Bu protokol, fare embriyolarının geliştikçe görüntülenmesini sağlar. Bu, erken kardiyogenezin ayrıntılı olarak incelenmesini sağlar. Sahte embriyoların hareketsiz görüntülerini çekmek gibi, canlı görüntüleme de embriyo gelişimindeki dinamik süreci incelemek için tam erişim sağlar.
Yaşam görüntüleme için gerekli becerilerin sadece metin yayınlarından kavranması zordur. Bunu yapan başka bir kişiyi izlemek, öğrenmek için çok önemlidir. Başlamak için, bir santimetre uzunluğundaki tungsten tel parçalarını kesin ve telin ucunu doymuş bir sodyum nitrat çözeltisine batırarak 0,02 ila 0,05 milimetre çapında keskinleştirin.
Dirsekli cam kılcal damarları hazırlamak için, standart bir milimetrelik cam kılcal damarın orta noktasını üç ila altı saniye boyunca bir bunsen çakmağının üzerine yerleştirin ve kılcal damar ince ve esnek hale gelene kadar her iki uçtan yavaşça çekin. Ardından, kılcal damarı ikiye bölün ve uçtan iki santimetre 90 derece bükülmek için kısa bir süre ısıtın. Yaklaşık yedi milimetre uzunluğunda, dört milimetre genişliğinde ve iki milimetre kalınlığında bir polimetil metakrilat parçası gördüm.
Metakrilat parçasını bir tezgah mengene kullanarak tutun, ardından tüm parça boyunca enine olarak özelleştirilmiş delikler açın. Düşük fakat sabit basınç uygularken matkabı yavaşça döndürün. Tutucunun kenarını yumuşatmak ve boyutunu ayarlamak için ince bir dosya kullanın.
Ek olarak, embriyo konumlandırmasını kolaylaştırmak için tutucunun kenarlarında hafif bir eğim oluşturun. Bitmiş tutucuyu durulamak için damıtılmış su içeren bir kaba yerleştirin. Stereo mikroskop altında, deliklerin delme tozu içerip içermediğini görmek için tutucuyu kontrol edin.
Toz varsa, çıkarmak için tungsten iğneleri kullanın. Tutucuyu sterilize etmek için, damıtılmış suyla dolu konik bir tüpe yerleştirin ve en az 20 watt güç çıkışıyla 20 dakika boyunca sonikasyon yapın. Uterusu ötenazi embriyonik bir gün 6.75 ila 7.5 hamile fareden çıkarın ve kuru ve temiz bir kağıt mendil üzerine yerleştirin.
Daha sonra, uterusu kesin, ince makasın ucunu mezometriyal taraftan yerleştirin ve decidui'yi ortaya çıkarmak için bıçağı kaydırın ve diseksiyon ortamına aktarın. Embriyoları disseke edin, ektoplasental koniyi sağlam tutun. Daha sonra, Reichter'ın zarını soyun ve bir kısmını ekstra embriyonik bölgede bırakın.
Diseksiyonu orta derecede sıcak tutmak için, her 10 dakikada bir değiştirin. Ayrıca, decidui'yi üç ila dört kişilik gruplar halinde diseke ederken, geri kalanını 37 santigrat derece banyoya yerleştirilmiş bir diseksiyon ortamında tutun. Disseke edilmiş embriyoları hemen bir kültür ortamına yerleştirin.
İstenilen floresan özelliklerine sahip embriyoları floresan stereo mikroskop kullanarak seçin ve görüntülemeden önce iki saat boyunca iyileşmek için hücre kültürü inkübatöründe kültür ortamını içeren tüpe yerleştirin. Bilgisayar, yazılım ve lazerler de dahil olmak üzere tüm mikroskop bileşenlerini açtıktan sonra, karbondioksit kontrol cihazını açın ve% 7'ye ayarlayın Cam kapak kayma tabanına sahip 35 milimetrelik bir kaba bir damla yüksek vakumlu silikon gres yerleştirin. Tutucuyu damlanın üzerine yerleştirin ve hareketsiz hale getirmek için hafifçe bastırın.
Embriyo montajı için, inkübatörden iki ila üç embriyoyu bir tutucu ile yemeğe aktarın. Bir çift forseps ve konik bir tungsten iğne kullanarak, embriyoları deliklere yerleştirin. Embriyoyu ektoplasental koni ile bağlamak için iğneyi kullanın ve boyut eşleştirme deliğine yerleştirin.
Embriyoları ve tutucuyu içeren kabı dikkatlice mikroskop plakasına taşıyın. Orta objektif arayüzde sıvı bir menisküs oluşana kadar hedefi düşürün. Embriyoyu odağa yerleştirdikten sonra, inkübasyon odasını monte edin ve bant kullanarak hedefin etrafına kapatın.
Mikroskop kontrol yazılımında canlı bir yakalama kullanarak, lazer çıkışını ayarlayın ve seviyeleri kazanın. Daha sonra, ortamı hedefe yavaşça damlatarak parafin yağı ile örtün. Hızlandırılmış kayıt ayarlayın.
Yığınlar arasında üç ila beş mikron Z boşluğu olacak şekilde beş ila 10 dakikalık bir aralık ayarlayın. Embriyo büyümesini tahmin etmek için Z-Stack'in üstünde boş bir alan bırakın. En az 50 mikron, her saat için 30 mikron eklenerek edinim denetlenmeyecektir.
Gerekirse Z-Stack boyutunun odak alanındaki ilgi alanına uyacak şekilde ayarlanmasına izin vermek üzere bir bilgisayardan edinimin denetlenmesine izin vermek için otomatik kaydetme seçeneğini etkinleştirin. Canlı tüm vücut embriyo kalp gelişimi multifoton görüntüleme ile gösterilmiştir. Embriyonik gün 7.5'te, nöral ektoderm boyunca venöz floresan mevcuttur, splanknikte birkaç pozitif çekirdek ve ekstra embriyonik mezoderm vardır.
Dört saat sonra, endotel progenitörleri venöz aktive olur ve yedi saat sonra kapalı yapılar haline gelen endokardiyal tüp ve altta yatan aortları oluşturmak için toplanır. Reichter'ın zarını çıkarırken dikkatli olun. Özellikle prevacillation aşamalarında embriyoya gerçekten yapışabilir.
Çıkarma sırasında, zarı ekstra embriyonik bölge tarafından sıkıştırmaya çalışın.
