This work was supported by NIH Grants R01-DC010146 and R01-DC010397. Its content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official view of the National Institutes of Health.

1. Hücre Kültürü Not: Tüm hücre kültürü protokolleri uygun hücre kültür teknikleri kullanılarak yapılmalıdır (: Bir Laboratuar El Kitabı, Cilt I 10 başvuru için Hücre Biyolojisi ilk 3 Bölümler bakınız). Hei-OC1 hücreleri uygun bir yapışma ve bir büyüme hücre kültür kaplarına ilave kaplama ya da işlem gerektirmez. Çok önemli: Hücre kültürü amaçlı cam yemekleri kullanmayın; fenotip ve farmakolojik ilaçların, hücrelerin biyolojik yanıt (yayınlanmamış G Kalinec &amp; F Kalinec) değişecektir; geleneksel plastik hücre kültürü yemekleri (Malzeme / Ekipman bkz: İçindekiler) tavsiye edilir. Bulaşmayı önlemek için aseptik teknikler özellikle dikkat edin, ancak HEI-OC1 hücreleri ile antibiyotik (örneğin, ampisilin veya streptomisin) asla kullanmayın. Gerekirse HeLa ve HEK-293 hücreleri Hei-OC1 8, başka bir hücre soyu olabilir önceki çalışmalarda bir kontrol olarak kullanılmış olsa da, amfoterisin B kullanımıBu amaç için kabul edilebilir. <ol><li> Dondurulmuş HEI-OC1 Hücrelerinin Resüsitasyon Not: stria 13,14 vaskularis gelen bu protokol, aynı transjenik Corti 11,12 organdan, örneğin OC-K3 olarak, laboratuarda geliştirilmiş fare ve SV-K1 diğer hücre çizgileri de kullanılabilir. <ol><li> Sıvı N 2 dondurulan Hei-OC1 hücrelerinin bir şişe çıkarın ve 37 ° C&#39;de bir su banyosu içine koyun. Şişenin sadece alt yarısı daldırın ve buz sadece küçük bir miktar şişede kalmaktadır kadar çözülme sağlar. % 70 alkol ile flakon dışını silin. </li><li> (Dulbecco değiştirilmiş Eagle aracı maddesi gibi önceden ısıtılmış büyüme ortamında 10 ml içeren 15 ml&#39;lik konik bir tüp içine yavaşça bütün hacmi (-1.5 x 10 5 hücre / mi), damla damla, şişeden hücreler pipet ve teslim DMEM),% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiştir. </li><li> t atarak, 5 dakika boyunca 300-500 xg tüp santrifüjle DMSO kaldırO süpernatan ve yeniden süspansiyon, taze büyüme ortamına (DMEM +% 10 FBS) 9 ml hücreleri. orta ve tersi, tüpün alt dokunmadan pipet ucu ile üç dört kez pipetle dan, asma hücrelerinin akı ve reflü kümeleri veya hücre yaprak parçalara ayırma. </li><li> 100 mm çapında işlenmemiş plastik hücre kültürü tabakları büyüme ortamı içinde süspansiyon haline hücrelerin toplam hacmi yerleştirin. </li><li> % 10 CO2 (izin veren koşullar) ile 33 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li></ol></li><li> HEI-OC1 Hücrelerinin Altkültür Not: izdiham önce (~% 80) hücre boyama kültür önlemek için süspansiyon ve alt-kültür haline getirilmesi gerekmektedir. Bu protokol, aynı zamanda stria gelen 13,14 vaskularis, çorti 11,12 ve SV-K1 organdan Bu OC-K3 aynı transgenik fare laboratuvarda geliştirilen diğer hücre çizgileri, kullanılabilir. <ol><li> 2 ml PBS ile hücreleri eski orta alın ve yıkama. &lt;/ Li&gt; <li> Yüzey alanı 25 cm2 başına 1 mi kullanılarak,% 0.25 tripsin solüsyonu ile hücre mono tabakasının örtün. hücrelerin% 40&#39;ından fazlası çıkartılması gerekmektedir sonraki adıma hareket ettirin. Gerekirse, ters bir mikroskop kullanılarak hücrelerin inceleyin ve &quot;tokat veya dokunun&quot; kalan bağlı hücreleri serbest bırakmak için hafifçe kültür yemekleri. Not: hücre ölümüne neden olabilir uzun süre trypsinization olarak özen gösterin; Yeterince ve transfer hücreleri olacak planlanan çalışmalar için yetersiz. değil </li><li> 1.1.3 tarif edilen prosedür izlenerek, hücrelerin tekrar ve 15 ml konik bir tüp aktarın. </li><li> 300-500 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüje, orta atmak, taze büyüme ortamına hücreleri toplamak ve, en az dört, 100 mm çapında, hücre kültür kaplarına bunları tohum. çanak başına hücre sayısı, geri kazanılan hücre miktarına bağlıdır. % 10 CO2 (P-Hei-OC1) ile 33 ° C&#39;de inkübe hücreleri ve için gerekli daha birçok kez bölmekPlanlanan deneyler ya da yeni bir stok oluşturmak için. </li><li> stok hazırlanması için, 250-550 ml hücre kültürü şişeleri ile 100 mm çaplı yemekler yerine; Deneyler için, daha küçük bir yemekler veya çok-kuyucuklu plak daha uygun olabilir. </li><li> Onlar gelinceye kadar farklılaşma, ~ hoşgörülü koşullarda% 80 izdiham HEI-OC1 hücreleri inkübe; daha sonra 2 ila 3 hafta içinde,% 5 CO2 (NP-Hei-OC1) 39 ° C&#39;ye kadar yemekler hareket eder. Not: Hücreler giderek çoğalan ve ölen duracaktır. Ölü hücreleri çıkarmak için her gün orta değiştirin. daha fazla hücre deneyleri için uygun olacak, genellikle yaklaşık 4 hafta sonra, orijinal hücre sayısına bağlı olarak. Hücreler NP koşullarında yerleştirilir olarak farklılaşma en kısa sürede başlar, ancak her hücre aynı hızda ayırt. Önemlisi, nitel sağlayan (Şekil 4 Temsilcisi Sonuçlar bakınız) farklılaşma sürecinde ifade ve membran yerelleştirme artar Prestinve farklılaşma düzeyi kantitatif bir gösterge. </li></ol></li></ol> 2. İlaç Sitotoksisite çalışmaları Not: izin veren koşullar (P-HEI-OC1) yetiştirilen HEI-OC1 hücreleri bu çalışmalarda (Şekil 1 Temsilcisi Sonuçlar bakınız) için tavsiye edilir. <ol><li> Hücre Canlılık (MTT testi) <ol><li> 1.2 anlatılan prosedürü izleyerek P-HEI-OC1 hücreleri toplamak ve otomatik hücre sayacı veya hemasitometre ya onları saymak. 2.0 x 10 5 hücre / ml konsantrasyon ayarlayın. </li><li> 96 oyuklu şeffaf yassı tabanlı plakalar (oyuk başına 100 ul) ile ilgili hücrelerin Tohum substrata eklenmesi için bir gece boyunca inkübe ve daha sonra söz konusu ilaç ile tedavi. boşlukları ve tedavi edilmeyen hücreleri (kontrol) eklemeyi unutmayın! </li><li> ilaç tedavisinden sonra (genellikle 24 veya 48 saat 33 ° C&#39;de), imalatçının protokolü izlenerek MTT gerçekleştirin. Genel olarakBu deney için protokol, aşağıdaki adımları vardır: <ol><li> Her bir oyuğa, MTT ayıracı 10 ul ekle. </li><li> mor boya görünene kadar 2 ila 4 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe plakası ve daha sonra her bir MTT Deterjan reaktifi 100 ul ilave edin. plaka sallamayın. </li><li> plaka Kapak ve 37 ° C&#39;de 2 saat 4 için karanlıkta bırakın. </li><li> boşlukları (tek başına büyüme ortamı) de dahil olmak üzere, her bir 570 nm&#39;de absorbansı ölçmek için bir mikro-plaka plaka okuyucusu kullanarak. canlılığı% 100 olarak kontrol hücreleri ortalama OD kullanarak veri normalize. </li></ol></li></ol></li><li> Kaspaz 3/7 aktivasyon deneyi Not: izin veren koşullar (P-Hei-OC1) yetiştirilen Hei-OC1 hücreleri bu çalışmalar için tavsiye edilir. <ol><li> 1.2 de tarif edilen prosedür takip edilerek Hei-OC1 hücreleri toplamak ve bir otomatik hücre sayacı veya hemasitometre ile ya say. 2.0 x 10 5 hücre / ml konsantrasyon ayarlayın. </li><li> wh üzerinde hücreleri Tohum(100 ul oyuk başına), 96 gözlü levhalar ite duvarlı, alt-tabakaya bağlanması için bir gece boyunca inkübe ve daha sonra söz konusu ilaç ile tedavi. boşlukları ve tedavi edilmeyen hücreleri (kontrol) eklemeyi unutmayın! </li><li> ilaç tedavisinden sonra (genellikle 24 veya 48 saat 33 ° C&#39;de), ilgili üreticinin protokolü takip kaspaz deneyi yapar. Genel olarak, bu deneme için olan protokole şu adımları vardır: <ol><li> , Reaktifler hazırlayın iyice karıştırın ve onları oda sıcaklığına gelmesini bekleyin. </li><li> inkübatör hücreleri çıkarın ve plakalar oda sıcaklığında dengelenmeye bırakın. </li><li> Aynı pipet uçları ile farklı örnekleri içeren kuyu dokunmadan değil tarafından çapraz bulaşmayı önlemek için dikkatli olmak, iyi her reaktif belirtilen miktarda ekleyin. </li><li> plaka Kapak ve 300-500 rpm&#39;de bir plaka çalkalayıcı kullanarak 30 saniye boyunca karıştırın. </li><li> en az 30 dakika, bir süre için, oda sıcaklığında inkübe plakası. determinampirik optimum kuluçka dönemi e. Oda sıcaklığı sıcaklık dalgalanmaları lüminesans okuma etkileyecektir, çünkü sabit sıcaklık kuluçka kullanın dalgalanmalar durumunda. </li><li> her bir lüminesans ölçümü ve kaspaz aktivasyonunun% 100 olarak kontrol hücreleri ortalama ışıldama kullanarak değerleri normalize. </li></ol></li></ol></li><li> Hücre Bölünmesi (Proliferation) <ol><li> 1.2 de tarif edilen prosedür takip edilerek Hei-OC1 hücreleri toplamak ve bir otomatik hücre sayacı veya hemasitometre ile ya say. 2.0 x 10 5 hücre / ml konsantrasyon ayarlayın. </li><li> 96 oyuklu şeffaf yassı tabanlı plakalar (oyuk başına 100 ul) ile ilgili hücrelerin Tohum alt-tabaka bağlanma izin veren koşullar gece boyunca inkübe ve daha sonra söz konusu ilaç ile tedavi. boşlukları ve tedavi edilmeyen hücreleri (kontrol) eklemeyi unutmayın! </li><li> muameleden sonra bir saat, her çukuruna hazırlanan 100x BrdU 1 ul (5-Bromo-2&#39;-deoxyuri) Çözeltisi yemek ve 33 ° C&#39;de inkübatör plakaları döndürür. </li><li> 12, 24 ve 48 saat sonra, ilgili plakalar mevcut orta kaldırmak ve PBS ile de bir kez, her yıkama. </li><li> Üreticinin protokolü takip hücre proliferasyon tahlili gerçekleştirmek. Genel olarak, bu deneme için olan protokole şu adımları vardır: <ol><li> / Sabitleme de dahil olmak üzere, üreticinin protokolüne belirtildiği gibi denatüre edici çözelti, yıkama tamponu birincil antikor algılama çözeltisi, ikincil antikor algılama çözeltisi ve BrdU çözelti belirteçlerinin hazırlayın. </li><li> üreticinin protokolü gösterilen miktarlarda, her bir kuyucuğa sabitleme / denatüre solüsyonu ekleyin ve 30 dakika için oda sıcaklığında plaka tutun. </li><li> Kurma / denatürasyon çözeltisi çıkarın ve üreticinin protokolüne belirtilen konsantrasyonda primer antikor ilave edin. 1 saat süre ile, oda sıcaklığında plaka tutun. </li><li> Primer ant ile çözüm çıkarıniBody, plaka, yıkama tamponuyla 3 kez yıkayın ve daha sonra imalatçının protokolüne belirtilen konsantrasyonda sekonder antikoru ilave edin. 30 dakika için oda sıcaklığında, ikincil antikor ile plaka tutun. </li><li> , Ikincil antikor ile çözüm çıkarın plaka, yıkama tamponuyla 3 kez yıkanır ve substrat ilave edin. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübasyondan sonra, durdurma çözeltisi ilave edin. Dikkatli olun: renk değişimi kontrol; çözüm çok karanlık olursa, 10 dakika standart geliştirme zamanı öncesinde reaksiyonu durdurmak. </li><li> Durdurma çözeltisi ekleyerek 30 dakika içinde 450 nm&#39;de absorbansı okumak. </li></ol></li></ol></li><li> sitotoksisite Not: izin veren koşullar (P-Hei-OC1) yetiştirilen Hei-OC1 hücreleri bu çalışmalar için tavsiye edilir. <ol><li> tek başına hücre kültürü ortamı (kontrol) ya da orta artı faiz uyuşturucu, 24-48 saat süreyle genellikle hoşgörülü koşullarda HEI-OC1 inkübe hücreleri. </li><li> Tedavi sonundaHücreleri, PBS ile üç kez yıkanır, ve 3 dakika için bir enzimatik olmayan hücre ayrışma çözeltisi yüzey alanının 25 cm2 başına 1 ml ile çıkarınız. </li><li> çıkardıktan sonra toplamak ve 5 dakika boyunca 3000 x g&#39;de santrifüj ile pelet hücreleri Süpernatantı ve sitotoksisite analizi dahil reaktif ile karanlıkta 15 dakika için hücrelerin lekelenmesi. </li><li> akış sitometresinin üreticisi tarafından belirtilen sitometri olarak akış canlı HEI-OC1 hücrelerinin sayısını belirler. </li></ol></li><li> yaşlılık <ol><li> tek başına hücre kültürü ortamı (kontrol) ya da orta artı faiz uyuşturucu, 24-48 saat süreyle genellikle hoşgörülü koşullarda HEI-OC1 inkübe hücreleri. </li><li> Güvenilir sonuçlar sağlamak için bilinen Debacq-Chainiaux ve ark., 15 ya da başka bir yöntemle tanımlanan protokol ile akış sitometrisi kullanılarak yaşlanmayla bağlantılı beta-galaktosidaz pozitif hücrelerin sayısını belirler. flow sitometri için kısa bir protokol şudur: <ol> &lt;li&gt; deneysel tedavi sonunda, hücrelerin PBS ile üç kez yıkanır ve daha sonra izin veren koşullar da 1 saat süre ile hücre kültür ortamı içinde, 100 nM bafilomisin A1 ile inkübe edin. </li><li> ~ 33 uM&#39;lik bir son konsantrasyonda C12FDG ekleyin ve 1-2 saat boyunca hücrelerin inkübe edilmesi devam edin. </li><li> 3 dakika için bir enzimatik olmayan hücre ayrışma çözeltisi yüzey alanının 25 cm2 başına 1 ml kullanarak hasat, PBS ile iki kez hücreleri yıkanır ve 5 dakika boyunca 3000 x g&#39;de santrifüj ile bunları pelet. </li><li> buz soğukluğunda PBS hücrelerin yeniden süspanse edin ve akış sitometresi üreticisi tarafından gösterildiği gibi akış sitometrisi ile pozitif Hei-OC1 hücrelerinin sayısını belirler. </li></ol></li></ol></li><li> otofaji <ol><li> Hei-OC1 hücreleri kontrol etmek ve aç 1.2 de tarif edilen prosedür takip edilerek (48 saat boyunca serumdan yoksun) ve standart protokoller izlenerek, batı lekesi üzere işlemden toplayın. Genel olarak, Western blot protokolleri, aşağıda st bilgisieps: <ol><li> 1.0 x 10 5 hücre / ml&#39;lik bir konsantrasyonda, 6 oyuklu tabaklar Tohum Hei-OC1 hücreleri. 