This work was financially supported by the Ministry of Science and Technology of Taiwan under Contract No. MOST 104-2311-B-002-026 (K. Y. Lo), No. MOST 104-2112-M-030-002 (Y. S. Sun), and National Taiwan University Career Development Project (103R7888) (K. Y. Lo). The authors also thank the Center for Emerging Material and Advanced Devices, National Taiwan University, for the use of the cell culture room.

1. Chip-Design und Fertigung <ol><li> Zeichnen Muster abzutragenden auf PMMA - Substraten und doppelseitige Klebebänder mit kommerziellen Software - 24. <ol><li> Um die Auswirkungen von chemischen Konzentrationen und Scherspannungen studieren, ziehen einen &quot;Weihnachtsbaum&quot; Muster mit unterschiedlicher Breite an seinem Ende in jeder der fünf Kulturflächen (1A und 1B). </li><li> Um die Auswirkungen von chemischen Konzentrationen und elektrischen Feldern zu studieren, ziehen einen &quot;Weihnachtsbaum&quot; Muster mit zwei weiteren Fluidik - Kanäle für Salzbrücken (2A und 2B). </li></ol></li><li> Scribe ein individuelles Muster auf einer PMMA - Platte oder einem doppelseitigen Klebeband , indem die entsprechende Datei in den CO 2 -Laser scriber laden. <ol><li> Schalten Sie den Laser scriber, und überprüfen Sie die Verbindung mit dem Computer. Öffnen Sie das Muster zu abzutragenden die kommerzielle Software. </li><li> Legen Sie eine PMMA-Platte oder ein doppelseitiges Klebeband on oben auf der Bühne des scriber. Stellen Sie den Fokus des Lasers CO 2 , falls erforderlich , die Kalibrierung bar und die sichtbare He-Ne - Laser. </li><li> Legen Sie das Muster in die Anreißer für die Ablation auf der PMMA-Platte oder dem Band. </li><li> Pick-up die gemusterte Folie oder ein Band, entfernen Sie unerwünschte Stücke, und reinigen Sie die Oberfläche mit Stickstoffblasen. HINWEIS: Die Dicke der PMMA-Platte beträgt 1 mm, und die des doppelseitigen Klebebands beträgt 0,07 mm oder 0,22 mm. </li></ol></li></ol> 2. Chipmontage <ol><li> Mit Superkleber, befestigen Acryl-Adapter (Länge x Breite x Höhe = 10 mm x 10 mm x 5 mm, mit Schraubengewinde in der Mitte) an die oberste Schicht des Chips durch das Gewinde ausrichten und die Löcher auf der Oberseite -Die meisten Schicht. Diese Adapter dienen als Medium / Auslässe und Salzbrücke Anschlüsse. </li><li> Montieren Sie den Mikrofluidik-Chip in einer Laminar-Flow-Haube. </li><li> Montieren Sie den chemisch-Schubspannung Mikrofluidik-Chip (CSS-Chip). <ol><li> EINttach 3 Blätter beschrieben PMMA-Platten unter Verwendung von 2 Stück doppelseitiges Klebeband beschrieben. (1A und 1B). </li><li> Fügen Sie ein weiteres Stück der 0,07 mm dicken doppelseitigem Klebeband auf der Unterseite des Chips und befestigen Sie den Chip auf einen Durchmesser von 10 cm Petrischale. </li><li> Setzen Sie die Montage-Chip in der Vakuumkammer über Nacht. </li></ol></li><li> Um die chemisch-elektrischen Feldchip (CEF - Chip), bringen Sie die PMMA - Platte mit einem doppelseitigen Klebeband mit einer Dicke = 0,22 mm (2A und 2B) montieren. <ol><li> Bringen Sie die beschriebenen PMMA-Platte und doppelseitiges Klebeband auf einen Durchmesser von 10 cm Petrischale das gleiche Stück Klebeband. </li></ol></li><li> Lassen Sie den montierten Chip im Inneren der Kapuze und setzen Sie es für 30 Minuten zur Sterilisation mit UV. </li><li> Verbinden Sie die Eingänge zu zwei 3-ml-Spritzen über Kunststoffrohre und handfest Nüsse. Verbinden Sie den Ausgang zu einem Abfallrohr über einen Kunststoffschlauch und einem fingerfest Mutter. HINWEIS: Die AutoklavenAlle Rohre und Muttern bei 121 ° C für 15 min vor der Verwendung. </li><li> Langsam drücken Sie den Kolben der Spritze zu grundieren die fluidischen Kanäle mit PBS. Push Spritzen hin und her, um Blasen zu entfernen. </li><li> Setzen Sie die Chips in einem Inkubator über Nacht bei 37 ° C unter 5% CO 2. HINWEIS: Diese beiden Schritte zielen darauf ab, den Chip und entfernen Sie alle verbleibenden Blasen innerhalb des Chips zu waschen. </li><li> Nehmen Sie den Chip aus dem Inkubator. </li><li> Bereiten Agar Salzbrücken zur Erzeugung elektrischer Felder im CEF-Chip. <ol><li> Löse 3% niedrigschmelzender Agarose in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) -Puffer unter Verwendung einer Mikrowelle. </li><li> Injizieren Lösung-Phasen-Agarose in die Salzbrücke Kanal und legen Sie die Elektroden vor Lösung erstarrt. </li><li> Legen Sie Silber / Silberchlorid-Elektroden in die Rohrmuttern. </li></ol></li><li> Schließen Sie die Spritzen an die Spritzenpumpen und fließen kontinuierlich das Kulturmedium (Dulbecco modifiziertem eagler17; s medium, DMEM) in den Fluidkanal für 10 min bei einer Flussrate von 20 ul / min PBS zu ersetzen. </li></ol> 3. Zellpräparation und Versuchsaufbau HINWEIS: vorwärmen 1x PBS, Kulturmedium (DMEM plus FBS) und Trypsin in einem 37 ° C Wasserbad vor dem Gebrauch. <ol><li> Platte 2 x 10 5 Zellen Lungenkrebs CL1-5 25,26 in einer 10 cm Petrischale geliefert mit DMEM plus 10% fötalem Rinderserum (FBS). Inkubieren der Zellen in einem Inkubator unter 5% CO 2 bei 37 ° C , bis 90% Konfluenz. </li><li> Saugen Sie das Medium und waschen Sie einmal, um die Zellen mit vorgewärmten 1x PBS. 2 ml 0,05% Trypsin-Puffer zu den Zellen und warten, für 2 bis 3 min bei 37 ° C um die Zellen zu lösen. </li><li> Transfer der Zellen in ein 15 ml steriles Zentrifugenröhrchen und 6 ml Kulturmedium in das Röhrchen. vorsichtig umdrehen das Röhrchen zum Mischen und nehmen 5 ul der zellhaltigen Medium für die Zellzahl in einem hemocytomete Zählenr. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 x g für 5 min. Suspendieren 10 6 Zellen in 1 ml Kulturmedium und legen die Zelle enthaltenden Medium in einer 1 ml - Spritze. </li><li> die zellhaltigen Medium in den Mikrofluidik-Chip aus der Steckdose ziehen lassen und stellen Sie sicher, dass die Lösung alle durch die fünf Kulturkreisen verteilt. Inkubieren Sie den Chip im Inneren eines Inkubators unter 5% CO 2 bei 37 ° C für 2 Stunden. </li></ol> 4. Versuchsaufbau <ol><li> Nehmen Sie den Chip aus dem Inkubator und legen Sie es auf einer transparenten Indium-Zinn-Oxid (ITO) Glasheizung. HINWEIS: Die ITO-Glas mit einer Proportional-Integral-Differential- (PID) -Steuerung zur Aufrechterhaltung der Temperatur bei 37 ± 0,5 ° C über Rückkopplung von einem Thermokopplers eingespannt fest zwischen der ITO-Erhitzer und dem Chip verbunden ist. </li><li> Setzen Sie den Chip-Heizanordnung auf einem motorisierten XY Bühne eines umgekehrten Mikroskops zur Nachführung der Zellmigration oder einen festen XY Stufe derein invertiertes Fluoreszenzmikroskop für die Produktion von ROS gemessen wird. </li><li> Zur Erzeugung unterschiedlicher chemischer Konzentrationen füllen zwei Spritzen mit 5 ml von chemischen Lösungen von relativen Konzentrationen 0 und 1 (in Kulturmedium) gelöst, und die Pumpe sie in den Chip an gewünschten Strömungsraten: in der CSS-Chip, mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,3 ml / min für 1 Stunde; in dem CEF-Chip, mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 20 &amp; mgr; l / min für die ersten 20 min und einer Strömungsgeschwindigkeit von 20 &amp; mgr; l / h für eine weitere 120 min (Gesamtzeit = 2 h). </li><li> In der CEF-Chip, für die Verfolgung von Zellmigration, Programm der XY-Tisch des Mikroskops Fotos zu wiederholen, wobei über eine digitale einäugige Spiegelreflexkamera (DSLR) Kamera, bestimmte Sichtfelder (FOVs) innerhalb Kulturkreisen alle 15 min für 2 h. </li><li> Für die Produktion von ROS zu messen, verwenden Sie die fluoreszenzbasierte Indikator 2&#39;-7&#39;-dichlorodihydrofluoresce diacetat (2&#39;-7&#39;-DCFDA). <ol><li> Bereiten Sie die Lager von 2&#39;-7&#39;-DCFDA bei 10 mM in die Molekularbiologie diMethylsulfoxid (DMSO). Verdünnte DCFDA in DMEM nur ohne Serum (5 &amp; mgr; M in DMEM). Das Potential Deacetylase könnten die Hintergrundsignale zu erhöhen und die Signale in den Zellen zu verringern. </li><li> Nach 1 Stunde der Scherspannung Stimulus in dem CSS-Chip oder nach 2 h EF Stimulus in dem CEF-Chip, der Pumpe 2&#39;-7&#39;-DCFDA (5 &amp; mgr; M in DMEM) in den Chip mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 20 &amp; mgr; l / min für die ersten 20 min und einer Strömungsgeschwindigkeit von 20 &amp; mgr; l / h für weitere 20 min. Zum Waschen, für 20 min DMEM in den Chip mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 20 &amp; mgr; l / h pumpen. </li><li> Nehmen Sie Fotos über eine Charge-Coupled Device (CCD) Kamera, bestimmter FOVs in Kulturkreisen für die Fluoreszenzintensitäten zu analysieren. </li></ol></li></ol> 5. Die Berechnungen der chemischen Konzentrationen, Scherspannungen und elektrische Felder <ol><li> Sowohl in der CSS-Chip und dem CEF-Chip, berechnen die chemischen Konzentrationen in den fünf Kulturkreisen. Beispielsweise durch H 2 O 2 von Konzentr Injizierenations 0 und 200 &amp; mgr; M von den zwei Einlässen, Konzentrationen von 0, 25, 100, 175, und 200 &amp; mgr; M erzeugt werden. HINWEIS: Unter der Annahme, dass alle Flüssigkeiten geteilter Strömung glatt und gleichmäßig um die Gabel sind die relativen Konzentrationen in den fünf Kulturbereichen 0, 1/8, 1/2, 7/8 und 1 sind. </li><li> In der CSS - Chip berechnet man die Schubspannung (τ) in jedem der Bereiche Kultur mit <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/54397/54397eq1.jpg" /> 27, wobei Q der Volumenstrom ist, η die Viskosität fluidischen ist, h die Höhe des Kanals und w die Breite des Kanals. HINWEIS: Q Einstellung = 0,3 ml / min in jedem Einlass (Q = 0,12 ml / min in jeder Kulturbereich), η = 0,0008 Pa · s für das Kulturmedium, h = 1 mm und w = 1 bis 4 mm, die Schubspannung errechnet sich aus 0,0048 Pa (4 mm breiten Bereich) bis 0,0192 Pa (1 mm breiten Bereich) zu reichen. </li><li> Imdie CEF - Chip, berechnen in jeder der Kulturbereiche der EF Stärke unter Verwendung von E = I / (&amp; Sgr; A eff) (Ohmsche Gesetz), wobei I der elektrische Strom über den Fluidkanal fließt, σ ist die elektrische Leitfähigkeit des Kulturmediums, und A eff ist die effektive Querschnittsfläche des Kanals. HINWEIS: Die Verwendung von σ = 1,38 Ω -1 m -1 für Kulturmedium und A eff = 0,22 mm 2 (Breite = 1 mm und Höhe = 0,22 mm) wird das EF Stärke E (mV / mm) = I berechnet werden ( A) × 3,3 × 10 6. <ol><li> Wie in 2D gezeigt, mit vier (8 + 35 + 8) Segmente und eine (5 + 35 + 5) -Segment das Ersatzschaltbild als fünf C-Abschnitt Schaltungen behandeln. Hinweis: Durch diese Parallelschaltung der Analyse zu Kirchhoffschen Spannungsgesetz und das Ohmsche Gesetz nach, Ströme über fünf Kultur fließen, sindwie, I 1 bis I 5 von unten nach oben, berechnet um 0,49 I (Bereich 1), 0,25 I (Bereich 2), 0,13 I (Bereich 3), 0,08 I (Bereich 4) und 0,05 I (Bereich sein 5) sind, wobei I die Gesamtgleichstrom (dC). Mit einer angelegten Gleich von 0,157 mA, EFs 254, 130, 67, 41 und 26 mV / mm sind in den fünf Kulturbereichen erzeugt. HINWEIS: Für eine vereinfachte elektrische Analyse des mikrofluidischen Netzwerk, alle fluidischen Segmente werden als Widerstände mit dem Widerstand als proportional zu ihrer Länge. </li></ol></li></ol> 6. Datenanalyse Hinweis: Die Datenanalyse ist die ImageJ-Software durchgeführt werden. <ol><li> Analysieren Sie die Produktion von ROS. <ol><li> Führen Sie die ImageJ Software. Gehen Sie auf &quot;Datei&quot; → Öffnen ein Fluoreszenzbild zu laden analysiert werden. </li><li> Gehen Sie auf &quot;Bild&quot; → &quot;Typ&quot; → &quot;16-Bit&quot;, um die im ändernAlter zu einer Grauskala. </li><li> Zeichnen Sie ein Polygon um eine Zelle zu umschließen. Gehen Sie auf &quot;Analysieren&quot; → &quot;Messen&quot; die mittlere Fluoreszenzintensität der Zelle zu messen. </li><li> Wiederholen 6.1.3 Intensitäten von mindestens 50 Zellen von drei unabhängigen Experimenten sammeln, und berechnen Sie die mittlere Intensität mit Standardabweichung vom Mittelwert (SEM). </li><li> Wiederholen Sie 6.1.1-6.1.4 für jeden experimentellen Zustand. </li></ol></li><li> Analysieren Zellmigration. <ol><li> Führen Sie die ImageJ Software. Gehen Sie auf &quot;Datei&quot; → Öffnen eines Bildes zum Zeitpunkt = 0 genommen zu laden analysiert werden. </li><li> Zeichnen Sie ein Polygon um eine Zelle zu umschließen. Gehen Sie auf &quot;Analysieren&quot; → &quot;Messen&quot; , um das Zentrum der Masse der Zelle messen , wie (x 1, y 1). </li><li> Wiederholen 6.2.1- 6.2.2 den Massenschwerpunkt der gleichen Zelle zu messen , wie (x 2, y 2) von einem anderen Bild zur Zeit t = nehmen. </li><li> Berechnen Sie die Migrationsrate (in &amp; mgr; m / h)Diese Zelle als <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/54397/54397eq2.jpg" /> . </li><li> Wiederholen Sie 6.2.1-6.2.4 zu Migrationsraten von mindestens 50 Zellen von drei unabhängigen Experimenten, und berechnen Sie die mittlere Wanderungsgeschwindigkeit mit Standardfehler des Mittelwertes (SEM) sammeln. </li><li> Von 6.2.2 und 6.2.3, die Berechnung der Migration Gerichtetheit dieser Zelle als Kosinus θ oder <img alt="Gleichung 3" src="/files/ftp_upload/54397/54397eq3.jpg" /> , Wobei θ der Winkel zwischen dem Vektor der angelegten EF (von positiv zu negativ) und der Vektor vom Start bis zur Endposition der Zelle (Figur 2G). </li><li> Wiederholen 6.2.6 Migration Gerichtetheit von mindestens 50 Zellen von drei unabhängigen Experimenten zu sammeln, und berechnen Sie die mittlere Migration Gerichtet mit Standardfehler des Mittelwerts (SEM). </li><li> Berechnen Sie den mittleren Migrationsrate mit SEM und die mittlere Migration Gerichtet mit SEM für jede Versuchsbedingung. HINWEIS: Ein Gerichtetvon 1 zeigt an, dass alle Zellen in Richtung der Kathode wandern, und ein Wert von -1 zeigt an, dass alle Zellen in Richtung der Anode wandern. Die Gerichtetheit einer Gruppe von zufällig bewegenden Zellen nahe 0. </li></ol></li><li> Analysieren Zellenausrichtung. <ol><li> Führen Sie die ImageJ Software. Gehen Sie auf &quot;Datei&quot; → &quot;Öffnen&quot; ein Bild zu laden, werden analysiert. </li><li> Behandeln Sie die Zelle als eine Ellipse und ziehen Sie eine Linie, die lange Achse einer Zelle anzuzeigen. Gehen Sie auf &quot;Analysieren&quot; → &quot;Messen&quot; den Winkel messen β zwischen der Linie und der horizontalen EF - Richtung. </li><li> Wiederholen 6.3.2 bis β von mindestens 50 Zellen von drei unabhängigen Experimenten zu sammeln, und berechnen mittlere Kosinus β mit Standardfehler des Mittelwerts (SEM). </li><li> Wiederholen Sie 6.3.1-6.3.3 für jeden experimentellen Zustand. HINWEIS: A cos β von +1 anzeigt , dass alle Zellen parallel zum angelegten EF auszurichten und einen 0 - Wert zeigt an, dass alle Zellen perpendicularl ausrichteny zum angelegten EF. </li></ol></li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Honokiol,+a+Multifunctional+Antiangiogenic+and+Antitumor+Agent.">Honokiol, a Multifunctional Antiangiogenic and Antitumor Agent.</a> Antioxid Redox Sign. 11, 1139-1148 (2009).</li><li>Chisti, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+damage+to+animal+cells.">Hydrodynamic damage to animal cells.</a> Crit Rev Biotechnol. 21, 67-110 (2001).</li><li>Davies, P. F., Remuzzi, A., Gordon, E. J., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turbulent+fluid+shear+stress+induces+vascular+endothelial+cell+turnover+in+vitro.">Turbulent fluid shear stress induces vascular endothelial cell turnover in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 2114-2117 (1986).</li><li>Zoro, B. J., Owen, S., Drake, R. A., Hoare, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+process+stress+on+suspended+anchorage-dependent+mammalian+cells+as+an+indicator+of+likely+challenges+for+regenerative+medicines.">The impact of process stress on suspended anchorage-dependent mammalian cells as an indicator of likely challenges for regenerative medicines.</a> Biotechnol Bioeng. 99, 468-474 (2008).</li><li>Chin, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+reactive+oxygen+species+in+endothelial+cells+under+different+pulsatile+shear+stresses+and+glucose+concentrations.">Production of reactive oxygen species in endothelial cells under different pulsatile shear stresses and glucose concentrations.</a> Lab Chip. 11, 1856-1863 (2011).</li><li>Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotaxis+of+oral+squamous+cell+carcinoma+cells+in+a+multiple-electric-field+chip+with+uniform+flow+field.">Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field.</a> Biomicrofluidics. 6, 34116 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

PMMA-Basis-Chips werden unter Verwendung von Laserablation und Schreiben hergestellt, die sind billiger und einfacher Methoden im Vergleich zu PDMS-basierten Chips, die komplizierter Weich-Lithographie erfordern. Nach einem mikrofluidischen Chip entwerfen, können die Fertigung und Montage innerhalb von nur 5 Minuten durchgeführt werden. Es gibt einige wichtige Schritte, dass darauf zu achten, sollte das Experiment durchführen. Die erste ist die &quot;Montage&quot; -Ausgabe. Die Adapter sollten richtig an die oberste ...

In vivo - Zellen werden durch eine Vielzahl von Biomolekülen , einschließlich der extrazellulären Matrix (ECM), Kohlehydraten, Lipiden und anderen Zellen umgeben. Sie funktionalisieren durch Mikro-Umweltreize wie Wechselwirkungen mit ECM und Antworten auf chemische Gradienten verschiedener Wachstumsfaktoren reagieren. Herkömmlicherweise werden in vitro - Zellstudien in Zellkulturschalen durchgeführt , wobei der Verbrauch von Zellen und Reagenzien groß ist und die Zellen wachsen in einem statischen (nicht zirkulierende) -Umgebung. Vor kurzem Mikro hergestellten integrierten Geräte mit fluidische Komponenten haben eine alternative Plattform für Zellstudien in kontrollierbarer Weise zur Verfügung gestellt. Solche Vorrichtungen sind in der Lage eine genaue Mikroumgebung von chemischen und physikalischen Stimuli zu schaffen, während der Verbrauch von Zellen und Reagenzien zu minimieren. Diese mikrofluidischen Chips von Glassubstraten, Siliciumwafern, Polydimethylsiloxan (PDMS) Polymere, Polymethylmethacrylat (PMMA) Substraten hergestellt werden oder polyethyleneterephthalat (PET) Substrate 1-3. PDMS-basierte Geräte sind transparent, biokompatibel und für Gase durchlässig, so dass sie geeignet für die Langzeitzellkultur und Studien zu machen. PMMA und PET-Substrate sind billig und einfach zu verarbeiten sind Laserablation und Schreiben verwenden. Mikrofluidik-Vorrichtungen sollten die Zellen mit einer stabilen und steuerbaren Mikroumgebung bereitzustellen, wo Zellen ausgesetzt sind unterschiedliche chemische und physikalische Reize. Beispielsweise werden Mikrofluidik-Chips verwendet, die Chemotaxis von Zellen zu untersuchen. Statt der traditionellen Methoden , die Boyden - Kammer und Kapillare 4,5 Diese miniaturisierten Fluidikvorrichtungen präzise chemische Gradienten verwenden für 1,6,7 Zellen &#39;Verhalten zu studieren erzeugen kann. Ein anderes Beispiel ist, Zellen &#39;gerichtete Migration unter elektrischen Feldern (EFS), ein Phänomen namens electro zu studieren. Electrotactic Verhalten von Zellen berichtet 8, 9 Embryonalentwicklung zur Nervenregeneration verbunden zu sein,und Wund 10,11 heilen. Und viele Studien durchgeführt wurden 12,13 die electro verschiedener Zelltypen , einschließlich Krebszellen zu untersuchen, Lymphozyten 14,15, Leukämiezellen 11, und Stammzellen 16. Herkömmlicherweise werden Petrischalen und Deckgläser verwendet für electrotactic Kammern zu bauen EFs zu erzeugen 17. Solche einfachen Setups stellen Probleme mittlerer Verdunstung und ungenau EFs, aber sie können von mikrofluidischen Vorrichtungen eingeschlossen, gut definierte fluidische Kanäle 12,18,19 überwunden werden. Um systematisch zelluläre Reaktionen unter präzise steuerbare chemische und elektrische Reize hat, wäre es von großem Nutzen sein, um mikrofluidische Geräte entwickeln, die Zellen mit mehreren Stimuli zugleich bietet. Beispielsweise Li et al. berichteten 20 ein PDMS-basierte Mikrofluidik - Vorrichtung ein- oder koexistieren chemische Gradienten und EFs für die Erstellung. Kao et al. developed eine ähnliche Mikrofluidik - Chip 6 die Chemotaxis von Lungenkrebszellen durch EFs zu modulieren. Darüber hinaus ist der Durchsatz, Hou et al zu erhöhen. entwickelt und gefertigte Chip eine PMMA-basierten Multichannel-Dual-elektrischen Feld Zellen mit 8 verschiedenen kombinierten Reize zu bieten, wobei (2 EF Stärken x 4 chemischen Konzentrationen) 21. Um die gesamten erhöhen und die Schubspannung Reiz hinzufügen, entwickelten wir zwei PMMA-Basis mikrofluidischen Vorrichtungen zur Untersuchung von zellulären Reaktionen unter Einzel- oder koexistieren chemisch / Elektro / Schubspannung Reize. Berichtet von Lo et al. 22,23, diese Geräte enthalten fünf unabhängige Zellkultur Kanäle unterliegt einer ständigen fluidischen fließende, die in vivo - Kreislauf - System nachahmt. In dem ersten Chip (chemisch-Scherspannung Chip oder dem CSS-Chip), fünf relativen Konzentrationen von 0, 1/8, 1/2, 7/8 und 1 sind in den Kulturbereichen erzeugt wird, und einer Scherspannungsgefälle ist produced innerhalb jedes der fünf Kulturbereichen. In dem zweiten Chip (der chemisch-elektrischen Feldes Chip oder dem CEF-Chip), durch einen einzigen Satz von Elektroden und zwei Spritzenpumpen verwendet wird, werden fünf EF Stärken neben fünf verschiedenen chemischen Konzentrationen innerhalb dieser Kulturbereichen erzeugt. Numerische Berechnungen und Simulationen sind besseres Design durchgeführt, und arbeiten diese Chips und Lungenkrebszellen innerhalb dieser Vorrichtungen kultiviert unterliegen Einfach- oder koexistierenden Stimuli für ihre Antworten in Bezug auf die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) zu beobachten, die Migrationsrate, und die Wanderungsrichtung. Diese Chips werden demonstriert werden zeitsparend mit hohem Durchsatz und zuverlässige Geräte für die Untersuchung, wie Zellen auf verschiedene Mikro-Umweltreize reagieren.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>Cell culture medium</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>detach cell from the dish</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td>Cell culture medium</td></tr><tr><td>10 cm cell culture Petri dish</td><td>Nunc</td><td>150350</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Bright-Line&amp;nbsp;Hemacytometer</td><td>Sigma</td><td>Z359629</td><td>Cell Counting Equipment</td></tr><tr><td>PMMA</td><td>Customized</td><td>Customized</td><td>Microfluidic chip</td></tr><tr><td>Adaptor</td><td>Customized</td><td>Customized</td><td>Microfluidic chip</td></tr><tr><td>0.07/0.22 mm double-sided tape&amp;nbsp;</td><td>3M</td><td>8018/9088</td><td>Microfluidic chip</td></tr><tr><td>Low melting point agarose</td><td>Sigma</td><td>A9414</td><td>Salt bridge</td></tr><tr><td>2&#039;-7&#039;-dichlorodihydrofluoresce diacetate</td><td>Sigma</td><td>D6883</td><td>Intracellular ROS measurement</td></tr><tr><td>Indium tin oxide (ITO) glass</td><td>Merck</td><td>300739</td><td>Heater</td></tr><tr><td>Proportional-integral-derivative controller&amp;nbsp;</td><td>JETEC Electronics Co.</td><td>TTM-J4-R-AB</td><td>Temperature controller</td></tr><tr><td>Thermal coupler</td><td>TECPEL</td><td>TPK-02A</td><td>Temperature controller</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; laser scriber</td><td>Laser Tools &amp;amp; Technics Corp.</td><td>ILS2</td><td>Microfluidic chip fabrication</td></tr><tr><td>Syringe pumps</td><td>New Era</td><td>NE-300</td><td>Pumping medium and chemicals into the chip</td></tr><tr><td>Power supply</td><td>Major Science&amp;nbsp;</td><td>MP-300V</td><td>Supplying direct currents</td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td>Monitoring cell migration</td></tr><tr><td>Inverted fluorescent microscope</td><td>Nikon</td><td>TS-100</td><td>Monitoring cell migartion and fluorescencent signals</td></tr><tr><td>DSLR camera</td><td>Canon</td><td>60D</td><td>Recording bright-field images&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Nikon</td><td>DS-Qi1</td><td>Recording fluorescent images&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>super glue</td><td>3M Scotch</td><td>7004</td><td>Attaching adaptors to PMMA substrates</td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>Autodesk Inc.</td><td></td><td>Designing microfluidic chips</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>Dissolving DCFDA</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>Quantifying fluorescent intensities and cell migration</td></tr></tbody></table>

designing microfluidic devices for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli

Mikrofluidik-Vorrichtungen sind in der Lage eine präzise und steuerbare zelluläre Mikroumgebung von pH-Wert, Temperatur, Salzkonzentration und andere physikalische oder chemische Stimuli zu schaffen. Sie wurden durch die Bereitstellung in vivo wie Umgebung für in - vitro - Zellstudien verwendet. Vor allem, wie Zellen als Reaktion auf chemische Gradienten, elektrische Felder und Scherspannungen hat viele Interessen gezogen, da diese Phänomene sind wichtig bei der zellulären Eigenschaften und Funktionen zu verstehen. Diese mikrofluidischen Chips von Glassubstraten, Siliciumwafern, Polydimethylsiloxan (PDMS) Polymere, Polymethylmethacrylat (PMMA) -Substraten oder Polyethylenterephthalat (PET) -Substraten hergestellt werden. Aus diesen Materialien sind PMMA-Substrate billig und leicht verarbeitet werden können Laserablation und Schreiben verwenden. Obwohl einige mikrofluidischen Vorrichtungen konstruiert und hergestellt mehrere zur Erzeugung koexistierenden chemische und elektrische Reize, keiner von ihnen wurde alseffizient genug experimentellen Wiederholungen bei der Reduzierung, insbesondere für Screening-Zwecke. In diesem Bericht beschreiben wir unsere Konstruktion und Herstellung von zwei PMMA-Basis mikrofluidischen Chips für zelluläre Reaktionen zu untersuchen, bei der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies und die Wanderung, die unter Ein- oder koexistieren chemisch / Elektro / Schubspannung Reize. Der erste Chip erzeugt fünf relativen Konzentrationen von 0, 1/8, 1/2, 7/8, und 1 in den Kulturbereichen zusammen mit einer Scherspannungsgefälle innerhalb jeder dieser Bereiche erzeugt. Der zweite Chip erzeugt die gleichen relativen Konzentrationen, aber mit fünf verschiedenen elektrischen Feldstärken innerhalb jeder Kulturbereich geschaffen. Diese Geräte bieten nicht nur Zellen mit einer präzisen, steuerbaren Mikroumgebung, sondern auch stark die experimentellen Durchsatz zu erhöhen.

Der Chemie-Scherspannung (CSS) Chip Der CSS - Chip besteht aus drei PMMA - Platten, die jeweils mit einer Dicke von 1 mm angebracht , miteinander über zwei doppelseitige Klebebänder, die jeweils mit einer Dicke von 0,07 mm (1A und 1B). Der &quot;Weihnachtsbaum&quot; Struktur erzeugt fünf relativen Konzentrationen von 0, 1/8, 1/2, 7/8 und 1 in den fünf Kulturkreisen. Durch die Ausbildung de...

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Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.

Entwerfen Mikrofluidiksysteme für ein Studium zellulären Reaktionen Unter Einzel- oder Coexisting Chemie / Elektro / Schubspannung Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

designing-microfluidic-devices-for-studying-cellular-responses-under

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.8K Aufrufe.  National Taiwan University. Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.

Serie: Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Mikrofabrizierten Plattformen für Mechanisch Dynamische Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Forschung

Biotechnik

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well quantifiable fluid shear stresses1.
Our flow chamber design and flow circuit (Fig. 1) contains a transparent viewing region that enables testing of cell adhesion and imaging of cell morphology immediately before flow (Fig. 11A, B), at various time points during flow (Fig. 11C), and after flow (Fig. 11D). These experiments are illustrated with human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells (EPCs) and porcine EPCs2,3.
This method is also applicable to other adherent cell types, e.g. smooth muscle cells (SMCs) or fibroblasts.
The chamber and all parts of the circuit are easily sterilized with steam autoclaving. In contrast to other chambers, e.g. microfluidic chambers, large numbers of cells (&gt; 1 million depending on cell size) can be recovered after the flow experiment under sterile conditions for cell culture or other experiments, e.g. DNA or RNA extraction, or immunohistochemistry (Fig. 11E), or scanning electron microscopy5. The shear stress can be adjusted by varying the flow rate of the perfusate, the fluid viscosity, or the channel height and width. The latter can reduce fluid volume or cell needs while ensuring that one-dimensional flow is maintained. It is not necessary to measure chamber height between experiments, since the chamber height does not depend on the use of gaskets, which greatly increases the ease of multiple experiments. Furthermore, the circuit design easily enables the collection of perfusate samples for analysis and/or quantification of metabolites secreted by cells under fluid shear stress exposure, e.g. nitric oxide (Fig. 12)6.

We are describing a method to subject adherent cells to laminar flow shear stress in a sterile continuous flow circuit. The cells' adhesion, morphology can be studied through the transparent chamber, samples obtained from the circuit for metabolite analysis and cells harvested after shear exposure for future experiments or culture.

Parallel-Platten-Flow-Kammer und Continuous Flow Circuit endothelialen Vorläuferzellen unter Laminar Flow Schubspannung Bewerten

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Einer mikrofluidischen Vorrichtung mit Groove Patterns für ein Studium Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Biologie

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a comparative manner. Multiwell plates are routinely used to compare many different strains or cell lines, but allow limited control over the environment dynamics. Microfluidic devices, on the other hand, allow exquisite dynamic control over the surrounding conditions, but it is challenging to image and distinguish more than a few strains in them. Here we describe a method to easily and rapidly manufacture a microfluidic device capable of applying dynamically changing conditions to multiple distinct yeast strains in one channel. The device is designed and manufactured by simple means without the need for soft lithography. It is composed of a Y-shaped flow channel attached to a second layer harboring microwells. The strains are placed in separate microwells, and imaged under the exact same dynamic conditions. We demonstrate the use of the device for measuring protein localization responses to pulses of nutrient changes in different yeast strains.

We present a simple method to produce microfluidic devices capable of applying similar dynamic conditions to multiple distinct strains, without the need for a clean room or soft lithography.

Einer mikrofluidischen Vorrichtung für ein Studium mehrere verschiedene Stämme

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

Ein Mikrofluidiktechnik to Cell Verformbarkeit Sonde

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Mikrostrukturierung und Montage von 3D-Micro-Ader

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth plate cartilage architecture and results in growth modulation of long bones of children. To determine the role of compressive stress in bone growth, we created a microfluidic device actuated by pneumatic pressure, to dynamically (or statically) compress growth plate chondrocytes embedded in alginate hydrogel cylinders. In this article, we describe detailed methods for fabricating and characterizing this device. The advantages of our protocol are: 1) Five different magnitudes of compressive stress can be generated on five technical replicates in a single platform, 2) It is easy to visualize cell morphology via a conventional light microscope, 3) Cells can be rapidly isolated from the device after compression to facilitate downstream assays, and 4) The platform can be applied to study mechanobiology of any cell type that can grow in hydrogels.

This article provides detailed methods for fabricating and characterizing a pneumatically actuating microfluidic device for chondrocyte compression.

Eine mikrofluidische Plattform zur Stimulierung von Chondrozyten mit dynamischer Kompression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Erzeugung dynamischer Umgebungsbedingungen mit einem hochdurchsatzstarken mikrofluidischen Gerät

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart muscle, the myocardium, is notoriously difficult to accomplish in vitro. Mainly, obstacles lie in the need for human cardiomyocytes (CMs) that are either adult or exhibit adult-like phenotypes and can successfully replicate the myocardium&#39;s cellular complexity and intricate 3D architecture. Unfortunately, due to ethical concerns and lack of available primary patient-derived human cardiac tissue, combined with the minimal proliferation of CMs, the sourcing of viable human CMs has been a limiting step for cardiac tissue engineering. To this end, most research has transitioned toward cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) as the primary source of human CMs, resulting in the wide incorporation of hiPSC-CMs within in vitro assays for cardiac tissue modeling.
Here in this work, we demonstrate a protocol for developing a 3D mature stem cell-derived human cardiac tissue within a microfluidic device. We specifically explain and visually demonstrate the production of a 3D in vitro anisotropic cardiac tissue-on-a-chip model from hiPSC-derived CMs. We primarily describe a purification protocol to select for CMs, the co-culture of cells with a defined ratio via mixing CMs with human CFs (hCFs), and suspension of this co-culture within the collagen-based hydrogel. We further demonstrate the injection of the cell-laden hydrogel within our well-defined microfluidic device, embedded with staggered elliptical microposts that serve as surface topography to induce a high degree of alignment of the surrounding cells and the hydrogel matrix, mimicking the architecture of the native myocardium. We envision that the proposed 3D anisotropic cardiac tissue-on-chip model is suitable for fundamental biology studies, disease modeling, and, through its use as a screening tool, pharmaceutical testing.

The goal of this protocol is to explain and demonstrate the development of a three-dimensional (3D) microfluidic model of highly aligned human cardiac tissue, composed of stem cell-derived cardiomyocytes co-cultured with cardiac fibroblasts (CFs) within a biomimetic, collagen-based hydrogel, for applications in cardiac tissue engineering, drug screening, and disease modeling.

Entwicklung von 3D-organisiertem menschlichem Herzgewebe innerhalb einer mikrofluidischen Plattform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...

Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress

Fluid shear stress is well known to play a major role in endothelial function. In most vascular beds, elevated shear stress from acute increases in blood flow triggers a signaling cascade resulting in vasodilation thereby alleviating mechanical stress on the vascular wall. The pattern of shear stress is also well known to be a critical factor in the development of atherosclerosis with laminar shear stress being atheroprotective and disturbed shear stress being pro-atherogenic. While we have a detailed understanding of the various intermediate cell signaling pathways, the receptors that first translate the mechanical stimulus into chemical mediators are not completely understood. Mechanosensitive ion channels are critical to the response to shear and regulate shear-induced cell signaling thereby controlling the production of vasoactive mediators. These channels are among the earliest activated signaling components to shear and have been linked to shear-induced vasodilation through promoting nitric oxide production (e.g., inwardly rectifying K+ [Kir] and transient receptor potential [TRP] channels) and endothelium hyperpolarizing factor (e.g., Kir and calcium-activated K+ [KCa] channels) and shear-induced vasoconstriction through an undetermined mechanism that involves piezo channels. Understanding the biophysical mechanism by which these channels are activated by shear forces (i.e., directly or through a primary mechano-receptor) could provide potential new targets to resolve the pathophysiology associated with endothelial dysfunction and atherogenesis. It is still a major challenge to record flow-induced activation of ion channels in real time using electrophysiology. The standard methods to expose cells to well-defined shear stress, such as the cone and plate rheometer and closed parallel plate flow chamber do not allow real time study of ion channel activation. The goal of this protocol is to describe a modified parallel plate flow chamber that allows real time electrophysiological recording of mechanosensitive ion channels under well-defined shear stress.

The goal of this protocol is to describe a modified parallel plate flow chamber for use in investigating real time activation of mechanosensitive ion channels by shear stress.

Elektrophysiologische Aufnahmen von einzelzelligen Ionenströmen unter genau definiertem Scherspannung

Fluid shear stress is well known to play a major role in endothelial function. In most vascular beds, elevated shear stress from acute increases in blood ...