Michael J. Bruno, Chianti Rusinova ve Jon T. Çuval birçok uyarıcı tartışmalar için teşekkür ederiz. NIH, R01GM021342 ve arra eki R01GM021342-35S1, ve OSA Josiah Macy, Jr. Vakfı&#39;nın maddi destek; Üç HII için SPK programı ve Iris L. ve S. Leverett Woodworth Tıp Bilim Adamı Bursu ve NIH MSTP hibe RK için GM07739.

1. KARINCALARIN-dolu Lipozomlar oluşturun <ol><li> 1 gün, çözücü organik gelen lipidler çıkarın. </li><li> Lipid dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığına gelmesini bekleyin. </li><li> 25 mg / ml 0,6 ml (1,2 dierucoyl-sn-Glycéro-3-Phosphocholin), 25 ml yuvarlak alt balona kloroform çözüm lipid ekleyin. </li><li> Kloroform buharlaştırılır ve ince bir beyaz film lipid kat balonun tüm alt yarısı kadar, azot altında kurutma sırasında sürekli şişeyi döndürmek. </li><li> Kuru geceleme vakum altında bir Desikatörde. </li></ol><ol><li> 2 gün, veziküller hayata geçirilecektir fluorofor örnek hazırlamak. </li><li> 100 mM NaNO 3, 25 mM KARINCALARIN (Na tuzu), 10 mM HEPES rehidrate. HNO 3 veya NaOH pH 7.0 &#39;ye ayarlamak için kullanın. Her KARINCALARIN molekülü olmak üzere toplam 150 mM, 2 Na + [Na +]. 10 mM lipid süspansiyonu elde etmek için 1.671 mL elektrolit ekleyin. </li><li> Iyice Parafilm ve vorteks süspansiyon. </li><li> Folyo ile ışıktan örnek korumak ve gece boyunca oda sıcaklığında yaş sağlar. </li></ol><ol><li> 3. Gün, büyük unilamellar veziküller ve vezikül dışındaki tüm fluorofor kaldırmak. </li><li> 1 dakika için düşük güç sonikatör sonikasyon. </li><li> Donma-çözülme örnek 5-6 kez, 5 dakika ve 5 dakika ılık (~ 50 ° C) su ile kuru buz her zaman. </li><li> Bir Avanti mini-ekstruder kullanarak lipid süspansiyon Extrude. 0.1 mikron polikarbonat filtre ve filtre destekler (Detaylar için ekstruder manuel bakınız) ile mini-extruder ayarlayın. Süspansiyon ters şırınga biter gibi 21 kez ileri ve geri süspansiyon Extrude. Birden çok toplu uzatılır, her zaman aynı şırıngayı örnekleri yüklemek için hatırlıyorum. Ekstrüzyon sırasında bulutlu ilk lipid süspansiyon (hala KARINCALARIN fluorofor nedeniyle sarı olacaktır) neredeyse şeffaf olması gerektiğini. Ekstrüzyon aniden daha kolay olur ve daha az basınç, filtre ile hareket ettirmek için gerekli ise, filtre rüptüre olabilir ve değiştirilmesi gerekir. </li><li> Gravite protokolünü kullanarak bir PD-10 tuzsuzlaştırma sütun üzerinde ekstrüde süspansiyon çalışan dış KARINCALARIN çıkarın. 20-30 ml Na-tampon sütun dengelenmesi (140 mM NaNO 3, 10 mM HEPES, pH 7.0, HNO 3 veya NaOH pH ayarlamak için kullanmayı unutmayın). 1.5 mL ekstrüde lipid süspansiyon sütun ekleyin ve 1 ml Na-tampon ekleyerek toplam hacmi 2.5 mL örnek getir içeri sızmasına izin verin. Tampon tam sütuna kurulmuştur ve hiçbir şey sızıntı sonra, Na-tampon 3 mL lipozomlar Zehir ve elde edilen numune toplamak. Dolu sonuçlanan KARINCALARIN stok solüsyonu 4-5 mM lipidler içerir ve saydam sütlü beyaz görünmesini LUV. Örnek folyo ile ışıktan koruyun. </li><li> 13 stok çözelti hemen kullanılmalıdır değilse, mağaza ° C 7 gün en fazla. Uyarı: dondurmak veya aşağıdaki lipid çözüm, sıvı kristal faz geçiş sıcaklığı (~ 12 ° C), bu veziküller bütünlüğünü yok edecek ve fluorofor sızıntı olarak serin. </li></ol> 2. Mix Floresan solüsyonu <ol><li> 24 saat önce, lipozomlar sulandırmak ve gramicidin ile inkübe (13 ° C). Lipid veziküller &#39;iç ve dış mono tabakaları arasında gramicidin Denge, uzun bir inkübasyon gerektiren yavaş bir süreçtir. </li><li> Iyice vorteks luvs yoğunluğu&gt; 1 g / mL stok çözelti LUV KARINCALARIN dolu ve bu nedenle tortu çözümler. </li><li> Mix KARINCALARIN dolu Na-tampon stok 01:20 LUV. Örnek bütünlüğü geliştirmek için tek bir cam şişe içinde birlikte deneyler bir gün kullanmak için tüm lipozomlar karıştırın. </li><li> Lipozomlar 3 / 4 ayrı ve 260 nM gramicidin DMSO önceden seyreltilmiş (500 mg / ml) ekleyin. </li><li> Için kalan 1 / 4, tüm örneklerde solvent konsantrasyonunu sabit tutmak için DMSO aynı hacimde (gramicidin olmadan) ekleyin. </li></ol> 3. Floresan Enstrüman ayarlama <ol><li> Sıcaklık kontrolü ile floresan su verme hızını ölçmek için bir Uygulamalı Photophysics SX.20 durdu akış spectrofluorometer kullanın. </li><li> Aletleri, ısınma için izin bir saat önceden açın. Bileşenleri şunlardır: bilgisayar, elektronik kontrol ünitesi, su banyosu (soğutucu ve ısıtıcı), lamba güç kaynağı ve nitrojen tankı. </li><li> Pro-Data SX yazılımı kullanarak kayıt koşullarına kadar ayarlayın. </li><li> Uyarma 1 / 1 için monokromatör dalgaboyu 352 nm ve yarık genişliği diyafram ayarlayın. </li><li> Λ = 455 nm emisyon kaydetmek için high-pass filtre kullanın. </li><li> Kayıt sırasında azot basıncı korumak için araç sağlar ve böylece ilk birkaç milisaniye içinde basınç salınımları (kayıt eserler) önler &quot;Basınç Tut&quot; ayarı kullanın. </li><li> &quot;Ti Setibana 5000 puan &quot;1 s ve&quot;. </li><li> Tekrar kutusunu kullanın ve tekrar sayısını ayarlamak, normalde sırasıyla 9 ve 13 tampon ve söndürücü çalışır tekrarlar kullanmak. </li><li> Su banyosu sıcaklığı 25 ° C sıcaklık SX yazılım izlenmelidir. </li><li> , Her zaman enstrüman, bir örnek çalışır, her iki şırınga 60 mcL karışımları, yani 120 mcL sürücü birimini ayarlayın. Bu enstrümantal kurulumu ile, 120 mcL hacmi ≈ 1.2 ms ölü bir zaman verir. </li><li> KARINCALARIN-lipozom Kullanıcı çıkışı için 8 civarında floresan dedektör üzerinde yüksek gerilim (kazanç) ayarlayın. Deneysel standart bir karışım için kazanç 400-420 V. Bazı ilaçlar, floresan, floresan sinyal doyurabilecek böyle. Bu durumlarda, kazanç / gerilim azaltılmalıdır. </li><li> Her zaman doğru şırınga sol şırınga ve tampon / söndürücü floresan örnek yükleyin. Iyice vorteks emin olun yüklemeden önce tüm örnekleri içeren lipozomlar ve zaman ile luvs şırınga yerleşmek unutmayın. </li></ol> 4. Deneme yapmak <ol><li> Ile birlikte Na-tampon veya Tl-quencher (50 mM, TlNO 3 94 mM NaNO 3, 10 mM, pH 7.0 Hepes) ya spectrofluorometer içine solvent veya bileşik ve yük ya KARINCALARIN yüklü luvs bir örnek hazırlayın. </li><li> 1,5 mL seyreltilmiş kullanın, ya da gramicidin olmadan, çözüm KARINCALARIN-LUV önceki gün hazırladı. </li><li> Istenilen konsantrasyonda bileşik veya kontrolleri için çözücü ekleyin. Solvent konsantrasyonu, tüm örnekleri arasında en az ve sabit tutun. Konsantrasyonları istenilen doz-yanıt aralığı elde etmek için herhangi bir yeni (bilinmeyen) bileşik ile ayarlanması gerekir. 10 dakika 25 ° C&#39;de karanlıkta. </li><li> Vortex örnek LUV ve sol şırınganın içine yüklemek. Na-tampon veya Tl-quencher doğru şırınga içine yükleyin. </li><li> Şırıngalar ve ileri geri iterek iyice Her iki örnekte hava kabarcıkları. </li><li> Vanaları kapatmadan önce her iki şırınga eşit yüklendiğinden emin olun. Kayıt odasına ulaşmadan önce Eşitsiz yükleme çözümleri ön karıştırma neden olacaktır. </li><li> İlk örnek için, Na-tampon ile floresan kayıt 4 kez tekrarlayın, gerektiği gibi yüksek gerilim (kazanç), ve 5 kez tekrarlayın. </li><li> Na-tamponu ile kalan örnekleri, kayıt 9 tekrarlar. </li><li> Na-tampon Tl giderici ve kayıt 13 tekrarlar ile değiştirin. </li><li> Su ile durulayın ve bir sonraki örneği ile devam edin. Solvent ile hiçbir gramicidin ve maksimum bileşik konsantrasyonu ile gramicidin ve gramicidin ve solvent hem biz örnekleri kullanmak kontrolleri gibi. </li></ol> 5. Analiz Veri <ol><li> Sonuçları analiz bilgisayara aktarın. MATLAB tüm verileri analiz etmek için okuyun. Her bir örnek için, bu karıştırma eserler içeren her durumda ilk dört hariç tüm tampon ve söndürücü tekrarlar okuyun. Önceki karışım tamamen durdu akış boru temizlemek için biraz daha az dört görüntüleri alır bir sürücü hacmi 120 mcL varsayarsak. </li><li> Tüm numuneler için tampon tekrarlar çok benzer olmalıdır. Floresan sinyali, bileşik konsantrasyonuna bağlı olarak belirgin bir değişim varsa, o zaman bileşik kendisi floresan olabilir ve bu ekstra floresan sinyal ilk örnekleri normalleştirilmesi önce çıkarmak için gerekli olabilir. </li><li> Elle izlerini üzerinden gitmek ve &quot;kötü&quot; tekrarlar kaldırmak: karıştırma eser ve / veya kabarcıklar nedeniyle multi-exponentiality, ani ya da sapmalar içeren tekrarlar. </li><li> Normale söndürücü tekrarlar, her örnek için tampon tekrarlar ortalama başlangıç ​​değeri. Bir grafik görüntüleme için tüm örnekler ortalamalara birleştirin. </li><li> İzleri yok gramicidin kaydedilen tüm benzer olması ve neredeyse hiç floresan su verme; Tl, kaçak yavaş + vezikül çift katlı 8 ile floresan sinyal nedeniyle yavaş bir azalma olabilir. Önemli su verme hiçbir gramicidin ve hiçbir değiştirici ile örnek gösterir, sonra veziküller bozulmuştur ve daha fazla kullanılmamalıdır. Hiçbir gramicidin ama değiştirici ile numunelerin önemli su verme göstermesi durumunda, o değiştirici veziküller bilayeri fluorofor veya söndürücü bilayeri çapraz olanak veren böyle bir ölçüde bozulacaktır. </li><li> Bileşik çift katlı lipid özelliklerini değiştirir, gramicidin kanallar tarafından algılanan, floresan süre içerisinde gözle görülür bir şekilde değişmiş olacak. </li><li> Her örnek için, gergin bir üstel <img src="/files/ftp_upload/2131/2131eg1.jpg" alt="Denklem 1" /> örneğin 4) bireysel tekrarlar normalize floresan su verme eğrisinin ilk 2-100 ms ve hızı için uygun olup <img src="/files/ftp_upload/2131/2131eg2.jpg" alt="Şekil 2" /> 42 ms olarak hesaplanmıştır. Verilen bir örnek için tüm bireysel tekrarlar ortalamaları ve standart sapmaları hesaplanır. </li><li> Son olarak, göreceli değişim gramicidin ve değiştirici yoktur en yakın zamanda kontrol örneği normalleştirilmesi quench oranı belirler. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1: floresan quench tabanlı testin şartları çift katlı lipid özellikleri değişiklikleri belirlemek için sol Top: Bir zoom-in iç ve dış NaNO 3 artı TlNO 3 artı NaNO 3 KARINCALARIN tek bir lipid vezikül. Sağ üst: söndürücü ve 87, 260 ve 780 nM gramicidin önceden katkılı, içki, içki olmadan (yukarıdan aşağıya) KARINCALARIN dolu veziküller kullanarak kaydedilen floresan sinyali. Alt: durdu akış karıştırma haznesinin şematik. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2: deney düzeneği açıklama başvurulan çeşitli paneller gösteren Pro-Veri SX yazılımı çekilen bir ekran. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3: Na-tampon ile KARINCALARIN yüklü luvs floresan sinyal birden fazla tekrar tespitler karıştırma eserler içeren ilk dört tekrarlar her zaman dışlanır . Karıştırma hücre örnek şırınga bağlayan boru belirli bir hacmi var, bu nedenle ilk birkaç tekrarlar önce tüpün içinde ne olduğunu bize bir okuma verecektir: su tekrar 1 ve 2, 3 için tekrar su ve örnek bazı kombinasyonu kalan tekrarlar için tekrar 4, ve sadece bir örnek daha çok örnek. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4: Na-tampon ve Tl-quencher KARINCALARIN yüklü luvs floresan sinyal Çoklu tekrar tespitler ilk dört tekrarlar, her iki şart da kaldırıldı . Ayrıca, Tl-söndürücü ölçümler için, eserler, büyük olasılıkla hava kabarcıkları nedeniyle kaldırılacak 8 ihtiyaçlarını tekrarlayın. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5: KARINCALARIN floresan su verme zamanı ders kapsaisin Etkisi (Cap) (A) 1 bitti Normalize floresan sinyal, gri noktalar tüm tekrarlar (n&gt; 5 durum başına) sonuçlarını gösterir; kırmızı çizgiler ortalama ifade tekrarlar. (B) ilk 100 ms, gri noktalar, her durum için tek bir tekrar sonuçları ifade etmektedir; kırmızı çizgiler üstel uyan (2 - 100 ms) gerilir bu tekrarlar. Kesikli mavi çizgi, 2 ms işareti, su verme oranı belirlenen süreyi ifade eder. A ve B üst iz Tl yokluğunda sonuçlarını gösterir +; sonraki iki izleri Tl, gA yokluğunda sonuçları + ± kap, dört alt izleri 260 nM gA ve Tl +, nerede sonuçları numaraları mcM [kap] ifade etmektedir. Gerilmiş üstel oranı tarafından belirlenir 0, 10, 30 ve 90 mcM kap, su verme oranları 36 ± 6, 69 ± 6, 85 ± 8 ve 247 ± 27 (ortalama ± SD, n&gt; 8) sırasıyla.

<ol>
	<li>Andersen, O. S., Giebisch, G. H., Purcel, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+transport+through+simple+membranes.">Ion transport through simple membranes.</a> Renal Function. , (1978).</li><li>Andersen, O. S., Koeppe, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bilayer+thickness+and+membrane+protein+function:+An+energetic+perspective.">Bilayer thickness and membrane protein function: An energetic perspective.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 107-130 (2007).</li><li>Andersen, O. S., Koeppe, R. E., Roux, B., Chung, S. -. H., Andersen, O. S., Krishnamurthy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gramicidin+channels.+Versatile+tools.">Gramicidin channels. Versatile tools.</a> Biological Membrane Ion Channels: Dynamics, Structure, and Applications. , (2007).</li><li>Berberan-Santos, M. N., Bodunov, E. N., Valeur, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mathematical+functions+for+the+analysis+of+luminescence+decays+with+underlying+distributions+1.+Kohlrausch+decay+function+(stretched+exponential.">Mathematical functions for the analysis of luminescence decays with underlying distributions 1. Kohlrausch decay function (stretched exponential.</a> Chem. Phys. 315, 171-182 (2005).</li><li>Bruggemann, E. P., Kayalar, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+molecularity+of+the+colicin+E1+channel+by+stopped-flow+ion+flux+kinetics.">Determination of the molecularity of the colicin E1 channel by stopped-flow ion flux kinetics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83, 4273-4276 (1986).</li><li>Bruno, M. J., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Docosahexaenoic+acid+alters+bilayer+elastic+properties.">Docosahexaenoic acid alters bilayer elastic properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 9638-9643 (2007).</li><li>Buboltz, J. T., Feigenson, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+strategy+for+the+preparation+of+liposomes:+rapid+solvent+exchange.">A novel strategy for the preparation of liposomes: rapid solvent exchange.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1417, 232-245 (1999).</li><li>Gutknecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadmium+&#38;+thallous+ion+permeabilities+through+lipid+bilayer+membranes.">Cadmium &#38; thallous ion permeabilities through lipid bilayer membranes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 735, 185-188 (1983).</li><li>Ing&#243;lfsson, H. I., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+is+a+modulator+of+bilayer+material+properties.">Curcumin is a modulator of bilayer material properties.</a> Biochemistry. 46, 10384-10391 (2007).</li><li>Keser&#252;, G. M., Makara, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+lead+discovery+strategies+on+the+properties+of+drug+candidates.">The influence of lead discovery strategies on the properties of drug candidates.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 8, 203-212 (2009).</li><li>Leeson, P. D., Springthorpe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+drug-like+concepts+on+decision-making+in+medicinal+chemistry.">The influence of drug-like concepts on decision-making in medicinal chemistry.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 6, 881-890 (2007).</li><li>Lundb k, J. A., Collingwood, S. A., Ing&#243;lfsson, H. I., Kapoor, R., Andersen, O. S., S, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+bilayer+regulation+of+membrane+protein+function:+gramicidin+channels+as+molecular+force+probes.">Lipid bilayer regulation of membrane protein function: gramicidin channels as molecular force probes.</a> J. R. Soc. Interface. 7, 373-395 (2010).</li><li>Moore, H. P. &. a. m. p. ;. a. m. p., Raftery, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+spectroscopic+studies+of+cation+translocation+by+Torpedo+acetylcholine+receptor+on+a+time+scale+of+physiological+relevance.">Direct spectroscopic studies of cation translocation by Torpedo acetylcholine receptor on a time scale of physiological relevance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77, 4509-4513 (1980).</li><li>Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+specificity+of+the+gramicidin+channel+and+the+thallous+ion.">Ionic specificity of the gramicidin channel and the thallous ion.</a> Biochim. Biophys. Acta. 401, 540-544 (1975).</li><li>O'Connell, A. M., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+gramicidin+channel+formation+in+lipid+bilayers:+transmembrane+monomer+association.">Kinetics of gramicidin channel formation in lipid bilayers: transmembrane monomer association.</a> Science. 250, 1256-1259 (1990).</li><li>S&#248;gaard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor+function+is+regulated+by+lipid+bilayer+elasticity.">GABAA receptor function is regulated by lipid bilayer elasticity.</a> Biochemistry. 45, 13118-13129 (2006).</li><li>Waring, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+optimum+lipophilicity+and+molecular+weight+ranges+for+drug+candidates-Molecular+weight+dependent+lower+logD+limits+based+on+permeability.">Defining optimum lipophilicity and molecular weight ranges for drug candidates-Molecular weight dependent lower logD limits based on permeability.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 2844-2851 (2009).</li></ol>

Yazının açıklanan yöntemleri kapsar geçici patent başvurusunda olmuştur. Co-mucitler HII ve OSA.

Biz, ilaç ve diğer küçük amfifiler bilayeri değiştirme potansiyeli belirlemek için hızlı bir floresan bazlı analiz göstermiştir. Bilayeri özelliklerini değiştirmek Bileşikler nonspesifik dolaylı bir şekilde membran protein işlevini değiştirmek için, muhtemelen &quot;off-hedef&quot; ilaç etkileri katkıda muhtemeldir. Bilayeri kapsayan proteinler tarafından algılanan çift katlı özelliklerinde değişiklik 12 probları olarak tahlil gramicidin kanalları güç patlatır. Floresans t...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>ANTS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A-350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>gramicidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Chemical Co</td>
<td>G-5002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti Polar Lipids</td>
<td>850398C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini-Extruder kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti Polar Lipids</td>
<td>610000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PD-10 Desalting column</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich Made by GE Healthcare</td>
<td>54805</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

gramicidin-based fluorescence assay; for determining small molecules potential for modifying lipid bilayer properties

Biyolojik bir işlevi modüle etmek için kullanılan birçok ilaç ve diğer küçük moleküller bilayeri / çözüm arayüzü ve böylece adsorbe çift katlı lipid özelliklerini değiştirebilir amfifiler. Membran proteinlerin hidrofobik etkileşimler enerjik ev sahibi bilayeri birleştiğinde, çünkü bu önemlidir. Çift katlı özelliklerinde değişiklikler dolayısıyla protein fonksiyonu ve &quot;off-hedef&quot; ilaç etkileri için olası bir mekanizma modüle amfifiler için dolaylı bir yol sağlar membran protein fonksiyonu, değiştirirler. Daha önce 3,12 probları gibi lineer gramicidin kanallarını kullanarak, çift katlı lipid özellikleri değişiklikleri saptamak için bir elektrofizyolojik tahlil geliştirdik . Gramicidin kanalları transbilayer dimerization iletken olmayan iki alt birimden oluşan mini-proteinleri. Onlar, çift katlı lipid özellikleri izleme değişiklikler için güçlü probları bilayeri kapsayan proteinler tarafından algılanan yapar membran çevre, değişimlere duyarlıdır. Şimdi probları aynı kanallarını kullanarak çift katlı özelliklerinde değişiklik tespit için bir floresan tahlil göstermektedir. Tahlil gramicidin kanallar aracılığıyla quencher giriş nedeniyle fluorofor yüklü büyük unilamellar veziküller floresan su verme zamanı ders ölçme dayanmaktadır. Biz floresan göstergesi / söndürücü çifti 8-aminonaphthalene-1 ,3,6-trisulfonate (KARINCALARIN) / Tl + diğer floresan su verme deneyleri 5,13 başarıyla kullanılmaktadır. Tl + yavaş yavaş 8 çift katlı lipid nüfuz ama gramicidin kanallar 1,14 yürütülmesi yoluyla kolayca geçer. Bu yöntem, mekanistik çalışmalar ve bilayeri rahatsızlık vermesini, ve potansiyel &quot;off-hedef&quot;, efektler için küçük moleküllerin yüksek verimli tarama için ölçeklenebilir ve uygun. Biz bu yöntemi kullanarak sonuçları önceki elektrofizyolojik sonuçları 12 ile iyi bir anlaşma olduğunu bulabilirsiniz.

Watch this Scientific Journal Video about Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties at JoVE.com

Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

Biz gramicidin kanal aktivitesinin bir ölçüsü olarak floresan su verme hızı monitörleri hızlı bir floresan bazlı analiz tanıtmak. Gramicidin kanalları, çift katlı kapsayan proteinler tarafından algılanan, çift katlı lipid özellikleri değişiklikleri izlemek için moleküler kuvvet dönüştürücüler olarak kullanılır.

Gramicidin tabanlı Floresan Testi; çift katlı lipid Özellikleri değiştirmek için Küçük Moleküller Potansiyel Belirleme

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter ...

gramicidin-based-fluorescence-assay-for-determining-small-molecules

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K Görüntüleme.  Weill Cornell Medical College. Biz gramicidin kanal aktivitesinin bir ölçüsü olarak floresan su verme hızı monitörleri hızlı bir floresan bazlı analiz tanıtmak. Gramicidin kanalları, çift katlı kapsayan proteinler tarafından algılanan, çift katlı lipid özellikleri değişiklikleri izlemek için moleküler kuvvet dönüştürücüler olarak kullanılır.

Video: Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations at risk. In the process of attempting to identify novel genetic factors associated with PD, scientists have generated many lists of candidate genes, polymorphisms, and proteins that represent important advances, but these leads remain mechanistically undefined. Our work is aimed toward significantly narrowing such lists by exploiting the advantages of a simple animal model system. While humans have billions of neurons, the microscopic roundworm Caenorhabditis elegans has precisely 302, of which only eight produce dopamine (DA) in hemaphrodites. Expression of a human gene encoding the PD-associated protein, alpha-synuclein, in C. elegans DA neurons results in dosage and age-dependent neurodegeneration.
Worms expressing human alpha-synuclein in DA neurons are isogenic and express both GFP and human alpha-synuclein under the DA transporter promoter (Pdat-1). The presence of GFP serves as a readily visualized marker for following DA neurodegeneration in these animals. We initially demonstrated that alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration could be rescued in these animals by torsinA, a protein with molecular chaperone activity 1. Further, candidate PD-related genes identified in our lab via large-scale RNAi screening efforts using an alpha-synuclein misfolding assay were then over-expressed in C. elegans DA neurons. We determined that five of seven genes tested represented significant candidate modulators of PD as they rescued alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration 2. Additionally, the Lindquist Lab (this issue of JoVE) has performed yeast screens whereby alpha-synuclein-dependent toxicity is used as a readout for genes that can enhance or suppress cytotoxicity. We subsequently examined the yeast candidate genes in our C. elegans alpha-synuclein-induced neurodegeneration assay and successfully validated many of these targets 3, 4.
Our methodology involves generation of a C. elegans DA neuron-specific expression vector using recombinational cloning of candidate gene cDNAs under control of the Pdat-1 promoter. These plasmids are then microinjected in wild-type (N2) worms, along with a selectable marker for successful transformation. Multiple stable transgenic lines producing the candidate protein in DA neurons are obtained and then independently crossed into the alpha-synuclein degenerative strain and assessed for neurodegeneration, at both the animal and individual neuron level, over the course of aging.

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson&#039;s Disease Genes

This video demonstrates how to use C. elegans to assess dopaminergic neuron neurodegeneration as a model for Parkinson's disease. Furthermore, genetic screens are used to identify factors that either enhance degeneration or are neuroprotective.

Potansiyel Parkinson Hastalığı Genler Doğrulama için C. elegans Dopamin Nöron Dejenerasyonu Testi Uygulama

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Biyoloji

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

Çift katlı Elastik Özellikleri İzleme Değişiklikler için Tek Molekül Yöntemleri

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Maya İzleme Mitophagy Floresan Mikroskopi Testi Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5' terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5' terminal (8 nucleotides) and a 3' terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5'-hydroxyl and a 2',3'-cyclic phosphate termini.

CRISPR/Cas systems mediate adaptive immunity in Bacteria and Archaea. Many Cas proteins are proposed to act as endoribonucleases acting on crRNA precursors of varying length. Here we illustrate three different approaches to generate pre-crRNA substrates for the biochemical analysis of Cas endonuclease activity.

CRISPR / Cas Sistemleri Endonükleazlar için Substrat Üretimi

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

Yüksek Verim Dizilimine tarafından MicroRNA ölçümü için Küçük RNA molekülleri, yüksek Verimli ligasyonu

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

Floresan Proteaz Koruma Kullanma Membran Protein topolojisini belirlenmesi (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Luciferase tamamlayıcı Imaging tahlil Nicotiana benthamiana yaprakları Protein-protein etkileşim Dynamics geçici belirlenmesi için

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry using tethered bilayer lipid membranes (tBLMs) assembled on gold electrodes. Irradiated modified GNPs, such as streptavidin-conjugated GNPs, are embedded in tBLMs containing target molecules, such as biotin. By using this approach, the heat transfer processes between irradiated GNPs and model bilayer lipid membrane with entities of interest are mediated by a horizontally focused laser beam. The thermal predictive computational model is used to confirm the electrochemically induced conductance changes in the tBLMs. Under the specific conditions used, detecting heat pulses required specific attachment of the gold nanoparticles to the membrane surface, while unbound gold nanoparticles failed to elicit a measurable response. This technique serves as a powerful detection biosensor which can be directly utilized for the design and development of strategies for thermal therapies that permits optimization of the laser parameters, particle size, particle coatings and composition.

This work outlines a protocol to achieve dynamic, non-invasive monitoring of heat transfer from laser-irradiated gold nanoparticles to tBLMs. The system combines impedance spectroscopy for the real-time measurement of conductance changes across the tBLMs, with a horizontally focused laser beam that drives gold nanoparticle illumination, for heat production.

Altın Nanopartiküller ve Lipid Membranları Arasındaki Isı Transferini İzlemek için Bağlı Bilayer Lipid Membranları

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry ...

Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In addition, autofluorescence attributed to chlorophyll hampers the observation of fluorescent proteins in plants. For a long time, various clearing reagents have been used to make plants transparent. However, conventional clearing reagents diminish fluorescent signals; therefore, it has not been possible to observe the cellular and intracellular structures with fluorescent proteins. Reagents were developed that can clear plant tissues by removing chlorophyll while maintaining fluorescent protein stability. A detailed protocol is provided here for the optical clearing of plant tissues using clearing reagents, ClearSee (CS) or ClearSeeAlpha (CSA). The preparation of cleared plant tissues involves three steps: fixation, washing, and clearing. Fixation is a crucial step in maintaining the cellular structures and intracellular stability of fluorescent proteins. The incubation time for clearing depends on the tissue type and species. In Arabidopsis thaliana, the time required for clearing with CS was 4 days for leaves and roots, 7 days for seedlings, and 1 month for pistils. CS also required a relatively short time of 4 days to make the gametophytic leaves of Physcomitrium patens transparent. In contrast, pistils in tobacco and torenia produced brown pigment due to oxidation during CS treatment. CSA reduced the brown pigment by preventing oxidation and could make tobacco and torenia pistils transparent, although it took a relatively long time (1 or 2 months). CS and CSA were also compatible with staining using chemical dyes, such as DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) and Hoechst 33342 for DNA and Calcofluor White, SR2200, and Direct Red 23 for the cell wall. This method can be useful for whole-plant imaging to reveal intact morphology, developmental processes, plant-microbe interactions, and nematode infections.

Here, a method is described for making plant tissues transparent while maintaining the stability of fluorescent proteins. This technique facilitates deep imaging of cleared plant tissues without physical sectioning.

Floresan Görüntüleme için Bitki Dokularının Optik Temizlenmesi

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In ...