Kardiyovasküler hastalık dünya çapında bir numaralı ölüm nedeni olmaya devam ediyor. Geleneksel in vitro modeller monolayer kültürüne dayanır. Bununla birlikte, kalp, özellikle kalp kası veya miyokard, 3D anizotropisi ve hücresel bileşiminde karmaşıktır.
Bu nedenle, hem hücresel bileşenleri hem de miyokard yapısını daha iyi taklit etmek için in vitro modeller içindeki doku bileşiminin karmaşıklığını artırmak önemlidir. Burada, bu çalışmada, yeni bir mikroakışkan cihaz içinde 3D olgun kök hücre türevi insan kardiyak dokusunun geliştirilmesi için bir protokol gösteriyoruz. Bu cihaz, çevredeki hidrojel kapsüllenmiş kardiyak hücrelerin yüksek derecede hizalanmasına neden olan doğuştan eliptik mikro direklere sahip bir 3D ana doku kanalı içerir.
Ana kanal, doku boyunca bir besin difüzyonu sağlayan enjeksiyon bağlantı noktalarına sahip medya kanalları tarafından kuşatılmıştır. Mikroakışkan cihazların işlenmesinde gereken bakım nedeniyle, bu protokolün görsel temsili, gelişmiş doku hizalaması için gömülü mikro direklere sahip bir mikroakışkan cihaz içinde 3D kardiyak dokunun düzgün bir şekilde oluşturulmasına yardımcı olur. İnsan kardiyak fibroblastını ayrıştırmak için önce kuvözden matarayı çıkar.
Biyogüvenlik kabininin içine koyun ve harcanan ortamı şişeden aspire etmeye başlayın. Ardından şişeyi yıkamak için üç ML PBS 1X alın. Kapağı kapatın ve şişeyi döndürün, böylece alt kısım PBS ile düzgün bir şekilde kaplanır.
PBS'i aspire edin. 37 derece tripsin üç ML alın ve şişeye ekleyin. Daha sonra şişeyi eğin ve alt kısım tamamen kaplanmış olacak şekilde döndürün.
Sonra inkübatöre dört ila altı dakika koyun. Üç ML alarak ve bunu şişeye ekleyerek FGM3 ile tripsin nötralize edin. Pipet, şişenin arkasında kalan hücreleri yerinden çıkarmak için çözeltiyi yukarı ve aşağı.
Hücre süspansiyonu 15 ML Falcon tüpünde toplayın. Hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini alın ve hücreleri mikroskopla saymak için bir hemositometrede dağıtın. Hücre süspansiyonu 250 G'de dört dakika santrifüjleyin.
Santrifüjlemeden sonra, hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatantı aspire edin. ML süspansiyon başına istenen 75 milyon hücreyi yapmak için hücre peletini taze FGM3 ile yeniden biriktirin. Hücreleri yeniden biriktirin, sonra tüpü gevşek bir şekilde takılmış bir kapakla ayarlayın.
Kardiyomiyositleri ayrıştırmak için plakayı inkübatörden çıkar ve ortamı aspire edin. Altı ML PBS alın ve kuyuları yıkayın, böylece her kuyuda bir ML PBS olur. Plakaya bağlı hücreleri rahatsız etmemeye dikkat ederek PBS'yi aspire edin.
Altı iyi plakanın her kuyusunda bir ML olması için altı ML ısıtılmış trypLE Express ekleyin. Hücreleri trypLE ile 10 dakika kuluçkaya bırakın. 10 dakika sonra, trypLE'yi altı ML RPMI artı B27 artı insülin ile nötralize edin, böylece her kuyuya bir ML RMPI eklersiniz.
Çözeltiyi toplamak için bir ML pipet kullanın ve tüm hücrelerin kaldırıldığından emin olmak için kuyuların sırtlarına patlatın. Hücre süspansiyonu 15 ML Falcon tüpünde toplayın. Tüpü üç dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin.
Santrifüjlemeden sonra, medyayı ve trypLE'yi aspire edin. Bu adım hassas kardiyomiyositleri yıkamak için önemlidir. Bu adım, tüm trypLE'lerin 3D kalp dokusu oluşumunda gitmesini sağlar.
Hücre peletini beş ML RPMI artı B27 artı insülin olarak yeniden diriltin. Homojen bir hücre süspansiyonu sağlamak için çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetlamak için bir ML pipet kullanın. Hemositometre ile saymak için hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini alın.
Hücreleri üç dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra medyayı ikinci kez aspire edin. ML süspansiyon başına 75 milyon hücre elde etmek için uygun miktarda RPMI artı B27 artı insülin ekleyin, ardından yeniden biriktirin.
Kollajen çözeltisini kapsülleme için hazırlamak için, tüm reaktifleri kaputtaki bir buz kutusunda sunun. Daha sonra stok kolajenden 75 mikrolitre alın. Kollajen çok viskozdur, bu yüzden pipetle yavaşça almak, sonra buz üzerinde bir mikrosantrifüj tüpünde dağıtmak.
13.85 mikrolitre RPMI alın ve Falcon tüpündeki kolajene ekleyin. Daha sonra 10 mikrolitre fenol kırmızısı alın ve karışıma buzun üzerine ekleyin ve yeniden dirilin. Son olarak, normal bir NaOH'un 1,15 mikrolitresini alın ve nötralize etmek için süspansiyona ekleyin.
Daha sonra 200 mikroliter pipet ucu alın ve süspansiyonu yeniden dirildi. Bir sonraki adım kollajen metrogel içindeki hücrelerin kapsüllenmesidir. Sonra sekiz mikrolitreLIK bir CD alın ve buz üzerinde taze bir Falcon tüpü ekleyin.
Sonra iki mikrolitre CS alın ve bu hücre karışımına ekleyin. Hücre süspansiyonu yeniden haline getir ve hücre süspansiyonunun 5.6 mikrolitresini al ve yeni bir Falcon tüpüne koy. Sonra yeni hazırladığınız kolajeni alın, kollajenden dört mikrolitre alın, ardından 2.4 mikrolitre metrogel alın.
Hücre hidrojel süspansiyonunun homojen bir dağılımını sağlamak için karışımı yukarı ve aşağı pipetleyin. Jel enjeksiyonu hazırlandıktan sonra cihazlara ekleyebilirsiniz. Yeni bir ipucu al ve yeniden dirile.
Petri kabını alın, ucu enjeksiyon bağlantı noktasına yerleştirin ve yavaşça ve istikrarlı bir şekilde enjekte edin. Cihaz kanalı hücre hidrojel süspansiyonu ile dolduğunda göreceksiniz. Diğer bağlantı noktası doldurulduktan sonra enjeksiyonu durdurun ve ucu çıkarın.
Enjeksiyondan sonra, cihazları cımbızla çevirin ve daha büyük Petri kabının içine dokuz dakika boyunca inkübatörde su ile yerleştirin. Dokuz dakika sonra, cihazları inkübatörden çıkarın ve dik olarak çevirin, ardından hidrojel polimerizasyonunu tamamlamak için dokuz dakika daha inkübatöre yerleştirin. Şimdi medyayı ekleme zamanı.
Bu nedenle, RMPI artı B27'yi alın ve ucu ortam bağlantı noktasına yerleştirin ve yavaşça itmeye başlayın. Ardından bunu karşı ortam bağlantı noktasında yapın. Medyanın enjekte etmediğini görebilirsiniz, bu nedenle bağlantı noktasının üzerine bir medya damlacığı koyabilir ve ardından pipeti alabilir ve medyayı diğer taraftan çekmek için negatif basınç kullanabilirsiniz.
Yani medya kanaldan çekilmeye başladığında göreceksiniz. Tüm medya kanallarına medya eklendikten sonra, cihazlar 37 derecede inkübatöre geri konur. Mikroakışkan cihaz sol üst köşede gösterilir.
Kültürün ilk, yedinci ve 14. 14 günlük kültürden sonra, hücreler mikro direklerin etrafında oluşan yüksek hizalanmış yapılara yoğunlaşmalıdır. 14. günün izleri burada Spontan kasılma C'nin yanı sıra aksin lekeli ve kardiyak belirteç lekeli dokuların immünoresan görüntülerinde gösterilmiştir.
Görülmesi gereken, kültürde 14 gün sonra oluşan yüksek hizalanmış akrin liflerinin yanı sıra paralel çizgili olgun sarkomlar ve lokalize boşluk kavşaklarıdır. Bu işlem sırasında, erken polimerizasyonu önlemek için hücre hidrojel enjeksiyonu sırasında tüm malzemelerin buz üzerinde düşük sıcaklıklarda tutulması kritik öneme sahiptir. Mikroakışkan cihazlar, hem imalat, enjeksiyon hem de genişletilmiş doku kültürü sırasında özenle ele alınmalıdır.
Hücre enjeksiyonları, erken polimerizasyon veya hidrojelin ortam eklemeden önce kurumasını önlemek için hızlı bir şekilde yapılırken tüm kanalın dolduğundan emin olmak için sabit bir işlem olmalıdır.
