-20, 100 ul çözülmesiyle. </li><li> tampon engelleme hazırlayın. % 0.2 Tween-20 içeren PBST 100 ml BSA, 3 g çözülmesiyle% 3 sığır serum albümini (BSA) Bloklama çözeltisi, sağlayın. </li><li> CUBIC-1 (reaktif 1) hazırlayın. Ağırlıkça% 25 üre, ağırlıkça% 25 N, N, N &#39;, N&#39;-tetrakis (2-hidroksipropil) etilendiamin 15 ağırlık% Karışım dH 2 O Triton X-100 </li><li> CUBIC-2 (reaktif 2) hazırlayın. Ağırlıkça% 50 sakaroz, ağırlık olarak% 25 üre, ağırlıkça% 10 oranında 2, 2 &#39;, 2&#39; &#39;karıştırın - nitrilotriethanol ve% 0.1 (v / v) dH 2 O Triton X-100 </li><li> Sca Le A2 hazırlanması: 4 M üre,% 10 w / v gliserol ve / Triton V X-10,% 0.1DH 2 O. 0 7.7 pH ayarlayın. </li><li> Sca le B4 hazırlayın: 8 M üre ve / Triton v X-100 w% 0.1 dH 2 O. 8.7 pH ayarlayın. </li><li> Hazırlama Sca Le 70: 4 M üre,% 70 ağırlık / hacim gliserol ve DH 2 O. / Triton v X-100% 0.1 </li></ol> 2. Tamoksifen İndüksiyon, Embriyo İzolasyon ve Fiksasyon <ol><li> Tamoksifen İndüksiyon ve Embriyo İzolasyonu <ol><li> Embriyonik gelişim günde E7.75 33. Tamoksifen 10 ug / g (R26Cre ERT2 erkek fareler tarafından takılı) kavisli bir beslenme tüpü onaylanan protokole (ACUP 13-12007), sonda kadın R26Cre ERT2 Confetti fareler kullanma. Embriyonik gün 9.5 (E9.5) veya E10.5 anda, CO 2 ve servikal dislokasyon ile dişi farelerin euthanize. </li><li> Fare ölüm doğrulanmasının ardından, makasla fare karın boşluğu açın ve uterin boynuz teşrih (Bölüm 1 Not bakınız) makas ve cımbız ve yeniden yardımıyla rahim tüp katmanlarını kaldırmakrahim tüp 23,24 embriyolar kira. <ol><li> PBS (pH 7.4) ihtiva eden bir petri embriyolar aktarın. Diseksiyon mikroskobu altında, cımbız yardımı ile embriyonik olmayan katmanları (koryon, yolk kesesi ve amniyon) çıkarın. </li></ol></li><li> Daha önce 22 bildirildiği gibi cımbız ve makas kullanarak, genotipleme için dişi fare ve embriyo kuyruk örnekleri toplamak. Bir pipet kullanarak, 1x PBS 1 ml içeren 48 çukurlu bir levhanın bir kuyucuğuna, her embriyo transferi. </li><li> Bir floresan mikroskop altında, bir kamera ile bir inverted mikroskop aracılığıyla GFP / RFP / CFP pozitif embriyolar tespit. uzakta Peel cımbız kullanarak perikard ve GFP / RFP / OBP filtreleri ile kalbin her iki tarafında floresan klonların sayısını belirlemek için kavisli cımbız yardımı ile kalp / embriyo döndürün. Hiçbir kesikler ihtiyaç vardır. </li></ol></li><li> GFP / RFP / CFP pozitif embriyolar belirledikten sonra, hızlı bir şekilde th 1x PBS ile iki kez (2 dk her biri) embriyolar yıkayınE 48, oda sıcaklığında (RT), bir plaka karıştırıcısı üzerinde iyi plaka. Bu aşırı kan kaldıracaktır. </li><li> Oda sıcaklığında% 4 paraformaldehid (PFA) kullanılarak embriyo / embriyonik kalbini düzelt. sabitleme süresi embriyonik yaş ve doku büyüklüğüne bağlıdır. E9.5 oda sıcaklığında 2 st için embriyo düzeltin. Geç embriyonik evre embriyolar bile doğum sonrası kalp için 24 saat için uzatılabilir uzun fiksasyon süresi gerektirir. UYARI: Paraformaldehyde toksik, deri, göz ve mukoza zarı ile temasından kaçının. </li><li> Tespit edildikten sonra, oda sıcaklığında, bir plaka karıştırıcısı üzerinde iki kez 48 çukurlu plaka içinde 1x PBS (10 dk) embriyo / kalp yıkayın. Bu embriyo / kalp aşırı PFA kaldırır. Embriyolar daha sonra tüm montaj boyama ve doku temizlenmesi için işlenir. </li></ol> 3. Tüm Dağı Boyama NOT: aşağıdaki gibi PFA Tespit edildikten sonra embriyo / kalp tüm montaj boyama tabi tutulur. <ol><li> 1 m kullanarak bir 48 iyi plaka embriyo / kalbi permeabilizeOda sıcaklığında plaka karıştırıcısı üzerinde 2 saat boyunca% 0.1 PBST l. </li><li> geçirgenliği sonra, 4 ° C&#39;de bir plaka karıştırıcısı üzerinde 2 saat veya gece boyunca bloke tamponu 1 ml embriyo / kalp bırakın. </li><li> 4 ° C&#39;de plaka karıştırıcısı üzerinde 48 saat süre ile blokaj tamponu 0.3 ml (100 1) ile seyreltildi, endotelyal hücreye özgü antikor PECAM (CD31), embriyo / kalp bırakın. </li><li> plaka karıştırıcısı üzerinde oda sıcaklığında PBST 5 kez, 30 dakika her kullanılarak embriyo / kalbi yıkayın. Bu dokudan fazla spesifik olmayan bağlanmış primer antikor kaldırır. </li><li> 4 ° C&#39;de plaka karıştırıcısı üzerinde 48 saat süre ile blokaj tamponu 1 ml (1.000 1) ile seyreltildi ve Alexa Fluor 647 keçi anti-fare ikincil antikoru embriyo / kalp, bırakın. </li><li> Adımı yineleyin 3.4 ikincil antikor yıkayın. </li><li> plaka karıştırıcısı üzerinde oda sıcaklığında 1 saat süreyle% 4 PFA ile embriyo / kalp sonrası düzeltmek ve PBS her biri 5 dakika iki kez yıkayın. </li><li> Bir konsantrasyonlarda ise PBST içinde seyreltilmiş Nükleer soya 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (embriyo / kalp LekeOda sıcaklığında plaka karıştırıcısı üzerinde 10 dakika boyunca, 0.01 mg / mL) oranı. Her biri 5 dakika iki PBS yıkama ile takip edin. </li></ol> 4. Embriyo / Sca l e veya KÜBİK Yöntemi ile kalp Takas NOT: Bütün montaj boyamadan sonra, embriyo / kalp Sca le veya KÜBİK doku takas yöntemiyle ya tabi tutulur. Metodun seçimi dokunun büyüklüğüne ve embriyonik yaşına bağlıdır. E11.5 veya daha önceki yaş embriyolar, kullanım Sca l e doku temizleme yöntemi için eski embriyolar ya da doğum sonrası kalpler için KÜBİK doku temizleme yöntemi tercih edilir. <ol><li> Ölçek Doku Takas Yöntemi <ol><li> Yumuşak bir arada 4 ° C&#39;de 48 saat süre ile (elle) çalkalanarak (alüminyum folyo ile sarılmış) bir sintilasyon şişesine Sca l e A2 çözeltisinin 1 ml&#39;si ile embriyo / kalp inkübe edin. </li><li> Sca l e A2 inkübasyondan sonra, ara sıra nazik bir anot çalkalanarak aynı şişe içinde, 4 ° C&#39;de Sca l e B4 çözeltisi 1 mL embriyo / kalp inkübeOnu 48 saat. </li><li> Zaman zaman hafifçe çalkalanarak 4 ^ &#39;de, 1 ml Sca l e 70 sahip bir 48 saat daha embriyo / kalp inkübe edin. % 90 gliserol kullanılarak Dağı embriyo (bakınız bölüm 5.1). </li></ol></li><li> KÜBİK Doku Takas Yöntemi <ol><li> Bütün embriyo / kalp KÜBİK takas için, nazik arada 37 ºC 7&#39;de 48 saat boyunca çalkalanarak CUBIC-1 1 ml her embriyo / kalbi batırmayın. 48 saat sonra, taze, KÜP indikatör 1 aynı hacimde çözelti yerine ve zaman zaman elle çalkalanarak 37 ° C&#39;de ek bir 48 saat boyunca örnek inkübe edin. </li><li> yumuşak el ile çalkalayarak oda sıcaklığında 1 x PBS ile birkaç kez kübik 1 ile tedavi, kalp / embriyo yıkayın. Bu aşırı CUBIC-1 çözümü kaldırır. </li><li> PBS ile CUBIC-1 yıkanmasından sonra, zaman zaman nazik eliyle çalkalanarak 37 ºC&#39;de 48 saat süreyle CUBIC-2 çözeltisi (embriyo / kalp başına 1 gr) embriyolar / kalpleri batırmayın. Bu gliserol kullanarak montaj embriyo / kalbi izler (bakınız Bölüm 5.2). </li></ol></li></ol> 5. Numune Montaj ve Görüntüleme NOT: Sca l e 70 ya da CUBIC-2 çözeltisi içinde temizlenir embriyolar veya organlar sırasıyla görüntüleme aracı olarak Ölçeği 70 ve CUBIC-2 çözeltisi ile doğrudan görüntülenebilir. Numuneler aşağıda protokol izlenerek% 90 gliserol örnekleri saklamak, hemen görüntülü, ancak uzun vadeli saklanabilir değilse Ancak, takas reaktif embriyonik örneklerin açığı göz önüne alındığında. <ol><li> Doğrudan Sca Le görüntüleme kadar 4 ° C &#39;de% 90 gliserol ve deposunun 1 ml örneği temizlenir bırakın. </li><li> Iki kez 1 x PBS ile her biri 5 dakika KÜP muamele edilmiş numune yıkanır ve sırasıyla 30 dakika için% 30,% 50,% 70 ve% 90 gliserol çözeltisi, her biri 1 ml örnek inkübe edin. </li><li> Görüntüleme için, iki foton yetenekleri ile donatılmış bir konfokal mikroskop ile% 90 gliserol ve görüntü klonlarının bir az miktarda cam alt Petri kabı örnek aktarmak. </li><li> Görüntü kalp ya da embriyo 10X / 0.3 NA ile gliserol, bir 25X / 0.8 NA daldırma veya 40X / 1.2 NA su düzeltici objektif lens. Görüntü DAPI tutarlı bir titanyumdan 2-foton uyarma kullanarak: safir bukalemun lazer. Mikroskop ve objektif lens seçimi süper çözünürlük için örneğin deneyler, amacına bağlı olacaktır, hafif bir tabaka floresan mikroskop yararlanılabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Vincent, S. D., Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+heart:+the+origin+and+regulation+of+cardiac+progenitor+cells.">How to make a heart: the origin and regulation of cardiac progenitor cells.</a> Curr Top Dev Biol. 90, 1-41 (2010).</li><li>Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+discoveries+in+cardiac+biology.">A decade of discoveries in cardiac biology.</a> Nat Med. 10, 467-474 (2004).</li><li>Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+networks+in+the+evolution+and+development+of+the+heart.">Gene regulatory networks in the evolution and development of the heart.</a> Science. 313, 1922-1927 (2006).</li><li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+genetics+of+congenital+heart+disease.">The developmental genetics of congenital heart disease.</a> Nature. 451, 943-948 (2008).</li><li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embedding+embryos+for+high-resolution+episcopic+microscopy+(HREM).">Embedding embryos for high-resolution episcopic microscopy (HREM).</a> Cold Spring Harb Protoc. , 678-680 (2012).</li><li>Soufan, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+gene+expression+patterns+during+cardiac+development.">Three-dimensional reconstruction of gene expression patterns during cardiac development.</a> Physiol Genomics. 13, 187-195 (2003).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li><li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains.">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PLoS One. 7, e33916 (2012).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158, 945-958 (2014).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+noninvasive+genetic/pharmacologic+strategy+for+visualizing+cell+morphology+and+clonal+relationships+in+the+mouse.">A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse.</a> J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li><li>Agah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+recombination+in+postmitotic+cells.+Targeted+expression+of+Cre+recombinase+provokes+cardiac-restricted,+site-specific+rearrangement+in+adult+ventricular+muscle+in+vivo.">Gene recombination in postmitotic cells. Targeted expression of Cre recombinase provokes cardiac-restricted, site-specific rearrangement in adult ventricular muscle in vivo.</a> J Clin Invest. 100, 169-179 (1997).</li><li>Jiao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+of+Bmp4+in+the+atrioventricular+septation+of+the+mouse+heart.">An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart.</a> Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling.">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151, 1083-1096 (2012).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+spindle+orientation+controls+cell+entry+into+the+myocardium.">Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium.</a> Dev Cell. 19, 114-125 (2010).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numb+family+proteins+are+essential+for+cardiac+morphogenesis+and+progenitor+differentiation.">Numb family proteins are essential for cardiac morphogenesis and progenitor differentiation.</a> Development. 141, 281-295 (2014).</li><li>Kaufman, M. H., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The atlas of mouse development. , (1992).</li><li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , (2003).</li><li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells.">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).</li><li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anterior+heart-forming+field:+voyage+to+the+arterial+pole+of+the+heart.">The anterior heart-forming field: voyage to the arterial pole of the heart.</a> Trends Genet. 18, 210-216 (2002).</li><li>Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+right+ventricle,+outflow+tract,+and+ventricular+septum+comprise+a+restricted+expression+domain+within+the+secondary/anterior+heart+field.">The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field.</a> Dev Biol. 287, 134-145 (2005).</li><li>Ward, C., Stadt, H., Hutson, M., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+the+secondary+heart+field+leads+to+tetralogy+of+Fallot+and+pulmonary+atresia.">Ablation of the secondary heart field leads to tetralogy of Fallot and pulmonary atresia.</a> Dev Biol. 284, 72-83 (2005).</li><li>Echelard, Y., Vassileva, G., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis-acting+regulatory+sequences+governing+Wnt-1+expression+in+the+developing+mouse+CNS.">Cis-acting regulatory sequences governing Wnt-1 expression in the developing mouse CNS.</a> Development. 120, 2213-2224 (1994).</li><li>Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+the+mammalian+cardiac+neural.">Fate of the mammalian cardiac neural.</a> Developement. 127, 1607-1616 (2000).</li><li>Viragh, S., Challice, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+the+epicardium+and+the+embryonic+myocardial+circulation+in+the+mouse.">The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse.</a> Anat Rec. 201, 157-168 (1981).</li><li>Wu, M., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numb+family+proteins:+novel+players+in+cardiac+morphogenesis+and+cardiac+progenitor+cell+differentiation.">Numb family proteins: novel players in cardiac morphogenesis and cardiac progenitor cell differentiation.</a> Biomolecular concepts. 6, 137-148 (2015).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Lineage+Tracing+Reveals+that+Oriented+Cell+Division+Contributes+to+Trabecular+Morphogenesis+and+Regional+Specification.">Single-Cell Lineage Tracing Reveals that Oriented Cell Division Contributes to Trabecular Morphogenesis and Regional Specification.</a> Cell reports. 15, 158-170 (2016).</li><li>Alkaabi, K. M., Yafea, A., Ashraf, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+thermal-+and+chemical-induced+denaturation+of+GFP.">Effect of pH on thermal- and chemical-induced denaturation of GFP.</a> Appl Biochem Biotechnol. 126, 149-156 (2005).</li><li>Captur, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+myocardial+trabeculae+in+the+mouse+embryo.">Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo.</a> J Anat. , (2016).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

embriyo izolasyonu çok kritik bir adımdır. E9.5 embriyolar bu yüzden ekstra bakım izolasyonu sırasında embriyo / kalp yapıları zarar vermemek için alınmalıdır, boyutu çok kırılgan ve küçük. Bütün embriyo görüntüleme sırasında embriyo / kalbi saran olmayan embriyonik ekstra katmanları dikkatlice özellikle çıkarılmalıdır. Bu embriyonik dokularda derinliklerine antikor ve takas karışımı penetrasyon sağlar ve aynı zamanda görüntüleme arka plan sinyali giderilmesinde yardımcı olur....

Kardiyak morphogenesis kalbin farklı sektörleri içine kalp progenitör hücrelerin dört farklı tipte zamanmekansal organizasyon gerektiren bir ardışık bir olay olduğunu ve aynı zamanda fonksiyonel kalp 1,2 oluşturmak için bu süreci düzenlemek için birden fazla genetik düzenleyici ağları gerektirir. Kardiyak şartname, farklılaşma, desenleme ve bölme olgunlaşma kardiyojenik transkripsiyon faktörleri 3 düzenlenir. Genetik mutasyon veya kardiyak progenitör hücrelerin bu faktörlerin posttranskripsiyonel sapmaları embriyonik öldürücülüğü veya konjenital kalp kusurları (KKH) 4 ya neden olabilir. Kalp morfolojilerinden çalışma kardiyak morfojenezinde anlayışı teşvik edecek kalp gelişimi sırasında izleme üç boyutlu (3D) doğasında yapısal detayları ve tek etiketli kalp progenitör hücre soyu anlamayı gerektirir. yüksek çözünürlüklü bölümü tomografi bir dizi yöntem inci geliştirilmiştirGörüntü organ yapısı 5,6 birkaç on yıl geçmiş, e; Ancak, bu yöntemler pahalı, özel araçlar, geniş emek gerektiren ve son hacimsel görüntü 7,8 yeniden tek hücreli çözünürlükte ayrıntılı yapısal organizasyon eksikliği. Tek hücre düzeyinde 3D hacimsel görüntüleme in vivo 7 progenitör hücre farklılaşması ve hücre davranışlarını incelemek için bir araç sağlar. Ancak, doku ışık saçılması derin bozulmamış kalp içinde 3D hücreleri ve yapıları görüntüleme önündeki en önemli engel olmaya devam etmektedir. Doku şeffaflığı 8 artırmak için potansiyel yaklaşımlar lipidler ışık saçılması önemli bir kaynak ve lipidler ve / veya lipidler ve çevresinde arasındaki kırılma indeksi farkı ayarlama kaldırma are. Son birkaç yıl içinde, doku temizleme bir dizi yöntem, doku donukluk ve ışık saçılması azaltan, geliştirilmiş Babb (benzil alkol ve benzil benzoat gibiE karışımı) ile DBE (tetrahidrofuran ve dibenzylether); ancak bu yöntemlerde, floresans bir sorun 8-10 devam etmektedir. Solvent gibi SeeDB (fruktoz / tiyogliserol) ve 3DISCO (diklorometan / dibenzylether) gibi hidrofilik yöntemleri, bazlı floresan sinyalleri korumak, ancak 7,8,11 şeffaf bütün organı render yoktur. Buna karşılık, CLARITY doku temizleme yöntemi organı saydam yapar, ama aynı zamanda hidrojel 7,13 gömme gerektirir PACT (pasif berraklık tekniği), yaptığı gibi, lipidler 8,12 kaldırmak için özel bir elektroforez aygıtı gerektirir. Tüm doku temizleme yöntemleri hakkında ayrıntılı bilgi için, ark Richardson ve Lichtman, Tablo 1&#39;e bakınız. 7.. 2011 yılında, Hama ve ark. Tesadüfen bir hidrofilik karışım &#39;Sca Le&#39; keşfettik (üre, gliserol ve Triton X-100 karışımı) fare beyin ve embriyo transpar hale getirdiğiKBB tamamen etiketli klonları 14 floresan sinyalleri koruyarak. Bu hücre içi çözünürlükte birkaç milimetre ve nöronal nüfus ve çıkıntılar büyük ölçekli yeniden derinlikte bozulmamış beyin görüntüleme sağlar. Susaki ve ark. ayrıca aminoalkoldür ekleyerek le SCA geliştirilmiş ve fosfolipid çözülmesini arttı &#39;CUBIC&#39; (net, engelsiz beyin görüntüleme kokteyller ve hesaplamalı analiz) doku temizleme yöntemi, azaltılmış temizleme zamanı geliştirdi ve çok renkli floresan görüntüleme 8 sağladı. Bu çalışmada, cardiogenesis sırasında kalbin içinde Sca le avantajı ve KÜBİK doku takas teknikleri ve yüksek çözünürlüklü 3D optik bölümlendirilmeleri, bireysel klonlar alarak Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, αMHC-Cre 17, cTnT-Cre kullanılarak takip edildi 18, </strong&gt; Nfatc1-Cre 19 ve Rosa26-mTmG (mTmG), 20 fare soyları. Tüm montaj boyama (WMS) yönteminin kombinasyonu, daha önce 21,22 daha etiketli klonlar diğer proteinlerin boyama ve 3D hacimsel bağlamında kendi davranış çalışma için izin verilen doku temizleme yöntemleri ile gelişti. Doku temizleme ve WMS kombinasyonu kalp gelişimi sırasında farklı genlerin ve proteinlerin rolleri daha iyi anlaşılması ve konjenital kalp etyolojisinde sağlar. Bu protokol, geliştirme sırasında diğer progenitör hücre farklılaşması, hücre davranışını ve organ morfogenez olayları incelemek için uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>2,2&amp;prime;,2&amp;prime;&amp;rsquo;-nitrilotriethanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90279</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde in PBS</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP16000</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>122262</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Triton&amp;nbsp;X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U-1250</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8773</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>Sunflower seed oil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5007</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>PECAM (CD31)</td><td>BD Pharmingen&amp;nbsp;</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>DAPI nuclear stain</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>37&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C Incubator</td><td>Thermoscientific Fischer</td><td>Heratherm, Compact Microbiological Incubators</td><td></td></tr><tr><td>48 well plates</td><td>Cell Treat</td><td>229148</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Balance</td><td>Metler Toledo</td><td>PB153-S/FACT</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss 510 confocal microscope</td><td></td></tr><tr><td>Disecting Microscope</td><td>Unitron</td><td>Z850</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>Zeiss</td><td>Observer. Z1</td><td></td></tr><tr><td>Germinator 500 Glass Bead Sterilizer</td><td>CellPoint Scientific</td><td>GER-5287-120V</td><td></td></tr><tr><td>Light Source</td><td>SCHOTT</td><td>ACE I</td><td></td></tr><tr><td>Pair of Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 60 mm x15 mm&amp;nbsp;</td><td>TPP Techno Plastic Products AG</td><td>93060</td><td></td></tr><tr><td>Rocker II&amp;nbsp; Platform Rocker</td><td>Boekel Scientific</td><td>260350</td><td></td></tr><tr><td>Scintillating tubes</td><td>Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>03-337-26</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette</td><td>Samco Scientific</td><td>202</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging cleared embryonic and postnatal hearts at single-cell resolution

Bütün kalp seviyesinde tek klonal izleme ve analiz kalp gelişimi sırasında kalp progenitör hücre davranışını ve farklılaşmasını belirlemek ve normal ve anormal kalp morfolojilerinden hücresel ve moleküler temeli çalışması için izin verebilirsiniz. retrospektif tek klonal analizler Son gelişen teknolojiler tek bir hücre çözünürlükte kalp morfolojilerinden çalışma mümkün olun. Ancak, doku donukluk ve görüntüleme derinliği gibi kalbin ışık saçılması tek bir hücre çözünürlükte hinder bütün kalp görüntüleme artar. Bu engelleri, geliştirilmesi gerekir aydınlatma ve tespiti hem son derece şeffaf kalbi işleyebilir bir bütün embriyo takas sistemini aşmak için. Neyse ki, son birkaç yıl içinde, bu tür CLARITY olarak tüm organizma temizleme sistemleri, Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, Babb ve PACT için birçok yöntemler bildirilmiştir. Bu laboratuvar kartının hücresel ve moleküler mekanizmalar ilgileniyorIAC morphogenesis. Son zamanlarda, biz ROSA26-Cre ERT2 üzerinden izleme tek bir hücre soyu kurulmuş, seyrek etiket hücrelere ROSA26-Konfeti sistemini kalp gelişimi sırasında. Biz kalp içinde görüntü tek klonlar bütün montaj boyama ile birlikte embriyo temizlemek için Sca le ve CUBIC (net, engelsiz beyin görüntüleme kokteyller ve hesaplamalı analizi) dahil olmak üzere birçok bütün embriyo-takas yöntemleri uyarladı. Kalp başarıyla tek bir hücre çözünürlükte görüntülendi. Biz CUBIC doğum sonrası kalbi temizlemek süre Sca le, embriyonik kalbi temizlemek, ancak etkili bir doğum sonrası kalbi temizlemek olamayacağını bulundu, ancak zarar dokuyu eriterek Embriyonik kalp. Burada açıklanan yöntemler sırayla, konjenital kalp defektleri hücresel ve moleküler temelini ortaya çıkarabilir, kalp morfolojilerinden sırasında tek bir klon çözünürlükte gen fonksiyonu çalışma izin verecektir.

temizlenir embriyonik kalbin görüntülenmesi Omurgalı kalp oluşumu spatiotemporally düzenlenmiş morfojenik süreçtir ve dört farklı kaynaklardan 1 organizasyon ve progenitör hücrelerin farklılaşması bağlıdır. Kalp hilalin ilk kalp alanından Hücreler doğrusal bir kalp tüp oluşturacak şekilde ventral orta hat doğru katlanır. Başlangıçta ilk kalp alanına dorsomedially ikamet eden ikinci kal...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution at JoVE.com

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.

Görüntüleme Tek hücreli Çözünürlük embriyonik ve Postnatal Kalpleri Temizlendi

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

imaging-cleared-embryonic-postnatal-hearts-at-single-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.1K Görüntüleme.  Albany Medical College. We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately. 

Video: Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated discs, and costameres requires the coordinated assembly of multiple components in time and space. Disruption in assembly of these components leads to developmental heart defects. Immunofluorescent staining techniques are used commonly in cultured cardiomyocytes to probe myofibril maturation, but this ex vivo approach is limited by the extent to which myocytes will fully differentiate in culture, lack of normal in vivo mechanical inputs, and absence of endocardial cues. Application of immunofluorescence techniques to the study of developing mouse heart is desirable but more technically challenging, and methods often lack sufficient sensitivity and resolution to visualize sarcomeres in the early stages of heart development. Here, we describe a robust and reproducible method to co-immunostain multiple proteins or to co-visualize a fluorescent protein with immunofluorescent staining in the embryonic mouse heart and use this method to analyze developing myofibrils, intercalated discs, and costameres. This method can be further applied to assess cardiomyocyte structural changes caused by mutations that lead to developmental heart defects.

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

Embriyonik Fare Heart Immunofluorescence kullanarak kardiyomiyosit Geliştirme Analizi

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Gelişim Biyolojisi

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

Temizlendi Embriyonik Kalpler Koroner Damarlar Analizi

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

Nicel bütün Dağı ayirt analiz fare embriyo kardiyak progenitör nüfusun

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in cardiac injury, primarily in the form of an acute myocardial infarction. With little resilience following injury, the once healthy cardiac tissue will be replaced by fibrous, non-contractile scar tissue and often be a prelude to heart failure. To identify novel treatment options in regenerative medicine, research has focused on vertebrates with innate regenerative capabilities. One such model organism is the neonatal mouse, which responds to cardiac injury with robust myocardial regeneration. In order to induce an injury in the neonatal mouse that is clinically relevant, we have developed a surgery to occlude the left anterior descending artery (LAD), mirroring a myocardial infarction triggered by atherosclerosis in the human heart. When matched with the technology to track changes both within cardiomyocytes and non-myocyte populations, this model provides us with a platform to identify the mechanisms that guide heart regeneration. Gaining insight into changes in cardiac cell populations following injury once relied heavily on methods such as tissue sectioning and histological examination, which are limited to two-dimensional analysis and often damage the tissue in the process. Moreover, these methods lack the ability to trace changes in cell lineages, instead providing merely a snapshot of the injury response. Here, we describe how technologically advanced methods in lineage tracing models, whole organ clearing, and three-dimensional (3D) whole-mount microscopy can be used to elucidate mechanisms of cardiac repair. With our protocol for neonatal mouse myocardial infarction surgery, tissue clearing, and 3D whole organ imaging, the complex pathways that induce cardiomyocyte proliferation can be unraveled, revealing novel therapeutic targets for cardiac regeneration.

Cardiomyocyte proliferation following injury is a dynamic process that requires a symphony of extracellular cues from non-myocyte cell populations. Utilizing lineage tracing, passive CLARITY, and three-dimensional whole-mount confocal microscopy techniques, we can analyze the influence of a variety of cell types on cardiac repair and regeneration.

Temizlenmiş Kalp Üç Boyutlu Görüntüleme ile Hedefhücre Popülasyonlarının Kardiyak Yaralanma Yanıtının Yakalanması

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in ...

Live Imaging of Early Cardiac Progenitors in the Mouse Embryo

The first steps of heart development imply drastic changes in cell behavior and differentiation. While analysis of fixed embryos allows studying in detail specific developmental stages in a still snapshot, live imaging captures dynamic morphogenetic events, such as cell migration, shape changes, and differentiation, by imaging the embryo as it develops. This complements fixed analysis and expands the understanding of how organs develop during embryogenesis. Despite its advantages, live imaging is rarely used in mouse models because of its technical challenges. Early mouse embryos are sensitive when cultured ex vivo and require efficient handling. To facilitate a broader use of live imaging in mouse developmental research, this paper presents a detailed protocol for two-photon live microscopy that allows long-term acquisition in mouse embryos. In addition to the protocol, tips are provided on embryo handling and culture optimization. This will help understand key events in early mouse organogenesis, enhancing the understanding of cardiovascular progenitor biology.

We present a detailed protocol for mouse embryo culture and imaging that enables 3D + time imaging of cardiac progenitor cells. This video-toolkit addresses the key skills required for successful live imaging otherwise hard to acquire from text-only publications.

Fare Embriyosundaki Erken Kardiyak Progenitörlerin Canlı Görüntülenmesi

The first steps of heart development imply drastic changes in cell behavior and differentiation. While analysis of fixed embryos allows studying in detail ...

Tek Hücre Çözünürlüğünde Fare Kardiyak Progenitör Hücrelerinden Çekirdek İzolasyonu

Nuclei Isolation from Mouse Cardiac Progenitor Cells for Epigenome and Gene Expression Profiling at Single-Cell Resolution

The developing heart is a complex structure containing various progenitor cells controlled by complex regulatory mechanisms. The examination of the gene expression and chromatin state of individual cells allows the identification of the cell type and state. Single-cell sequencing approaches have revealed a number of important characteristics of cardiac progenitor cell heterogeneity. However, these methods are generally restricted to fresh tissue, which limits studies with diverse experimental conditions, as the fresh tissue must be processed at once in the same run to reduce the technical variability. Therefore, easy and flexible procedures to produce data from methods such as single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) and the single-nucleus assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (snATAC-seq) are needed in this area. Here, we present a protocol to rapidly isolate nuclei for subsequent single-nuclei dual-omics (combined snRNA-seq and snATAC-seq). This method allows the isolation of nuclei from frozen samples of cardiac progenitor cells and can be combined with platforms that use microfluidic chambers.

Yazar Spotlight: Tek Hücre Çözünürlüğünde Epigenom ve Gen İfadesi Profili Oluşturma için Fare Kardiyak Progenitör Hücrelerinden Çekirdek İzolasyonu  

Here, we present a protocol describing cell nuclei preparation. After microdissection and enzymatic dissociation of cardiac tissue into single cells, the progenitor cells were frozen, followed by isolation of pure viable cells, which were used for single-nucleus RNA sequencing and the single-nucleus assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing analyses.

Epigenom ve Tek Hücre Çözünürlüğünde Gen Ekspresyon Profillemesi için Fare Kardiyak Progenitör Hücrelerinden Çekirdek İzolasyonu

The developing heart is a complex structure containing various progenitor cells controlled by complex regulatory mechanisms. The examination of the gene ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. Traditional light-sheet techniques involve the use of a single illumination beam directed orthogonally at sample tissue. Images of large samples that are produced using a single illumination beam contain stripes or artifacts and suffer from a reduced resolution due to the scattering and absorption of light by the tissue. This study uses a dual-sided illumination beam and a simplified CLARITY optical clearing technique for the murine heart. These techniques allow for deeper imaging by removing lipids from the heart and produce a large field of imaging, greater than 10 x 10 x 10 mm3. As a result, this strategy enables us to quantify the ventricular dimensions, track the cardiac lineage, and localize the spatial distribution of cardiac-specific proteins and ion-channels from the post-natal to adult mouse hearts with sufficient contrast and resolution.

This study uses a dual-sided illumination light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) technique combined with optical clearing to study the murine heart.

Fare kalp çalışma için ışık sayfalık floresans mikroskobu

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Biyomühendislik

Kapsamlı kardiyak görüntüleme için ışık tabakası mikroskobu ve doku temizleme

Light-Sheet Imaging to Reveal Cardiac Structure in Rodent Hearts

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights into fundamental cardiac physiology and pathologic responses. We hereby delve into the development and implementation of the LSM technique to elucidate the micro-architecture of the heart in mouse models. The methodology integrates a customized LSM system with tissue clearing techniques, mitigating light scattering within cardiac tissues for volumetric imaging. The combination of conventional LSM with image stitching and multiview deconvolution approaches allows for the capture of the entire heart. To address the inherent trade-off between axial resolution and field of view (FOV), we further introduce an axially swept light-sheet microscopy (ASLM) method to minimize out-of-focus light and uniformly illuminate the heart across the propagation direction. In the meanwhile, tissue clearing methods such as iDISCO enhance light penetration, facilitating the visualization of deep structures and ensuring a comprehensive examination of the myocardium throughout the entire heart. The combination of the proposed LSM and tissue clearing methods presents a promising platform for researchers in resolving cardiac structures in rodent hearts, holding great potential for the understanding of cardiac morphogenesis and remodeling.

Yazar Spotlight: Kemirgen Kalplerinde Miyokard Yapılarını Araştırmak için Özelleştirilmiş Işık Sayfası Görüntüleme

The protocol utilizes advanced light-sheet microscopy along with adapted tissue clearing methods to investigate intricate cardiac structures in rodent hearts, holding great potential for the understanding of cardiac morphogenesis and remodeling.

Kemirgen kalplerinde kalp yapısını ortaya çıkarmak için ışıklı tabaka görüntüleme

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights ...

Görüntüleme Tek hücreli Çözünürlük embriyonik ve Postnatal Kalpleri Temizlendi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Embriyonik Fare Heart Immunofluorescence kullanarak kardiyomiyosit Geliştirme Analizi

Temizlendi Embriyonik Kalpler Koroner Damarlar Analizi

Nicel bütün Dağı ayirt analiz fare embriyo kardiyak progenitör nüfusun

Temizlenmiş Kalp Üç Boyutlu Görüntüleme ile Hedefhücre Popülasyonlarının Kardiyak Yaralanma Yanıtının Yakalanması

Fare Embriyosundaki Erken Kardiyak Progenitörlerin Canlı Görüntülenmesi

Epigenom ve Tek Hücre Çözünürlüğünde Gen Ekspresyon Profillemesi için Fare Kardiyak Progenitör Hücrelerinden Çekirdek İzolasyonu

Epigenom ve Tek Hücre Çözünürlüğünde Gen Ekspresyon Profillemesi için Fare Kardiyak Progenitör Hücrelerinden Çekirdek İzolasyonu

Epigenom ve Tek Hücre Çözünürlüğünde Gen Ekspresyon Profillemesi için Fare Kardiyak Progenitör Hücrelerinden Çekirdek İzolasyonu

Fare kalp çalışma için ışık sayfalık floresans mikroskobu

Kemirgen kalplerinde kalp yapısını ortaya çıkarmak için ışıklı tabaka görüntüleme