Name: analysis of coronary vessels in cleared embryonic hearts
Uploaded: 2016-12-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts at JoVE.com

iş Çocuklar NHS Foundation Trust ve University College London Great Ormond Street Hastanesi Sağlık Araştırma Biyomedikal Araştırma Merkezi Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenen İngiliz Kalp Foundation&#39;and tarafından finanse edildi.

Tüm hayvan araştırmaları UK Home Office lisansı altında kurumsal kurallarına uygun olarak yürütülmüştür. 1. Diseksiyon ve Embriyonik Kalpler Fixation <ol><li> Etik açıdan onaylanmıştır itlaf teknik, sonra servikal dislokasyon yapılmıştır, örneğin CO2 narkozu ile istenen günde bir zamanlı gebe fare öldürülür ve fosfat tamponlu tuzlu su ile dolu bir 10 santimetrelik bir petri tabağına yerleştirilerek embriyonik keseleri 14 kaldırma (PBS) . </li><li> göbek bağını kesilmesinin ve yolk sac çıkarmadan, dikkatle her embriyo rahim keseler açmak ve kaldırmak, bir mikroskop ve forseps kullanma. </li><li> genotiplendirme amaçlı, daha sonra lizis / DNA ekstraksiyonu için 1.5 ml mikrosantrifüj tüp embriyonik kuyruk ve yer çıkarın. </li><li> Paslanmaz çelik minutien işaretçilerine kullanarak, bir PBS dolu silikon elastomer kaplı 35 mm Petri kabındaki sırtında her bir embriyo dışarı, kalp kaldırmak pin için. Ince forseps ca kullanarakrefully göğüs açık ve büyük damarları sever, kalp ön. Sonra kalp arkasında damarları kavramak ve kalp kaldırmak için hafifçe çekin, forseps ile kalp arkasında ulaşan; Akciğerler aynı anda uzak gelebilir. </li><li> PBS içeren taze bir 35 mm Petri kabı kalbi aktarın ve gerekirse, akciğer dokusunun uzak trim ince forseps kullanabilir. Daha sonra, soğuk PBS ile dolu bir 48-çukurlu plaka iyi kalp aktarın. </li><li> 48-çukurlu plaka içindeki tüm kalpleri topladıktan sonra, ince uçlu bir plastik pastör pipeti ile PBS aspire ve 0.5 ml% 4 paraformaldehit (PFA) ile değiştirin. UYARI: PFA, alerjik, kanserojen ve zehirli olduğu bilinen bir olduğunu. <ol><li> Düzeltme E11.5 - oda sıcaklığında% 4 PFA içinde 30 dakika süreyle 15.5 kalpler, - 20 dakika karıştırıldı ve E14.5 12.5, 15 dakika boyunca kalpler, E 13.5 kalpler. </li></ol></li><li> ince uçlu plastik Pasteur pipeti ile PFA aspirat ve kalpleri 2x soğuk PBS ile durulayın. cautION: PFA tehlikelidir ve kurumsal düzenlemelere uygun olarak bertaraf edilmelidir. </li><li> % 25 metanol /% 75 PBS,% 50 metanol /% 50 PBS,% 75 metanol / 25: tüm montaj immün için hemen kullanmaya değilse aşağıdaki çözümleri ardışık 5 dk yıkar yaparak kalpleri kurutmak, (bakınız bölüm 2) % PBS ile yıkandı. DİKKAT: Metanol zehirlidir, eldiven giymek. % 100 metanol içinde -20 ° C&#39;de kalpleri saklayın. </li></ol> Anti-PECAM1 Antikor ile Embriyonik Hearts 2. Tüm Dağı immün NOT: Anti-PECAM1 antikorları koroner damarları boyama için iyi çalışır, ancak uygun olacağını güçlü bir sinyal veren herhangi bir pan-endotelyal işaretleyici (adım 2.4). <ol><li> % 100 metanol saklanan kalpleri kullanılıyorsa, bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüplerine transfer aşağıdaki Çözeltilerin art arda 5 dakika yıkama yaparak rehidrate:% 75 metanol /% 25 PBS ve% 50 metanol /% 50 PBS ve% 25 metanol /% 75 PBS ile yıkandı. </li&gt; <li> Oda sıcaklığında döner, 1.0 mi PBST (PBS /% 0.1 Tween-20) - 0.5, 3 x 10 dakika yıkama yaparak kalpleri geçirgenliği. </li><li> PBST içinde 1.0 ml% 10 keçi serumu, oda sıcaklığında 1 saat süre ile döndürülmesi ile kalpleri bloke eder. </li><li> ince uçlu plastik Pasteur pipeti veya 1000 ul pipet ile engelleme tamponu çıkarın ve 400 ile değiştirin - 01:50 seyreltilmiş anti-PECAM1 birincil antikor içeren 500 ul taze blok. 4 ° C&#39;de bir gece tüpler döndürün. </li><li> Ertesi gün, oda sıcaklığında tüpleri dönen, bir ince uçlu plastik Pasteur pipeti veya 1000 ul pipet ile blok / birincil antikor aspire ve 1.0 ml PBST en az 6x 1 saat yıkar yürütmek. </li><li> 1 seyreltilmiş florofor-konjuge sekonder antikor içeren taze bloke tamponu ile son yıkama yerine: 500 ve rotasyon ile, 4 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edilir. folyo tüpler sararak ışıktan koruyunuz. </li><li> Ertesi gün, blok / sn aspireince uçlu bir plastik pastör pipeti ile sekonder antikor, ve oda sıcaklığında tüpleri döner, 1.0 mi PBST içinde en az 1 saat 6x yıkama yapın. </li><li> 4 ° (ışıktan korumalı) C kadar gerekli de kalpleri saklayın. </li></ol> Takas Çözümleri ve Mikroskopi Yemekleri 3. hazırlanması NOT: Babb kalpleri görüntüleme yaparken BABB çözümün hiçbiri mikroskop bileşenleri ile temas o hayati önem taşımaktadır. Bu amaç için, aşağıdaki protokolü de önceden hazırlanabilir floresan mikroskobu için uygun silikon elastomer sızdırmaz yemekler hazırlamak için talimatları içerir. silikon elastomer Babb içerir ve potansiyel olarak cam alt ve yemeğin polikarbonat tarafı arasında sızmasını önlemek için bir engel oluşturur. <ol><li> çapında silikon elastomer kaplı yemekler hazırlamak için, vida üst şişe, 4 ml bir kap optik cam tabanlı kültür kaplarına alıp koyun (yaklaşık 1.5 cm) Tabakların her merkezinde. NOT: Elastomer çanak uygulandığında, bu örnek için bir kuyu oluşturacaktır. </li><li> üreticinin talimatlarına uygun olarak, uygulandıkları gibi iki bileşeni karıştırmak için bir uygulama kartuşu kullanılarak, yaklaşık olarak 0.5 cm derinliğe kadar silikon elastomer yemekler doldurun. Şişe kapağı her yemeğin ortasında kalır emin, en az 24 saat boyunca tedavi etmek için bırakın. NOT: Göz ile silikon elastomer yanlışlıkla temasını önlemek için koruyucu gözlük kullanın. </li><li> elastomer sertleştikten sonra, her bir tabaktan şişe kapağı çıkarın Bu örnek çanak, cam alt ile doğrudan temas halinde yerleştirilebilir yansıması için merkezi bir kuyu bırakacaktır. NOT: tedavi sırasında elastomer dokunulduğunda sert ve kuru olmalıdır. </li><li> (2 parça benzil benzoat 1 kısım benzil alkol) BABB çözeltisi hazırlayın. Bu, bir cam şişe içinde saklanan ve ışıktan korunmalıdır. DİKKAT: BABB toksik, korozif bir çözümdür. Uygun koruyucu giysiler giyen ederken bir çeker ocak içinde taşıyınız. </li><li> bir cam şişede - (5 mi 1) karışımı BABB ve metanol 50:50 çözelti yapmak için. Folyo şişeyi sararak, örneğin ışık koruyun. </li></ol> 4. Dehidrasyon, Takas ve Konfokal Mikroskopi için Hearts montajı NOT: Büyük örnekler ancak küçük örnekler için, 4 ml&#39;lik cam şişelerde silinebilir (örneğin, E13.5 kadar kupa) o mikroskobu çanak doğrudan takas işlemini yürütmek için daha iyidir. Bu önlemeye yardımcı olur kalpleri bir kez temizlenmiş çok şeffaf olmak gibi örnekleri &#39;kaybetme&#39;. Bu küçük örnekler için takas birkaç dakika içinde ortaya çıkan, çok hızlıdır. NOT: / sarma folyo ile tüpler ve yemekleri kapsayan tüm aşağıdaki adımları sırasında ışıktan örnekleri koruyun. <ol><li> temizlemeden önce, oda tempe de kalpleri döndürerek bir metanol dizi immunohistokimyasal-kalpleri kurutmakAşağıdaki çözümlerden art arda değişikliklerin bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde rature: metanol /% 75 PBS ve% 50 metanol /% 50 PBS ve% 75 metanol /% 25 PBS (her biri 5 dakika),% 25. Son olarak, 100% metanol 3 x 5 dakika boyunca döner. </li><li> yukarı mikroskopi çanak merkezinde E13.5, yere kalpleri için; mikroskop altında kalp dorsal yan en üstte şekilde yönlendirilir emin olun. ince uçlu plastik Pasteur pipeti ile kalbin etrafında herhangi metanol çıkarın. </li><li> Temiz ince uçlu bir plastik pastör pipeti kullanılarak, Babb ekleyin: metanol, 50:50 solüsyonu kalp sokmak için yeterli bir hacimde (yaklaşık 300-400 ul). kalpler bazen çözeltide çevirmek gibi kalpleri hala opak iken, yine yönünü kontrol edin. 5 dakika boyunca çözelti içinde bırakın. </li><li> davlumbaz cam atık şişesine 50:50 çözüm çıkarın ve tekrar ince uçlu bir plastik Pasteur pipeti kullanarak, Babb ile değiştirin. NOT: Bir büyük hacimli gerekli değildir; SUFF eklemekicient böylece kalp çözeltisinin bir damlası içinde oturur. kalp 5 dakika içinde temizlemek gerekir. </li><li> Daha büyük kalpleri için, cam şişe numuneleri temizleyin. NOT: Bir E15.5 kalp 30 dakika-1 saat içinde temizlemek gerekir ancak gerekirse bir gecede bırakılabilir. </li><li> Örnek açıktır sonra çözelti, kaldırıp Babb en az bir hacim ile değiştirin. İsteğe bağlı olarak, ancak bu mutlaka gerekli değildir, yerinde tutmak için yardımcı olmak için bir kayar kapak ile birlikte örnek kapsamaktadır. görüntüleme için kalbi kullanın. </li></ol> Konfokal Mikroskopi 5. Görüntüleme Temizlendi Kalpler NOT: Görüntüler 10X veya 20X kuru hedefleri kullanarak ters bir konfokal mikroskop ele geçirildi. bir dik konfokal yemekler kullanmak mümkün olsa da, ekstra bakım BABB çözeltisi ile objektif temasından kaçınmak için dikkat edilmelidir. <ol><li> Kalp 15 z-tarama toplayın. Kalbin boyutuna bağlı olarak, bir döşeme tarama görüntü tüm kalp 16 gerekebilir. <br/&gt; DİKKAT: BABB bir aşındırıcı bir çözümdür, temiz eldiven giymek ve mikroskopi çanak dışında Babb ücretsiz olduğundan emin olun. dikkatli çanak Kulp ve mikroskop üzerine kazara dökülme riskini en aza indirmek için çanak kapağı tutmak. </li><li> objektif çalışma mesafesi izin veriyorsa, ilgi alanlarının daha yüksek çözünürlüklü fotoğraf elde etmek için daha yüksek bir büyütme kullanmak. </li></ol> Fiji Yazılım Kullanma 6. Veri Analizi <ol><li> Fiji 17 görüntülerin z yığınını açın. </li><li> Bütün yığının veya bir kısmının az projeksiyonunu yapmak için, Görüntü tıklayın ve Z projesi takip Stack seçin. Başlat girin ve dilim numaraları durdurun ve z projeksiyon, örneğin, ortalama yoğunluk, maksimum yoğunluk türünü seçin. </li><li> Şişirme aracı kullanmak görüntü dilimlerinin bir yığın içinde tek tek damarları vurgulamak (Eklentiler menüsünden seçin segmentasyonu gelen ve daha sonra Kement aracı / Darbe) ve görüntü alanlarına tıklayın ea doldurulacakch dilim. seçim ön plan rengiyle seçili alanları doldurmak için (o Dolgu seçin Düzenle üzerine tıklayın) Dolgu komutunu kullanın (Renkler ve Önalan tarafından takip Seçenekler, seçin, Düzenle üzerine tıklayın). </li><li> görüntü olarak daha önce yığını Z projesi. </li></ol> Koroner Arter 7. 3D Yüzey Volume Rendering Imaris kullanma Oluşturulan <ol><li> Ekranın üst kısmındaki Aşan görünümü simgesini tıklayın ve sürükle ve veri penceresine görüntü dosya açılır. Ekranın üst kısmındaki 3D Görünüm simgesini tıklayın. </li><li> yüzeyler simgesine (mavi simge) seçin ve ardından Oluştur sekmesine tıklayın. &#39;Elle düzenlemek, otomatik oluşturmayı atla&#39; iletişim kutusunda tıklayın ve Beraberlik simgesi (ince kalem simgesi) tıklayın. </li><li> Kontur sekmesini ve ardından Mod sekmesini seçin. Modunda, sihirli değnek veya Isoline simgeleri tıklayın. &#39;Seç&#39; yanındaki tıklayarak ekranın sağ taraftaki Pointer seçiminde ibre modunu seçin ve ardından &#39;Beraberlik tıklayın9; (Ekranın sol alt köşesinde) kutusu. </li><li> ardışık dilimleri arterlerin hatlarını seçmek için Isoline veya sihirli değnek aracını kullanın. Dilim Pozisyonu kaydırıcısını kullanarak dilim dilim gidin. </li><li> Tüm konturlar seçilmiştir olduğunda, Surface Oluştur kutusuna tıklayın. Çevredeki hacim görünmez hale veya Blend modunu kullanarak daha fazla veya daha az opak kılınabilir; vurgulayın ve ardından Mod sekmesine ardından Ayarlar sekmesini seçmek için Volume tıklayın. Blend seçin ve donukluk değiştirmek için kaydırıcıyı kullanın. </li><li> Anlık işlevini kullanarak görüntüler çekin. </li></ol>

<ol>
	<li>Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+arteries+form+by+developmental+reprogramming+of+venous+cells.">Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells.</a> Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepicardial+endothelial+cells+invade+the+embryonic+ventricle+wall+to+form+coronary+arteries.">Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries.</a> Cell Res. 23 (9), 1075-1090 (2013).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling.">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li><li>Klotz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+lymphatics+are+heterogeneous+in+origin+and+respond+to+injury.">Cardiac lymphatics are heterogeneous in origin and respond to injury.</a> Nature. 522 (7554), 62-67 (2015).</li><li>Nam, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+veins+determine+the+pattern+of+sympathetic+innervation+in+the+developing+heart.">Coronary veins determine the pattern of sympathetic innervation in the developing heart.</a> Development. 140 (7), 1475-1485 (2013).</li><li>Zhu, D., Larin, K. V., Luo, Q., Tuchin, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+tissue+optical+clearing.">Recent progress in tissue optical clearing.</a> Laser Photon. Rev. 7 (5), 732-757 (2013).</li><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nat. Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li><li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li><li>Zucker, R. M., Hunter, E. S., Rogers, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+laser+scanning+microscopy+of+morphology+and+apoptosis+in+organogenesis-stage+mouse+embryos.">Confocal laser scanning microscopy of morphology and apoptosis in organogenesis-stage mouse embryos.</a> Methods Mol. Biol. 135, 191-202 (2000).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Erturk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cleared+intact+biological+systems+at+a+cellular+level+by+3DISCO.">Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO.</a> J. Vis.Exp : JoVE. (89), (2014).</li><li>Dyer, L. A., Wu, Y., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+isolation+from+the+developing+embryonic+mouse+heart+valve+region.">Protein isolation from the developing embryonic mouse heart valve region.</a> J. Vis.Exp s : JoVE. (91), e51911 (2014).</li><li>Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cardiomyocyte+development+using+immunofluorescence+in+embryonic+mouse+heart.">Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart.</a> J. Vis.Exp : JoVE. (97), (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+origin+and+developmental+program+of+coronary+angiogenesis.">Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis.</a> Circ. Res. 116 (3), 515-530 (2015).</li><li>Ivins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CXCL12/CXCR4+Axis+Plays+a+Critical+Role+in+Coronary+Artery+Development.">The CXCL12/CXCR4 Axis Plays a Critical Role in Coronary Artery Development.</a> Dev. Cell. 33 (4), 455-468 (2015).</li><li>Theveniau-Ruissy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+stem+development+in+wild-type+and+Tbx1+null+mouse+hearts.">Coronary stem development in wild-type and Tbx1 null mouse hearts.</a> Dev. Dyn : an official publication of the American Association of Anatomists. 245 (4), 445-459 (2016).</li><li>Tomanek, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+coronary+vasculature+during+development.">Formation of the coronary vasculature during development.</a> Angiogenesis. 8 (3), 273-284 (2005).</li><li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-C+and+aortic+cardiomyocytes+guide+coronary+artery+stem+development.">VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development.</a> J. Clin.Iinvest. 124 (11), 4899-4914 (2014).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vessel+formation.+De+novo+formation+of+a+distinct+coronary+vascular+population+in+neonatal+heart.">Vessel formation. De novo formation of a distinct coronary vascular population in neonatal heart.</a> Science. 345 (6192), 90-94 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bütün embriyonik kalplerinde koroner damarlar optik açıklık ve konfokal mikroskobu ile takip anti-PECAM1 antikoru ile wholemount immün tarafından görüntülendi. basit bir yöntem Babb ile embriyonik fare kalpleri temizlenmesi için, burada açıklanan, optik penetrasyon artar ve aort ve ventriküler duvarlarında lokalize kan damarlarının yüksek çözünürlüklü görüntüler yakalanmasını sağlar. Bu Vectashield (kırılma indisi 1.45) halinde gliserol tabanlı montaj reaktifler de Babb yüksek refraktif indeksi (1.56), daha derin doku penetrasyonu sağlayan daha da ışık saçılması azaltır, ancak, koroner damar 22 görüntülenmesi için kullanılmaktadır. Doku temizleme gibi daha az hazır araştırmacılara olabilir multiphoton ve hafif levha mikroskopisi olarak mikroskopi daha karmaşık, pahalı formlar için ihtiyacı ortadan kaldırmaktadır. Takas işlemi diğer yöntemlere 6-9 ve küçük örnekler ca olabilir karşılaştırıldığında son derece hızlıdırdoğrudan mikroskopi tabağına reaktiflerin küçük hacimli kullanılarak rried. damar sağlam boyama, yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için gereklidir; Anti-PECAM1 antikoru boyama uygun yüksek seviyeleri verdiği bulunmuştur koroner EC ve ticari olarak bir takım antikorların her türlü işaretleri olarak seçilmiştir. Buna ek olarak, floresan boyama Babb son derece sağlam olarak görülmektedir; (Işıktan korunmuş olarak) Babb oda sıcaklığında saklanabilir örnekler birkaç ay süreyle fluoresan sinyali korudu. peritruncal pleksus görüntülerini yakalamak özellikle PECAM1 antikor verimli, hem de damar bazen sorunlu olduğu gibi koroner endokardı etiketler gerçeği. peritruncal EC kıyasla aort lümeninin güçlü boyama görüntüleme parametrelerinin dikkatli ayarlanması gerekli, yani görüntülerin bazı bölgelerde aşırı doygunluk riski sonuçlandı. İdeal olarak, bir antikor boyama sadece damar EC kullanılacaktır; uygulamada,Ancak, Wholemount boyama istenen düzeyde verim uygun antikorlar bulmak zor olabilir. Son zamanlarda, yağlı asit bağlanma proteini 4 (FABP4), koroner damar EC 23 bir göstergesi olduğu gösterilmiştir ve bu nedenle PECAM1 bir alternatif de sağlayabilir. ancak, numuneler düz monte değildi aort ve kalp boşluklarının 3D morfolojisi korumak için yerine cam tabanlı yemekleri görüntülendi. yansıması için numunelerin derinliği nedeniyle kısa çalışma mesafeleri, yüksek büyütme hedefleri kullanımını engellemiştir. Ancak yüksek çözünürlüklü görüntüler piksel bekleme süresini artırmak ve görüntü yakalamak için en az 1024 x 1024 piksel dizisi boyutu kullanarak 10X objektif kullanılarak hala ulaşılabilir idi. Ancak bu, hücresel yapının ince analiz numunelerinin düz monte gerektirebilir, yapısı ve koroner damarların dağılımının analizi için yeterli idi. Montaj için kalbin bireysel parçaların Diseksiyon,örneğin, ventrikül duvar veya aort, gerekli olabilir. Seçenek olarak ise, aşırı örnekleme dekonvolüsyon ardından görüntünün çözünürlüğünü ve duyarlılığı arttırmak için gerçekleştirilebilir; bu ancak oldukça uzun tarayarak süreleri gerektirir ve işlemek için işlem gücünü bir sürü gerektirir son derece büyük görüntü dosyaları oluşturur. E15.5 kadar Kalpler başarıyla bu yöntem kullanılarak görüntülendi ve aynı protokol kullanılarak (en azından E11.5 kadar), tüm embriyo damar analiz etmek mümkündür. Diğer hücre tipleri, örneğin, düz kas hücreleri, aynı zamanda, bu teknik kullanılarak laboratuvarda görüntülenmiştir edilmiştir. Kalın dokuların, örneğin, kupa E15.5 daha büyük antikor penetrasyon sınırlayıcı bir faktör olabilir; uzun inkubasyon ve / veya yüksek bir deterjan gerekebilir. Görüntülerin büyük bir z yığını toplarken Buna ek olarak, lazerler doku uzak bölümlerini nüfuz olarak gücü azaltılabilir sinyali; Ancak confOcal arttırmadan Z mesafe ile lazer gücü geliştirmek için ayarlanabilir. Bu yöntem, koroner damar oluşumunun erken aşamaları ve geç gelişim evrelerinde koroner arterlerin desen hem odaklı mikroskopik analiz kolaylaştırır. dağıtım, dallanma ve kan damarlarının yapısı hakkında detaylı bilgiler bu anjiyogenez yollarının belirli kusurları ile genetik fare mutantlar çalışma için değerli bir araç yapma, kısa bir süre içinde elde edilebilir.

İşleyen bir koroner ağının kurulması, bu gelişim sürecini altında yatan moleküler sinyalleri içine değerli bilgiler sağlayabilir kalp fonksiyonu ve embriyonik gelişim ve genetik fare mutantlar analizi için çok önemlidir. Bir bütün olarak, embriyonik koroner pleksusu görselleştirmek için yeteneği, çok histolojik kesitlerin bir dizi sunulmuştur daha genetik mutantlar damar desen analizini kolaylaştırmak için gereklidir, ve mekanik bir sonucu olarak meydana gelebilir bilginin potansiyel kaybını önler doku dilimleme. Arterleri oluşturmak için kaderde gemiler ve kılcal derin ventriküller ve aort 1-3 hem de duvarları içinde lokalizedir. Ancak, Wholemount etiketli yüzeysel venöz / lenfatik damarların 4,5 yüksek çözünürlüklü görüntülerini sağlayabilir lazer tarama konfokal mikroskobu ile birlikte hücrelerin floresan etiketleme ederken, görüntüleme derinliği optik nüfuz ile sınırlıdır. kapağın yüksek çözünürlüklü görüntülemeKalbin tüm derinliği boyunca illaries ve arterler doku temizleme çeşit olmadan mümkün değildir. Kötü bir optik penetrasyon çoklu hücresel ve hücre dışı (örneğin, kollajen ve elastik liflerin) kalınlığındaki doku bileşenlerinin yüksek kırılma endeksi ile kaynaklanır. Bu, görüntüleme ışığı dağıtır bulanıklık neden ve kontrast azalmıştır. Yıkama maddesi tipik olarak, ışık engelsiz numune boyunca seyahat ve doku içine daha derine nüfuz edebilir, yani bu dokuların yüksek refraksiyon endeksi eşleşmesi. Su, nispeten düşük bir kırılma indisine sahip olduğu temizlemeden önce dokular genellikle suyu alınır. Yeni takas yöntemleri bir bolluk, ancak takas işlemi günler ya da haftalar sürebilir ve pahalı reaktifler 6-9 gerektirebilir kullanılan tekniğe bağlı olarak, son zamanlarda geliştirilmiştir. BABB (1: benzil alkol ve benzil benzoat: 2 karışımı) olan bir ucuz, yaygın olarak kullanılan temizleme maddesi, birSon derece hızlı bir şekilde örnekleri takas avantajı. BABB bazlı temizleme ve görüntüleme teknikleri nörolojik örnekleri ve çeşitli organlarda 10-13 daha önce tarif edilmiştir. 15.5 - Burada E (embriyonik gün) 11.5 den sıçangil kalplerinde kan damarlarının incelenmesi özel referansla, konfokal mikroskobu ile takip immunohistokimyasal örneklerin BABB temizlenmesi için sağlam ve basit bir teknik açıklanmaktadır. Ayrıca gösterilmiştir Bununla birlikte, teknik, aynı zamanda uzun bir ilgi belirteçleri olarak, yüksek kaliteli antikorlar kullanılabilir, tüm embriyo analizi, hem de diğer hücre tipleri de uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>FST</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Petri dishes</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri dishes</td><td>Sigma</td><td>P5112</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel minutien pins 0.2 mm diameter</td><td>FST</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Fine tip pastettes&amp;nbsp;</td><td>Alpha Laboratories</td><td>LW4061</td><td></td></tr><tr><td>1,000 ml pipette tips</td><td>Sorenson</td><td>34000</td><td></td></tr><tr><td>48-well plate</td><td>Falcon</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-Gard</td><td>World Precision Instrument</td><td>KWIKGARD</td><td>Silicone elastomer Sylgard184 packaged in a cartridge for mixing and dispensing</td></tr><tr><td>Kwik-Gard refill</td><td>World Precision Instrument</td><td>KWIKGLUE</td><td>Refill cartridges and dispensing tips</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Make up in PBS and store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>100% methanol</td><td>VWR</td><td>20847307</td><td></td></tr><tr><td>Tween&amp;reg;20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PECAM1 antibody, rat anti-mouse</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td>Primary antibody, dilute 1 in 50</td></tr><tr><td>Anti-CD31 polyclonal, rabbit polyclonal</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>Primary antibody, dilute 1 in 50</td></tr><tr><td>Anti-CD31/PECAM1 clone 2H8, armenian hamster monoclonal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA3105</td><td>Primary antibody, dilute 1 in 400</td></tr><tr><td>Endomucin antibody (V.7C7), rat monoclonal</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-65495</td><td>Primary antibody, dilute 1 in 50</td></tr><tr><td>Anti-SM22 alpha antibody, rabbit polyclonal</td><td>Abcam</td><td>ab14106</td><td>Primary antibody, dilute 1 in 250</td></tr><tr><td>Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11007</td><td>Secondary antibody, dilute 1 in 500</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG (H+L)Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Secondary antibody, dilute 1 in 500</td></tr><tr><td>Goat anti-Armenian Hamster IgG (H+L)Alexa Fluor 488</td><td>Abcam</td><td>ab173003</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21208</td><td>Secondary antibody, dilute 1 in 500</td></tr><tr><td>Phenolic screw cap</td><td>Wheaton</td><td>240408</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl alcohol</td><td>Sigma</td><td>402834</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl benzoate</td><td>Sigma</td><td>B6630</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane Imaging</td><td>image analysis software</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>NIH</td><td>Freeware</td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of coronary vessels in cleared embryonic hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

Kalp geliştikçe, ventriküler miyokardın çeşitli kaynaklardan endotel hücreleri (EC) tarafından işgal edilir ve vasküler pleksus oluşur. Ventriküler miyokardın içinde geliştirmek gemiler kalp dokusuna 18 oksijenli kan teslim kılcal ve arteriyel ağları oluşturmak için devam edecektir. Aort 14,19,20 lümenini çevreleyen koroner (peritruncal pleksus olarak da bilinir), ayrı bir kılcal ağ bağımsız geliştirmeye başlar sapları (E11.5 civarında), aynı zamanda. Peritruncal pleksus EC başlangıçta ancak sonuçta sadece bir gemi sağ ve sol koroner arterler 21 köklerini oluşturmak için oluyor aort her tarafında devam edecek, valf sinüslerin seviyesinde aort lümeni ile çoklu bağlantı oluşturur. etrafında peritruncal E13.5 ve ventriküler itibaren miyokard damarlar a kan akışını sağlayan, birbirine bağlı bir ağ oluşturmak üzere katılmakorta koroner damarların 14,22 içine. bozulmamış kalpleri BABB temizlenmesi ile birlikte anti-PECAM-1 antikoru ile EC boyanması, mümkün olan en erken aşamalarından itibaren gelişen koroner ağların analiz edilmesini sağlar. geç gelişim evrelerinde olgunlaşan koroner arterlerin desen de incelenebilir. Bu yöntem, aynı zamanda tüm embriyo damar leke için kullanılabilir (kadar E11.5 en az) ve örneğin, farklı antikorlar ile anti-alfa düz kas aktini (Sm22α) ve Endomucin. Şekil 1, Fiji yazılımı kullanılarak üretilen bir E11.5 kalp maksimum yoğunluğu z projeksiyonunu göstermektedir. Çini işlevi kalbin birden kısmi görüntüler toplamak ve tam bir görüntü içine bunları birleştirmek için kullanılmıştır; Bütün bu örnekte boyanma genel bir fikir vermek için yararlıdır. Bu aşamada PECAM1 antikor ağırlıklı olarak kalp ve çıkış v endokardiyal astar lekeleriessels, ancak birkaç ECS ( &#39;1A büyütülmüş olarak gösterilen, Şekil 1A kutulu bölgesi), sol ventrikül duvarı gözlenebilir. Buna ek olarak, peritruncal pleksus açık çıkış yoluna (OT) (Şekil 1B kutulu bölge) duvarında gözlenebilir. Bu durumda, çıkıntı oluşturmak için kullanılan z yığındaki dilimlerin sayısını azaltarak (Şekil 1B &#39;) daha fazla belirgin görüntülenmiştir aort lümeni ile bağlantı sağlayan, görüntünün netliğini geliştirmiştir. Şekil 2&#39;de, aort artan damar yakın bir E12.5 kalbinde görülebilir. Şekil 3 E12.5 kalbinde peritruncal pleksus gösterir. Şekil 3A 12-dilim z projeksiyon bazı gemiler z-yığını i bölme, (aynı zamanda ağır bir anti-PECAM1 antikoru ile lekeli) aort lümenine ventral lokalize ancak olarak, bütün plexus gösteriralt yığınlarının bir dizi nto (Şekil 3B-D) daha fazla görsel bilgi sağlar. Örneğin, Şekil 3B&#39;de öngörülen alt yığın tam projeksiyon görünür olmayan aort lümeninin ventral yüzeyi, bağlanma peritruncal teknesini göstermektedir. Şekil 4, E15.5 kalp kısmını göstermektedir; Koroner arterler Bu aşamada (Şekil 4A, 30 dilim projeksiyon) açıkça görebilir. 5 dilim z Şekil 4B gösterilen projeksiyonları ve C aort ve pulmoner vanalar da PECAM1 boyama ile görüntülenmiştir olabilir; dalları ve koroner kılcal ağ bağlantıları bu küçük alt-yığını projeksiyonlar da temizdir. Manuel segmentasyon teknikleri Fiji (Şekil 4D) veya Imaris (Şekil 4D ve E) kullanarak koroner arterleri vurgulamak için kullanılmıştır. Koroner arterlerin 3D yüzey hacmi render / aort lümen u oluşturulansing Imaris veya çevredeki damarsal (Şekil 4E ve F) olmadan izlenebilir. Bütün embriyoların damar da PECAM1 boyama / BABB açıklık kullanılarak incelenebilir. Sırasıyla embriyo ve sol tarafını (z dilimleri 66-110) - Şekil 4A ve A &#39;, sağ tarafında alt yığınlarının üretilen z projeksiyonlar (65 z dilimleri 11) göstermektedir. İki görüntünün karşılaştırması Floresan sinyalin yoğunluğu önemli ölçüde doku derin nüfuz azaltmadığını göstermektedir. Şekil 4B, PECAM1 (kırmızı sinyali) ve Endomucin (yeşil sinyal) antikorlar, bir E11.5 embriyo sırasıyla intersomitic arterler (ISA) ve damarlar etiketlemek için bir araya getirilmiştir. Şekil 4C SM22α (kırmızı sinyal) ve E11.5 embriyoda Uluslararası Denetim Standartlarının PECAM1 boyama (yeşil sinyali) gösterir. Şekil 6&#39;da, E11.5 embriyolarPECAM 1 ile boyanmıştır BABB boşluk (Şekil 4A) hemen sonra görüntü verilen ya da yaklaşık iki ay (Şekil 4B) aradan sonra bulundu. floresan sinyal başarıyla Babb numunenin uzun süreli depolamadan sonra hareketsiz görüntü için yeterince güçlü oldu. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig1.jpg" /> (Alexa 594 Anti-fare IgG Konjuge ile Tespit Edilen) Anti-PECAM1 Antikor ile E11.5 Kalp Şekil 1. immün. (A, B), bir 2 X 2 karo görüntü ters konfokal mikroskop 10X objektif kullanılarak toplanmıştır. PECAM1 antikor lekeleri endokardiyal ve vasküler EC hem. Projeksiyonlar (maksimum yoğunluk) Fiji yazılımı kullanılarak, 22 (A) veya 5 (b) Z, dilimleri 4 um kalınlığında her oluşturuldu. A &#39;ve B&#39; enlargemen vardırsırasıyla A ve B kutulu alanların ts. A &#39;de oklarla ventrikül duvar kan damarları gösterir; B &#39;, dirsek peritruncal pleksus gösterir. OT, çıkış yolu; LV, sol ventrikül, RV sağ ventrikül. Tüm görüntüler ön görüntüleridir. Ölçek A bar ve B = 200 mikron; A &#39;ve B&#39; = 100 mikron ölçekli barlar. Panel 1B &#39;Ivins ve diğ., 2015 19 uyarlanmıştır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig2.jpg" /> Anti-PECAM1 Antikor ile E12.5 Kalp Şekil 2. immün. Panel A 2x2 kiremitli tarama az projeksiyonu (maksimum yoğunluk) gösterir. A kutulu bölge ENLARG gösterilirA Ed &#39;; oklar proksimal aort (Ao) birden fazla kan damarları gösterir. LV, sol ventrikül, RV sağ ventrikül. Tüm görüntüler ön görüntüleridir. A Ölçek çubuğu = 200 mikron; A &#39;= 100 mikron ölçekli bar. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54800/54800fig3.jpg" /> E12.5 Heart Peritruncal Pleksusu 3. Görüntüleme Şekil. Anti-PECAM1 antikoru ile boyanmış E12.5 aort (AO) Konfokal görüntüler 10X objektif kullanılarak toplanmıştır. A z çıkıntı (maksimum yoğunluk) 12 Z dilimleri (4 um kalınlığında) elde edildi; Oklar peritruncal pleksus damarları göstermektedir. Belirtilen ve ayrı projecti üretmek için kullanılan BD 12 z dilimler üç alt-yığınlarının ayrıldıons; ok uçları aort lümenine peritruncal pleksus oluşturduğu bağlantıları gösterir. Aort lümeni ventral lokalize Peritruncal kaplar B ve C görebilir. Tüm görüntüler ön görüntüleridir. Ölçek çubuğu 50 mikron =. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54800/54800fig4.jpg" /> Bir E15.5 Heart 4. Koroner Arterler ve kapiller ağı Şekil. Anti-PECAM1 antikoru ile boyanmış bir E15.5 kalp Konfokal görüntüler 10X objektif kullanılarak toplanmıştır. Panel A 30 z dilim (4 mikron kalınlığında) üretilen maksimum yoğunluk z projeksiyon göstermektedir; oklar aorta (Ao) bağlanarak görülebilir sol ve sağ koroner arterleri (LCA ve RCA) gösterir. ayırıcı kullanarakt 5 z dilim aort ve pulmoner kapaklar (AOV ve PV) sırasıyla (mavi parantez) B ve C görülebilir alt yığınları. ventriküler kapiller pleksus bu küçük alt-yığını projeksiyonlar da nettir; pulmoner kapak (küçük kutu) proksimal kan damarları paneli C (büyük kutu) sağ alt büyütülmüş gösterilmektedir. Fiji Şişirme / kement aracı projeksiyon öncesi her z dilim el Kırmızı renk ile koroner arterleri doldurmak için kullanılan Panel D, örneğin, bireysel kan damarları, vurgulamak için kullanılmıştır. Imaris yazılım arterlerin (kırmızı) ve E ve F aort lümeninin (yeşil) 3D görüntüler oluşturmak için kullanılan; Yine bu her z dilim nesne hatlarını oluşturmak için sihirli değnek aracını kullanarak, elle yapılıyordu. Çevre hacim opaklık E gibi Karışım modunda değiştirilebilir. F &#39;de gösterildiği gibi alternatif olarak 3D görüntü elde edilebilir </strong&gt;. LV, sol ventrikül. Tüm görüntüler ön görüntüleridir. A = 100 mikron ölçekli bar. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54800/54800fig5.jpg" /> Embriyonik vaskülatürüne 5. Görüntüleme Şekil. Paneller A ve 10X objektif (kiremitli tarama) kullanılarak toplanmıştır anti-PECAM1 antikoru ile boyanmış bir E10.5 vahşi tip embriyo, bir A &#39;gösterisi konfokal görüntüler. Ortalama yoğunluk Z çıkıntılar embriyo kalınlığı boyunca floresan yoğunluğu, sadece hafif bir kayıp gösteren bir 120 z dilim tarama (4 um kalınlığında dilimler) z dilimleri 11-65 (A) ve 66-110 (A &#39;), elde edildi . Panel B, Antibod ile boyanmış bir E11.5 embriyo intersomitic damarları gösterir<html> Döşenmiş bir (ortalama yoğunluk z çıkıntı sırası intersomitic arter (ok) ve damarları (ok başı) leke PECAM1 (594-konjuge sekonder antikor kırmızı sinyali) ve Endomucin (EMCN, 488-konjuge sekonder antikor yeşil sinyal) karşı ler ) tarayın. Panel C, PECAM1 karşı antikorlar ile boyanmış bir E11.5 vahşi tip embriyo intersomitic arterler (ISA) (yeşil 488-konjuge sekonder antikor sinyali) ve SM22α (594-konjuge sekonder antikor kırmızı sinyal) göstermektedir. Konfokal görüntüler 20X kuru objektif kullanılarak toplandı ve maksimum yoğunluk Z projeksiyonları üretilmesi için kullanılmıştır. Tüm görüntüler sagital görüntüleridir. A ve B Ölçek çubukları = 250 um, C = 100 um &#39;deki ölçek çizgisi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> d / 54800 / 54800fig6.jpg &quot;/&gt; Babb Temizlendi Şekil 6. immüno Örnekleri en az iki ay için Floresan Sinyali saklayın. E11.5 embriyolar PECAM1 antikoru ile boyanmış ve Babb ile temizlendi; Aynı partiden embriyoların ya da iki aylık bir aradan sonra görüntülenmiştir. Panel A derhal görüntülü embriyonun intersomitic arterleri gösteriyor ve panel B embriyo iki ay sonra görüntülü gösterir. Konfokal görüntüler 10X kuru objektif kullanılarak toplandı ve maksimum yoğunluk Z projeksiyonları üretilmesi için kullanılmıştır. dAO, dorsal aorta. Görüntüler sagital görünümleri göstermek. Ölçek A bar ve B = 100 mikron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts at JoVE.com

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Biz optik açıklık ve konfokal mikroskobu ile takip standart immünolojik boyama yöntemleri kullanarak, E15.5 kadar bütün embriyonik fare kalplerinde koroner damarların analizi için bir protokol mevcut. Bu teknik, dizi bölgelerinin zaman alıcı analizi için gerek kalmadan tüm kalp boyunca kan damarlarının görselleştirme sağlar.

Temizlendi Embriyonik Kalpler Koroner Damarlar Analizi

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

analysis-of-coronary-vessels-in-cleared-embryonic-hearts

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.0K Görüntüleme.  UCL Institute of Child Health.  Biz optik açıklık ve konfokal mikroskobu ile takip standart immünolojik boyama yöntemleri kullanarak, E15.5 kadar bütün embriyonik fare kalplerinde koroner damarların analizi için bir protokol mevcut. Bu teknik, dizi bölgelerinin zaman alıcı analizi için gerek kalmadan tüm kalp boyunca kan damarlarının görselleştirme sağlar. 

Video: Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in the thymus proper vasculature formation and patterning is essential for thymocyte entry into the organ and mature T-cell exit to the periphery. The spatial arrangement of blood vessels in the thymus is dependent upon signals from the local microenvironment, namely thymic epithelial cells (TEC). Several recent reports suggest that disruption of these signals results in thymus blood vessel defects 1,2. Previous studies have described techniques used to label the neonatal and adult thymus vasculature 1,2. We demonstrate here a technique for labeling blood vessels in the embryonic thymus. This method combines the use of FITC-dextran or Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I (GSL 1 - isolectin B4) facial vein injections and CD31 antibody staining to identify thymus vascular structures and PDGFR-&beta; to label thymic perivascular mesenchyme 3-5. The option of using cryosections or vibratome sections is also provided. This protocol can be used to identify thymus vascular defects, which is critical for defining the roles of TEC-derived molecules in thymus blood vessel formation. As the method labels the entire vasculature, it can also be used to analyze the vascular networks in multiple organs and tissues throughout the embryo including skin and heart 6-10.

This article describes a method for labeling embryonic skin and thymus blood vessels.

Embriyonik Farelerde damarları Etiketleme Bir Yöntem

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, and allow for the study of the cellular and molecular basis of normal and abnormal cardiac morphogenesis. Recent emerging technologies of retrospective single clonal analyses make the study of cardiac morphogenesis at single cell resolution feasible. However, tissue opacity and light scattering of the heart as imaging depth is increased hinder whole-heart imaging at single cell resolution. To overcome these obstacles, a whole-embryo clearing system that can render the heart highly transparent for both illumination and detection must be developed. Fortunately, in the last several years, many methodologies for whole-organism clearing systems such as CLARITY, Scale, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB and PACT have been reported. This lab is interested in the cellular and molecular mechanisms of cardiac morphogenesis. Recently, we established single cell lineage tracing via the ROSA26-CreERT2; ROSA26-Confetti system to sparsely label cells during cardiac development. We adapted several whole embryo-clearing methodologies including Scale and CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis) to clear the embryo in combination with whole mount staining to image single clones inside the heart. The heart was successfully imaged at single cell resolution. We found that Scale can clear the embryonic heart, but cannot effectively clear the postnatal heart, while CUBIC can clear the postnatal heart, but damages the embryonic heart by dissolving the tissue. The methods described here will permit the study of gene function at a single clone resolution during cardiac morphogenesis, which, in turn, can reveal the cellular and molecular basis of congenital heart defects.

We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.

Görüntüleme Tek hücreli Çözünürlük embriyonik ve Postnatal Kalpleri Temizlendi

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Gelişim Biyolojisi

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

Embriyonik Anjiyojenezin Görselleştirilmesi ve Nicel Analizi<emXenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic lamellae and smooth muscle cells (SMCs), and an outer layer of fibroblasts and extracellular matrix. In contrast to the widespread study of pathological models (e.g., atherosclerosis) in the adult aorta, much less is known about the embryonic and perinatal aorta. Here, we focus on SMCs and provide protocols for the analysis of the morphogenesis and pathogenesis of embryonic and perinatal aortic SMCs in normal development and disease. Specifically, the four protocols included are: i) in vivo embryonic fate mapping and clonal analysis; ii) explant embryonic aorta culture; iii) SMC isolation from the perinatal aorta; and iv) subcutaneous osmotic mini-pump placement in pregnant (or non-pregnant) mice. Thus, these approaches facilitate the investigation of the origin(s), fate, and clonal architecture of SMCs in the aorta in vivo. They allow for modulating embryonic aorta morphogenesis in utero by continuous exposure to pharmacological agents. In addition, isolated aortic tissue explants or aortic SMCs can be used to gain insights into the role of specific gene targets during fundamental processes such as muscularization, proliferation, and migration. These hypothesis-generating experiments on isolated SMCs and the explanted aorta can then be assessed in the in vivo context through pharmacological and genetic approaches.

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Protocols for studying the embryonic and perinatal murine aorta using in vivo clonal analysis and fate mapping, aortic explants, and isolated smooth muscle cells are detailed here. These diverse approaches facilitate the investigation of the morphogenesis of the embryonic and perinatal aorta in normal development and the pathogenesis in disease.

Morfogenez ve embriyonik ve Perinatal aort patogenezi okumaya vivo içinde ve doku ve hücre Explant yaklaşımları kullanma

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

Nicel bütün Dağı ayirt analiz fare embriyo kardiyak progenitör nüfusun

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

Bütün Mount Epifluorescence kullanarak fare embriyogenez sırasında kalp odası gelişimin analizi

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes for CHD are still poorly understood. The developing mouse constitutes a valuable model for the study of CHD, because cardiac developmental programs between mice and humans are highly conserved. The protocol describes in detail how to produce mouse embryos of the desired gestational stage, methods to isolate and preserve the heart for downstream processing, quantitative methods to identify common types of CHD by histology (e.g., ventricular septal defects, atrial septal defects, patent ductus arteriosus), and quantitative histomorphometry methods to measure common muscular compaction phenotypes. These methods articulate all the steps involved in sample preparation, collection, and analysis, allowing scientists to correctly and reproducibly measure CHD.

In this protocol, we describe procedures to qualitatively and quantitatively analyze developmental phenotypes in mice associated with congenital heart defects.

Nitel ve Nicel Histolojik Yöntemlerle Fare Embriyolarında Konjenital Kalp Defektlerinin Analizi

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart disease. The development of the primitive cardiac valves involves the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) of endocardial cells from the atrioventricular canal (AVC) and outflow tract (OFT) regions of the heart in response to local inductive myocardial and endocardial signals. Once the cells delaminate and invade the extracellular matrix (cardiac jelly) located between the endocardium and the myocardium, the primitive endocardial cushions (EC) are formed. This process implies that the endocardium has to fill the gaps left by the delaminated cells and has to reorganize itself to converge (narrow) or extend (lengthen) along an axis. Current research has implicated the planar cell polarity (PCP) pathway in regulating the subcellular localization of the factors involved in this process. Classically, the initial phases of cardiac valve development have been studied in cross-sections of embryonic hearts or in ex vivo AVC or OFT explants cultured on collagen gels. These approaches allow the analysis of apico-basal polarity but do not allow the analysis of cell behavior within the plane of the epithelium or of the morphological changes of migrating cells. Here, we show an experimental approach that allows the visualization of the endocardium at valvulogenic regions as a planar field of cells. This experimental approach provides the opportunity to study PCP, planar topology, and intercellular communication within the endocardium of the OFT and AVC during valve development. Deciphering new cellular mechanisms involved in cardiac valve morphogenesis may contribute to understanding congenital heart disease associated with endocardial cushion defects.

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

Classically, the endocardium of the mouse embryonic valve primordium has been analyzed using transversal, coronal, or sagittal sections. Our novel approach for en face, two-dimensional imaging of the endocardium at valvulogenic regions allows planar polarity and cell rearrangement analysis of the endocardium during valve development.

En Yüz Fare Embriyolarında Düzlemsel Morfogenez Analizi için Endokardiyal Minderin Hazırlanması

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart ...

A Pipeline to Characterize Structural Heart Defects in the Fetal Mouse

Congenital heart diseases (CHDs) are major causes of infant death in the United States. In the 1980s and earlier, most patients with moderate or severe CHD died before adulthood, with the maximum mortality during the first week of life. Remarkable advances in surgical techniques, diagnostic approaches, and medical management have led to marked improvements in outcomes. To address the critical research needs of understanding congenital heart defects, murine models have provided an ideal research platform, as they have very similar heart anatomy to humans and short gestation rates. The combination of genetic engineering with high-throughput phenotyping tools has allowed for the replication and diagnosis of structural heart defects to further elucidate the molecular pathways behind CHDs. The use of noninvasive fetal echocardiography to screen the cardiac phenotypes in mouse models coupled with the high fidelity of Episcopic fluorescence image capture (EFIC) using Episcopic confocal microscopy (ECM) histopathology with three-dimensional (3D) reconstructions enables a detailed view into the anatomy of various congenital heart defects. This protocol outlines a complete workflow of these methods to obtain an accurate diagnosis of murine congenital heart defects. Applying this phenotyping protocol to model organisms will allow for accurate CHD diagnosis, yielding insights into the mechanisms of CHD. Identifying the underlying mechanisms of CHD provide opportunities for potential therapies and interventions.

This article details murine congenital heart disease (CHD) diagnostic methods using fetal echocardiography, necropsy, and Episcopic fluorescence image capture (EFIC) using Episcopic confocal microscopy (ECM) followed by three-dimensional (3D) reconstruction.

Fetal Faredeki Yapısal Kalp Kusurlarını Karakterize Etmek İçin Bir Boru Hattı

Congenital heart diseases (CHDs) are major causes of infant death in the United States. In the 1980s and earlier, most patients with moderate or severe ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

Yeni Bir<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Fare Kalp için&gt; Kültür Yöntemi

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Temizlendi Embriyonik Kalpler Koroner Damarlar Analizi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler