This study was supported by the Velux Stiftung (A.K.M.), NIH grant EY024207 (A.K.M.) and the Austrian Science Fund (FWF) project J3686 (B.P.).

Lipozomlar ve Proteoliposomes hazırlanması 1. <ol><li> Lipozom oluşumu <ol><li> Bir cam şırınga kullanılarak, POPC bir molar oranda 52.5 umol lipidler elde etmek için bir yuvarlak tabanlı şişeye kloroform (25 mg / ml) ve 160 ul POPG (kloroform içinde, 25 mg / ml) 1.435 ul POPC ekleyin: POPG = 9: 1 arasındadır. </li><li> (Su banyosu çözücünün, bu hacim için gerekli olan) 145 rpm&#39;lik bir dönme hızında bir döner buharlaştırıcı kullanılarak 30 dakika boyunca lipidleri Kuru, daha sonra oda sıcaklığında, gece boyunca en az 3 saat, ya da bir elektrikli desikatöre balona (RT). </li><li> 50 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCI, 10 ml ile kurutuldu lipid filminin hidratlanması yavaşça homojen, bulanık bir süspansiyon elde edilene değin balon dönen tarafından (bundan sonra tampon A olarak ifade edilecektir); NOT: Bu aşamada lipid konsantrasyonu hiçbir kayıp bugüne kadar meydana gelmiş gerektiği gibi 5.25 mM olması bekleniyor. </li><li> Bir frekans O, oda sıcaklığında 10 dakika için bir su banyosu içinde süspansiyon sonikasyonf 40 kHz. Çözelti biraz daha net görünecektir. </li><li> Bir ekstrüder kullanılarak 200 nm gözenek boyutuna sahip bir zar boyunca 4 geçiş ekstruderden bir ikinci döngü ve ardından 400 nm gözenek büyüklüğü olan bir membrandan süspansiyon 10 kez geçer. NOT: Elde edilen luvs ortalama çapı ~ 175 nm. Gerekirse, luvs büyüklüğü ve homojenliği, üreticinin talimatlarına uygun olarak dinamik ışık dağılımı ile kontrol edilebilir. </li><li> Bölüm 1.2&#39;de anlatıldığı gibi) LUV süspansiyonun fosfolipid konsantrasyonu ölçmek. NOT: ekstrüzyon sırasında kayıpların, konsantrasyon genelde yaklaşık 3.6 mM olduğu için. </li><li> Hemen kullanılmadığı takdirde, yaklaşık 2 hafta boyunca 4 ° C&#39;de luvs saklayın. </li></ol></li><li> fosfolipid Niceleme Not: fosfolipid Sulandırma için kullanılan LUV süspansiyon konsantrasyonu, hem de en sonunda üretilen proteoliposomes olduğu gibi belirlemek için, numunenin bir alikotu subje olanperklorik asit ile oksidasyonu cted. Bu prosedür daha sonra aykırı 23 ile karşılaştırıldığında kolorimetrik deneyi ile ölçülür, inorganik fosfat serbest bırakmak için fosfolipidleri parçalar. <ol><li> Iyonu giderilmiş damıtma suyu içinde sodyum fosfat, 40 mM stok çözeltisi (Na 2 HPO 4) hazırlanması. </li><li> 4 mM ve kalibrasyon standartları olarak görev yapacak çözümler çalışan 0.4 mM elde etmek için deiyonize distile su ile stok solüsyonu sulandırmak. </li><li> Çalışma çözüm kullanılarak, 0 ila 50 ul&#39;lik nihai bir hacimde 80 nmol sodyum fosfat kadar 13 x 100 mm 2 cam tüplerde standartlar hazırlandı. </li><li> LUV ve proteoliposome numunelerin her sayısal olarak 10 ul alın ve 13 x 100 mm 2 cam tüplerde GKD 2 O 40 ul seyreltin. Not: luvs ve proteoliposomes lipid konsantrasyon aralığında olduğu 2.5-5 uM, örnek 10 ul 25-50 nmol yağ fosfor içermelidir.</li><li> bir ısıtma bloğu içinde 145 ° C de 1 saat süre ile standart ve numuneleri ve ısı her 300 ul perklorik asit ekleyin. buharlaşmasını önlemek için tüplerde mermerleri koyun. </li><li> Tüpler oda sıcaklığında soğumaya bırakılmıştır ve GKD 2 O 1 ml ekle </li><li> Yeni hazırlanmış 12 g / L amonyum molibdat ve 50 g / L sodyum askorbat ve vorteks her karıştırmak için 400 ul ekle. </li><li> tüpler üzerine mermer ile 100 ° C &#39;de 10 dakika süre ile ısı. ısıtma bloğu tüpleri çıkarın ve oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. </li><li> 797 nm&#39;lik bir dalga boyunda bir spektrometre ile boş (0 nmol sodyum fosfat ihtiva eden standart bir örnek) karşı örneklerin absorbansı ölçülür. </li><li> Kalibrasyon standart bir eğriye karşı örneklerin fosfat içeriğini belirlemek. </li></ol></li><li> Opsin şifreden Not: deterjan doğasına bağlı, hem de yeniden oluşturma için en uygun şişme koşulların belirlenmesi için gerekli olanLuvs lipit bileşimi ve konsantrasyonu. Luvs süreci şişme kendi ışık saçılması özelliklerini değiştirmek olarak Rigaud ve Levy 24 ve Geertsma ve ark., 25 tarafından gözden absorbansı (Şekil 2) ölçerek izlenebilir. <ol><li> Pipet luvs 800 ul (bölüm 1.1, ekstrüzyondan sonra lipit geri kazanımı% 70 olarak, luvs beklenen konsantrasyonu 3.6 mM fosfolipiddir) 2 ml mikrofüj tüpüne. </li><li> DCM tampon A içinde çözülmüştür (w / v) Tampon A 5.3 ul% 10 34.7 ul ekle </li><li> sonu aşırı uç karıştırma ile, oda sıcaklığında 3 saat süreyle inkübe edilir. </li><li> Bu arada polistiren taneler hazırlamak: <ol><li> örnek başına boncuk 400 mg kullanın ve bir cam beher tartılır. </li><li> su ile, metanol ile iki kez, üç kez yıkayın ve bir kez tampon A ile her bir yıkama adımı kullanım için 5 ml sıvı, 10 dakika boyunca yavaşça karıştırın. NOT: polistiren hazırlamak için tavsiye edilirörneğin aynı anda birden fazla numune için boncuklardan 6 g tartın ve sıvının 75 ml ile yıkanır. Aşırı boncuklar birkaç gün boyunca buzdolabında saklanır. </li></ol></li><li> Numune başına, 0.4 mol% sonuçta NBD-PC 9.5 ul (1 mg / kloroform içinde mi,: vezikül destabilizasyonu son 30 dakika boyunca bir vida kapaklı bir cam tüp içinde NBD-etiketli fosfolipid ( &#39;sulandırma cam tüp&#39;) kuru Toplam fosfolipid) bir cam tüp içinde bir azot akımı altında kurutulur ve daha sonra,% 0.1, 45 ul (tampon a içinde ağırlık / hacim) DDM içinde çözüldü </li><li> Vezikül destabilizasyonu 3 saat 1 ml nihai hacim% 0.36 içeren bir örneğin çözündürüldü-NBD-etiketli fosfolipid DCM çözülmüş protein ekleyin ve tamponlar (a / h), yani, 7 mM, DCM. <ol><li> Bu nedenle, (% 0.1 DDM içinde çözülmüş) NBD-PC&#39;nin 45 ul,% 0.1 DDM 60 ul tampon A 55 ul (bir kontrol numunesi olarak kullanılan) proteinsiz lipozomları üretmek için; proteoliposomes için Sınava eklemekple,% 0.1 DDM (~ 110 ng / | il tipik bir stok çözeltiden), proteinin 40 ul, NBD-PC&#39;nin 45 ul,% 0.1 DDM 20 ul ve tampon 55 ul (% 0.1 DDM içinde çözülmüş) . NOT: Ayrıca sırası olarak listelenmiş olmalıdır. </li></ol></li><li> Oda sıcaklığında sonuna göre ek bir saat sonu için örnek karıştırın. </li><li> Hazırlanan polistiren boncuklar 80 mg ekleme ve son aşırı uç oda sıcaklığında 1 saat karıştırılarak, örnek inkübe edin. </li><li> Sonraki polistiren boncuklar ilave 160 mg ekleme ve son aşırı uç oda sıcaklığında ilave bir 2 saat boyunca karıştırılarak inkübe edilir. </li><li> Taze polistiren boncuklar 160 mg ihtiva eden bir cam vida kapaklı tüp örnek (arkasına harcanan polistiren boncuklar bırakarak) aktarın ve 4 ° C&#39;de bir gece karıştırılır. NOT: örnek aktarmak ve boncuk emme kadar önlemenin en kolay yolu biraz pozitif basınç ile cam tüpün dibine itilir Pasteur pipeti kullanmaktır. pipet ucu sıkıca bir kezTüpün alt, daha sonra örnek bir boncuk müdahalesi olmaksızın kolayca çekilebilir. </li><li> Ertesi sabah, scramblase aktivite deneyi için hazırlık olarak buz üzerinde boncuklar ve yeri üzerinde taşıyan olmayan bir mikrofüj tüpüne örnek aktarmak. </li></ol></li></ol> 2. Scramblase Aktivite Deneyi Not: tampon A ile seyreltilmiştir lipozomlar veya proteoliposomes floresans yoğunluğu bir floresan spektrometresinde ditionit ilave edildikten sonra zaman içinde izlenir. istikrarlı başlangıç ​​yoğunluğu elde etmek için, floresans sürekli karıştırılan örnek ditionit ilave edilmeden önce en az 50 saniye (ya da sabit bir sinyal elde edilene kadar) için kaydedilir ve daha sonra ditionit ilave sonra en az 500 saniye boyunca takip edilir. <ol><li> mini karıştırma-bar içeren plastik küvete tampon A 1950 ul ekleyin. </li><li> (Lipozomlar) hazırlanan Proteo 50 ul ekleyin ve örnek floresan spektrfotometrik dengeye izinBirkaç saniye sabit karıştırma ile ölçer. </li><li> Bu arada, 0.5 M tamponlanmamış Tris (iki numune mikrofüj tüpüne ditiyonit 20 mg tartılır ve 114 içinde çözülür örneğin; 1 M ditionit ihtiva eden bir çözelti hazırlamak ul buz soğukluğunda doğrudan kullanımdan önce ve sonraki için buz üzerinde tutulur, 0.5 M Tris örnek). Not: ditionit solüsyonu taze hazırlanmış olması ve hazırlandıktan sonra fazla 20 dakika kullanılmamalıdır; Birçok ölçümleri yapılacak olduğunda, ditiyonit alikotları önceden tartıldı ve hemen kullanım öncesi eritilebilir. </li><li> floresan izleme başlatın (uyarma 470 nm, emisyon 530 nm, genişliği 0.5 nm yarık). </li><li> kayıt floresan (mümkünse küvet odasının kapağındaki septum kullanın) başladıktan sonra küvet 50 sn 1 M ditiyonit çözeltisi 40 ul ekleyin ve bir daha 400-600 saniye floresan kaydetmeye devam ediyor. </li><li> Bölüm 3&#39;te tarif edildiği gibi analiz edin. </li></ol> 3..Veri analizi <ol><li> Scrambling kinetiği <ol><li> Başlangıç ​​floresans tanımlayarak scramblase aktivite deneyi ile elde edilen her bir numune floresans izleme karakterize, K i ditiyonit ekleme ve son-nokta floresan, K, ulaştığı öncesinde&gt; 400 saniye sonra. F öncesinde ditiyonit ilavesinden 30 saniye süre ile floresans ortalama değer olarak, her bir örnek için tespit edildi. </li><li> Floresan azalma ölçüde, R = 100 karşılık gelen uç nokta veri belirleme • F / F i. Biz opsin içeren proteoliposomes için protein içermeyen lipozomlar ve R P terimleri R L kullanın. </li></ol></li><li> Fonksiyonel Yeniden yapılandırılmış Scramblase molekül ağırlıklarının belirlenmesi <ol><li> aşağıdaki denkleme göre flüoresans indirgeme veri dönüştürme: p (≥1 scramblase) = (R P - R L) / (R max - R L) (Denklem 1) NOTR max yeterli protein örnekteki tüm veziküller en az bir işlevsel scramblase sahip olacak şekilde yeniden zaman elde edilen maksimum azalma ve p sulandırılmış bir numune içindeki özel bir vezikül &#39;scramblase aktif&#39; olduğu olasılığı olduğu durumda, örneğin, en az bir işlevsel scramblase sahiptir. R max yerine beklenen% 100 (deneysel&gt; 1 mg / mmol PPR ile opsin proteoliposomes için tespit edilebilir R max) ve tipik% 82.5 3 ise R L değeri tipik olarak 45% 3. R max olarak &lt;% 100 veziküllerin bir alt popülasyonunun sulandırma dirençli olduğu varsayılmıştır. R max =% 82.5 için, protein kabul edemiyor veziküllerin kesir 0.35 olduğunu. </li><li> aşağıdaki gibi Poisson istatistiklerine göre p (≥1 scramblase) ve PPR (mg protein / mmol fosfolipid) arasındaki ilişkiyi açıklar: e - p (≥1 scramblase) 1 = <s&gt; -m = 1 kadar - exp (-PPR / a) (Denklem 2) Not: Burada mg protein / mmol fosfolipid birimlerinde vezikül ve α = mono- üstel uygun sabit ortalama scramblases M = sayısı. </li><li> veziküllerin bir kısmını (tartışma) bile yüksek ppr çabalıyorlar katkıda bulunmaz olarak, denklem için değiştirin: p (≥1 scramblase) = 1 - exp (-PPR * / α) (Denklem 3) NOT: Burada f, bu durumda, PPR * = PPR / 0.65 (Denklem 4) içinde, veziküllerin refrakter nüfusu veya PPR * = PPR / (1- f). Not: uygun sabit bir α, bir mono- üstel fonksiyon PPR * karşı p (≥1 scramblase) &#39;in bir grafiğini uydurma ile belirlenir. Opsin (moleküler ağırlığı 41.7 kDa) işlevsel 175-nm çaplı veziküller içine yeniden oluşturulmasını Eğer bir monomer olarak, α = 0.187 mg mmol -1 (her vezikül 280.000 fosfolipid 26 vardır). Opsin dimerleşir Eğer önceden α sonra, scramblase aktif veziküller vermek üzere 3 sulandırma için= 0.37 mg mmol -1. PPR yerine PPR * analizi için kullanılacak olsaydı, o zaman gelen α değerleri 0.122 ve 0.244 mg mmol -1 olacaktır. a bu tahmin değerleri tüm opsin molekülleri fonksiyonel yetkili olduğunu varsayıyorum. moleküllerin yalnızca bir kısmını lipidler karıştırmak için yetkili ise, o a karşılık gelen değerleri daha büyük olacaktır. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ernst, O. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+and+animal+rhodopsins:+structures,+functions,+and+molecular+mechanisms.">Microbial and animal rhodopsins: structures, functions, and molecular mechanisms.</a> Chem. Rev. 114, 126-163 (2014).</li><li>Menon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsin+is+a+phospholipid+flippase.">Opsin is a phospholipid flippase.</a> Curr. Biol. CB. 21, 149-153 (2011).</li><li>Goren, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+phospholipid+scramblase+activity+of+a+G+protein-coupled+receptor.">Constitutive phospholipid scramblase activity of a G protein-coupled receptor.</a> Nat. Commun. 5, 5115 (2014).</li><li>Ernst, O. P., Menon, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+scrambling+by+rhodopsin.">Phospholipid scrambling by rhodopsin.</a> Photochem. Photobiol. Sci. Off. J. Eur. Photochem. Assoc. Eur. Soc. Photobiol. , (2015).</li><li>Sanyal, S., Menon, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flipping+lipids:+why+an'+what's+the+reason+for?.">Flipping lipids: why an' what's the reason for?.</a> ACS Chem. Biol. 4, 895-909 (2009).</li><li>Bevers, E. M., Williamson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+scramblase:+an+update.">Phospholipid scramblase: an update.</a> FEBS Lett. 584, 2724-2730 (2010).</li><li>Leventis, P. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+and+function+of+phosphatidylserine+in+cellular+membranes.">The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes.</a> Annu. Rev. Biophys. 39, 407-427 (2010).</li><li>Quazi, F., Lenevich, S., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABCA4+is+an+N-retinylidene-phosphatidylethanolamine+and+phosphatidylethanolamine+importer.">ABCA4 is an N-retinylidene-phosphatidylethanolamine and phosphatidylethanolamine importer.</a> Nat. Commun. 3, 925 (2012).</li><li>Quazi, F., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-binding+cassette+transporter+ABCA4+and+chemical+isomerization+protect+photoreceptor+cells+from+the+toxic+accumulation+of+excess+11-cis-retinal.">ATP-binding cassette transporter ABCA4 and chemical isomerization protect photoreceptor cells from the toxic accumulation of excess 11-cis-retinal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 5024-5029 (2014).</li><li>Ben-Shabat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+a+nonaoxirane+from+A2E,+a+lipofuscin+fluorophore+related+to+macular+degeneration,+and+evidence+of+singlet+oxygen+involvement.">Formation of a nonaoxirane from A2E, a lipofuscin fluorophore related to macular degeneration, and evidence of singlet oxygen involvement.</a> Angew. Chem. Int. Ed Engl. 41, 814-817 (2002).</li><li>Sparrow, J. R., Wu, Y., Kim, C. Y., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+meets+all-trans-retinal:+the+making+of+RPE+bisretinoids.">Phospholipid meets all-trans-retinal: the making of RPE bisretinoids.</a> J. Lipid Res. 51 (2010), 247-261 (2010).</li><li>Sch&#252;tt, F., Davies, S., Kopitz, J., Holz, F. G., Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodamage+to+human+RPE+cells+by+A2-E,+a+retinoid+component+of+lipofuscin.">Photodamage to human RPE cells by A2-E, a retinoid component of lipofuscin.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 2303-2308 (2000).</li><li>Picollo, A., Malvezzi, M., Accardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMEM16+proteins:+unknown+structure+and+confusing+functions.">TMEM16 proteins: unknown structure and confusing functions.</a> J. Mol. Biol. 427, 94-105 (2015).</li><li>Mohammadi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FtsW+as+a+transporter+of+lipid-linked+cell+wall+precursors+across+the+membrane.">Identification of FtsW as a transporter of lipid-linked cell wall precursors across the membrane.</a> EMBO J. 30, 1425-1432 (2011).</li><li>Meeske, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MurJ+and+a+novel+lipid+II+flippase+are+required+for+cell+wall+biogenesis+in+Bacillus+subtilis.">MurJ and a novel lipid II flippase are required for cell wall biogenesis in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 6437-6442 (2015).</li><li>Ruiz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Flippases+for+Bacterial+Peptidoglycan+Biosynthesis.">Lipid Flippases for Bacterial Peptidoglycan Biosynthesis.</a> Lipid Insights. 8, 21-31 (2015).</li><li>Rick, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+the+wzxE+gene+of+Escherichia+coli+K-12+encodes+a+protein+involved+in+the+transbilayer+movement+of+a+trisaccharide-lipid+intermediate+in+the+assembly+of+enterobacterial+common+antigen.">Evidence that the wzxE gene of Escherichia coli K-12 encodes a protein involved in the transbilayer movement of a trisaccharide-lipid intermediate in the assembly of enterobacterial common antigen.</a> J. Biol. Chem. 278, 16534-16542 (2003).</li><li>Suzuki, J., Imanishi, E., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+of+phosphatidylserine+by+Xk-related+protein+family+members+during+apoptosis.">Exposure of phosphatidylserine by Xk-related protein family members during apoptosis.</a> J. Biol. Chem. 289, 30257-30267 (2014).</li><li>Suzuki, J., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+scrambling+on+the+plasma+membrane.">Phospholipid scrambling on the plasma membrane.</a> Methods Enzymol. 544, 381-393 (2014).</li><li>Alaimo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+but+interchangeable+mechanisms+for+flipping+of+lipid-linked+oligosaccharides.">Two distinct but interchangeable mechanisms for flipping of lipid-linked oligosaccharides.</a> EMBO J. 25, 967-976 (2006).</li><li>Ernst, C. M., Peschel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+antimicrobial+peptide+restistance+by+MprF-mediated+aminoacylation+and+flipping+of+phospholipids.">Broad-spectrum antimicrobial peptide restistance by MprF-mediated aminoacylation and flipping of phospholipids.</a> Mol. Microbial. 80 (2), 290-299 (2011).</li><li>Vehring, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flip-flop+of+fluorescently+labeled+phospholipids+in+proteoliposomes+reconstituted+with+Saccharomyces+cerevisiae+microsomal+proteins.">Flip-flop of fluorescently labeled phospholipids in proteoliposomes reconstituted with Saccharomyces cerevisiae microsomal proteins.</a> Eukaryot. Cell. 6, 1625-1634 (2007).</li><li>Rouser, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+dimensional+then+[sic]+layer+chromatographic+separation+of+polar+lipids+and+determination+of+phospholipids+by+phosphorus+analysis+of+spots.">Two dimensional then [sic] layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots.</a> Lipids. 5, 494-496 (1970).</li><li>Rigaud, J. -. L., L&#233;vy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).</li><li>Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+reconstitution+of+ABC+transporters+and+assays+of+translocator+function.">Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function.</a> Nat. Protoc. 3, 256-266 (2008).</li><li>Mimms, L. T., Zampighi, G., Nozaki, Y., Tanford, C., Reynolds, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+vesicle+formation+and+transmembrane+protein+incorporation+using+octyl+glucoside.">Phospholipid vesicle formation and transmembrane protein incorporation using octyl glucoside.</a> Biochemistry. 20, 833-840 (1981).</li><li>Malvezzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-dependent+phospholipid+scrambling+by+a+reconstituted+TMEM16+ion+channel.">Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel.</a> Nat. Commun. 4, 2367 (2013).</li><li>Eckford, P. D. W., Sharom, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reconstituted+P-glycoprotein+multidrug+transporter+is+a+flippase+for+glucosylceramide+and+other+simple+glycosphingolipids.">The reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter is a flippase for glucosylceramide and other simple glycosphingolipids.</a> Biochem. J. 389, 517-526 (2005).</li><li>Marek, M., G&#252;nther-Pomorski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+Flippase+Activity+in+Proteoliposomes+Using+Fluorescent+Lipid+Derivatives.">Assay of Flippase Activity in Proteoliposomes Using Fluorescent Lipid Derivatives.</a> Methods Mol. Biol. 1377, 181-191 (2016).</li><li>Coleman, J. A., Kwok, M. C. M., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+purification,+and+functional+reconstitution+of+the+P4-ATPase+Atp8a2,+a+phosphatidylserine+flippase+in+photoreceptor+disc+membranes.">Localization purification, and functional reconstitution of the P4-ATPase Atp8a2, a phosphatidylserine flippase in photoreceptor disc membranes.</a> J. Biol. Chem. 284, 32670-32679 (2009).</li><li>Coleman, J. A., Quazi, F., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+P4-ATPases+and+ABC+transporters+and+their+role+in+phospholipid+transport.">Mammalian P4-ATPases and ABC transporters and their role in phospholipid transport.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1831, 555-574 (2013).</li><li>Romsicki, Y., Sharom, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+flippase+activity+of+the+reconstituted+P-glycoprotein+multidrug+transporter.">Phospholipid flippase activity of the reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter.</a> Biochemistry. 40, 6937-6947 (2001).</li><li>Zhou, X., Graham, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+phospholipid+translocase+activity+with+purified+Drs2p,+a+type-IV+P-type+ATPase+from+budding+yeast.">Reconstitution of phospholipid translocase activity with purified Drs2p, a type-IV P-type ATPase from budding yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16586-16591 (2009).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Scramblase etkinlik tahlili olduğu opsin fosfolipid scramblase aktivitesi 2 bulunmaktadır belirlemek için ilk olarak sağladı. Tahlil da bize özgüllük test ederek opsin en scramblase etkinliğini karakterize izin (biz böyle Şekil 1A NBD-PC için gösterilen, ya da gibi bir asil zinciri üzerindeki NBD ile etiketlenmiş NBD-fosfatidiletanolamin olarak NBD etiketli muhabiri lipidlerin çeşitli kullanılan ana grup, NBD-sfingomiyelin veya NBD- fosfatidilserin 2), vezikül li...

Fotoreseptör rodopsin (referans 1, örneğin gözden) bir prototip G protein-eşli reseptör, tanımlanacak ilk fosfolipid scramblase ve biyokimyasal olarak 2,3 sunmaktadır. Scramblases transbilayer fosfolipid hareketin özünde yavaş oranını artırmak fosfolipid taşıyıcıları olan bir çift yönlü fizyolojik uygun seviyelere, ATP-bağımsız bir şekilde 4-6. Eylemlerinin örnekleri endoplazmik retikulum ve konstitütif karıştırıcı olarak glikosilasyon yolakları 5 çeşitli zar homeostaz ve büyüme için gerekli olan bakteriyel sitoplazmik membranda bulunur. Bu gibi etki ettiği Ayarlı fosfolipid apoptotik hücrelerin yüzeyi üzerinde fosfatidilserin (PS) ortaya çıkarmak için gerekli olan her karıştırma bir makrofaj 7 -Sinyal &quot;me-yemeği&quot; ve protein faktörü üretimini katalize aktive kan plateletleri üzerinde prokoagülan yüzey sağlarkan pıhtılaşması için gerekli s. Fotoreseptör disk membranlarda, rodopsin en çabalıyorlar faaliyeti ATP-bağımlı, tek yönlü lipid tarafından oluşturulan iki tabakalı iki zar broşürleri arasındaki fosfolipid dengesizliği ortadan kaldırmak için önerilen ABCA4 4,8,9 10-12 Flippase edilmiştir. Rodopsin plazma membranında PS maruz için gereken 2 + -bağımlı scramblases (referans 2, TMEM16 protein ailesinin üyeleri, Ca olarak tanımlanmıştır fotoreseptör diskleri bir scramblase olarak rapor kadar scramblases fizyolojik önemine rağmen, kimlik elde edilememiştir 13) ve bir lipid II peptidoglikan sentezinin 14 için gerekli olan scramblase gibi bakteriyel protein FtsW önerilmiştir. Bu keşifler yöntem describ Oluşan proteoliposomes lipozomlarda saflaştırılmış proteinlerin yeniden oluşturulması ve scramblase etkinliğinin gösterilmesi dayanmaktadırBurada ed. Diğer potansiyel scramblases 15-21 - peptidoglikan biyosentezinde rol MurJ ve Amj proteinleri, WzxE ve ilgili proteinler O-antijeni öncüleri karıştırıcı karışmış, MprF proteini, bakteriyel sitoplazma zarından olarak amino fosfatidilgliserol yerini değiştirmek için gerekli olan ve Xkr8 aile üyeleri önerilmiştir bu apoptotik hücre yüzeyi üzerinde PS maruz - biyokimyasal test edilmesi gerekmektedir. Bu tespit ve scramblase etkinliğini karakterize etmek sağlam bir testin önemini vurgulamaktadır. Burada, bir floresans bazlı deney kullanılarak elde edilen proteoliposomes büyük tek tabakalı veziküller (luvs) saflaştırılmış opsin tekrar oluşturulmasını, fotoreseptör rodopsin apoprotein ve scramblase aktivitesi daha sonra analiz tarif eder. heterolog ifade ve opsin saflaştırılması için literatürde mevcut birkaç iyi tanımlanmış protokoller bu nedenle olmaz, vardırBu protokolde tarif; yaklaşık 100 ng FLAG etiketli, ısı ayarlı opsin verir Goren ve ark. 3&#39;te tarif protokollerini kullanan /% 0.1 ul (ağırlık / hacim) dodecylmaltoside (DCM). Sulandırma şişmeyen fakat çözünmez olduğu için, yeterli deterjan ile luvs muamele edilmesiyle elde edilmektedir. Bu koşullar altında, bir membran proteini - protein deterjan miseller halinde temin - lipozomlar entegre ve proteoliposomes sonuçlanan deterjanın alınması üzerine lipozom zarı içine yeniden hale gelir. (% 0.1 (ağırlık / hacim) DCM içinde saflaştırılmış proteini olarak elde edilmiştir) opsin tekrar oluşturmak için, LUVler POPC (1-palmitoil-2-oleoil sn -glisero-3-fosfokolin) ve POPG karışımı (1-hazırlanır palmitoil-2-oleoil sn -glisero-3- [fosfo-rak- (1-gliserol)]) ve opsin ve NBD-PC eklemeden önce DDM ile doyuruldu. Deterjan daha sonra polistiren boncuklar ile örnek muamele etmek suretiyle uzaklaştırılır. lass = &quot;jove_content&quot;&gt; floresans bazlı analiz temel ilkesi Şekil 1B &#39;de gösterilmiştir. Luvs simetrik NBD-PC veya diğer NBD etiketli floresan fosfolipid muhabiri (Şekil 1A) bir eser miktarı ile yeniden edilmektedir. ditionit ilave üzerinde NBD nitro grubu gibi bir zar geçirgenliği olmayan dianyon, luvs dış broşürde NBD-PC molekülleri işlenen floresan olmayan bir floresan olmayan amino grubuna indirgenir. de NBD-PC molekülleri de ditiyonit deneyi (&lt;10 dakika), zaman ölçeğinde membran hareket mümkün olduğundan, bu floresan sinyalin% 50 azalma ile sonuçlanır. Lipozomlar, bir scramblase ile yeniden Ancak, eğer, iç yaprakçıkta NBD-PC moleküller azaltılır dış hızla karıştırmak olabilir. Bu ideal bir durumda (Şekil 1C) floresans toplam kayıp ile sonuçlanır. ES / ftp_upload / 54.635 / 54635fig1.jpg &quot;/&gt; . Şekil 1: scramblase aktivite deneyinin şematik temsili tahlil, bir flüoresan NBD-etiketli raportör lipid kullanır; NBD-PC gösterilmiştir (A). Büyük tek tabakalı veziküller NBD-PC&#39;nin eser miktarı ile tekrar kurulmuştur. Sulandırma dış ve iç broşürlerde eşit olarak dağıtılır NBD-PC ile, simetrik veziküller üretir. Ditiyonit (S2 O 4 2-) kimyasal olmayan bir floresan amino grubuna NBD nitro grubunu azaltır. Ditiyonit (B, yukarıda) ile birlikte protein içermeyen lipozomlar tedavisi azaltılır, dış sayfada tek NBD-PC moleküllerinin floresan bir% 50 azalmaya neden olan: ditiyonit negatif yüklü ve NBD-PC molekülleri ile tepkimeye zarı geçemez iç broşürde. Opsin içeren proteoliposomes (B, alt), bir ditiyonit tedavi, yani scramblase aktif proteoliposomes, f% 100 kaybına yol açaropsin olarak luorescence iç ve dış broşürde arasında NBD-PC hareketini kolaylaştırır. (C) ditionit ile protein içermeyen lipozomlar ve opsin içeren proteoliposomes tedavi elde edilen idealize floresan izlerini gösterir. floresans kaybı oranı ditionit ile NBD kimyasal indirgeme karıştırıcı kimyasal tepkime oranından daha büyük veya eşit bir hızda gerçekleşir, ve bu oran-sınırlayıcı olduğunu gösteren her iki durumda da aynıdır. Gerçek bir deneyde elde edilen izleri Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54635/54635fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Bu tarif yöntemleri diğer saflaştırılmış proteinleri, hem de deterjan 22 mikrozomları ekstre, örneğin, elde edilen zar proteinlerinin karışımlarını sulandırmak ve analiz etmek için kullanılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1148">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:683px;">1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td style="width:141px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:132px;">850457C</td>
			<td style="width:193px;">POPC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840457C</td>
			<td>POPG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-an-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810130C</td>
			<td>NBD-PC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>EM-5330</td>
			<td>HEPES</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dodecyl-&#946;-d-maltoside&#160;</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310 5 GM</td>
			<td>DDM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorimeter cuvettes</td>
			<td>sigma</td>
			<td>C0918-100EA</td>
			<td>cuvettes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrofluorometer</td>
			<td colspan="2">Photon Technology International, Inc.</td>
			<td>fluorimeter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydrosulfite technical grade, 85%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>157953-5G</td>
			<td>dithionite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GraphPad Prism 5 software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prism</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Base</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JTX171-3</td>
			<td>Tris</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIPEX 10 mL extruder&#160;</td>
			<td>Northern Lipids, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Extruder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:683px;">Whatman, Drain disc, PE, 25 mm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:132px;">28156-243</td>
			<td>Disc support</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:683px;">Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 &#181;m, 25 mm diameter</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:132px;">WHA110607</td>
			<td>400 nm membrane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:683px;">Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 &#181;m, 25 mm diameter</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:132px;">WHA110606</td>
			<td>200 nm membrane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3264-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13x100 mm</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>47729-572</td>
			<td>glass tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Perchloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30755-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Molybdate Tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-7302</td>
			<td>ammonium molybdate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(+)-Sodium L-ascorbate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7631-25G</td>
			<td>sodium ascorbate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bio-Beads SM2 adsorbents</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1523920</td>
			<td>polystyrene beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;2.0 mL Microtubes clear</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>10011-742</td>
			<td>Reconstitution tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reconstitution glass tube</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td style="width:132px;">53283-800</td>
			<td>Reconstitution glass tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zetasizer&#160;</td>
			<td>Malvern&#160;</td>
			<td></td>
			<td>DLS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence-based assay of phospholipid scramblase activity

Scramblases çift yönlü bir ATP-bağımsız bir şekilde membran çift-tabakanın fosfolipidleri transloke. İlk scramblase tespit ve biyokimyasal, fotoreseptör rodopsin apoproteini opsin edilmiştir doğrulanmış olması. Rodopsin ışık algılama sorumludur retina çubuk fotoreseptör membranlarının lokalize bir G-protein bağlı reseptördür. Rodopsin adlı scramblase faaliyeti onun ligandı 11- sis -retinal, yani bağlı değildir, apoprotein opsin da bir scramblase olarak aktiftir. karıştırıcı konstitütif ve regüle fosfolipid hücre fizyolojisinde önemli rol oynamakla birlikte, sadece bir kaç fosfolipid scramblases kadar opsin yanında tespit edilmiştir. Burada opsin en scramblase aktivitesinin bir floresans bazlı analiz tarif eder. Opsin fosfatidilkolin, fosfatidilgliserol ve flüoresan NBD-etiketli bilgisayar (1-p izi miktardan oluşan büyük tek katmanlı lipozomlar içine kuruluralmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-benzoksadiazol-4-il) amino] heksanoil} - sn -glisero-3-fosfokolin). Scramblase aktivitesi vezikül iç broşürde bulunan NBD-PC molekülleri floresans kimyasal membranını geçemediği için bir indirgeyici madde ile elimine edilir dış yaprakçık erişebilir ne ölçüde ölçülerek belirlenir. Bu tarif yöntemler genel olarak uygulanmaktadır ve diğer membran proteinleri scramblase aktivitelerini belirlemek ve karakterize etmek için kullanılabilir.

Bir flüoresan bazlı analiz kullanarak scramblase aktivitesinin karakterize edilmesi için luvs halinde opsin tekrar oluşturulmasını tarif eder. Biz çabalıyorlar opsin aracılı fosfolipid oranı üzerinde bir alt sınır koymak için ve opsin işlevsel veziküller içine yeniden oluşturulmasını hangi oligomerik durumunu belirlemek için sonuçları analiz. uygun sulandırma koşullarını belirlemek için, deneysel d...

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity at JoVE.com

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin.

Fosfolipid Scramblase Aktivitesinin bir floresan bazlı analiz

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

a-fluorescence-based-assay-of-phospholipid-scramblase-activity

Research

JoVE Journal

Biochemistry

13.8K Görüntüleme.  Weill Cornell Medical College. We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin. 

Video: A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many of these conditions cause protein unfolding in the cell and have detrimental impact on the survival of the organism. A group of unrelated, stress-specific molecular chaperones have been shown to play essential roles in the survival of these stress conditions. While fully folded and chaperone-inactive before stress, these proteins rapidly unfold and become chaperone-active under specific stress conditions. Once activated, these conditionally disordered chaperones bind to a large number of different aggregation-prone proteins, prevent their aggregation and either directly or indirectly facilitate protein refolding upon return to non-stress conditions. The primary approach for gaining a more detailed understanding about the mechanism of their activation and client recognition involves the purification and subsequent characterization of these proteins using in vitro chaperone assays. Follow-up in vivo stress assays are absolutely essential to independently confirm the obtained in vitro results.
This protocol describes in vitro and in vivo methods to characterize the chaperone activity of E. coli HdeB, an acid-activated chaperone. Light scattering measurements were used as a convenient read-out for HdeB&#39;s capacity to prevent acid-induced aggregation of an established model client protein, MDH, in vitro. Analytical ultracentrifugation experiments were applied to reveal complex formation between HdeB and its client protein LDH, to shed light into the fate of client proteins upon their return to non-stress conditions. Enzymatic activity assays of the client proteins were conducted to monitor the effects of HdeB on pH-induced client inactivation and reactivation. Finally, survival studies were used to monitor the influence of HdeB&#39;s chaperone function in vivo.

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

This study describes biophysical, biochemical and molecular techniques to characterize the chaperone activity of Escherichia coli HdeB under acidic pH conditions. These methods have been successfully applied for other acid-protective chaperones such as HdeA and can be modified to work for other chaperones and stress conditions.

pH bağımlı aktivitenin tespiti<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; İn Vitro</em&gt; ve<em&gt; İn Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Biyokimya

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some S100 proteins have the capacity to bind transition metals with high affinity and effectively sequester them away from invading microbial pathogens in a process that is termed "nutritional immunity". S100A12 (EN-RAGE) binds both zinc and copper and is highly abundant in innate immune cells such as macrophages and neutrophils. We report a refined method for the expression, enrichment and purification of S100A12 in its active, metal-binding configuration. Utilization of this protein in bacterial growth and viability analyses reveals that S100A12 has antimicrobial activity against the bacterial pathogen, Helicobacter pylori. The antimicrobial activity is predicated on the zinc-binding activity of S100A12, which chelates nutrient zinc, thereby starving H. pylori which requires zinc for growth and proliferation.

Here, we present a method to express and purify S100A12 (calgranulin C). We describe a protocol to measure its antimicrobial activity against the human pathogen H. pylori.

S100A12&#39;nin Ekspresyon, Saflaştırma ve Antimikrobiyal Aktivitesi

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ metabolic activity assays can provide information about the spatial distribution of metabolic activity within a tissue. We provide here a detailed protocol for monitoring the activity of the enzyme lactate dehydrogenase directly in tissue samples. Lactate dehydrogenase is an important determinant of whether consumed glucose will be converted to energy via aerobic or anaerobic glycolysis. A solution containing lactate and NAD is provided to a frozen tissue section. Cells with high lactate dehydrogenase activity will convert the provided lactate to pyruvate, while simultaneously converting provided nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) to NADH and a proton, which can be detected based on the reduction of nitrotetrazolium blue to formazan, which is visualized as a blue precipitate. We describe a detailed protocol for monitoring lactate dehydrogenase activity in mouse skin. Applying this protocol, we found that lactate dehydrogenase activity is high in the quiescent hair follicle stem cells within the skin. Applying the protocol to cultured mouse embryonic stem cells revealed higher staining in cultured embryonic stem cells than mouse embryonic fibroblasts. Analysis of freshly isolated mouse aorta revealed staining in smooth muscle cells perpendicular to the aorta. The methodology provided can be used to spatially map the activity of enzymes that generate a proton in frozen or fresh tissue.

We describe a protocol for mapping the spatial distribution of enzymatic activity for enzymes that generate nicotinatmide adenine dinucleotide phosphate (NAD(P)H) + H+ directly in tissue samples.

Eşleme metabolizma: doğrudan dokusunda laktat dehidrogenaz etkinliğini izleme

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

TRNA-Isopentenyl transferaz aktivite tespit etmek için bir In Vitro tahlil

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic properties of the absorbed/immobilized mass on sensor surfaces, allowing the measurements of the interaction of proteins with solid-supported surfaces, such as lipid bilayers, in real-time and with a high sensitivity. Annexins are a highly conserved group of phospholipid-binding proteins that interact reversibly with the negatively charged headgroups via the coordination of calcium ions. Here, we describe a protocol that was employed to quantitatively analyze the binding of annexin A2 (AnxA2) to planar lipid bilayers prepared on the surface of a quartz sensor. This protocol is optimized to obtain robust and reproducible data and includes a detailed step-by-step description. The method can be applied to other membrane-binding proteins and bilayer compositions.

Here, we present an experimental protocol that can be employed to determine the binding affinities and mode of interaction of label-free phospholipid-binding protein annexin A2 with immobilized solid-supported bilayers (SLB) by simultaneously measuring the mass uptake and the viscoelastic properties of the protein annexin A2.

A2 bir kuvars rezonatör kullanarak katı destekli Lipid Bilayers için Annexin Protein bağlayıcı fosfolipid bağlama dinamikleri çalışmaya dissipative Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released from many cell types and play a pivotal role in regulating cell-cell communication and a diverse range of biological processes. Many different methods for the characterization of EVs have been described. However, most of these methods have the disadvantage that the preparation and characterization of the samples are very time-consuming, or it is extremely difficult to analyze specific markers of interest due to their small size and due to the lack of discrete populations. While methods for analysis of EVs have been considerably improved over the last decade, there is still no standardized method for characterization of single EVs. Here, we demonstrate a semi-automated method for characterization of single EVs by fluorescence-based nanoparticle-tracking analysis. The protocol that is presented addresses the common problem of many researchers in this field and provides the complete workflow for rapid isolation of EVs and characterization with PKH67, a general cell membrane linker, as well as with specific surface markers such as CD63, CD9, vimentin, and lysosomal-associated membrane protein 1 (LAMP-1). The presented results show a high level of reproducibility, as confirmed by other methods, such as Western blotting. In the conducted experiments, we exclusively used EVs isolated from human serum samples, but this method is also suitable for plasma or other body fluids and can be adjusted for characterization of EVs from cell culture supernatants. Irrespective of the future progress of research on EV biology, the protocol that is presented here provides a rapid and reliable method for rapid characterization of single EVs with specific markers.

In this protocol, we describe the complete workflow for rapid isolation of extracellular vesicles from human whole blood and characterization of specific markers by fluorescence-based nanoparticle-tracking analysis. The presented results show a high level of reproducibility and can be adjusted to cell culture supernatants.

İnsan kanı nanopartikül izleme analizi ile tek hücre dışı veziküller floresans tabanlı hızlı karakterizasyonu

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often viruses exhibit cell and tissue tropism and are adapted to specific cell or tissue proteases. Moreover, these viruses can introduce mutations or insertions into their genome during replication that may affect the cleavage, and thus can contribute to adaptations to a new host. Here, we present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of peptides mimicking the cleavage site of viral fusion proteins. The technique is very flexible and can be used to investigate the proteolytic activity of a single protease on many different substrates, and in addition, it also allows exploration of the activity of multiple proteases on one or more peptide substrates. In this study, we used peptides mimicking the cleavage site motifs of the coronavirus spike protein. We tested human and camel derived Middle East Respiratory Syndrome coronaviruses (MERS-CoV) to demonstrate that single and double substitutions in the cleavage site can alter the activity of furin and dramatically change cleavage efficiency. We also used this method in combination with bioinformatics to test furin cleavage activity of feline coronavirus spike proteins from different serotypes and strains. This peptide-based method is less labor- and time intensive than conventional methods used for the analysis of proteolytic activity for viruses, and results can be obtained within a single day.

We present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of the proteolytic activity of proteases on peptides representing the cleavage site of viral fusion peptides. This method can also be used on any other amino acid motif within a protein sequence to test for the protease activity.

Bir Fluorogenic peptid bölünme tahlil için proteolitik aktivite ekran: coronavirus uygulamalarda spike protein etkinleştirme

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of physiological processes. Mitochondrial dysfunction is a primary cause of a number of metabolic and neurodegenerative diseases. Intact mitochondria are critical for their proper functioning. The enzyme citrate synthase is localized in the mitochondrial matrix and thus can be used as a quantitative enzyme marker of intact mitochondrial mass. Given that many molecules and pathways that have important functions in mitochondria are highly conserved between humans and Drosophila, and that an array of powerful genetic tools are available in Drosophila, Drosophila serves as a good model system for studying mitochondrial function. Here, we present a protocol for fast and simple measurement of citrate synthase activity in tissue homogenate from adult flies without isolating mitochondria. This protocol is also suitable for measuring citrate synthase activity in larvae, cultured cells, and mammalian tissues.

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

We present a protocol for a colorimetric assay of citrate synthase activity for quantification of intact mitochondrial mass in Drosophila tissue homogenates.

Drosophila Melanogaster'de Sitrat Synthase Aktivitesinin Kolorimetrik Tsöplini

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of fungal secondary metabolites. Inhibitor screening, however, requires purified enzyme activities. Since class 1 deacetylases exert their function as multiprotein complexes, they are usually not active when expressed as single polypeptides in bacteria. Therefore, endogenous complexes need to be isolated, which, when conventional techniques like ion exchange and size exclusion chromatography are applied, is laborious and time consuming. Tandem affinity purification has been developed as a tool to enrich multiprotein complexes from cells and thus turned out to be ideal for the isolation of endogenous enzymes. Here we provide a detailed protocol for the single-step enrichment of active RpdA complexes via the first purification step of C-terminally TAP-tagged RpdA from Aspergillus nidulans. The purified complexes may then be used for the subsequent inhibitor screening applying a deacetylase assay. The protein enrichment together with the enzymatic activity assay can be completed within two days.

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets to treat fungal infections. Here we present a protocol for the specific enrichment of TAP-tagged RpdA combined with an HDAC activity assay that allows in vitro efficacy testing of histone deacetylase inhibitors.

Enzimatik aktivite assay için Filasentous mantar Aspergillus nidulans bir tap-Tagged histon Deacetylase tek adımlı zenginleştirme

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. Nucleases display a variety of vital physiological roles in prokaryotic and eukaryotic organisms, ranging from maintaining genome stability to providing protection against pathogens. Altered nuclease activity has been associated with several pathological conditions including bacterial infections and cancer. To this end, nuclease activity has shown great potential to be exploited as a specific biomarker. However, a robust and reproducible screening method based on this activity remains highly desirable.
Herein, we introduce a method that enables screening for nuclease activity using nucleic acid probes as substrates, with the scope of differentiating between pathological and healthy conditions. This method offers the possibility of designing new probe libraries, with increasing specificity, in an iterative manner. Thus, multiple rounds of screening are necessary to refine the probes&#39; design with enhanced features, taking advantage of the availability of chemically modified nucleic acids. The considerable potential of the proposed technology lies in its flexibility, high reproducibility, and versatility for the screening of nuclease activity associated with disease conditions. It is expected that this technology will allow the development of promising diagnostic tools with a great potential in the clinic.

Altered nuclease activity has been associated with different human conditions, underlying its potential as a biomarker. The modular and easy to implement screening methodology presented in this paper allows the selection of specific nucleic acid probes for harnessing nuclease activity as a biomarker of disease.

Nükleik Asit Probları Kullanılarak Nükleaz Aktivitesinin Kinetik Taraması

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...