Name: a fluorescence-based assay of phospholipid scramblase activity
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity at JoVE.com

This study was supported by the Velux Stiftung (A.K.M.), NIH grant EY024207 (A.K.M.) and the Austrian Science Fund (FWF) project J3686 (B.P.).

Lipozomlar ve Proteoliposomes hazırlanması 1. <ol><li> Lipozom oluşumu <ol><li> Bir cam şırınga kullanılarak, POPC bir molar oranda 52.5 umol lipidler elde etmek için bir yuvarlak tabanlı şişeye kloroform (25 mg / ml) ve 160 ul POPG (kloroform içinde, 25 mg / ml) 1.435 ul POPC ekleyin: POPG = 9: 1 arasındadır. </li><li> (Su banyosu çözücünün, bu hacim için gerekli olan) 145 rpm&#39;lik bir dönme hızında bir döner buharlaştırıcı kullanılarak 30 dakika boyunca lipidleri Kuru, daha sonra oda sıcaklığında, gece boyunca en az 3 saat, ya da bir elektrikli desikatöre balona (RT). </li><li> 50 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCI, 10 ml ile kurutuldu lipid filminin hidratlanması yavaşça homojen, bulanık bir süspansiyon elde edilene değin balon dönen tarafından (bundan sonra tampon A olarak ifade edilecektir); NOT: Bu aşamada lipid konsantrasyonu hiçbir kayıp bugüne kadar meydana gelmiş gerektiği gibi 5.25 mM olması bekleniyor. </li><li> Bir frekans O, oda sıcaklığında 10 dakika için bir su banyosu içinde süspansiyon sonikasyonf 40 kHz. Çözelti biraz daha net görünecektir. </li><li> Bir ekstrüder kullanılarak 200 nm gözenek boyutuna sahip bir zar boyunca 4 geçiş ekstruderden bir ikinci döngü ve ardından 400 nm gözenek büyüklüğü olan bir membrandan süspansiyon 10 kez geçer. NOT: Elde edilen luvs ortalama çapı ~ 175 nm. Gerekirse, luvs büyüklüğü ve homojenliği, üreticinin talimatlarına uygun olarak dinamik ışık dağılımı ile kontrol edilebilir. </li><li> Bölüm 1.2&#39;de anlatıldığı gibi) LUV süspansiyonun fosfolipid konsantrasyonu ölçmek. NOT: ekstrüzyon sırasında kayıpların, konsantrasyon genelde yaklaşık 3.6 mM olduğu için. </li><li> Hemen kullanılmadığı takdirde, yaklaşık 2 hafta boyunca 4 ° C&#39;de luvs saklayın. </li></ol></li><li> fosfolipid Niceleme Not: fosfolipid Sulandırma için kullanılan LUV süspansiyon konsantrasyonu, hem de en sonunda üretilen proteoliposomes olduğu gibi belirlemek için, numunenin bir alikotu subje olanperklorik asit ile oksidasyonu cted. Bu prosedür daha sonra aykırı 23 ile karşılaştırıldığında kolorimetrik deneyi ile ölçülür, inorganik fosfat serbest bırakmak için fosfolipidleri parçalar. <ol><li> Iyonu giderilmiş damıtma suyu içinde sodyum fosfat, 40 mM stok çözeltisi (Na 2 HPO 4) hazırlanması. </li><li> 4 mM ve kalibrasyon standartları olarak görev yapacak çözümler çalışan 0.4 mM elde etmek için deiyonize distile su ile stok solüsyonu sulandırmak. </li><li> Çalışma çözüm kullanılarak, 0 ila 50 ul&#39;lik nihai bir hacimde 80 nmol sodyum fosfat kadar 13 x 100 mm 2 cam tüplerde standartlar hazırlandı. </li><li> LUV ve proteoliposome numunelerin her sayısal olarak 10 ul alın ve 13 x 100 mm 2 cam tüplerde GKD 2 O 40 ul seyreltin. Not: luvs ve proteoliposomes lipid konsantrasyon aralığında olduğu 2.5-5 uM, örnek 10 ul 25-50 nmol yağ fosfor içermelidir.</li><li> bir ısıtma bloğu içinde 145 ° C de 1 saat süre ile standart ve numuneleri ve ısı her 300 ul perklorik asit ekleyin. buharlaşmasını önlemek için tüplerde mermerleri koyun. </li><li> Tüpler oda sıcaklığında soğumaya bırakılmıştır ve GKD 2 O 1 ml ekle </li><li> Yeni hazırlanmış 12 g / L amonyum molibdat ve 50 g / L sodyum askorbat ve vorteks her karıştırmak için 400 ul ekle. </li><li> tüpler üzerine mermer ile 100 ° C &#39;de 10 dakika süre ile ısı. ısıtma bloğu tüpleri çıkarın ve oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. </li><li> 797 nm&#39;lik bir dalga boyunda bir spektrometre ile boş (0 nmol sodyum fosfat ihtiva eden standart bir örnek) karşı örneklerin absorbansı ölçülür. </li><li> Kalibrasyon standart bir eğriye karşı örneklerin fosfat içeriğini belirlemek. </li></ol></li><li> Opsin şifreden Not: deterjan doğasına bağlı, hem de yeniden oluşturma için en uygun şişme koşulların belirlenmesi için gerekli olanLuvs lipit bileşimi ve konsantrasyonu. Luvs süreci şişme kendi ışık saçılması özelliklerini değiştirmek olarak Rigaud ve Levy 24 ve Geertsma ve ark., 25 tarafından gözden absorbansı (Şekil 2) ölçerek izlenebilir. <ol><li> Pipet luvs 800 ul (bölüm 1.1, ekstrüzyondan sonra lipit geri kazanımı% 70 olarak, luvs beklenen konsantrasyonu 3.6 mM fosfolipiddir) 2 ml mikrofüj tüpüne. </li><li> DCM tampon A içinde çözülmüştür (w / v) Tampon A 5.3 ul% 10 34.7 ul ekle </li><li> sonu aşırı uç karıştırma ile, oda sıcaklığında 3 saat süreyle inkübe edilir. </li><li> Bu arada polistiren taneler hazırlamak: <ol><li> örnek başına boncuk 400 mg kullanın ve bir cam beher tartılır. </li><li> su ile, metanol ile iki kez, üç kez yıkayın ve bir kez tampon A ile her bir yıkama adımı kullanım için 5 ml sıvı, 10 dakika boyunca yavaşça karıştırın. NOT: polistiren hazırlamak için tavsiye edilirörneğin aynı anda birden fazla numune için boncuklardan 6 g tartın ve sıvının 75 ml ile yıkanır. Aşırı boncuklar birkaç gün boyunca buzdolabında saklanır. </li></ol></li><li> Numune başına, 0.4 mol% sonuçta NBD-PC 9.5 ul (1 mg / kloroform içinde mi,: vezikül destabilizasyonu son 30 dakika boyunca bir vida kapaklı bir cam tüp içinde NBD-etiketli fosfolipid ( &#39;sulandırma cam tüp&#39;) kuru Toplam fosfolipid) bir cam tüp içinde bir azot akımı altında kurutulur ve daha sonra,% 0.1, 45 ul (tampon a içinde ağırlık / hacim) DDM içinde çözüldü </li><li> Vezikül destabilizasyonu 3 saat 1 ml nihai hacim% 0.36 içeren bir örneğin çözündürüldü-NBD-etiketli fosfolipid DCM çözülmüş protein ekleyin ve tamponlar (a / h), yani, 7 mM, DCM. <ol><li> Bu nedenle, (% 0.1 DDM içinde çözülmüş) NBD-PC&#39;nin 45 ul,% 0.1 DDM 60 ul tampon A 55 ul (bir kontrol numunesi olarak kullanılan) proteinsiz lipozomları üretmek için; proteoliposomes için Sınava eklemekple,% 0.1 DDM (~ 110 ng / | il tipik bir stok çözeltiden), proteinin 40 ul, NBD-PC&#39;nin 45 ul,% 0.1 DDM 20 ul ve tampon 55 ul (% 0.1 DDM içinde çözülmüş) . NOT: Ayrıca sırası olarak listelenmiş olmalıdır. </li></ol></li><li> Oda sıcaklığında sonuna göre ek bir saat sonu için örnek karıştırın. </li><li> Hazırlanan polistiren boncuklar 80 mg ekleme ve son aşırı uç oda sıcaklığında 1 saat karıştırılarak, örnek inkübe edin. </li><li> Sonraki polistiren boncuklar ilave 160 mg ekleme ve son aşırı uç oda sıcaklığında ilave bir 2 saat boyunca karıştırılarak inkübe edilir. </li><li> Taze polistiren boncuklar 160 mg ihtiva eden bir cam vida kapaklı tüp örnek (arkasına harcanan polistiren boncuklar bırakarak) aktarın ve 4 ° C&#39;de bir gece karıştırılır. NOT: örnek aktarmak ve boncuk emme kadar önlemenin en kolay yolu biraz pozitif basınç ile cam tüpün dibine itilir Pasteur pipeti kullanmaktır. pipet ucu sıkıca bir kezTüpün alt, daha sonra örnek bir boncuk müdahalesi olmaksızın kolayca çekilebilir. </li><li> Ertesi sabah, scramblase aktivite deneyi için hazırlık olarak buz üzerinde boncuklar ve yeri üzerinde taşıyan olmayan bir mikrofüj tüpüne örnek aktarmak. </li></ol></li></ol> 2. Scramblase Aktivite Deneyi Not: tampon A ile seyreltilmiştir lipozomlar veya proteoliposomes floresans yoğunluğu bir floresan spektrometresinde ditionit ilave edildikten sonra zaman içinde izlenir. istikrarlı başlangıç ​​yoğunluğu elde etmek için, floresans sürekli karıştırılan örnek ditionit ilave edilmeden önce en az 50 saniye (ya da sabit bir sinyal elde edilene kadar) için kaydedilir ve daha sonra ditionit ilave sonra en az 500 saniye boyunca takip edilir. <ol><li> mini karıştırma-bar içeren plastik küvete tampon A 1950 ul ekleyin. </li><li> (Lipozomlar) hazırlanan Proteo 50 ul ekleyin ve örnek floresan spektrfotometrik dengeye izinBirkaç saniye sabit karıştırma ile ölçer. </li><li> Bu arada, 0.5 M tamponlanmamış Tris (iki numune mikrofüj tüpüne ditiyonit 20 mg tartılır ve 114 içinde çözülür örneğin; 1 M ditionit ihtiva eden bir çözelti hazırlamak ul buz soğukluğunda doğrudan kullanımdan önce ve sonraki için buz üzerinde tutulur, 0.5 M Tris örnek). Not: ditionit solüsyonu taze hazırlanmış olması ve hazırlandıktan sonra fazla 20 dakika kullanılmamalıdır; Birçok ölçümleri yapılacak olduğunda, ditiyonit alikotları önceden tartıldı ve hemen kullanım öncesi eritilebilir. </li><li> floresan izleme başlatın (uyarma 470 nm, emisyon 530 nm, genişliği 0.5 nm yarık). </li><li> kayıt floresan (mümkünse küvet odasının kapağındaki septum kullanın) başladıktan sonra küvet 50 sn 1 M ditiyonit çözeltisi 40 ul ekleyin ve bir daha 400-600 saniye floresan kaydetmeye devam ediyor. </li><li> Bölüm 3&#39;te tarif edildiği gibi analiz edin. </li></ol> 3..Veri analizi <ol><li> Scrambling kinetiği <ol><li> Başlangıç ​​floresans tanımlayarak scramblase aktivite deneyi ile elde edilen her bir numune floresans izleme karakterize, K i ditiyonit ekleme ve son-nokta floresan, K, ulaştığı öncesinde&gt; 400 saniye sonra. F öncesinde ditiyonit ilavesinden 30 saniye süre ile floresans ortalama değer olarak, her bir örnek için tespit edildi. </li><li> Floresan azalma ölçüde, R = 100 karşılık gelen uç nokta veri belirleme • F / F i. Biz opsin içeren proteoliposomes için protein içermeyen lipozomlar ve R P terimleri R L kullanın. </li></ol></li><li> Fonksiyonel Yeniden yapılandırılmış Scramblase molekül ağırlıklarının belirlenmesi <ol><li> aşağıdaki denkleme göre flüoresans indirgeme veri dönüştürme: p (≥1 scramblase) = (R P - R L) / (R max - R L) (Denklem 1) NOTR max yeterli protein örnekteki tüm veziküller en az bir işlevsel scramblase sahip olacak şekilde yeniden zaman elde edilen maksimum azalma ve p sulandırılmış bir numune içindeki özel bir vezikül &#39;scramblase aktif&#39; olduğu olasılığı olduğu durumda, örneğin, en az bir işlevsel scramblase sahiptir. R max yerine beklenen% 100 (deneysel&gt; 1 mg / mmol PPR ile opsin proteoliposomes için tespit edilebilir R max) ve tipik% 82.5 3 ise R L değeri tipik olarak 45% 3. R max olarak &lt;% 100 veziküllerin bir alt popülasyonunun sulandırma dirençli olduğu varsayılmıştır. R max =% 82.5 için, protein kabul edemiyor veziküllerin kesir 0.35 olduğunu. </li><li> aşağıdaki gibi Poisson istatistiklerine göre p (≥1 scramblase) ve PPR (mg protein / mmol fosfolipid) arasındaki ilişkiyi açıklar: e - p (≥1 scramblase) 1 = <s&gt; -m = 1 kadar - exp (-PPR / a) (Denklem 2) Not: Burada mg protein / mmol fosfolipid birimlerinde vezikül ve α = mono- üstel uygun sabit ortalama scramblases M = sayısı. </li><li> veziküllerin bir kısmını (tartışma) bile yüksek ppr çabalıyorlar katkıda bulunmaz olarak, denklem için değiştirin: p (≥1 scramblase) = 1 - exp (-PPR * / α) (Denklem 3) NOT: Burada f, bu durumda, PPR * = PPR / 0.65 (Denklem 4) içinde, veziküllerin refrakter nüfusu veya PPR * = PPR / (1- f). Not: uygun sabit bir α, bir mono- üstel fonksiyon PPR * karşı p (≥1 scramblase) &#39;in bir grafiğini uydurma ile belirlenir. Opsin (moleküler ağırlığı 41.7 kDa) işlevsel 175-nm çaplı veziküller içine yeniden oluşturulmasını Eğer bir monomer olarak, α = 0.187 mg mmol -1 (her vezikül 280.000 fosfolipid 26 vardır). Opsin dimerleşir Eğer önceden α sonra, scramblase aktif veziküller vermek üzere 3 sulandırma için= 0.37 mg mmol -1. PPR yerine PPR * analizi için kullanılacak olsaydı, o zaman gelen α değerleri 0.122 ve 0.244 mg mmol -1 olacaktır. a bu tahmin değerleri tüm opsin molekülleri fonksiyonel yetkili olduğunu varsayıyorum. moleküllerin yalnızca bir kısmını lipidler karıştırmak için yetkili ise, o a karşılık gelen değerleri daha büyük olacaktır. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ernst, O. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+and+animal+rhodopsins:+structures,+functions,+and+molecular+mechanisms.">Microbial and animal rhodopsins: structures, functions, and molecular mechanisms.</a> Chem. Rev. 114, 126-163 (2014).</li><li>Menon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsin+is+a+phospholipid+flippase.">Opsin is a phospholipid flippase.</a> Curr. Biol. CB. 21, 149-153 (2011).</li><li>Goren, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+phospholipid+scramblase+activity+of+a+G+protein-coupled+receptor.">Constitutive phospholipid scramblase activity of a G protein-coupled receptor.</a> Nat. Commun. 5, 5115 (2014).</li><li>Ernst, O. P., Menon, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+scrambling+by+rhodopsin.">Phospholipid scrambling by rhodopsin.</a> Photochem. Photobiol. Sci. Off. J. Eur. Photochem. Assoc. Eur. Soc. Photobiol. , (2015).</li><li>Sanyal, S., Menon, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flipping+lipids:+why+an'+what's+the+reason+for?.">Flipping lipids: why an' what's the reason for?.</a> ACS Chem. Biol. 4, 895-909 (2009).</li><li>Bevers, E. M., Williamson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+scramblase:+an+update.">Phospholipid scramblase: an update.</a> FEBS Lett. 584, 2724-2730 (2010).</li><li>Leventis, P. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+and+function+of+phosphatidylserine+in+cellular+membranes.">The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes.</a> Annu. Rev. Biophys. 39, 407-427 (2010).</li><li>Quazi, F., Lenevich, S., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABCA4+is+an+N-retinylidene-phosphatidylethanolamine+and+phosphatidylethanolamine+importer.">ABCA4 is an N-retinylidene-phosphatidylethanolamine and phosphatidylethanolamine importer.</a> Nat. Commun. 3, 925 (2012).</li><li>Quazi, F., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-binding+cassette+transporter+ABCA4+and+chemical+isomerization+protect+photoreceptor+cells+from+the+toxic+accumulation+of+excess+11-cis-retinal.">ATP-binding cassette transporter ABCA4 and chemical isomerization protect photoreceptor cells from the toxic accumulation of excess 11-cis-retinal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 5024-5029 (2014).</li><li>Ben-Shabat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+a+nonaoxirane+from+A2E,+a+lipofuscin+fluorophore+related+to+macular+degeneration,+and+evidence+of+singlet+oxygen+involvement.">Formation of a nonaoxirane from A2E, a lipofuscin fluorophore related to macular degeneration, and evidence of singlet oxygen involvement.</a> Angew. Chem. Int. Ed Engl. 41, 814-817 (2002).</li><li>Sparrow, J. R., Wu, Y., Kim, C. Y., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+meets+all-trans-retinal:+the+making+of+RPE+bisretinoids.">Phospholipid meets all-trans-retinal: the making of RPE bisretinoids.</a> J. Lipid Res. 51 (2010), 247-261 (2010).</li><li>Sch&#252;tt, F., Davies, S., Kopitz, J., Holz, F. G., Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodamage+to+human+RPE+cells+by+A2-E,+a+retinoid+component+of+lipofuscin.">Photodamage to human RPE cells by A2-E, a retinoid component of lipofuscin.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 2303-2308 (2000).</li><li>Picollo, A., Malvezzi, M., Accardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMEM16+proteins:+unknown+structure+and+confusing+functions.">TMEM16 proteins: unknown structure and confusing functions.</a> J. Mol. Biol. 427, 94-105 (2015).</li><li>Mohammadi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FtsW+as+a+transporter+of+lipid-linked+cell+wall+precursors+across+the+membrane.">Identification of FtsW as a transporter of lipid-linked cell wall precursors across the membrane.</a> EMBO J. 30, 1425-1432 (2011).</li><li>Meeske, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MurJ+and+a+novel+lipid+II+flippase+are+required+for+cell+wall+biogenesis+in+Bacillus+subtilis.">MurJ and a novel lipid II flippase are required for cell wall biogenesis in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 6437-6442 (2015).</li><li>Ruiz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Flippases+for+Bacterial+Peptidoglycan+Biosynthesis.">Lipid Flippases for Bacterial Peptidoglycan Biosynthesis.</a> Lipid Insights. 8, 21-31 (2015).</li><li>Rick, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+the+wzxE+gene+of+Escherichia+coli+K-12+encodes+a+protein+involved+in+the+transbilayer+movement+of+a+trisaccharide-lipid+intermediate+in+the+assembly+of+enterobacterial+common+antigen.">Evidence that the wzxE gene of Escherichia coli K-12 encodes a protein involved in the transbilayer movement of a trisaccharide-lipid intermediate in the assembly of enterobacterial common antigen.</a> J. Biol. Chem. 278, 16534-16542 (2003).</li><li>Suzuki, J., Imanishi, E., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+of+phosphatidylserine+by+Xk-related+protein+family+members+during+apoptosis.">Exposure of phosphatidylserine by Xk-related protein family members during apoptosis.</a> J. Biol. Chem. 289, 30257-30267 (2014).</li><li>Suzuki, J., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+scrambling+on+the+plasma+membrane.">Phospholipid scrambling on the plasma membrane.</a> Methods Enzymol. 544, 381-393 (2014).</li><li>Alaimo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+but+interchangeable+mechanisms+for+flipping+of+lipid-linked+oligosaccharides.">Two distinct but interchangeable mechanisms for flipping of lipid-linked oligosaccharides.</a> EMBO J. 25, 967-976 (2006).</li><li>Ernst, C. M., Peschel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+antimicrobial+peptide+restistance+by+MprF-mediated+aminoacylation+and+flipping+of+phospholipids.">Broad-spectrum antimicrobial peptide restistance by MprF-mediated aminoacylation and flipping of phospholipids.</a> Mol. Microbial. 80 (2), 290-299 (2011).</li><li>Vehring, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flip-flop+of+fluorescently+labeled+phospholipids+in+proteoliposomes+reconstituted+with+Saccharomyces+cerevisiae+microsomal+proteins.">Flip-flop of fluorescently labeled phospholipids in proteoliposomes reconstituted with Saccharomyces cerevisiae microsomal proteins.</a> Eukaryot. Cell. 6, 1625-1634 (2007).</li><li>Rouser, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+dimensional+then+[sic]+layer+chromatographic+separation+of+polar+lipids+and+determination+of+phospholipids+by+phosphorus+analysis+of+spots.">Two dimensional then [sic] layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots.</a> Lipids. 5, 494-496 (1970).</li><li>Rigaud, J. -. L., L&#233;vy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).</li><li>Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+reconstitution+of+ABC+transporters+and+assays+of+translocator+function.">Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function.</a> Nat. Protoc. 3, 256-266 (2008).</li><li>Mimms, L. T., Zampighi, G., Nozaki, Y., Tanford, C., Reynolds, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+vesicle+formation+and+transmembrane+protein+incorporation+using+octyl+glucoside.">Phospholipid vesicle formation and transmembrane protein incorporation using octyl glucoside.</a> Biochemistry. 20, 833-840 (1981).</li><li>Malvezzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-dependent+phospholipid+scrambling+by+a+reconstituted+TMEM16+ion+channel.">Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel.</a> Nat. Commun. 4, 2367 (2013).</li><li>Eckford, P. D. W., Sharom, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reconstituted+P-glycoprotein+multidrug+transporter+is+a+flippase+for+glucosylceramide+and+other+simple+glycosphingolipids.">The reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter is a flippase for glucosylceramide and other simple glycosphingolipids.</a> Biochem. J. 389, 517-526 (2005).</li><li>Marek, M., G&#252;nther-Pomorski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+Flippase+Activity+in+Proteoliposomes+Using+Fluorescent+Lipid+Derivatives.">Assay of Flippase Activity in Proteoliposomes Using Fluorescent Lipid Derivatives.</a> Methods Mol. Biol. 1377, 181-191 (2016).</li><li>Coleman, J. A., Kwok, M. C. M., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+purification,+and+functional+reconstitution+of+the+P4-ATPase+Atp8a2,+a+phosphatidylserine+flippase+in+photoreceptor+disc+membranes.">Localization purification, and functional reconstitution of the P4-ATPase Atp8a2, a phosphatidylserine flippase in photoreceptor disc membranes.</a> J. Biol. Chem. 284, 32670-32679 (2009).</li><li>Coleman, J. A., Quazi, F., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+P4-ATPases+and+ABC+transporters+and+their+role+in+phospholipid+transport.">Mammalian P4-ATPases and ABC transporters and their role in phospholipid transport.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1831, 555-574 (2013).</li><li>Romsicki, Y., Sharom, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+flippase+activity+of+the+reconstituted+P-glycoprotein+multidrug+transporter.">Phospholipid flippase activity of the reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter.</a> Biochemistry. 40, 6937-6947 (2001).</li><li>Zhou, X., Graham, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+phospholipid+translocase+activity+with+purified+Drs2p,+a+type-IV+P-type+ATPase+from+budding+yeast.">Reconstitution of phospholipid translocase activity with purified Drs2p, a type-IV P-type ATPase from budding yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16586-16591 (2009).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Scramblase etkinlik tahlili olduğu opsin fosfolipid scramblase aktivitesi 2 bulunmaktadır belirlemek için ilk olarak sağladı. Tahlil da bize özgüllük test ederek opsin en scramblase etkinliğini karakterize izin (biz böyle Şekil 1A NBD-PC için gösterilen, ya da gibi bir asil zinciri üzerindeki NBD ile etiketlenmiş NBD-fosfatidiletanolamin olarak NBD etiketli muhabiri lipidlerin çeşitli kullanılan ana grup, NBD-sfingomiyelin veya NBD- fosfatidilserin 2), vezikül li...

Fotoreseptör rodopsin (referans 1, örneğin gözden) bir prototip G protein-eşli reseptör, tanımlanacak ilk fosfolipid scramblase ve biyokimyasal olarak 2,3 sunmaktadır. Scramblases transbilayer fosfolipid hareketin özünde yavaş oranını artırmak fosfolipid taşıyıcıları olan bir çift yönlü fizyolojik uygun seviyelere, ATP-bağımsız bir şekilde 4-6. Eylemlerinin örnekleri endoplazmik retikulum ve konstitütif karıştırıcı olarak glikosilasyon yolakları 5 çeşitli zar homeostaz ve büyüme için gerekli olan bakteriyel sitoplazmik membranda bulunur. Bu gibi etki ettiği Ayarlı fosfolipid apoptotik hücrelerin yüzeyi üzerinde fosfatidilserin (PS) ortaya çıkarmak için gerekli olan her karıştırma bir makrofaj 7 -Sinyal &quot;me-yemeği&quot; ve protein faktörü üretimini katalize aktive kan plateletleri üzerinde prokoagülan yüzey sağlarkan pıhtılaşması için gerekli s. Fotoreseptör disk membranlarda, rodopsin en çabalıyorlar faaliyeti ATP-bağımlı, tek yönlü lipid tarafından oluşturulan iki tabakalı iki zar broşürleri arasındaki fosfolipid dengesizliği ortadan kaldırmak için önerilen ABCA4 4,8,9 10-12 Flippase edilmiştir. Rodopsin plazma membranında PS maruz için gereken 2 + -bağımlı scramblases (referans 2, TMEM16 protein ailesinin üyeleri, Ca olarak tanımlanmıştır fotoreseptör diskleri bir scramblase olarak rapor kadar scramblases fizyolojik önemine rağmen, kimlik elde edilememiştir 13) ve bir lipid II peptidoglikan sentezinin 14 için gerekli olan scramblase gibi bakteriyel protein FtsW önerilmiştir. Bu keşifler yöntem describ Oluşan proteoliposomes lipozomlarda saflaştırılmış proteinlerin yeniden oluşturulması ve scramblase etkinliğinin gösterilmesi dayanmaktadırBurada ed. Diğer potansiyel scramblases 15-21 - peptidoglikan biyosentezinde rol MurJ ve Amj proteinleri, WzxE ve ilgili proteinler O-antijeni öncüleri karıştırıcı karışmış, MprF proteini, bakteriyel sitoplazma zarından olarak amino fosfatidilgliserol yerini değiştirmek için gerekli olan ve Xkr8 aile üyeleri önerilmiştir bu apoptotik hücre yüzeyi üzerinde PS maruz - biyokimyasal test edilmesi gerekmektedir. Bu tespit ve scramblase etkinliğini karakterize etmek sağlam bir testin önemini vurgulamaktadır. Burada, bir floresans bazlı deney kullanılarak elde edilen proteoliposomes büyük tek tabakalı veziküller (luvs) saflaştırılmış opsin tekrar oluşturulmasını, fotoreseptör rodopsin apoprotein ve scramblase aktivitesi daha sonra analiz tarif eder. heterolog ifade ve opsin saflaştırılması için literatürde mevcut birkaç iyi tanımlanmış protokoller bu nedenle olmaz, vardırBu protokolde tarif; yaklaşık 100 ng FLAG etiketli, ısı ayarlı opsin verir Goren ve ark. 3&#39;te tarif protokollerini kullanan /% 0.1 ul (ağırlık / hacim) dodecylmaltoside (DCM). Sulandırma şişmeyen fakat çözünmez olduğu için, yeterli deterjan ile luvs muamele edilmesiyle elde edilmektedir. Bu koşullar altında, bir membran proteini - protein deterjan miseller halinde temin - lipozomlar entegre ve proteoliposomes sonuçlanan deterjanın alınması üzerine lipozom zarı içine yeniden hale gelir. (% 0.1 (ağırlık / hacim) DCM içinde saflaştırılmış proteini olarak elde edilmiştir) opsin tekrar oluşturmak için, LUVler POPC (1-palmitoil-2-oleoil sn -glisero-3-fosfokolin) ve POPG karışımı (1-hazırlanır palmitoil-2-oleoil sn -glisero-3- [fosfo-rak- (1-gliserol)]) ve opsin ve NBD-PC eklemeden önce DDM ile doyuruldu. Deterjan daha sonra polistiren boncuklar ile örnek muamele etmek suretiyle uzaklaştırılır. lass = &quot;jove_content&quot;&gt; floresans bazlı analiz temel ilkesi Şekil 1B &#39;de gösterilmiştir. Luvs simetrik NBD-PC veya diğer NBD etiketli floresan fosfolipid muhabiri (Şekil 1A) bir eser miktarı ile yeniden edilmektedir. ditionit ilave üzerinde NBD nitro grubu gibi bir zar geçirgenliği olmayan dianyon, luvs dış broşürde NBD-PC molekülleri işlenen floresan olmayan bir floresan olmayan amino grubuna indirgenir. de NBD-PC molekülleri de ditiyonit deneyi (&lt;10 dakika), zaman ölçeğinde membran hareket mümkün olduğundan, bu floresan sinyalin% 50 azalma ile sonuçlanır. Lipozomlar, bir scramblase ile yeniden Ancak, eğer, iç yaprakçıkta NBD-PC moleküller azaltılır dış hızla karıştırmak olabilir. Bu ideal bir durumda (Şekil 1C) floresans toplam kayıp ile sonuçlanır. ES / ftp_upload / 54.635 / 54635fig1.jpg &quot;/&gt; . Şekil 1: scramblase aktivite deneyinin şematik temsili tahlil, bir flüoresan NBD-etiketli raportör lipid kullanır; NBD-PC gösterilmiştir (A). Büyük tek tabakalı veziküller NBD-PC&#39;nin eser miktarı ile tekrar kurulmuştur. Sulandırma dış ve iç broşürlerde eşit olarak dağıtılır NBD-PC ile, simetrik veziküller üretir. Ditiyonit (S2 O 4 2-) kimyasal olmayan bir floresan amino grubuna NBD nitro grubunu azaltır. Ditiyonit (B, yukarıda) ile birlikte protein içermeyen lipozomlar tedavisi azaltılır, dış sayfada tek NBD-PC moleküllerinin floresan bir% 50 azalmaya neden olan: ditiyonit negatif yüklü ve NBD-PC molekülleri ile tepkimeye zarı geçemez iç broşürde. Opsin içeren proteoliposomes (B, alt), bir ditiyonit tedavi, yani scramblase aktif proteoliposomes, f% 100 kaybına yol açaropsin olarak luorescence iç ve dış broşürde arasında NBD-PC hareketini kolaylaştırır. (C) ditionit ile protein içermeyen lipozomlar ve opsin içeren proteoliposomes tedavi elde edilen idealize floresan izlerini gösterir. floresans kaybı oranı ditionit ile NBD kimyasal indirgeme karıştırıcı kimyasal tepkime oranından daha büyük veya eşit bir hızda gerçekleşir, ve bu oran-sınırlayıcı olduğunu gösteren her iki durumda da aynıdır. Gerçek bir deneyde elde edilen izleri Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54635/54635fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Bu tarif yöntemleri diğer saflaştırılmış proteinleri, hem de deterjan 22 mikrozomları ekstre, örneğin, elde edilen zar proteinlerinin karışımlarını sulandırmak ve analiz etmek için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457C</td><td>POPC</td></tr><tr><td>1-Palmitoyl-2-oleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840457C</td><td>POPG</td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810130C</td><td>NBD-PC</td></tr><tr><td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid</td><td>VWR Scientific</td><td>EM-5330</td><td>HEPES</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-1KG</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Dodecyl-&amp;beta;-D-maltoside</td><td>Anatrace</td><td>D310 5 GM</td><td>DDM</td></tr><tr><td>Fluorimeter cuvettes</td><td>sigma</td><td>C0918-100EA</td><td>cuvettes</td></tr><tr><td>Spectrofluorometer</td><td>Photon Technology International, Inc.</td><td>fluorimeter</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydrosulfite technical grade, 85%</td><td>Sigma</td><td>157953-5G</td><td>dithionite</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5 software</td><td></td><td></td><td>Prism</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>VWR</td><td>JTX171-3</td><td>Tris</td></tr><tr><td>LIPEX 10 ml extruder&amp;nbsp;</td><td>Northern Lipids, Inc.</td><td></td><td>Extruder</td></tr><tr><td>Whatman, Drain disc, PE, 25 mm</td><td>Sigma</td><td>28156-243</td><td>Disc support</td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 &amp;micro;m, 25 mm diameter</td><td>Sigma</td><td>WHA110607</td><td>400 nm membrane</td></tr><tr><td>Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 &amp;micro;m, 25 mm diameter</td><td>Sigma</td><td>WHA110606</td><td>200 nm membrane</td></tr><tr><td>sodium phosphate</td><td>Sigma</td><td>S3264-500G</td><td></td></tr><tr><td>VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13 x 100 mm</td><td>VWR Scientific</td><td>47729-572</td><td>glass tubes</td></tr><tr><td>Perchloric acid</td><td>Sigma</td><td>30755-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Molybdate Tetrahydrate</td><td>Sigma</td><td>A-7302</td><td>ammonium molybdate</td></tr><tr><td>(+)-Sodium L-ascorbate</td><td>Sigma</td><td>A7631-25G</td><td>sodium ascorbate</td></tr><tr><td>Bio-Beads SM2 adsorbents</td><td>Bio Rad</td><td>1523920</td><td>polystyrene beads</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;2.0 ml Microtubes clear</td><td>VWR Scientific</td><td>10011-742</td><td>Reconstitution tubes</td></tr><tr><td>Reconstitution glass tube</td><td>VWR Scientific</td><td>53283-800</td><td>Reconstitution glass tubes</td></tr><tr><td>Zetasizer&amp;nbsp;</td><td>Malvern&amp;nbsp;</td><td></td><td>DLS</td></tr></tbody></table>

a fluorescence-based assay of phospholipid scramblase activity

Scramblases çift yönlü bir ATP-bağımsız bir şekilde membran çift-tabakanın fosfolipidleri transloke. İlk scramblase tespit ve biyokimyasal, fotoreseptör rodopsin apoproteini opsin edilmiştir doğrulanmış olması. Rodopsin ışık algılama sorumludur retina çubuk fotoreseptör membranlarının lokalize bir G-protein bağlı reseptördür. Rodopsin adlı scramblase faaliyeti onun ligandı 11- sis -retinal, yani bağlı değildir, apoprotein opsin da bir scramblase olarak aktiftir. karıştırıcı konstitütif ve regüle fosfolipid hücre fizyolojisinde önemli rol oynamakla birlikte, sadece bir kaç fosfolipid scramblases kadar opsin yanında tespit edilmiştir. Burada opsin en scramblase aktivitesinin bir floresans bazlı analiz tarif eder. Opsin fosfatidilkolin, fosfatidilgliserol ve flüoresan NBD-etiketli bilgisayar (1-p izi miktardan oluşan büyük tek katmanlı lipozomlar içine kuruluralmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-benzoksadiazol-4-il) amino] heksanoil} - sn -glisero-3-fosfokolin). Scramblase aktivitesi vezikül iç broşürde bulunan NBD-PC molekülleri floresans kimyasal membranını geçemediği için bir indirgeyici madde ile elimine edilir dış yaprakçık erişebilir ne ölçüde ölçülerek belirlenir. Bu tarif yöntemler genel olarak uygulanmaktadır ve diğer membran proteinleri scramblase aktivitelerini belirlemek ve karakterize etmek için kullanılabilir.

Bir flüoresan bazlı analiz kullanarak scramblase aktivitesinin karakterize edilmesi için luvs halinde opsin tekrar oluşturulmasını tarif eder. Biz çabalıyorlar opsin aracılı fosfolipid oranı üzerinde bir alt sınır koymak için ve opsin işlevsel veziküller içine yeniden oluşturulmasını hangi oligomerik durumunu belirlemek için sonuçları analiz. uygun sulandırma koşullarını belirlemek için, deneysel d...

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity at JoVE.com

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin.

Fosfolipid Scramblase Aktivitesinin bir floresan bazlı analiz

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

a-fluorescence-based-assay-of-phospholipid-scramblase-activity

Research

JoVE Journal

Biochemistry

13.8K Görüntüleme.  Weill Cornell Medical College. We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin. 

Video: A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a determinant phosphoinositide of the plasma membrane (PM), and it is required to modulate ion channels, actin dynamics, exocytosis, endocytosis, intracellular signaling, and many other cellular processes. However, the spatial organization of PI(4,5)P2 in the PM is controversial, and its nanoscale distribution is poorly understood due to the technical limitations of research approaches. Here by utilizing single molecule localization microscopy and the Pleckstrin Homology (PH) domain based dual color fluorescent probes, we describe a novel method to visualize the nanoscale distribution of PI(4,5)P2 in the PM in fixed membrane sheets as well as live cells.

PI(4,5)P2 regulates various cellular functions, but its nanoscale organization in the cell plasma membrane is poorly understood. By labeling PI(4,5)P2 with a dual-color fluorescent probe fused to the Pleckstrin Homology domain, we describe a novel approach to study the PI(4,5)P2 spatial distribution in the plasma membrane at the nanometer scale.

Roman Floresan Probları Plazma Membran Fosfatidilinositol 4,5-bisfosfatın tek molekül Süper çözünürlüklü görüntüleme

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Biyokimya

Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates

Microorganisms produce a wide spectrum of (phospho)lipases that are secreted in order to make external substrates available for the organism. Alternatively, other (phospho)lipases may be physically associated with the producing organism causing a turnover of intrinsic lipids and frequently giving rise to a remodeling of the cellular membranes. Although potential (phospho)lipases can be predicted with a number of algorithms when the gene/protein sequence is available, experimental proof of the enzyme activities, substrate specificities, and potential physiological functions has frequently not been obtained. This manuscript describes the optimization of assay conditions for prospective (phospho)lipases with unknown substrate specificities and how to employ these optimized conditions in the search for the natural substrate of a respective (phospho)lipase. Using artificial chromogenic substrates, such as p-nitrophenyl derivatives, may help to detect a minor enzymatic activity for a predicted (phospho)lipase under standard conditions. Having encountered such a minor enzymatic activity, the distinct parameters of an enzyme assay can be varied in order to obtain a more efficient hydrolysis of the artificial substrate. After having determined the conditions under which an enzyme works well, a variety of potential natural substrates should be assayed for their degradation, a process that can be followed employing distinct chromatographic methods. The definition of substrate specificities for new enzymes, often provides hypotheses for a potential physiological role of these enzymes, which then can be tested experimentally. Following these guidelines, we were able to identify a phospholipase C (SMc00171) that degrades phosphatidylcholine to phosphocholine and diacylglycerol, in a crucial step for the remodeling of membranes in the bacterium Sinorhizobium meliloti upon phosphorus-limiting conditions of growth. For two predicted patatin-like phospholipases (SMc00930 and SMc01003) of the same organism, we could redefine their substrate specificities and clarify that SMc01003 is a diacylglycerol lipase.

Many predicted (phospho)lipases are poorly characterized with regard to their substrate specificities and physiological functions. Here we provide a protocol to optimize enzyme activities, search for natural substrates, and propose physiological functions for these enzymes.

Lipaz ve Fosfolipaz Adayları için substrat özellikleri tanımlama

Microorganisms produce a wide spectrum of (phospho)lipases that are secreted in order to make external substrates available for the organism. ...

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral membrane enzymes, resulting in triacylated proteins. The first step in the lipoprotein modification pathway involves the transfer of a diacylglyceryl group from phosphatidylglycerol onto the prolipoprotein, resulting in diacylglyceryl prolipoprotein. In the second step, the signal peptide of prolipoprotein is cleaved, forming an apolipoprotein, which in turn is modified by a third fatty acid derived from a phospholipid. This last step is catalyzed by apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). The lipoprotein modification pathway is essential in most &#947;-proteobacteria, making it a potential target for the development of novel antibacterial agents. Described here is a sensitive assay for Lnt that is compatible with high-throughput screening of small inhibitory molecules. The enzyme and substrates are membrane-embedded molecules; therefore, the development of an in vitro test is not straightforward. This includes the purification of the active enzyme in the presence of detergent, the availability of alkyne-phospholipids and diacylglyceryl peptide substrates, and the reaction conditions in mixed micelles. Furthermore, in order to use the activity test in a high-throughput screening (HTS) setup, direct readout of the reaction product is preferred over coupled enzymatic reactions. In this fluorometric enzyme assay, the alkyne-triacylated peptide product is rendered fluorescent through a click-chemistry reaction and detected in a multiwell plate format. This method is applicable to other acyltransferases that use fatty acid-containing substrates, including phospholipids and acyl-CoA.

Presented here is a sensitive fluorescence assay to monitor apolipoprotein N-acyltransferase activity using diacylglyceryl peptide and alkyne-phospholipids as substrates with click-chemistry.

Enzim Karakterizasyonundan Yüksek Verimli Taramaya Kadar Apolipoprotein N-asiltransferaz için Click-Kimya Tabanlı Florometrik Analiz

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

Bir Damlacık birleştirme sonra Floresan Kurtarma Fosfolipid Monolayer İki boyutlu Difüzyon Tedbir

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Biyomühendislik

Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main common features required for this activity resulted from the interactions of CPPs with the plasma membrane (lipids) and more particularly with components of the extracellular matrix of the membrane itself (heparan sulphate). Indeed, independent of the direct translocation or the endocytosis-dependent internalization, lipid bilayers are involved in the internalization process both at the level of the plasma membrane and at the level of intracellular traffic (endosomal vesicles). In this article, we present a detailed protocol describing the different steps of a large unilamellar vesicles (LUVs) formulation, purification, characterization, and application in fluorescence leakage assay in order to detect possible CPP-membrane destabilization/interaction and to address their role in the internalization mechanism. LUVs with a lipid composition reflecting the plasma membrane content are generated in order to encapsulate both a fluorescent dye and a quencher. The addition of peptides in the extravesicular medium and the induction of peptide-membrane interactions on the LUVs might thus induce in a dose-dependent manner a significant increase in fluorescence revealing a leakage. Examples are provided here with the recently developed tryptophan (W)- and arginine (R)-rich Amphipathic Peptides (WRAPs), which showed a rapid and efficient siRNA delivery in various cell lines. Finally, the nature of these interactions and the affinity for lipids are discussed to understand and to improve the membrane translocation and/or the endosomal escape.

The fluorescence leakage assay is a simple method that enables the investigation of peptide/membrane interactions in order to understand their involvement in several biological processes and especially the ability of cell-penetrating peptides to disturb phospholipids bilayers during a direct cellular translocation process.

Hücre Delici Peptit ile Membran Dengesizleşmesini Araştırmak için Floresan Sızıntı Tahlil

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found to represent a novel lipid transfer protein (LTP) group in yeast and human cells. They transfer phosphatidylserine (PS) from the endoplasmic reticulum (ER) to the plasma membrane (PM) via PS/phosphatidylinositol 4-phosphate (PI(4)P) exchange cycles. This finding allows a better understanding of how PS, which is critical for signaling processes, is distributed throughout the cell and the investigation of the link between this process and phosphoinositide (PIP) metabolism. The development of new fluorescence-based protocols has been instrumental in the discovery and characterization of this new cellular mechanism in vitro at the molecular level. This paper describes the production and the use of two fluorescently labelled lipid sensors, NBD-C2Lact and NBD-PHFAPP, to measure the ability of a protein to extract PS or PI(4)P and to transfer these lipids between artificial membranes. First, the protocol describes how to produce, label, and obtain high-purity samples of these two constructs. Secondly, this paper explains how to use these sensors with a fluorescence microplate reader to determine whether a protein can extract PS or PI(4)P from liposomes, using Osh6p as a case study. Finally, this protocol shows how to accurately measure the kinetics of PS/PI(4)P exchange between liposomes of defined lipid composition and to determine lipid transfer rates by fluorescence resonance energy transfer (FRET) using a standard fluorometer.

Here, we describe protocols using fluorescent lipid sensors and liposomes to determine whether a protein extracts and transports phosphatidylserine or phosphatidylinositol 4-phosphate in vitro.

Membranlar Arasında Fosfataylserine/Fosfatidiylinositol 4-Fosfat Değişiminin Floresan Bazlı Ölçümleri

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter lipid bilayer properties. This is important because membrane proteins are energetically coupled to their host bilayer by hydrophobic interactions. Changes in bilayer properties thus alter membrane protein function, which provides an indirect way for amphiphiles to modulate protein function and a possible mechanism for "off-target" drug effects. We have previously developed an electrophysiological assay for detecting changes in lipid bilayer properties using linear gramicidin channels as probes 3,12. Gramicidin channels are mini-proteins formed by the transbilayer dimerization of two non-conducting subunits. They are sensitive to changes in their membrane environment, which makes them powerful probes for monitoring changes in lipid bilayer properties as sensed by bilayer spanning proteins. We now demonstrate a fluorescence assay for detecting changes in bilayer properties using the same channels as probes. The assay is based on measuring the time-course of fluorescence quenching from fluorophore-loaded large unilamellar vesicles due to the entry of a quencher through the gramicidin channels. We use the fluorescence indicator/quencher pair 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonate (ANTS)/Tl+ that has been successfully used in other fluorescence quenching assays 5,13. Tl+ permeates the lipid bilayer slowly 8 but passes readily through conducting gramicidin channels 1,14. The method is scalable and suitable for both mechanistic studies and high-throughput screening of small molecules for bilayer-perturbing, and potential "off-target", effects. We find that results using this method are in good agreement with previous electrophysiological results 12.

We introduce a fast fluorescence-based assay that monitors the rate of fluorescence quenching as a measure of gramicidin channel activity. The gramicidin channels are used as molecular force transducers to monitor changes in lipid bilayer properties as sensed by bilayer spanning proteins.

Gramicidin tabanlı Floresan Testi; çift katlı lipid Özellikleri değiştirmek için Küçük Moleküller Potansiyel Belirleme

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter ...

Biyoloji

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

Manyetik Aktif Hücre Ayırma (LIMACS) kullanarak Lipid veziküllü aracılı Afinite Kromatografisi: Protein-lipit Etkileşim Analiz Roman Yöntemi

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. During neurotransmitter or hormone release via exocytosis, the fusion pore can transiently open and close repeatedly, regulating cargo release kinetics. Pore dynamics also determine the mode of vesicle recycling; irreversible resealing results in transient, &#34;kiss-and-run&#34; fusion, whereas dilation leads to full fusion. To better understand what factors govern pore dynamics, we developed an assay to monitor membrane fusion using polarized total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution in a biochemically well-defined in vitro system. Fusion of fluorescently labeled small unilamellar vesicles containing v-SNARE proteins (v-SUVs) with a planar bilayer bearing t-SNAREs, supported on a soft polymer cushion (t-SBL, t-supported bilayer), is monitored. The assay uses microfluidic flow channels that ensure minimal sample consumption while supplying a constant density of SUVs. Exploiting the rapid signal enhancement upon transfer of lipid labels from the SUV to the SBL during fusion, kinetics of lipid dye transfer is monitored. The sensitivity of TIRF microscopy allows tracking single fluorescent lipid labels, from which lipid diffusivity and SUV size can be deduced for every fusion event. Lipid dye release times can be much longer than expected for unimpeded passage through permanently open pores. Using a model that assumes retardation of lipid release is due to pore flickering, a pore &#34;openness&#34;, the fraction of time the pore remains open during fusion, can be estimated. A soluble marker can be encapsulated in the SUVs for simultaneous monitoring of lipid and soluble cargo release. Such measurements indicate some pores may reseal after losing a fraction of the soluble cargo.

Here, we present a protocol to detect single, SNARE-mediated fusion events between liposomes and supported bilayers in microfluidic channels using polarized TIRFM, with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution. Lipid and soluble cargo release can be detected simultaneously. Liposome size, lipid diffusivity, and fusion pore properties are measured.

Polarize TIRF Mikroskopi tarafından İzlenen mikroakışkan Akış Hücredeki Gergin Desteklenen Bilayers Tek Proteoliposomes ve tuzak aracılı Fusion

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Nörobilim

pH Modulation Assay on Supported Lipid Bilayers to Detect Protein-Phosphoinositide Interactions

Source: Shengjuler, D., et al., <a href="https://app.jove.com/v/55869">PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions.</a> J. Vis. Exp. (2017)
In this video, we demonstrate protein-phosphoinositide interactions in a microfluidic pattern using the pH modulation assay, using pH-sensitive fluorescent dye tagged to phosphatidylethanolamine lipid of a supported lipid bilayer, called a microfluidic platform. The modulations in pH after protein binding to phospholipid cause fluorescence quenching.