24 ve / veya 48 saat sonra, buz gibi soğuk PBS ile yıkayın hücreleri. </li><li> Lyse ile TNESV tamponu (% 1 NP40, 50 mM Tris-HCI pH 7.5, 100 mM NaCI, 2 mM EDTA, 1 mM Na 3 VO 4), buz üzerinde 5 dakika süre ile proteaz inhibitör kokteyli ile ve 1 mM PMSF 200 ul. </li><li> (Her bir alt kazıma) hücreler toplama 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 16,800 x g&#39;de mikrosantrifüj tüpleri ve santrifüj aktarın. </li><li> süpernatantlar toplamak ve BCA Testi kullanarak protein konsantrasyonunu ölçmek. </li><li> proteinleri denatüre etmek için 5 dakika boyunca 5x yükleme tamponu ve her bir örnek için, 1 mM DTT ve kaynatılır. </li><li> % 4-12 jel üzerinde SDS-PAGE kullanılarak örnekleri çalıştırın ve PVDF zarlarına transfer. </li><li> Oda sıcaklığında 60 dakika boyunca Tween 20% 0.1 TBS-T içinde% 5 yağsız kuru süt ile bloke membranlar. </li><li> Birincil ant ile 4 ° C&#39;de bir gece boyunca inkübe membranlaribodies. </li><li> Sonraki gün, TBS-T ile iyice membranları yıkamak ve yaban turpu peroksidazı (HRP) (1: 1500) konjüge edilmiş bir sekonder IgG ile inkübe 1 saat karıştırıldı. </li><li> bir chemiluminescence (ECL) algılama sistemi ile immünoreaktivite algılar. standart olarak (% 10 yağsız kuru süt ile TBS-T içinde 2.000 1) GAPDH kullanılarak protein ekspresyon seviyelerini normalize. </li></ol></li><li> Western blotlar olarak ekspresyonunu incelemek en azından bu Beclin-1 ve LC3B olarak Otofaji iki farklı işaretleri (genellikle 1 için:% 2.5 BSA ile TBS-T içinde 1000 seyrelti). GAPDH veya aktin gibi protein ifade bir denetim bakmak için unutma. </li><li> Böyle kamu malı NIH Image veya ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/) gibi dijital Blot tarayıcı veya bilgisayar yazılımı kullanılarak dansitometrisi tarafından ilgilenilen proteinin ifadesini değerlendirir. </li></ol></li></ol> HEI-OC1 Hücreleri ile 3. Elektrofizyoloji Deneyler <ol><li>Hasat Hücreler Not: kullanımlar hücreleri 50% -80% birbirine karıştığında 100 mm çaplı kültür tabaklarında büyüyen. Tripsin, Accutase bir asetik asit (PBS-EDTA) etra meti! D iamine t uffered s aline + e B enzim içermeyen bir çözelti ya da p hosphate- gigaseals sayısı ve kalitesi üzerinde önemli bir etkisi olmaksızın hücreleri kaldırma için kullanılabilmektedir . Bazı durumlarda ise, tripsin tedavisi hücreleri daha kırılgan hale getirmektedir. Bu gibi durumlarda, hücreler, bir deney başlamadan önce, yaklaşık 30 dakika boyunca geri sağlar. <ol><li> 10 ml Ca olmadan PBS 2+ ve Mg 2+ ile iki kez hücreleri yıkayın. </li><li> % 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de 3 dakika boyunca yemekler gibi enzimatik olmayan hücre ayrışma çözeltisi gibi bir enzim içermeyen detacher çözeltisi 2 mi, ekleme ve inkübe edilir. </li><li> Hücrelerin dekolmanı kontrol etmek için ters bir mikroskop kullanın. Gerekirse, cel hareketl kültür çanak fazla hücreleri ayırmak için, ama nazikçe yapın. Not: çanak sallamayın. </li><li> DMEM +% 10 FBS, 10 ml ilave edilir ve yavaşça yukarı ve 10 ml bir pipet ile beş defa hücreleri pipetle. </li><li> Mikroskop altında hücrelerin bak. Hücrelerin&gt;% 80 zaten (tek) ayrılmış ise, başka pipet gereklidir. Hücreler kümeler hala varsa% 80&#39;den fazla hücreleri tek olana kadar yavaşça pipetleme tekrarlayın. </li><li> 100 x g&#39;de 2 dakika süre ile, 15 ml konik bir tüp içine santrifüj süspansiyon hücrelerinin ~ 10 mi yerleştirin ve süpernatant atılır. </li><li> hücreler tekrar süspansiyon - harici kayıt solüsyonu ~ 200 ul kullanarak (damıtılmış su ile 310 mOsm Leibovitz L-15 ortamı 305 ayarlanmıştır). hücrelerin optik kontrol pürüzsüz zar kenarlara sahip çok sayıda tek, yuvarlak hücreler göstermesi gerekir. </li></ol></li><li> Patch-kelepçe ve NLC Ölçümler <ol><li> yama-kelepçe ve bir kullanarak voltaj bağımlı doğrusal olmayan kapasitans ölçümü (NLC) gerçekleştirindequate yükselticiler ve yazılım, yanı sıra standart elektrofizyolojik teknikler. İç (intrapipette) çözeltisi kullanımı, 150 mM KCI, 1 mM MgCI2, 0.1 mM EGTA, 2 mM ATP, Mg gibi, 0.1 mM GTP-Na ve 10 mM HEPES; Tris ile pH&#39;ı 7.2&#39;ye ayarlayın. </li><li> Mikroskop altında, yuvarlak ve pürüzsüz zar kenarlara sahip tek, sağlıklı hücreyi seçin. hücre yüzeyine cam pipet ucu takın ve membran direnci kontrol edin. Bu ~ 2 um pipet ucu, iç çapı (ID) tekabül eden, yaklaşık 3-6 megohm olmalıdır. </li><li> Yavaşça hücre plazma zarı karşı mikropipet ucu basın ve sonra emme uygulanır. 100 gigaOhms (gigaseal) - hücre zarının bir kısmı 10 için bir elektriksel direnç üreten pipet içine emilen olacaktır. </li><li> Emme darbeleri ile plazma zarı bozarak tüm hücre durumunu kurmak. </li><li> Kontrol 9 gibi, bu HEK-293 olarak Prestin eksprese etmeyen hücreler, kullanma. Not: Şu tepkiler 5 kHz filtre edilmelidir ve düzeltmeler artık seri direnç etkileri için yapılmış. Tüm veri toplama ve çoğu analizler genellikle kilitli amplifikatörler birlikte gelen yazılımı kullanılarak yapılabilir. Kapasitans fonksiyonu membran gerilimine 16 doğrusal olmayan ücret ile ilgili bir iki devlet Boltzmann fonksiyonunun birinci türevi takılabilir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+derivation+of+conditionally+immortall+cell+lines+from+an+H-2Kb-tsA58+transgenic+mouse.">Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).</li><li>Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cochlear+cell+line+as+an+in+vitro+system+for+drug+ototoxicity+screening.">A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening.</a> Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).</li><li>Devarajan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-induced+apoptosis+in+auditory+cells:+role+of+death+receptor+and+mitochondrial+pathways.">Cisplatin-induced apoptosis in auditory cells: role of death receptor and mitochondrial pathways.</a> Hear Res. 174, 45-54 (2002).</li><li>Chen, F. Q., Hill, K., Guan, Y. J., Schacht, J., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+apoptotic+pathways+in+the+absence+of+cell+death+in+an+inner-ear+immortomouse+cell+line.">Activation of apoptotic pathways in the absence of cell death in an inner-ear immortomouse cell line.</a> Hear Res. 284, 33-41 (2012).</li><li>Hayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagy+pathway+maintained+signaling+crosstalk+with+the+Keap1-Nrf2+system+through+p62+in+auditory+cells+under+oxidative+stress.">The autophagy pathway maintained signaling crosstalk with the Keap1-Nrf2 system through p62 in auditory cells under oxidative stress.</a> Cell Signal. 27, 382-393 (2015).</li><li>Tsuchihashi, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+through+4EBP1+and+AMPK+regulates+oxidative+stress-induced+premature+senescence+in+auditory+cells.">Autophagy through 4EBP1 and AMPK regulates oxidative stress-induced premature senescence in auditory cells.</a> Oncotarget. 6, 3644-3655 (2015).</li><li>Youn, C. K., Kim, J., Park, J. H., Do, N. Y., Cho, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+autophagy+in+cisplatin-induced+ototoxicity.">Role of autophagy in cisplatin-induced ototoxicity.</a> Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 79, 1814-1819 (2015).</li><li>Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+drug+cytotoxicity.">HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity.</a> Hear Res. 335, 105-117 (2016).</li><li>Park, C., Thein, P., Kalinec, G., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+prestin+function.">HEI-OC1 cells as a model for investigating prestin function.</a> Hear Res. 335, 9-17 (2016).</li><li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, (2006).</li><li>Bertolaso, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+the+OC-k3+immortalized+cell+line+treated+with+different+agents.">Apoptosis in the OC-k3 immortalized cell line treated with different agents.</a> Audiology. 40, 327-335 (2001).</li><li>Kalinec, F., Kalinec, G., Boukhvalova, M., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+conditionally+immortalized+organ+of+corti+cell+lines.">Establishment and characterization of conditionally immortalized organ of corti cell lines.</a> Cell Biol Int. 23, 175-184 (1999).</li><li>Belyantseva, I., Kalinec, G. M., Kalinec, F., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+two+immortalized+cell+lines+derived+from+the+stria+vascularis+of+a+transgenic+mouse.">In vitro differentiation of two immortalized cell lines derived from the stria vascularis of a transgenic mouse.</a> 21st Midwinter Meeting Association for Research in Otolaryngology. 620a, (1998).</li><li>Gratton, M. A., Meehan, D. T., Smyth, B. J., Cosgrove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strial+marginal+cells+play+a+role+in+basement+membrane+homeostasis:+in+vitro+and+in+vivo+evidence.">Strial marginal cells play a role in basement membrane homeostasis: in vitro and in vivo evidence.</a> Hear Res. 163, 27-36 (2002).</li><li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+(SA-betagal)+activity,+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo.">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).</li><li>Santos-Sacchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+inhibition+of+voltage-dependent+outer+hair+cell+motility+and+capacitance.">Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance.</a> J. Neurosci. 11, 3096-3110 (1991).</li><li>Fink, S. L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis,+pyroptosis,+and+necrosis:+mechanistic+description+of+dead+and+dying+eukaryotic+cells.">Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells.</a> Infect Immun. 73, 1907-1916 (2005).</li><li>Majno, G., Joris, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis,+oncosis,+and+necrosis.+An+overview+of+cell+death.">Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death.</a> Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).</li><li>Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+necrosis:+the+expanding+network+of+non-apoptotic+cell+death+pathways.">Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 135-147 (2014).</li><li>Sun, L., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+kind+of+cell+suicide:+mechanisms+and+functions+of+programmed+necrosis.">A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis.</a> Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).</li><li>Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+necrosis+in+the+cross+talk+of+cell+death+and+inflammation.">Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation.</a> Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).</li><li>Vercammen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+signaling+of+the+Fas+receptor:+initiation+of+both+apoptotic+and+necrotic+cell+death+pathways.">Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways.</a> J Exp Med. 188, 919-930 (1998).</li><li>Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+cellular+senescence,+and+cancer.">Aging, cellular senescence, and cancer.</a> Annu Rev Physiol. 75, 685-705 (2013).</li><li>Bian, S., Koo, B. W., Kelleher, S., Santos-Sacchi, J., Navaratnam, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+expressing+Tet-inducible+cell+line+recapitulates+in+situ+developmental+changes+in+prestin's+Boltzmann+characteristics+and+reveals+early+maturational+events.">A highly expressing Tet-inducible cell line recapitulates in situ developmental changes in prestin's Boltzmann characteristics and reveals early maturational events.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 299, C828-C835 (2010).</li><li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+of+the+outer+hair+cell+motor+prestin+in+the+mouse.">Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse.</a> J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).</li><li>Oliver, D., Fakler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+density+and+functional+characteristics+of+the+outer+hair+cell+motor+protein+are+regulated+during+postnatal+development+in+rat.">Expression density and functional characteristics of the outer hair cell motor protein are regulated during postnatal development in rat.</a> J Physiol. 519 Pt 3, 791-800 (1999).</li><li>Tsunoo, M., Perlman, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+Oxygen+Tension:+Relation+to+Blood+Flow+and+Function.">Cochlear Oxygen Tension: Relation to Blood Flow and Function.</a> Acta Otolaryngol. 59, 437-450 (1965).</li></ol>

The authors declare no existing or potential conflict of interest.

Bu yazıda nasıl kültür HEI-OC1 hücrelerini açıklamak ve ilaca bağlı sitotoksisite mekanizmaları değerlendirmek için bunları kullanmak ve lüks mah, koklear OHCs moleküler motor fonksiyonel özelliklerini araştırmak için. teknik prosedürler, ancak kolayca farklı çalışmalara adapte edilebilecek kadar geneldir. Burada tarif edilen tüm protokoller, köklü hücre kültürü teknikleri 10 doğru kullanımını gerektirir. Sadece herhangi bir başka hücre hattı ...

Corti 1 Ev Kulak Enstitüsü Organ (HEI-OC1) hücreler transgenik fare 1,2 işitsel organdan türetilmiştir. 33 ° C /% 10 CO2 (permisif koşullar) bu transjenik fareden bir hücre inkübasyonu de-farklılaşma ve hızlandırılmış çoğalmasını tetikler bir immortalize genin ekspresyonuna neden olur; 39 ° C /% 5 CO2 en az Hei-OC1, hücre ölümü 2,3 halinde, çoğalma, farklılaşma azalma ve (non-permisif koşullar) talebi hücreleri ediyor. HEI-OC1 hücreleri klonlanmış ve on yıl önce laboratuvarımızda karakterize ve ilk çalışmalar spesifik gibi lüks mah, miyozin 7a, Atoh1, BDNF, calbindinden ve kalmodulin olarak koklear saç hücrelerinin, belirteçleri, aynı zamanda destekleyici işaretleri ifade belirtti edildi Connexin 26 ve fibroblast büyüme faktörü reseptörü (FGF-R) 2 gibi bir hücre. Bu nedenle, HEI-OC1 bir Commo temsil kanısına varıldıCorti 2 organı duyusal ve destekleyici hücreler n progenitör. Penisilin gibi, olmayan ototoksik kabul ilaçlar, 2,3 vermedi iken Paralel çalışmalar bu hücrelerde kaspaz-3 aktivasyonu kaynaklı sisplatin, gentamisin ve streptomisin gibi ototoksik ilaçlar arketipsel güçlü deliller sağladı. Bu nedenle, bu hücre çizgisi ototoksisitenin potansiyel ototoksiklikleri veya farmakolojik ilaçların otoprotective özellikleri taranması için dahil hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek için in vitro bir sistem önerilmiştir. HEI-OC1 hücreleri son on yıl içinde yayınlanan birden fazla yüz elli çalışmalarında kullanılmıştır tahmin edilmektedir. Farklı ilaçların potansiyel pro-apoptotik etkisi bakarak bu hücre hattını kapsayan çalışmaların çoğunda temel amacı iken, otofaji ve yaşlanma gibi diğer önemli hücre işlemleri sadece HEI-OC1 hücrelerinde 4-7 araştırılması başlamıştır. benna Laboratuvarımızda 8&#39;den yeni bir çalışmada, sık sık klinikte kullanılan farklı farmakolojik ilaçların yol açtığı hücre ölümü, hayatta kalma, proliferasyon, yaşlanma ve otofaji ilgili verilerin kapsamlı bir dizi toplamak için HEI-OC1 hücreler kullanılmaktadır. Ayrıca aynı tedavi HEK-293 (insan embriyonik böbrek hücreleri) ve HeLa gelenler (insan epitel hücre) Hei-OC1 hücre yanıtları bazıları karşılaştırıldığında. Sonuçlarımız, Hei-OC1 hücreleri üzerinde çalışılan mekanizmaların en az birine farklı bir doza ve zamana bağımlı bir hassasiyetle, karakteristik bir şekilde, The her ilacın yanıt göstermiştir. Biz de deney sonuçlarını doğru bir yorumu birden fazla teknikle 8 ile paralel çalışmalar yapmak gerektirdiğini Bu çalışmada vurgulanmıştır. Farklı çalışmada lüks mah fonksiyonel yanıtı, koklear dış saç hücreleri motor protein (OHCs) 9 değerlendirmek için Hei-OC1 hücrelerin kullanımı araştırılmıştır </s&gt; Yukarı. Bu izin veren (P-Hei-OC1) ve non-kültüre Hei-OC1 hücrelerinde Prestin ifade deseni, hem de doğrusal olmayan kondansatör (NLC) bütün hücre yama kenetleme çalışmaları akış sitometrisi ve konfokal lazer tarama mikroskobu incelemeleri rapor keyfi (NP-HEI-OC1) koşullar. Bizim sonuçlar, NP-Hei-OC1 hücrelerinde zamana bağlı bir şekilde, toplam Prestin sentezleme ve plazma membran lokalizasyonuna artış hem. İlginç bir şekilde, daha da bulundu toplam hücre ekspresyonunda önemli bir değişiklik olmadan sitoplazma plazma membranından transloke Na + K + ATPaz bir azalma ile ilişkili NP-Hei-OC1 hücrelerin plazma membranında Prestin lokalizasyonu artış. Ayrıca, p-Hei-OC1 hücreleri sağlam olarak kendisine plazma membranında bulunan Prestin moleküllerin yoğunluğu arttıkça azalmıştır motor fonksiyonları, Prestin ilişkili olduğunu göstermiştir. Toplamda, bu sonuçlar şiddetle HEI-OC yararlılığını destek1 hücreleri işitsel proteinleri araştırmak. Bu video makalede, nasıl ilaca bağlı sitotoksisite ve nasıl mekanizması / sn değerlendirmek için nasıl sitotoksisite çalışmaları için (P-HEI-OC1) izin veren koşullar büyüyen hücreleri kullanmak daha uygun olur neden kültür HEI-OC1 hücrelerini, açıklamak elektrofizyolojik çalışmalar yapmak (örneğin, patch-kelepçe, doğrusal olmayan kapasitans (NLC)) lüks mah, koklear OHCs moleküler motor fonksiyonel özelliklerini araştırmak için.

<table><tbody><tr><td>HEI-OC1 cells</td><td></td><td></td><td>ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Class II Biological Safety cabinet</td><td>The Baker Company</td><td>Sterilgard III</td><td>AND COMPANIES INDICATED IN THE</td></tr><tr><td>Refrigerated centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY</td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 25</td><td>EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR</td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Stovall</td><td>HWB115</td><td>PRODUCT COULD BE USED.</td></tr><tr><td>Cell counter</td><td>Nexcelom</td><td>Cellometer Auto T4</td><td></td></tr><tr><td>Two (2) Cell incubators, one at 33 &amp;deg;C/10% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; and other at 39 &amp;deg;C/5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Forma Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dishes, PS, 100 mm x 20 mm with vents</td><td>Greinier Bio-One</td><td>664-160</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dishes , PS,&amp;nbsp; 60 mm x 15 mm with vents&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar tissue culture flasks&amp;nbsp; 250 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658-175</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar tissue cultur&amp;nbsp; flasks 550 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>660-175</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;6 well cell culture plate, with lid-Cellstar</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657-160</td><td></td></tr><tr><td>Microtest Tissue culture plate, 96 well, flat bottom with lid</td><td>Becton Dickinson</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white, clear bottom</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655098</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars</td><td>Becton Dickinson&amp;nbsp;</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188-271</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 (1x)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH10073.1</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&#039;s L-15 Medium, no phenol red</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, 0.25%&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit</td><td>Trevigen</td><td>4890-25-K</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-Glo 3/7 Assay&amp;nbsp; kit</td><td>Promega</td><td>&amp;nbsp; G8091&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BrdU Cell Proliferation Assay Kit&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling</td><td>6813</td><td></td></tr><tr><td>Non-enzymatic cell dissociation solution&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5789</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit</td><td>Promega</td><td>&amp;nbsp; G8741&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FACSAriaIII instrument&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>&amp;nbsp;FACSAriaIII</td><td>With 488 nm excitation (blue laser)</td></tr><tr><td>Digital Blot Scanner</td><td>LI-COR</td><td>C-DiGit</td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis and Blotting Unit</td><td>Hoefer</td><td>SE300 miniVE</td><td></td></tr><tr><td>Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax 5</td><td></td></tr><tr><td>Patch-clamp amplifier</td><td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Puller for preparing patch electrodes</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr></tbody></table>

working with auditory hei-oc1 cells

HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic drugs, these cells have been used to investigate drug-activated apoptotic pathways, autophagy, senescence, mechanism of cell protection, inflammatory responses, cell differentiation, genetic and epigenetic effects of pharmacological drugs, effects of hypoxia, oxidative and endoplasmic reticulum stress, and expression of molecular channels and receptors. Among other several important markers of cochlear hair cells, HEI-OC1 cells endogenously express prestin, the paradigmatic motor protein of outer hair cells. Thus, they can be very useful to elucidate novel functional aspects of this important auditory protein. HEI-OC1 cells are very robust, and their culture usually does not present big complications. However, they require some special conditions such as avoiding the use of common anti-bacterial cocktails containing streptomycin or other antibiotics as well as incubation at 33 &#176;C to stimulate cell proliferation and incubation at 39 &#176;C to trigger cell differentiation. Here, we describe how to culture HEI-OC1 cells and how to use them in some typical assays, such as cell proliferation, viability, death, autophagy and senescence, as well as how to perform patch-clamp and non-linear capacitance measurements.

Son yayınlar bir çift biz birkaç sık kullanılan farmakolojik ilaçlara HEI-OC1 hücrelerinin tepkisini değerlendirirken yanı sıra Prestin fonksiyonunu 8,9 araştırılması amaçlanmıştır çalışmaların kapsamlı bir dizi bildirdi. Bu çalışmalarda önceki bölümlerde açıklanan tüm protokollerin kullanımını yaptı. Bu önceki çalışmaların sonuçlarından biri HEI-OC1 hücreleri non-permisif...

Watch this Scientific Journal Video about Working with Auditory HEI-OC1 Cells at JoVE.com

Working with Auditory HEI-OC1 Cells

House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) is one of the few mouse auditory cell lines currently available for research purposes. This protocol describes how to work with HEI-OC1 cells to investigate the cytotoxic effects of pharmacological drugs as well as functional properties of inner ear proteins.

İşitsel HEI-OC1 Hücreleri ile Çalışma

HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic ...

Research

JoVE Journal

Biology

14.9K Görüntüleme.  University of California, Los Angeles. House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) is one of the few mouse auditory cell lines currently available for research purposes. This protocol describes how to work with HEI-OC1 cells to investigate the cytotoxic effects of pharmacological drugs as well as functional properties of inner ear proteins.

Video: Working with Auditory HEI-OC1 Cells

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Elektroporasyon tarafından Embriyonik Fare Koklear Eksplantlarından Kültür ve Gen Transferi

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Gelişim Biyolojisi

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the postsynaptic activity of a single ribbon synapse 1-4. Ribbon synapses of sensory cells release neurotransmitter continuously, the rate of which is modulated in response to graded changes in IHC membrane potential 5. Ribbon synapses have been shown to operate by multivesicular release, where multiple vesicles can be released simultaneously to evoke excitatory postsynaptic currents (EPSCs) of varying amplitudes 1, 4, 6-11. Neither the role of the presynaptic ribbon, nor the mechanism underlying multivesicular release is currently well understood.
The IHC is innervated by 10-20 auditory nerve fibers, and every fiber contacts the IHC with a unmyelinated single ending to form a single ribbon synapse. The small size of the afferent boutons contacting IHCs (approximately 1 &mu;m in diameter) enables recordings with exceptional temporal resolution to be made. Furthermore, the technique can be adapted to record from both pre- and postsynaptic cells simultaneously, allowing the transfer function at the synapse to be studied directly 2. This method therefore provides a means by which fundamental aspects of neurotransmission can be studied, from multivesicular release to the elusive function of the ribbon in sensory cells.

Whole-cell patch-clamp recordings from auditory nerve fiber dendrites at the inner hair cell ribbon synapse in the mammalian cochlea.

Koklear İç Saç Hücreleri Ulaşın Afferent Dendritler postsinaptik Kayıtlar: Şerit Synapse Multivesicular Yayın İzleme

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the ...

Nörobilim

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

Tavuk İşitsel Organ gen Transferi tarafından<em&gt; Ovo olarak</em&gt; Mikro-elektroporasyon

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives from their characteristic apical bundle of stereocilia, a critical element for detection and transduction of sound energy 1. OHCs are able to change shape &#x2014;elongate, shorten and bend&#x2014; in response to electrical, mechanical and chemical stimulation, a motor response considered crucial for cochlear amplification of acoustic signals 2.
OHC stimulation induces two different motile responses: i) electromotility, a.k.a fast motility, changes in length in the microsecond range derived from electrically-driven conformational changes in motor proteins densely packed in OHC plasma membrane, and ii) slow motility, shape changes in the millisecond to seconds range involving cytoskeletal reorganization 2, 3. OHC bending is associated with electromotility, and result either from an asymmetric distribution of motor proteins in the lateral plasma membrane, or asymmetric electrical stimulation of those motor proteins (e.g., with an electrical field perpendicular to the long axis of the cells) 4. Mechanical and chemical stimuli induce essentially slow motile responses, even though changes in the ionic conditions of the cells and/or their environment can also stimulate the plasma membrane-embedded motor proteins 5, 6. Since OHC motile responses are an essential component of the cochlear amplifier, the qualitative and quantitative analysis of these motile responses at acoustic frequencies (roughly from 20 Hz to 20 kHz in humans) is a very important matter in the field of hearing research 7.
The development of new imaging technology combining high-speed videocameras, LED-based illumination systems, and sophisticated image analysis software now provides the ability to perform reliable qualitative and quantitative studies of the motile response of isolated OHCs to an external alternating electrical field (EAEF) 8. This is a simple and non-invasive technique that circumvents most of the limitations of previous approaches 9-11. Moreover, the LED-based illumination system provides extreme brightness with insignificant thermal effects on the samples and, because of the use of video microscopy, optical resolution is at least 10-fold higher than with conventional light microscopy techniques 12. For instance, with the experimental setup described here, changes in cell length of about 20 nm can be routinely and reliably detected at frequencies of 10 kHz, and this resolution can be further improved at lower frequencies. 
We are confident that this experimental approach will help to extend our understanding of the cellular and molecular mechanisms underlying OHC motility.

A reliable method to investigate outer hair cell (OHC) motile responses, including electromotility, slow motility and bending, is described. OHC motility is elicited by stimulation with an external alternating electrical field, and the method takes advantage of high-speed image recording, LED-based illumination, and last generation image analysis software.

Harici Alternatif Elektrik Alan Uyarılma ve Görüntü Analizi Yüksek hızlı bir kombinasyonu ile Dış Saç Hücre Motilite incelenmesi

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

İşitsel Sinir optogenetic uyarılması

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.

Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.

Koklear Hücre Dejenerasyonu Inducing için hızlı ve Güvenilir Teknik: Ototoksik Ajan Teslimat için Fare Yuvarlak pencere Yaklaşımı

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research ...

Tıp

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to amplify the weak vibration of low-level sound signal. The morphology and electrophysiological property of outer hair cells (OHCs) develop in early postnatal ages. The maturation of outer hair cell may contribute to the development of the auditory system. However, the process of OHCs development is not well studied. This is partly because of the difficulty to measure their function by an electrophysiological approach. With the purpose of developing a simple method to address the above issue, here we describe a step-by-step protocol to study the function of OHCs in acutely dissociated cochlea from postnatal rats. With this method, we can evaluate the cochlear response to pure tone stimuli and examine the expression level and function of the motor protein prestin in OHCs. This method can also be used to investigate the inner hair cells (IHCs).

This protocol describes methods to record the auditory brainstem response from postnatal rat pups. To examine the functional development of outer hair cells, the experimental procedure of whole-cell patch clamp recording in isolated outer hair cells is described step-by-step.

İşitsel Beyin Sapı Davranım Odyometrisi ve dış saç hücre bütün hücreli yama kelepçe kayıt Doğum sonrası sıçanlarda

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a condition that typically involves damage to or loss of the delicate mechanosensory structures of the inner ear. Sophisticated in vitro and ex vivo assays have emerged in recent years, enabling the screening of an increasing number of potentially therapeutic compounds while minimizing resources and accelerating efforts to develop cures for SNHL. Though homogenous cultures of certain cell types continue to play an important role in current research, many scientists now rely on more complex organotypic cultures of murine inner ears, also known as cochlear explants. The preservation of organized cellular structures within the inner ear facilitates the in situ evaluation of various components of the cochlear infrastructure, including inner and outer hair cells, spiral ganglion neurons, neurites, and supporting cells. Here we present the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The careful preparation of these explants facilitates the identification of mechanisms that contribute to SNHL and constitutes a valuable tool for the hearing research community.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

The goal of this protocol is to demonstrate the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The technique can be utilized as an in vitro screening tool in hearing research.

Yenidoğan Murin Koklear Explant Tekniği<em&gt; In vitro</em&gt; İşitme Araştırmalarında Tarama Aracı

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Cochlear Implant Surgery and Electrically-evoked Auditory Brainstem Response Recordings in C57BL/6 Mice

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of hearing. Improvement of the implant technology is needed if CI users are to perceive music and perform in more natural environments, such as hearing out a voice with competing talkers, reflections, and other sounds. Such improvement requires experimental animals to better understand the mechanisms of electric stimulation in the cochlea and its responses in the whole auditory system. The mouse is an increasingly attractive model due to the many genetic models available. However, the limited use of this species as a CI model is mainly due to the difficulty of implanting small electrode arrays. More details about the surgical procedure are therefore of great interest to expand the use of mice in CI research.
In this report, we describe in detail the protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in the C57BL/6 mouse strain. We demonstrate the functional efficacy of this procedure with electrically-evoked auditory brainstem response (eABR) and show examples of facial nerve stimulation. Finally, we also discuss the importance of including a deafening procedure when using a normally hearing animal. This mouse model provides a powerful opportunity to study genetic and neurobiological mechanisms that would be of relevance for CI users.

Animal models of cochlear implants can advance knowledge of the technological bases of treating permanent sensorineural hearing loss with electrical stimulation. This study presents a surgical protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in mice as well as the functional assessment with auditory brainstem response.

Koklear Implant ameliyatı ve elektriksel olarak uyarılmış işitsel beyin sapı yanıt kayıtları C57BL/6 farelerde

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of ...

Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia that are arranged in rows of increasing height. When stereocilia are deflected, they tug on tiny (~5 nm in diameter) extracellular tip links interconnecting stereocilia, which convey forces to the mechanosensitive transduction channels. Although mechanotransduction has been studied in live hair cells for decades, the functionally important ultrastructural details of the mechanotransduction machinery at the tips of stereocilia (such as tip link dynamics or transduction-dependent stereocilia remodeling) can still be studied only in dead cells with electron microscopy. Theoretically, scanning probe techniques, such as atomic force microscopy, have enough resolution to visualize the surface of stereocilia. However, independent of imaging mode, even the slightest contact of the atomic force microscopy probe with the stereocilia bundle usually damages the bundle. Here we present a detailed protocol for the hopping probe ion conductance microscopy (HPICM) imaging of live rodent auditory hair cells. This non-contact scanning probe technique allows time lapse imaging of the surface of live cells with a complex topography, like hair cells, with single nanometers resolution and without making physical contact with the sample. The HPICM uses an electrical current passing through the glass nanopipette to detect the cell surface in close vicinity to the pipette, while a 3D-positioning piezoelectric system scans the surface and generates its image. With HPICM, we were able to image stereocilia bundles and the links interconnecting stereocilia in live auditory hair cells for several hours without noticeable damage. We anticipate that the use of HPICM will allow direct exploration of ultrastructural changes in the stereocilia of live hair cells for better understanding of their function.

Here we present a protocol for the Hopping Probe Ion Conductance Microscopy (HPICM), a non-contact scanning probe technique that allows nanoscale imaging of stereocilia bundles in live auditory hair cells.

Canlı Memeli İşitsel Saç Hücrelerinde Nano ölçekli Çözünürlüğe Sahip Stereosilia Bundle Görüntüleme

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia ...

İşitsel HEI-OC1 Hücreleri ile Çalışma

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler