Biz prosedürlerin rakam tasarımı ve gösteri yardım için Roxann Hetu-Arbour müteşekkiriz. Laboratuvarda Araştırma Cole Vakfı Geçiş ödülü tarafından desteklenen, Discovery hayır verin. Doğa Bilimleri ve Kanada&#39;nın (NSERC) Mühendislik Araştırma Konseyi ve Kanada Yenilik Vakfı (CFI Liderler Fonu hayır. 31377 hibe) 419226-2012. Santé (FRQS) - KMH Fonds de recherche du Québec için chercheur-BOURSIER konumundadır olduğunu.

Bu protokol açıklanan tüm prosedürler kurumsal hayvan etik komitesi tarafından onaylanmış ve Hayvan Bakımı yönergelere Kanada Konseyi izleyin edilmiştir. Not: Steril / spesifik patojen free konut koşulları sağlamak için, biyolojik güvenlik kabini veya laminer akış kaputu içinde canlı farelerin doğrudan kullanım ile ilgili tüm işlemleri yürütmek. Temizleyin veya sterilize kafesleri, kısıtlayıcı cihazlar, konut malzemeleri, uygun hayvanlara verilen yemi ve su. enjeksiyonlar için ve kan alma için, sadece steril, tek kullanımlık iğneler kullanın. Aseptik teknik greft hazırlanması sırasında çok önemlidir. Alıcı 1. Farelerin hazırlanması <ol><li> Zamanla periferik kan ve kemik iliği sulandırma bireysel takiplerinde etkinleştirmek için kulak çentikler (ya da yerel hayvan etik kurulu 8 tarafından onaylanmış başka bir yöntemle) ile alıcı fareler tanımlayın. Nakil sonrası izlem için fareler tartılır. Bize(Az 25 g), 7 ila 12 hafta eski e alıcı fareler. Not: Verilen örnekte, CD45.1 + CD45.2 + alıcı fareler congenic B6.SJL fareler ile C57BL / 6 fareler geçerek evinde yetiştirildi. </li><li> hematopoetik aktivite yok etmek için 450 rad iki doz ile alıcı fareler ışın tedavisi. İlk doz transplantasyondan önceki gün ve transplantasyon öncesi ikinci 1-2 saat verin. Not: X-ışını veya gama ışınları hem uygun tesislerin doluluk durumuna bağlı olarak kullanılabilir. </li></ol> Verici ve Rakip kemik iliği hücrelerinin 2. Hazırlık <ol><li> Donör (testi ve kontrolü; CD45.2 +) Euthanize ve rakip (CD45.1 +; B6.SJL), boyunları kırılarak ya da yerel hayvan etik komitesi tarafından onaylanmış yöntemler kullanılarak takip CO 2 boğulma tarafından fareler. </li><li> Boş bir petri veya steril gazlı bez üzerine, açık geniş sırtlarında, bacaklar fareler yerleştirin i (temiz iş yüzeyi tutmak için)Bir biyolojik güvenlik kabini nside. % 70 etanol /% 30 H deri ve kürk Islak 2 O (hac / hac). </li><li> Bir cerrahi bıçak veya keskin bir makas ile ayak kesti. bacak boyunca cildi açın ve tırtıklı forseps kullanarak cilt çekmeye kesin. aşırı kas kesip. </li><li> Bacak kemiği çekerek ve bir karşı güç olarak pelvis kemikleri karşı makas bıçakları kullanarak femur yerinden. tibia ayırın ve dizkapağı gelen femur ve kas ve tendonların artıklarını temizleyin. 6-yuvalı doku kültürü plakasında 2-3 ml steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde kemik yerleştirin. </li><li> Steril PBS 5 ml kemikleri temizlenerek kemik iliği hücreleri toplamak. <ol><li> forseps ile yavaşça kemik tutun ve kemik bir ucuna bir dolu 1 ml şırınga bağlanmış bir 25 G iğne yerleştirin. pistonu ve 15 ml konik bir tüp içinde hücreleri toplamak. Kemik merkezi beyaz kadar gerektiği gibi tekrarlayın. </li></ol></li><li> iğne geçen tekrarlı hücreleri ayırmaktek bir hücre süspansiyonu elde etmek. kabarcıklar ve aşırı kuvvet kaçının. Not: Bu adımda, hücre canlılığını geliştirmek için biraz daha büyük bir iğne (22 g) kullanın. </li><li> homojen bir hücre süspansiyonu sağlamak ve enkaz ve kümeleri kaldırmak için 70 mikron naylon süzgeç vasıtasıyla hücrelere geçerler. </li><li> Bir hemasitometre kullanarak hücre sayımı için bir numuneyi çıkarın. 4 ° C&#39;de 5 dakika 200 x g&#39;de kalan hücre süspansiyonu santrifüj. Steril PBS (10 8 hücre / ml) içinde gerekli olan hücre yoğunluğu yeniden ayarlayın. hücreleri buz üzerinde tutun. </li></ol> 3. Donör Hücre HSC Benzerleri oluşturulması <ol><li> Flow sitometri boyama için alt polistiren tüp yuvarlak bir 5 ml&#39;lik 3 x 10 6 hücre (30 ul) eşdeğer aktarın. (2.5 ug / ml&#39;lik bir nihai konsantrasyonda (PBS,% 0.1 büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) ve 1 mM EDTA ile takviye edilmiş) boyama bileşiği içinde sulandırılmış) özel olmayan renklenme engelleme CD16 / CD32 karşı işaretlenmemiş antikora eşit hacim. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe. </li><li> boyama tamponu içinde hazırlanmış 90 ul florokrom-konjuge antikor ana karışımı ekleyin: biyotinlenmiş Lineage kokteyl (B220, CD3e, CD11b, GR1, Ter119), Sca1, CD117, CD135, CD150. ışıktan koruyarak 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Not: Uygun seyreltmeler antikorun her lot için belirlenmelidir. Bu çalışmada kullanılan dilüsyonları için Malzemelerin tabloya bakınız. </li><li> bağlanmamış antikorların çıkarılması için 4 ° C&#39;de 5 dakika 200 x g&#39;de hücreleri, girdap ve santrifüj 2 mi lekeleme tampon maddesi ekleyin. hafifçe vurarak süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet süzün. </li><li> Lekeleme tampon maddesi içinde seyreltilmiş 10 ul florokrom-eşlenik streptavidin ekleyin (Malzeme Tablo). ışıktan koruyarak 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. bağlanmamış streptavidin kaldırmak için adım 3.3 olarak yıkayın. </li><li> En az altı dedektör 9 ile debi sitometresinde hücre örnekleri edinin. Lin sıklığını belirlemek - Sca1 + CD117 + CD135 - CD150 <suAnaliz şablon kullanılarak her numune p&gt; + hücreleri (HSClerin tahmin edilen) Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, daha önce 10,11 rapor etmiştir. Not: Bu nüfus içinde fonksiyonel HKH&#39;lerin sıklığı 1/3 ve 1/5 2,12 arasında olduğu tahmin edilebilir. </li><li> (Tipik olarak, bu örnekte, rakip B6.SJL CD45.1 +) temel olarak altında ve Şekil 2&#39;de ayrıntılı olarak, bir örnek kullanarak, tüm örnekler 11 tahmini HSC eşdeğerleri oluşturulması. <ol><li> aşağıdaki formüller kullanılarak gerekli hücrelerin sayısını hesaplayın: #transplanted HSC / alıcının = 5 x 10 5 hücre X tahmin HSC frekansı (başlangıç ​​numune için belirlenen bu sayı vahşi tipli C57BL / 6 fareleri için, genellikle 75 ila 125) 10-12. Not: Şekil 2&#39;de, Örnek A için, sonuç 139 HKH&#39;lerin olduğunu. (Diğer örnekler için Şekil 2&#39;de örneğin Örnek B) toplam sayısı nakledilen hücrelerin = # transekili HKH&#39;lerin / HSC frekansı. Not: Şekil 2, örnek B, sonuç 197.826 (ya da yaklaşık olarak 2 x 10 5) toplam kemik iliği hücreleri. </li></ol></li><li> Yukarıda elde edilen sonuçları kullanarak, her numune için, nakil alıcısına başına gereken hücrelerin toplam sayıları hesaplayın. Not: Bu sayı temel örneği (rakip) için 5 x 10 5 olmalıdır. <ol><li> alıcı farelerin sayısı adım 3.7 elde çarpın ve şırınga ölü hacim telafi etmek için en azından iki ilave fareler için yeterli hücre ekleyin. </li></ol></li><li> Adım 3.6 hesaplanan ve steril PBS kullanarak enjeksiyon başına 200 ul nihai ses seviyesini ayarlamak olarak 1 HSC eşdeğer oranda (örneğin, CD45.1 +) rakip ve 1 test hücreleri (CD45.2 +) karıştırın. Not: Beş alıcı farelerin bir grup önerilen hacminin büyümesine, dolayısıyla 3.5 x 10 6 rakip kemik iliği hücreleri ihtiva eden, en az 1.4 mi, olduğu (ya da olur için973, Şekil 2&#39;de Örnek A) için tahmin edilen HSC hücreleri, test hücre eşdeğer sayısı (Şekil 2&#39;de, Örnek B eşdeğeri) 197.826 x 7 = 1.384.782 kemik iliği hücreleri olabilir. </li></ol> 4. Kemik İliği Nakilleri <ol><li> Kan damarlarının genişlemesine sağlamak ve lateral kuyruk daha görünür damarları yapmak için kırmızı ısı lambası ile adım 1.2 ışınlanmış alıcı fareler ısıtın. </li><li> 27 G iğne (veya daha küçük) ile donatılmış bir 1 ml tüberkülin şırıngası hazırlayın. Aspire (3 alıcı fareler için) hazırlanan hücre süspansiyonu, yaklaşık 750 ul. şırınga içinde hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olun. </li><li> frenleyici bir cihaz içine fare yerleştirin. kuyruk inceleyin ve kuyruk her iki tarafında açıkça görülebilir olmalıdır yanal kuyruk venleri arayın. etanol ile enjeksiyon bölgesini silin. Yukarı konik iğneyi deriye paralel ve pistonu hafifçe bastırın. Enjeksiyon kolay olmalıdır. kuvvet yeniden isequired iğne ven değil. Not: Eski fareler damar daha zor bulma yapabilir kalın bir deri var. İğne ven değilse, ilk enjeksiyon yerinde iğne proksimal takın. </li><li> İğneyi çıkarın ve kanamayı durdurmak için birkaç saniye için steril gazlı bez ile enjeksiyon bölgesini basın. Temiz bir kafesin içine fare aktarın. Not: İğne çok sıkıcı hale gelebilir, bundan sonra üç enjeksiyon, aynı şırınga ve iğne kullanın. </li><li> Nakil sonrası takipte, ilk beş gün boyunca fareler rehydrate steril PBS subkutan 1 ml enjekte edilir. (; Opsiyonel gerekirse) enfeksiyonları önlemek için içme suyu antibiyotik ekleyin. İlk üç hafta boyunca her iki ya da üç gün fareler tartılır ve fazla% 15-20 oranında kendi nakil öncesi vücut kilo kaybı (ya da yerel hayvan etik komitesi tarafından belirlenir) olan fareler euthanize. </li></ol> Periferik Kan 5. Analizi <ol><li> bir damla kan toplayın (approx. EDTA tüpleri içine 50-100 ul). <ol><li> Mandibular ven kan toplamak için, çene kemiği altında bulunan tüysüz noktaya yakın yüz cilt delmek ve kan 13 damla almak için toplama tüp yerleştirmek için bir neşter veya 22 G iğne kullanın. çok soyundan sulandırma takip etmek nakilden sonra 4, 8, 12 ve 16 haftalarda kan toplayın. </li></ol></li><li> Aşama 5.1.1 toplanan kan damla 1 ml taze hazırlanmış RT alyuvar lisiz tamponu (9 kısım 0.16 M NH4CI + 1 kısım 0.17 M Tris-HCI, pH 7.65) ilave. 5 ml flow sitometri için uygun yuvarlak dipli polistiren tüp karıştırın ve transfer örnek. Oda sıcaklığında 4 dakika bekletin. </li><li> buz soğukluğunda PBS 4 hacim ekleyin. uçtan uca çevirerek karıştırın ve buz üzerinde hemen aktarın. 4 ° C&#39;de 200 x g&#39;de santrifüjleyin 10 dakika. </li><li> hafifçe vurarak süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet süzün. Süpernatant berrak ve kırmızı olmalıdır. kısaca tampon ve vorteks boyama 2 ml ekleyin. 200 XGA santrifüjleyin 5 dakikaT, 4 ° C. </li><li> hafifçe vurarak süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet süzün. </li><li> CD45.1, CD45.2, CD3e, CD19, GR1: adımlara 3.3 3.1 ayrıntılı genel protokolünü kullanarak flow sitometri boyama ve aşağıdaki ana karışımı için antikorlar ile devam edin. </li><li> En az altı dedektör 9 ile debi sitometresinde hücre örnekleri edinin. Şekil 3&#39;te verilen analiz şablon kullanılarak her numune her bir soy (CD19 + B lenfositleri, CD3e + T lenfositleri, GR1 parlak granülositler) ve 10,11 geçme donor kaynaklı hücrelerin sıklığını belirler. </li></ol> Kemik İliği Sulandırma 6. Analizi <ol><li> bölüm 2. Leke master karışımı için adımlar 3.3 3.1 ayrıntılı genel protokolünü kullanarak flow sitometri analizi için hücreleri ve aşağıdaki antikorlar ayrıntılı olarak kemik iliği hücreleri toplamak: Lineage kokteyl, Sca1, CD117, CD135, CD150, CD45.1 , CD45.2. lin AlgılamaAşama 3.4 de tarif edildiği gibi florokrom-eşlenik streptavidin kullanılarak EAGE kokteyl antikorlar. </li><li> En az sekiz dedektör 9 ile debi sitometresinde hücre örnekleri edinin. Sadece altı varsa CD135 + hücreleri dahil edileceği gibi, kalıtsal aynı kanala CD135 ekleyin. Donör kaynaklı Lin sıklığını belirlemek - Sca1 + CD117 + CD135 - Şekil 4 ve 10 geçme olarak sağlanan analiz şablon kullanılarak her numunede CD150 + HSC hücreleri. </li></ol>

<ol>
	<li>Li, H. W., Sykes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+haematopoietic+cell+transplantation.">Emerging concepts in haematopoietic cell transplantation.</a> Nat Rev Immunol. 12 (6), 403-416 (2012).</li><li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells.">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li><li>Kim, I., He, S., Yilmaz, O. H., Kiel, M. J., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+purification+of+fetal+liver+hematopoietic+stem+cells+using+SLAM+family+receptors.">Enhanced purification of fetal liver hematopoietic stem cells using SLAM family receptors.</a> Blood. 108 (2), 737-744 (2006).</li><li>Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+analysis+of+murine+hematopoietic+stem+cells.">Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells.</a> Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).</li><li>Rossi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Less+Is+More:+Unveiling+the+Functional+Core+of+Hematopoietic+Stem+Cells+through+Knockout+Mice.">Less Is More: Unveiling the Functional Core of Hematopoietic Stem Cells through Knockout Mice.</a> Cell Stem Cell. 11 (3), 302-317 (2012).</li><li>Till, J. E., McCulloch, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+measurement+of+the+radiation+sensitivity+of+normal+mouse+bone+marrow+cells.">A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells.</a> Radiat Res. 14, 213-222 (1961).</li><li>Shen, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+Ly-5+cDNA.">Cloning of Ly-5 cDNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (21), 7360-7363 (1985).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+GM+mice.">Identification of GM mice.</a> Laboratory Animals. 37 (suppl 1), 33-35 (2003).</li><li>Rundberg Nilsson, A., Bryder, D., Pronk, C. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+determination+of+rare+populations+by+flow+cytometry:+A+hematopoietic+stem+cell+perspective.">Frequency determination of rare populations by flow cytometry: A hematopoietic stem cell perspective.</a> Cytometry Part A. 83A (8), 721-727 (2013).</li><li>Abidin, B. M., Owusu Kwarteng, E., Heinonen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frizzled-6+Regulates+Hematopoietic+Stem/Progenitor+Cell+Survival+and+Self-Renewal.">Frizzled-6 Regulates Hematopoietic Stem/Progenitor Cell Survival and Self-Renewal.</a> J Immunol. 195 (5), 2168-2176 (2015).</li><li>Heinonen, K. M., Vanegas, J. R., Lew, D., Krosl, J., Perreault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt4+enhances+murine+hematopoietic+progenitor+cell+expansion+through+a+planar+cell+polarity-like+pathway.">Wnt4 enhances murine hematopoietic progenitor cell expansion through a planar cell polarity-like pathway.</a> PLoS One. 6 (4), e19279 (2011).</li><li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors.">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li><li>Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+simple,+and+humane+method+for+submandibular+bleeding+of+mice+using+a+lancet.">A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet.</a> Lab Anim (NY). 34 (9), 39-43 (2005).</li><li>Santaguida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JunB+protects+against+myeloid+malignancies+by+limiting+hematopoietic+stem+cell+proliferation+and+differentiation+without+affecting+self-renewal.">JunB protects against myeloid malignancies by limiting hematopoietic stem cell proliferation and differentiation without affecting self-renewal.</a> Cancer Cell. 15 (4), 341-352 (2009).</li><li>Czechowicz, A., Kraft, D., Weissman, I. L., Bhattacharya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transplantation+via+antibody-based+clearance+of+hematopoietic+stem+cell+niches.">Efficient transplantation via antibody-based clearance of hematopoietic stem cell niches.</a> Science. 318 (5854), 1296-1299 (2007).</li><li>Zhang, C. C., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+hematopoietic+stem+cells+change+their+surface+phenotype+during+ex+vivo+expansion.">Murine hematopoietic stem cells change their surface phenotype during ex vivo expansion.</a> Blood. 105 (11), 4314-4320 (2005).</li><li>Benveniste, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermediate-Term+Hematopoietic+Stem+Cells+with+Extended+but+Time-Limited+Reconstitution+Potential.">Intermediate-Term Hematopoietic Stem Cells with Extended but Time-Limited Reconstitution Potential.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 48-58 (2010).</li><li>Fazekasde St Groth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evaluation+of+limiting+dilution+assays.">The evaluation of limiting dilution assays.</a> J Immunol Methods. 49 (2), R11-R23 (1982).</li><li>Louis, I., Heinonen, K. M., Chagraoui, J., Vainio, S., Sauvageau, G., Perreault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+signaling+protein+Wnt4+enhances+thymopoiesis+and+expands+multipotent+hematopoietic+progenitors+through+beta-catenin-independent+signaling.">The signaling protein Wnt4 enhances thymopoiesis and expands multipotent hematopoietic progenitors through beta-catenin-independent signaling.</a> Immunity. 29 (1), 57-67 (2008).</li><li>Cui, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+protocol+for+total+body+irradiation+for+allogeneic+bone+marrow+transplantation+in+mice.">Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice.</a> Bone Marrow Transplant. 30 (12), 843-849 (2002).</li><li>Benz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+Stem+Cell+Subtypes+Expand+Differentially+during+Development+and+Display+Distinct+Lymphopoietic+Programs.">Hematopoietic Stem Cell Subtypes Expand Differentially during Development and Display Distinct Lymphopoietic Programs.</a> Cell Stem Cell. 10 (3), 273-283 (2012).</li><li>Eppert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+gene+expression+programs+influence+clinical+outcome+in+human+leukemia.">Stem cell gene expression programs influence clinical outcome in human leukemia.</a> Nat Med. 17 (9), 1086-1093 (2011).</li><li>McIntosh, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonirradiated+NOD,B6.SCID+Il2rgamma-/-+Kit(W41/W41)+(NBSGW)+mice+support+multilineage+engraftment+of+human+hematopoietic+cells.">Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rgamma-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Burada açıklanan protokol bilinen rakip HKH&#39;lerin karşı donör (test) HKH&#39;lerin göreceli uygunluğunu değerlendirmek için tasarlanmıştır. Yarışmanın durum (kök hücre fitness ılımlı düşüşler tespit etmek için daha büyük olasılıkla) tahlil göreceli hassasiyetini arttırır ve ışınlama ve enjeksiyonu etkinliğinin için bir iç teknik kontrol sağlar. Bununla birlikte, HSC spor mutlak ölçü olarak kullanılmamalıdır; Rekabetçi sulandırma bir azalma otomatik HKH&#39;lerin rekabet...

Hematopoiezis yaralanma, radyasyon ve hücre ölümü ile kaybolmuş kan hücrelerinin doldurulmasını sağlayan bir rejeneratif bir süreçtir. Bu işlem, büyük ölçüde Yetişkin kemik iliğinde bulunan hematopoietik kök hücreler (HSC) ile sağlanmaktadır. Buna ek olarak, hematopoietik kök hücreler, otoimmün bozukluklar, hematolojik malignanlıklar ve immün yetmezliği 1 terapötik amaçlar için kullanılabilir. daha iyi çoğalma genişlemesi ve ulaşmak ve nakli sonrasında alıcı kemik iliğini aşılamak için kendi yeteneği dahil olmak üzere, HSC işlevini düzenleyen mekanizmaları anlamak için bir ihtiyaç vardır. Son çalışmalar, ileriye yönelik olarak, yaklaşık% 50 saflıkta 2-4 yetişkin HSClerin ve fetal HSClerin ettirecek SLAM aile üyeleri CD150 ve CD48 dahil olmak üzere birçok hücre yüzey belirteçleri, rapor olmakla birlikte, işlevsel HSCler altın standart ölçmek için bir in vivo deney, repopulating kalır kan c yeniden kurmak için yeteneklerini belirlemekIşınlanan ev 5 ell üretimi. In vivo klonal repopulating tahlil başlangıçta kadar ve McCulloch 6 tarafından geliştirilen ve o zamandan beri rafine ve genişletilmiştir. Başlangıçta tanımlandığı gibi, HKH&#39;lerin kendini yenileme ve farklılaşma yoluyla yaşam boyu kan hücresi üretimini sağlamak. Işınlanan alıcıya HKH&#39;lerin transferi Böylece ABD değerlendirmek sağlar: farklı kan hücre soylarının analizi ile (T lenfositler, B lenfositler, granülositler, monositler) ve seri transplantasyonu ile kendini yenileme kapasitelerini ayırt etme yeteneği. Tahlil genellikle HKH&#39;lerin iki nüfusun işlevselliği ve / veya miktar karşılaştırılması yer alacağı, örneğin, tedavi veya HKH&#39;lerin bakım veya genişleme etkileyebilecek değişik faktörlerin ile işlenmemiş olan farklı genotipleri veya hücre iki farelerin gelen hücreler kültür. Donör kimerizm, veya transfer donör HKH&#39;lerin t katkısıO kan hücresi üretimi daha sonra hücre yüzeyi markerleri veya alıcı ya da ev sahibi donör hücreleri ayırt edecek başka yöntemler kullanılarak periferik kan akış sitometri analizi ve kemik iliği ile tespit edilebilir. En yaygın olarak kullanılan belirteçler kesinlikle aşağıda verilen örnekler için seçtiğiniz gen Ptprc veya CD45 lökosit antijen 7 için iki alleldir. klonal repopulation tahlil rekabetçi ya da rekabetçi olmayan olabilir. bir rekabetçi olmayan bir ortamda, kontrol ve test HSC hücreleri ayrı bir alıcı farelere aktarıldı ve her hücre tipi için sonuç birbirinden bağımsız olacaktır. Rekabetçi bir ortamda, test ve kontrol hem HKH&#39;lerin işlevi rakip HKH&#39;lerin bir nüfusa karşı ölçülür. Burada açıklanan protokol rekabetçi bir ortam kullanır, ancak, aynı zamanda, rekabetçi olmayan durumlar için uyarlanabilir. Her iki yaklaşımın da avantajları ve sınırlamaları var ve biz detaylı olarak bunları karşılaştırmak olacaktırtartışma. Biz de nakledilen HKH&#39;lerin sayısında hakkaniyeti sağlamak için farklı yaklaşımlar tarif seyreltme deneyi (LDA) sınırlayarak HKH&#39;lerin ölçülmesi için tahlil adapte ve sonuçların yorumlanması için başarılı ve başarısız nakli hem de örnekler sunmak nasıl açıklar.

<table><tbody><tr><td>Microtainer tubes with K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;EDTA</td><td>BD Biosciences</td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>20 G needle</td><td>BD Syringe</td><td></td><td>For blood sampling from the mandibular vein</td></tr><tr><td>LabQuake Shaker rotisserie</td><td>Thermo&amp;nbsp; Scientific</td><td>C415110</td><td></td></tr><tr><td>Purified anti-mouse CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>2.50 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Pe-Cy7-conjugated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11)</td><td>eBioscience</td><td>25-0031</td><td>0.25 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>PE-conjugated anti-mouse CD19 (clone 1D3)</td><td>eBioscience</td><td>12-0193</td><td>0.25 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>APC-eFluor780 (APC-Cy7 equivalent)-conjugated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5)</td><td>eBioscience</td><td>47-5931</td><td>0.25 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>FITC-conjugate anti-mouse CD45.1 (clone A20)</td><td>eBioscience</td><td>11-0453</td><td>2.50 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>eFluor450-conjugated anti-mouse CD45.2 (clone 104)</td><td>eBioscience</td><td>48-0454</td><td>1.00 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Biotinylated anti-human/mouse CD45R (B220) (clone RA3-6B2)</td><td>eBioscience</td><td>13-0452</td><td>1.25 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Biotinylated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11)</td><td>eBioscience</td><td>13-0031</td><td>1.25 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Biotinylated anti-mouse CD11b (clone M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>13-0112</td><td>1.25 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Biotinylated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5)</td><td>eBioscience</td><td>13-5931</td><td>1.25 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Biotinylated anti-mouse TER119 (clone TER119)</td><td>eBioscience</td><td>13-5921</td><td>0.625 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>V500 streptavidin</td><td>BD Biosciences</td><td>56149</td><td>0.5 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>PE-conjugated anti-mouse CD117 (clone 2B8)</td><td>BD Biosciences</td><td>553355</td><td>0.25 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>PE-Cy7-conjugated anti-mouse Ly6A/E (Sca1) (clone D7)</td><td>BD Biosciences</td><td>558162</td><td>0.25 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>PerCP-eFluor710-conjugated anti-mouse CD135 (clone A2F10)</td><td>eBioscience</td><td>46-1351</td><td>0.5 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Alexa fluor 647-conjugated anti-mouse CD150 (clone TC15-12F12.2)</td><td>Biolegend</td><td>115918</td><td>0.625 &amp;mu;g/ml
BD Biosciences and eBioscience do not carry the same clone</td></tr><tr><td>1 ml tuberculin syringe with 27 G needle</td><td>BD Syringe</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>1 ml tuberculin syringe with 25 G needle</td><td>BD Syringe</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m cell strainer</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr></tbody></table>

competitive transplants to evaluate hematopoietic stem cell fitness

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to reestablish blood cell production for the lifespan of the recipient. This protocol explains how to set up a functional assay to compare the HSC capacities of two different populations of cells, such as bone marrow from mice of two different genotypes, and how to analyze the recipient mice by flow cytometry. The protocol uses HSC equivalents rather than cell sorting for standardization and discusses the advantages and disadvantages of both approaches. We further discuss different variations to the basic protocol, including serial transplants, limiting dilution assays, homing assays and non-competitive transplants, including the advantages and preferred uses of these varied approaches. These assays are central for the study of HSC function and could be used not only for the investigation of fundamental HSC intrinsic aspects of biology but also for the development of preclinical assays for bone marrow transplant and HSC expansion in culture.

(Ayrıca aşağıda açıklanmıştır) ikincil nakli dahil rekabetçi nakli ayarı, genel bir açıklama Şekil 1&#39;de bulunabilir. Transplantasyon öncesi kemik iliği HKH&#39;lerin için temsili bir analiz Şekil 2&#39;de bulunabilir. Daha detaylı bilgi çiftler dışlanması ve ölü hücreler başka yerde 9 bulunabilir. 3 ve 4, sırasıyla p...

Watch this Scientific Journal Video about Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness at JoVE.com

Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

This protocol provides step-by-step guidelines for setting up competitive mouse bone marrow transplant experiments to study hematopoietic stem/progenitor cell function without prior purification of stem cells by cell sorting.

Rekabetçi Nakli Hematopoetik Kök Hücre Fitness değerlendirin

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to ...

competitive-transplants-to-evaluate-hematopoietic-stem-cell-fitness

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

15.2K Görüntüleme.  Institut National de la Recherche Scientifique. This protocol provides step-by-step guidelines for setting up competitive mouse bone marrow transplant experiments to study hematopoietic stem/progenitor cell function without prior purification of stem cells by cell sorting. 

Video: Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

Transduction-Transplantation Mouse Model of Myeloproliferative Neoplasm

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the gene of interest in hematopoietic cells and can be used to study the gene's role in normal and/or malignant hematopoiesis. This protocol provides a detailed description on how to perform transduction-transplantation using calreticulin (CALR) mutations recently identified in myeloproliferative neoplasm (MPN) as an example. In this protocol whole bone marrow cells from 5-flurouracil (5-FU) treated donor mice are transduced with a retrovirus encoding mutant CALR and transplanted into lethally irradiated syngeneic hosts. Donor cells expressing mutant CALR are marked with green fluorescent protein (GFP). Transplanted mice develop an MPN phenotype including elevated platelets in the peripheral blood, expansion of megakaryocytes in the bone marrow, and bone marrow fibrosis. We provide a step-by-step account of how to generate retrovirus, calculate viral titer, transduce whole bone marrow cells, and transplant into irradiated recipient mice.

This manuscript provides a description of the methodology used to establish transduction-transplantation mouse models. A detailed account is given of technical errors to avoid when performing bone marrow transplants. A clear understanding should be gained of the importance of high viral titer, transfection/transduction, and irradiation.

Myeloproliferatif tümörün İletimi-Transplantasyon Fare Modeli

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the ...

Kanser Araştırmaları

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules that regulate HSCs. In these transplant model systems, the function of HSCs is determined by the ability of these cells to engraft and reconstitute lethally irradiated recipient mice. Commonly, the donor cell contribution/engraftment is measured by antibodies to donor- specific cell surface proteins using flow cytometry. However, this method heavily depends on the specificity and the ability of the cell surface marker to differentiate donor-derived cells from recipient-originated cells, which may not be available for all mouse strains. Considering the various backgrounds of genetically modified mouse strains in the market, this cell surface/ flow cytometry-based method has significant limitations especially in mouse strains that lack well-defined surface markers to separate donor cells from congenic recipient cells. Here, we reported a PCR-based technique to determine donor cell engraftment/contribution in transplant recipient mice. We transplanted male donor bone marrow HSCs to lethally irradiated congenic female mice. Peripheral blood samples were collected at different time points post transplantation. Bone marrow samples were obtained at the end of the experiments. Genomic DNA was isolated and the Y chromosome specific gene, Zfy1, was amplified using quantitative Real time PCR. The engraftment of male donor-derived cells in the female recipient mice was calculated against standard curve with known percentage of male vs. female DNAs. Bcl2 was used as a reference gene to normalize the total DNA amount. Our data suggested that this approach reliably determines donor cell engraftment and provides a useful, yet simple method in measuring hematopoietic cell reconstitution in murine bone marrow transplantation models. Our method can be routinely performed in most laboratories because no costly equipment such as flow cytometry is required.

Determining donor cell engraftment presents a challenge in mouse bone marrow transplant models that lack well-defined phenotypical markers. We described a methodology to quantify male donor cell engraftment in female transplant recipient mice. This method can be used in all mouse strains for the study of HSC functions.

Rekabetçi bir mürin Kemik İliği Transplantasyon Modelinde Donör Hücre Aşı belirleme Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR kullanarak

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Tıp

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

Embriyonik hematopoetik kök hücre öncüleri endotel hücre niş ortak kültürü ile kombine sıralama tek hücre dizini kullanarak klonal analizi

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Gelişim Biyolojisi

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood cytopenias, dysplasia, and a propensity for transformation to acute leukemia. NUP98-HOXD13 (NHD13) transgenic mice recapitulate human MDS in terms of peripheral blood cytopenias, dysplasia, and transformation to acute leukemia. We previously demonstrated that MDS could be transferred from a genetically engineered mouse with MDS to wild-type recipients by transplanting MDS bone marrow nucleated cells (BMNC). To more clearly understand the MDS cell of origin, we have developed approaches to transplant specific, immunophenotypically defined hematopoietic subsets. In this article, we describe the process of isolating and transplanting specific populations of hematopoietic stem and progenitor cells. Following transplantation, we describe approaches to assess the efficiency of transplantation and persistence of the donor MDS cells.

We describe the use of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) to assess the malignant potential of genetically engineered hematopoietic cells. HSCT is useful for evaluating various malignant hematopoietic cells in vivo as well as generating a large cohort of mice with myelodysplastic syndromes (MDS) or leukemia to evaluate novel therapies.

Hematopoetik kök hücre transplantasyonu myelodisplastik sendromu kökeni değerlendirmek için kullanımı

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Engineering Oncogenic Heterozygous Gain-of-Function Mutations in Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Throughout their lifetime, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) acquire somatic mutations. Some of these mutations alter HSPC functional properties such as proliferation and differentiation, thereby promoting the development of hematologic malignancies. Efficient and precise genetic manipulation of HSPCs is required to model, characterize, and better understand the functional consequences of recurrent somatic mutations. Mutations can have a deleterious effect on a gene and result in loss-of-function (LOF) or, in stark contrast, may enhance function or even lead to novel characteristics of a particular gene, termed gain-of-function (GOF). In contrast to LOF mutations, GOF mutations almost exclusively occur in a heterozygous fashion. Current genome-editing protocols do not allow for the selective targeting of individual alleles, hampering the ability to model heterozygous GOF mutations. Here, we provide a detailed protocol on how to engineer heterozygous GOF hotspot mutations in human HSPCs by combining CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair and recombinant AAV6 technology for efficient DNA donor template transfer. Importantly, this strategy makes use of a dual fluorescent reporter system to allow for the tracking and purification of successfully heterozygously edited HSPCs. This strategy can be employed to precisely investigate how GOF mutations affect HSPC function and their progression toward hematological malignancies.

Novel strategies to faithfully model somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) are necessary to better study hematopoietic stem cell biology and hematological malignancies. Here, a protocol to model heterozygous gain-of-function mutations in HSPCs by combining the use of CRISPR/Cas9 and dual rAAV donor transduction is described.

İnsan Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerinde Onkojenik Heterozigot Fonksiyon Kazancı Mutasyonlarının Mühendisliği

Throughout their lifetime, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) acquire somatic mutations. Some of these mutations alter HSPC functional ...

Evaluation of Abnormal Growth-related Genes of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells by Combining CRISPR/Cas9 Technology with Cell Counting

Hematopoietic stem cells possess the ability for long-term self-renewal and the potential to differentiate into various types of mature blood cells. However, the accumulation of cancerous mutations in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) can block normal differentiation, induce aberrant proliferation, and ultimately lead to leukemogenesis. To identify and/or evaluate the cancerous mutations, we integrated CRISPR/Cas9 technology with the Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay to investigate a model gene Trp53, that is essential for abnormal proliferative ability of HSPCs. Specifically, bone marrow cells enriched for HSPCs from Cas9 mice were harvested and then subjected to viral transfection with single-guide RNAs (sgRNAs) targeting one or several candidate genes to introduce genetic alterations in HSPCs. Then, a CCK-8 assay was performed to investigate the proliferative capacity of transfected HSPCs. The sgRNA targeting efficiency was confirmed by a Tracking of Indels by Decomposition assay. These identified genes may play crucial roles in leukemogenesis and could serve as potential therapeutic targets.

Here, we present a protocol that integrates CRISPR/Cas9 technology with the Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay to identify candidate genes that are crucial for the abnormal proliferative capacity of hematopoietic stem and progenitor cells.

Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerin Anormal Büyüme ile İlgili Genlerinin CRISPR/Cas9 Teknolojisi ile Hücre Sayımı ile Birleştirilerek Değerlendirilmesi

Hematopoietic stem cells possess the ability for long-term self-renewal and the potential to differentiate into various types of mature blood cells. ...

Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting from advances in genome editing technology and lentivirus-mediated transgene delivery systems, an efficient and economical method is described here that establishes mice in which genes are manipulated specifically in hematopoietic stem cells. Lentiviruses are used to transduce Cas9-expressing lineage-negative bone marrow cells with a guide RNA (gRNA) targeting specific genes and a red fluorescence reporter gene (RFP), then these cells are transplanted into lethally-irradiated C57BL/6 mice. Mice transplanted with lentivirus expressing non-targeting gRNA are used as controls. Engraftment of transduced hematopoietic stem cells are evaluated by flow cytometric analysis of RFP-positive leukocytes of peripheral blood. Using this method, ~90% transduction of myeloid cells and ~70% of lymphoid cells at 4 weeks after transplantation can be achieved. Genomic DNA is isolated from RFP-positive blood cells, and portions of the targeted site DNA are amplified by PCR to validate the genome editing. This protocol provides a high-throughput evaluation of hematopoiesis-regulatory genes and can be extended to a variety of mouse disease models with hematopoietic cell involvement.

Described are protocols for the highly efficient genome editing of murine hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) by the CRISPR/Cas9 system to rapidly develop mouse model systems with hematopoietic system-specific gene modifications.

Hastalık Modellerinde Hematopoetik Hücrelerin İncelemi için Lentiviral CRISPR/Cas9-Aracılı Genom Düzenleme

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). Mutations in driver genes, that confer cellular fitness, can lead to the development of expanding HSPC clones that increasingly give rise to progeny leukocytes harboring the somatic mutation. Because clonal hematopoiesis has been associated with heart disease, stroke, and mortality, the development of experimental systems that model these processes is key to understanding the mechanisms that underly this new risk factor. Bone marrow transplantation procedures involving myeloablative conditioning in mice, such as total-body irradiation (TBI), are commonly employed to study the role of immune cells in cardiovascular diseases. However, simultaneous damage to the bone marrow niche and other sites of interest, such as the heart and brain, is unavoidable with these procedures. Thus, our lab has developed two alternative methods to minimize or avoid possible side effects caused by TBI: 1) bone marrow transplantation with irradiation shielding and 2) adoptive BMT to non-conditioned mice. In shielded organs, the local environment is preserved allowing for the analysis of clonal hematopoiesis while the function of resident immune cells is unperturbed. In contrast, the adoptive BMT to non-conditioned mice has the additional advantage that both the local environments of the organs and the hematopoietic niche are preserved. Here, we compare three different hematopoietic cell reconstitution approaches and discuss their strengths and limitations for studies of clonal hematopoiesis in cardiovascular disease.

We describe three methods of bone marrow transplantation (BMT): BMT with total-body irradiation, BMT with shielded irradiation, and BMT method with no pre-conditioning (adoptive BMT) for the study of clonal hematopoiesis in mouse models.

Klonal Hematopoez Çalışması İçin Farelerde Kemik İliği Nakli İşlemleri

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production of all mature blood cells. In recent years cellular metabolism has emerged as a crucial regulator of HSC function and fate. We have previously demonstrated that modulation of mitochondrial metabolism influences HSC fate. Specifically, by chemically uncoupling the electron transport chain we were able to maintain HSC function in culture conditions that normally induce rapid differentiation. However, limiting HSC numbers often precludes the use of standard assays to measure HSC metabolism and therefore predict their function. Here, we report a simple flow cytometry assay that allows reliable measurement of mitochondrial membrane potential and mitochondrial mass in scarce cells such as HSCs. We discuss the isolation of HSCs from mouse bone marrow and measurement of mitochondrial mass and membrane potential post ex vivo culture. As an example, we show the modulation of these parameters in HSCs via treatment with a metabolic modulator. Moreover, we extend the application of this methodology on human peripheral blood-derived T cells and human tumor infiltrating lymphocytes (TILs), showing dramatic differences in their mitochondrial profiles, possibly reflecting different T cell functionality. We believe this assay can be employed in screenings to identify modulators of mitochondrial metabolism in various cell types in different contexts.

Here we describe a reliable method to measure mitochondrial mass and membrane potential in ex vivo cultured hematopoietic stem cells and T cells.

Hematopoetik Kök Hücrelerde ve T-Hücrelerinde Mitokondriyal Kitle ve Membran Potansiyelinin Akış Sitometrisi ile Ölçülmesi

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Biyoloji

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Self-renewing&#160;multipotent&#160;hematopoietic stem cells (HSCs) are an important cell type due to their abilities to support hematopoiesis throughout life and reconstitute the entire blood system following transplantation. HSCs are used clinically in stem cell transplantation therapies, which represent curative treatment for a range of blood diseases. There is substantial interest in both understanding the mechanisms that regulate HSC activity and hematopoiesis, and developing new HSC-based therapies. However, the stable culture and expansion of HSCs ex vivo has been a major barrier in studying these stem cells in a tractable ex vivo system. We recently developed a polyvinyl alcohol-based culture system that can support the long-term and large-scale expansion of transplantable mouse HSCs and methods to genetically edit them. This protocol describes methods to culture and genetically manipulate mouse HSCs via electroporation and lentiviral transduction. This protocol is expected to be useful to a wide range of experimental hematologists interested in HSC biology and hematopoiesis.

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Presented here is a protocol to initiate, maintain, and analyze mouse hematopoietic stem cell cultures using ex vivo polyvinyl alcohol-based expansion, as well as methods to genetically manipulate them by lentiviral transduction and electroporation.

Ex Vivo Polivinil Alkol Bazlı Kültürlerde Fare Hematopoetik Kök Hücrelerinin Genleşmesi ve Genetik Manipülasyonu

Self-renewing&#160;multipotent&#160;hematopoietic stem cells (HSCs) are an important cell type due to their abilities to support hematopoiesis throughout ...