LHB was funded by the Wellcome Trust Dynamic Cell PhD programme; KAR was funded by MRC project grant MR/L002566/1 (awarded to EJR and CLH) and CLH was funded by ARUK grant 19479. We would also like to thank the Wolfson Bioimaging facility for imaging advice.

protokolü dahilinde tüm adımları Üniversite Bristol hayvan bakımı ve refahı kurallarına ve İngiltere Ev Office olanların izleyin. Kas-iskelet Anatomi 1. Görselleştirme NOT: kas ölçmek için ve kas ekleri tam yerleştirme tanımlamak için, iskelet elemanlarının şeklini görselleştirmek için, immunostain (bölüm 1.1) (kas ortaya) iskelet miyozin için uygun yaşta balık ve tip II kollajen (görselleştirmek için kıkırdak). Alternatif olarak, kollajen a1 muhabiri col2a1 olarak transgenik floresan muhabiri hatları kullanılarak kas-iskelet anatomisi görselleştirmek: mCherry 13,14 kıkırdak ve yavaş miyozin ağır zincir raportör smyhc görselleştirmek için: GFP 15 kas ekleri (Bölüm 1.2) konumunu görselleştirmek için. kıkırdak ve kas işaretlemek alternatif hatlar eşit işe yarayabilir. <ol><li> floresan Immunostaadencilik <ol><li> 1 saat süre ile, fosfat-tamponlu tuzlu su (PBS) içinde fazla% 4 paraformaldehit (PFA) larva düzeltildi. % 0.1 Tween 20 (PBT) ile PBS içinde yıkanır ve sırasıyla, 5 dakika için PBT içinde% 50 metanol (MeOH) ve% 100 MeOH kurutmak. Dikkat: PFA toksik ve malzeme güvenlik levha doğrultusunda ele alınmalıdır. Not: gerekene kadar Larva% 100 MeOH içinde saklanabilir. </li><li> 5 dakika PBT içinde% 50 MeOH larva rehidrate. 5 dakika boyunca PBT yıkayın. </li><li> 5-6 dakika boyunca buz üzerinde PBT% 0.25 tripsin larva geçirgenliği. 5 dakika her biri için 4x PBT yıkayın. </li><li> PBT% 5 serum 2-3 saat engelleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat ve gece boyunca 4 ° C PBT içinde% 5 serum içinde tavşan anti-tip 2, kollajen ve fare anti-miyosin antikorların Tavsiye edilen seyreltme larva inkübe edin. NOT: Tavsiye edilen seyreltme aralığı antikor veri sayfasında normalde. birbirinden farklı türlere karşı yükseltilir ve bu da yönün olan antikorları seçindokuya kira. </li><li> PBT 15 dakika Larva 6x yıkayın. </li><li> PBT% 5 serumunda 1-2 saat engelleyin. </li><li> Karanlıkta, ikincil antikorlar inkübe edin. Belirli bir antikor için% 5 serum ve PBT uygun seyreltide flüoresan etiketli anti-fare (550) ve anti-tavşan (488) sekonder antikor kullanın. </li><li> mümkün olduğunca çabuk bir 10X konfokal mikroskop PBT ve görüntüde her biri 10 dakika yıkayın 6X. </li></ol></li><li> Görüntüleme Kas-iskelet Geometri <ol><li> Danieau çözümü 16 ılık 0.3-0.5% düşük erime noktası (LMP) agaroz bir lamel ventral larvaları monte edin. NOT: Transgenik balık montaj öncesi ve görüntüleme sırasında% 0.02 MS222 (Tricaine metansülfonat, pH 7) sedasyon gerekir. </li><li> 10X objektif lens ve yaklaşık 2.5X dijital zoom kullanarak ilgi bölgenin konfokal görüntü yığını alın. 488 nm ve 561 n kullanarak yeşil ve kırmızı kanalın görüntülerini hazırlayınm sırasıyla lazerler. 1.3 mikron ve 3 hat ortalamalar z düzlemleri arasında bir aralık ile 512 x 512 piksel çözünürlükte görüntü. Ortaya çıkan yığın yaklaşık 100 z dilim oluşacaktır. </li><li> Bir tiff dizisi olarak veri ihracat. Bir 5dpf zebrabalıkları larva kas ve kıkırdak elemanlarının en fazla çıkıntılar, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. </li></ol></li></ol> 2. 3D Surface oluşturuluyor <ol style="margin-left: 40px;"><li> 3, 4 ve 5 dpf, her bir zaman noktası için temsili bir veri kümesi seçin (çoklu numunelerin görselleştirme sonra seçin). </li><li> 3 boyutlu tiff yığını açın ve analiz yazılımı tüm kanalları seçmek. Sağ kıkırdak kanala tıklayın ve görüntü filtresi ve yumuşatma seçin: Gauss (Şekil 2B). </li><li> Proje görünümünde sağ &#39;yeni bir etiket düzenleme&#39; sonra süzülür resmin üzerine tıklayın ve &#39;görüntü segmentasyonu&#39; seçin ve. Her malzeme, yani kıkırdak ve j için yeni bir etiket oluşturunoint. Sihirli değnek aracını kullanarak görüntünün kıkırdak bölgesini (Şekil 2C, beyaz sinyal, mor anahat) seçin. özetliyor gürültü çıkarmak için fırça aracını kullanın. NOT: sihirli değnek aracını kullanarak ise, &#39;Bütün dilimleri tıklayın. </li><li> Fırça aracıyla ortak bölgeyi seçin ve ortak bir bileşene atamak (Şekil 2C, mavi anahat) </li><li> Üst menüde ve pürüzsüz etiketlerde segmentasyon seçerek bir kerede düzgün birden dilimleri. Sağ 3D yüzey bileşeni (Şekil 2B) render üretmek için yüzey oluşturmak resmin üzerine tıklayın ve seçin. </li><li> yüzeyde tıklayın ve meshing yazılımı içine aktarmak için bir hmascii dosyası olarak kaydedebilirsiniz. </li></ol> 3. FE Modeli Kullanılacak Muscle Kuvvetleri hesaplanması <ol style="margin-left: 40px;"><li> Smyhc konfokal görüntüleri kas liflerinin sayısını: GFP transgenik zebra balığı (Şekil 1A, ok ucu, 1C) ve diam ölçmekelyafların eter enine kesit alanını hesaplamak için (πr 2). </li><li> literatürden kas birim alan başına uygun kuvvet tanımlayın. Larva Zebra balığı iskelet kasları (40 nN / um 2) için birim alan başına üretilen maksimal kas kuvveti 17 kullanılmıştır. </li><li> Birim alan başına kuvvet liflerin sayısı ve bunların alanı çarpılarak her bir anatomik kas grubu için kuvvetleri hesaplayın. Tablo 1&#39;e bakınız. </li></ol> 4. Bir Mesh oluşturma <ol style="margin-left: 40px;"><li> Bir sonlu elemanlar örgü üretme yeteneğine sahip bir yazılım paketi içine bölüm 2 (yukarıda) üretilen 3D modeli alın. </li><li> 2B menüsü altında shrink wrap aracını kullanarak kıkırdak ve eklem yüzeylerinin A2D örgü oluşturun. Uygun bir eleman boyutunu seçin. Not: 1.5-2.5 arasında bir eleman boyutunu kullanın. Gerekirse, farklı boyutlardaki 2D yüzeyin bir dizi 3D örgü optimizasyonu (Bölüm 4 yürütmek için kafesleri oluşturmak.4). </li><li> &#39;&gt; 2D&gt; Araçlar elemanların kontrol&#39; altında bulunan örgü kalite kontrolleri yürütmek örgü çoğaltılamaz elemanları, eklemeler ve sızmalar kontrol paneli. Model ağacında yarar sekmesini kullanarak dihedral açıları sabitleyin. </li><li> 3D&gt; Tetramesh nolu alt-panel kullanılarak eleman boyutunu farklı 2D yüzey kafesleri bir 3B kafes oluşturun. NOT: Farklı örgü boyutlarda sonuçları karşılaştırın ve daha fazla simülasyonları sonra yakınsar ve özellik tanımı ödün vermeyen düşük mesh boyutu ile FE model seçin. Şekil 3&#39;te örnek alt çene kıkırdaklar için 1,5 milyon tetrahedral öğeler içerir ve 2.0 2D eleman boyutu vardı. </li><li> çene modeli Geometri&gt; Mesafe nolu alt-panel kullanarak konfokal yığınının başına ölçekli yani örgü Transform. NOT: kıkırdak sağlanması ve ortak bileşenler birleştirilmiş bir model ihraç ederek veya bağlarını kullanarak modelde bağlanır. </li></ol> 5. Sonlu Elemanlar Model İnşaat <ol><li> Ticari sonlu eleman (FE) yazılımını kullanarak, bir FE modeli oluşturmak. 3D kas ve bir rehber olarak bölüm 1 oluşturulan kıkırdak etiketli konfokal yığınları kullanarak, kas bağlantı noktaları karşılık düğümleri atayın. Her kasın kökeni ve ekleme temsil iki düğüm (Şekil 3) arasında bir vektör oluşturun. </li><li> tip &#39;tarih&#39; bir yük toplayıcı oluşturun, her kas için bir &#39;C yükü&#39; uygulamak için. (Adım 3.3 hesaplanan) Newton cinsinden büyüklüğünü belirleyin ve ilgili vektör atayın. 3 adduktor mandibulae&#39;de (PM), açıölçer hyoideus (PH) ve intermandibularis (IM) için bağlantı noktaları göstermektedir. NOT: Bu çene kaslarının için, maksimum kasılma kuvveti her yükün sadece% 50&#39;si her yerinde uygulanan, böylece kökeni ve ekleme arasında dağıtılır. </li><li> Literatürde tarafından belirlenen uygun elastik izotrop malzeme özelliklerini atayın. kıkırdak için Young modülüve bu modelde Interzone, sırasıyla 1.1 MPa ila 0.25 MPa ve Poisson oranı, her iki 18,19 için 0.25 olmuştur. </li><li> model üzerinde ilk kısıtlamalar uygulamak Türün &#39;sınır&#39; bir yük toplayıcı oluşturun. Sekme Analiz&gt; Kısıtlar gidin ve oluşturmak nolu alt-panel de, sen sınırlamak istediğiniz modele düğümleri seçin. serbestlik dereceleri (DOF) hareket doğal aralığının en iyi yaklaşım Modelin bu sınırı hareketini seçin. Not: Şekil 3&#39;te örnek tüm hareket eksenleri sınırlandığını: modeli ve bir orta noktada yer içinde çapa ceratohyal de (DOF 1, 2, 3, sırasıyla x, y ve z, temsil eder) palatoquadrate zebra balığı kafatası geri kalanı (Şekil 3, Tablo 1) bağlandığı noktada, y ve z eksenleri. modeli en az bir düğüm üç derinliğindeki sınırlanmalıdır. </li><li> Eğer Simul istediğiniz hareketin her tür için bir &#39;yük adım&#39; oluşturmaAnaliz menüsü altında (yani, açma, kapama) yedik ve bu hareketi simüle etmek (Bölüm 5.4&#39;te yapılan) ve kısıtlamaları (Bölüm 5.2 yapılan) ilgili tüm yükleri seçin. göründüğünde açılır menüden &#39;Static&#39; seçeneğini seçin. </li><li> Bu durumda &quot;.inp&quot; biçiminde uygun bir dosya biçiminde örgü, yükler, kısıtlamalar ve malzeme özellikleri de dahil olmak üzere ihracat modeli. </li><li> FE analiz yazılımı yükleyin modeli. Oluşturma ve İş modülü kullanılarak model için bir iş yürütmek. </li><li> Sonuçlar sekmesi ve görselleştirme menüsü bulunan vb stres, gerginlik, yer değiştirme, için çıkış analiz (Şekil 4 ve 5). </li></ol> Çene Deformasyon / Deplasman Mesafeler 6. Doğrulama <ol><li> Transgenik zebrafish: 3-6 Tg (mCherry Col2a1aBAC) seçin. </li><li> onlar dokunmak ama yürekleri hala yenerek cevap sona erene kadar hafifçe% 0.02 MS222 ile larva uyuşturan. </li><li> dağyanal ılık% 1 LMP agaroz lamelleri (anestezi iken) (Danieau çözümü içinde yapılır) larvalarının. </li><li> başının etrafında agaroz çıkarın ve forseps ile çene. </li><li> Normal ağız hareketleri devam ettirene kadar Pasteur pipeti kullanarak anestezi kaldırmak için larva başının üzerinde (hiçbir MS222) ile taze Danieau çözümünü yıkayın. </li><li> Ağız hareketlerinin parlak alan yüksek hızlı video çekmek için film yakalama yazılımı kullanabilirsiniz. En yüksek kare hızında bir dakika süre etrafında film çekmek, ya da yeterli çene açıklığının birden döngülerini kaydetmek için. </li><li> maksimum deplasman açık çene göstermek çerçeveleri seçin. Meckel kıkırdağı ön uç ve mikron üst çene (etmoid plaka ucu) arasındaki mesafeyi ölçün. </li><li> Birden balık larvaları ortalama deplasman hesaplayın. </li><li> modelden deplasman veri ayıklayın. (Model değiştirme davranışı doğrulamak için 6.8 hesaplanan ortalama deplasman kullanın <strong&gt; Şekil 4). Model sırayla malzeme özelliklerini ve kas yüklerini değiştirerek beklenen çalıştırmak duyarlılık analizi saparsa. </li></ol>

<ol>
	<li>Rayfield, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finite+Element+Analysis+and+Understanding+the+Biomechanics+and+Evolution+of+Living+and+Fossil+Organisms.">Finite Element Analysis and Understanding the Biomechanics and Evolution of Living and Fossil Organisms.</a> Annu. Rev. Earth Planet. Sci. 35, 541-576 (2007).</li><li>Rao, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Finite Element Method in Engineering: Fifth Edition. , (2010).</li><li>Taylor, M., Prendergast, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+decades+of+finite+element+analysis+of+orthopaedic+devices:+Where+are+we+now+and+what+are+the+opportunities.">Four decades of finite element analysis of orthopaedic devices: Where are we now and what are the opportunities.</a> J Biomech. 48, 767-778 (2015).</li><li>Button, D. J., Rayfield, E. J., Barrett, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+biomechanics+underpins+high+sauropod+diversity+in+resource-poor+environments.">Cranial biomechanics underpins high sauropod diversity in resource-poor environments.</a> Proc Royal Soc London B: Biol Sci. 281. 281, (2014).</li><li>Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+and+developmental+control.">Mechanobiology and developmental control.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 27-61 (2013).</li><li>Shwartz, Y., Farkas, Z., Stern, T., Aszodi, A., Zelzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+contraction+controls+skeletal+morphogenesis+through+regulation+of+chondrocyte+convergent+extension.">Muscle contraction controls skeletal morphogenesis through regulation of chondrocyte convergent extension.</a> Dev biol. 370, 154-163 (2012).</li><li>Rolfe, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mechanosensitive+genes+during+skeletal+development:+alteration+of+genes+associated+with+cytoskeletal+rearrangement+and+cell+signalling+pathways.">Identification of mechanosensitive genes during skeletal development: alteration of genes associated with cytoskeletal rearrangement and cell signalling pathways.</a> BMC genomics. 15, 48 (2014).</li><li>Roddy, K. A., Kelly, G. M., van Es, M. H., Murphy, P., Prendergast, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+patterns+of+mechanical+stimulation+co-localise+with+growth+and+cell+proliferation+during+morphogenesis+in+the+avian+embryonic+knee+joint.">Dynamic patterns of mechanical stimulation co-localise with growth and cell proliferation during morphogenesis in the avian embryonic knee joint.</a> J Biomech. 44, 143-149 (2011).</li><li>Haudenschild, D. R., Chen, J., Steklov, N., Lotz, M. K., D'Lima, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+chondrocyte+actin+cytoskeleton+in+living+three-dimensional+culture:+response+to+anabolic+and+catabolic+stimuli.">Characterization of the chondrocyte actin cytoskeleton in living three-dimensional culture: response to anabolic and catabolic stimuli.</a> Mol cell biomech. 6, 135-144 (2009).</li><li>Nowlan, N. C., Murphy, P., Prendergast, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+pattern+of+mechanical+stimulation+promotes+ossification+in+avian+embryonic+long+bones.">A dynamic pattern of mechanical stimulation promotes ossification in avian embryonic long bones.</a> J Biomech. 41, 249-258 (2008).</li><li>Giorgi, M., Carriero, A., Shefelbine, S. J., Nowlan, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiological+simulations+of+prenatal+joint+morphogenesis.">Mechanobiological simulations of prenatal joint morphogenesis.</a> J Biomech. 47, 989-995 (2014).</li><li>Heegaard, J. H., Beaupre, G. S., Carter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+modulated+cartilage+growth+may+regulate+joint+surface+morphogenesis.">Mechanically modulated cartilage growth may regulate joint surface morphogenesis.</a> J Ortho Res. 17, 509-517 (1999).</li><li>Hammond, C. L., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+populations+of+endochondral+osteoblasts+with+differential+sensitivity+to+Hedgehog+signalling.">Two populations of endochondral osteoblasts with differential sensitivity to Hedgehog signalling.</a> Development. 136, 3991-4000 (2009).</li><li>Mitchell, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+osteoarthritis+genetics+in+zebrafish.">New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish.</a> Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarth Res Soc. 21, 269-278 (2013).</li><li>Elworthy, S., Hargrave, M., Knight, R., Mebus, K., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+multiple+slow+myosin+heavy+chain+genes+reveals+a+diversity+of+zebrafish+slow+twitch+muscle+fibres+with+differing+requirements+for+Hedgehog+and+Prdm1+activity.">Expression of multiple slow myosin heavy chain genes reveals a diversity of zebrafish slow twitch muscle fibres with differing requirements for Hedgehog and Prdm1 activity.</a> Development. 135, 2115-2126 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Danieau's+solution+(30&#215;).">Danieau's solution (30&#215;).</a> Cold Spring Harb Prot. , (2011).</li><li>Iorga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromechanical+function+of+myofibrils+isolated+from+skeletal+and+cardiac+muscles+of+the+zebrafish.">Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish.</a> J Gen physiol. 137, 255-270 (2011).</li><li>Tanck, E., Blankevoort, L., Haaijman, A., Burger, E. H., Huiskes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+muscular+activity+on+local+mineralization+patterns+in+metatarsals+of+the+embryonic+mouse.">Influence of muscular activity on local mineralization patterns in metatarsals of the embryonic mouse.</a> J Ortho Res. 18, 613-619 (2000).</li><li>Tanck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+consequences+of+mineralization+in+embryonic+bone.">The mechanical consequences of mineralization in embryonic bone.</a> Bone. 35, 186-190 (2004).</li><li>Brunt, L. H., Norton, J. L., Bright, J. A., Rayfield, E. J., Hammond, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finite+element+modelling+predicts+changes+in+joint+shape+and+cell+behaviour+due+to+loss+of+muscle+strain+in+jaw+development.">Finite element modelling predicts changes in joint shape and cell behaviour due to loss of muscle strain in jaw development.</a> J Biomech. 48, 3112-3122 (2015).</li><li>Roddy, K. A., Prendergast, P. J., Murphy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+influences+on+morphogenesis+of+the+knee+joint+revealed+through+morphological,+molecular+and+computational+analysis+of+immobilised+embryos.">Mechanical influences on morphogenesis of the knee joint revealed through morphological, molecular and computational analysis of immobilised embryos.</a> PloS one. 6, e17526 (2011).</li><li>Cuff, A. R., Bright, J. A., Rayfield, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+experiments+on+finite+element+models+of+an+ostrich+(Struthio+camelus)+cranium.">Validation experiments on finite element models of an ostrich (Struthio camelus) cranium.</a> Peer J. 3, 1294 (2015).</li><li>Schilling, T. F., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Musculoskeletal+patterning+in+the+pharyngeal+segments+of+the+zebrafish+embryo.">Musculoskeletal patterning in the pharyngeal segments of the zebrafish embryo.</a> Development. 124, 2945-2960 (1997).</li><li>Dowthwaite, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+underlying+the+movement+requirement+for+synovial+joint+cavitation.">A mechanism underlying the movement requirement for synovial joint cavitation.</a> Matrix biol. 22, 311-322 (2003).</li><li>Nia, H. T., Han, L., Li, Y., Ortiz, C., Grodzinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poroelasticity+of+cartilage+at+the+nanoscale.">Poroelasticity of cartilage at the nanoscale.</a> Biophys J. 101, 2304-2313 (2011).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok. Şekil 3-5&#39;te bazı veriler J.Biomech, 48 (12), Brunt ve ark. Yeniden basıldı olmuştur Sonlu eleman modelleme nedeniyle çene gelişiminde, 3112-22 kas zorlanma kaybına ortak şekil ve hücre davranış değişiklikleri öngörüyor. 2015, Elsevier 15 izniyle.

Finite Element models have been used to relate the areas of skeletal elements that are under strain with those undergoing bone formation 10, as well as to map the areas under strain during endochondral ossification and joint morphogenesis 8,12,21. Other studies have also been able to apply theoretical growth models to replicate changes during joint development 11,12. Here we show the protocol for building FE models for a relatively simple system, the zebrafish jaw 20. Unlike alternative methods of collecting raw images for the FE models, such as CT scanning 22, confocal imaging of transgenic lines or immunostained zebrafish allows for multiple tissues to be studied. It can, therefore, provide direct information on muscle attachment points in relation to cartilage. Among vertebrate models zebrafish are particularly amenable to genetic and pharmacological manipulation. The generation of FE models for zebrafish craniofacial cartilage now opens up the possibility of further study of the interplay between biomechanics and genetics in joint morphogenesis.
There are a number of critical steps to the process of creating an FE model; the first is generating an accurate three-dimensional representation of the system. This requires imaging at high enough resolution to clearly define boundaries. Note that even with high-resolution imaging to make a good surface one may have to smooth out some regions. Another critical step is defining the correct placement of the load and correct constraints. An insufficiently constrained model will fail to solve and incorrect placement of the loads will cause abnormal movement.
Some processing of the raw data (Figure 2) is necessary as a surface generated from the raw data would be difficult to mesh (Figure 2B). We filtered the data using a Gaussian filter (Figure 2C) and we carried out some manual smoothing of the curves to produce a set of clean outlines that can be converted into a 3D surface. Too much smoothing can produce a &#34;melted&#34; surface that has lost many of its features. Choosing the correct element size is an iterative process as choosing too small an element size creates too large a mesh which is computationally intensive. However, choosing too large an element size will produce a mesh which fails to recapitulate the correct shape of the structure. The correct mesh had the smallest element size that captured the correct shape of the jaw and converged on a correct solution, verified using the jaw displacement. It may also be necessary to modify the material properties or load calculations to better emulate the correct displacement as different ages and species will have substantially different properties.
It is important to remember that there are always limitations to a hypothetical model and assumptions made to run FE models. When only modeling one or a small number of samples it is critical to ensure that a representative sample is chosen as there are likely to be small variations between individuals. As only some of the jaw elements and muscles were included, the model is a simplified version of the zebrafish craniofacial musculoskeletal system. Therefore, constraints had to be positioned to account for where the modelled jaw elements would connect with the rest of the skull and the model was artificially constrained in the center to fix it in &#39;space&#39;. This artificial constraint did not impact on the interpretation drawn from the models as the ceratohyal itself was not analyzed. The inclusion of more of the craniofacial structure, especially other jaw opening muscles such as the sternohyals and its attached cartilage 23, could have added to the model, but limitations include the ability of larger models to run in the Finite Element software.
Another limitation is that we have not modeled ligament insertion, though this could be achieved by the insertion of springs 8. One other assumption made in this case was that the model would behave linearly. The magnitudes of strains on the models were comparable to those in published models and applied to in vitro cells 10,24, with strains being below +3,500 and above -5,000 &#181;&#603; apart from constraint and muscle attachment points. Therefore, the strains at the relevant regions of the model were deemed within a range acceptable for a linear model. Cartilage does not behave entirely as a linear material and has previously been modelled as a poroelastic material, which enabled analysis of the fluid behavior in the model 25. Spreading the muscle attachment points amongst a cluster of local nodes would distribute the peak forces and more accurately represent the muscle insertion for certain muscles.
Use of FE allows an assessment of the strains and stresses acting on a structure. As a technique it is frequently used in many bioscience disciplines including orthopedics, paleontology and more recently developmental biology. Here we describe how to build FEs for the zebrafish lower jaw. In the future these models could be extended to look at the whole jaw, including the palate. Similar techniques could be used to model spinal biomechanics in fish, which to date have mostly been studied by kinematic means.

Sonlu Elemanlar (FE) modelleme hesaplama hesaplamak ve bir yapı 1 etkiyen suşları büyüklüğünü ve konumunu harita olabilir bir mühendislik tekniğidir. Modeli &quot;Sonlu Element&quot; bir örgü ile temsil edilen 3D yapı oluşur ve analiz Sonuç örgü, mekanik büyüklük ve konum elemanlarının yapısı ve sayısı da dahil olmak üzere bir dizi faktöre tarafından yönetilir yükler ve malzeme özellikleri. Malzeme özellikleri yükün belli bir türü altında bir malzemenin davranış bazı yönlerini tanımlamak; Örnek gerildiğinde Poisson oranı, uzunluğu bir malzemenin genişliği oransal azalma tarif ise Young modülü (E) malzemenin elastikiyetini açıklanmaktadır. FE modelleme &#39;yapısı hakkında hesaba benzersiz giriş verileri alarak model üzerinde değiştirme, stres, baskı ve gerilme oyunculuk da dahil olmak üzere değişkenler çeşitli hesaplamak için kullanılabilir; S şekil, konum ve yüklerin büyüklüğü ve özgül malzeme özellikleri. FE modelleme yaygın mühendislik 2 ve giderek 3, ortopedik ve paleontolojik uygulamaları 4 kullanılır. Gelişmede biyomekanik kuvvetler hücresi tepkilerini 5-8 aktif hale getirmek için birçok hücrede bir uyarıcı olarak işlev gördükleri bilinmektedir ve organ sistemlerini geliştirmek içinde göreli konumları ve mekanik uyarıcılara büyüklüğünü hem de tahmin etmek yararlıdır, ancak, şu anda FE modelleme az kullanılan olmuştur Zebra balığı gelişimi için. Hem kıkırdak ve kemik mechanosensitive malzeme olduğu gösterilmiştir. Örneğin, in vitro olarak bir sıkıştırma gerilimi kemik oluşumu 9 için gerekli olduğu gösterilmiştir edilmiş olmasına rağmen, kondrojenik yolunu aktive olduğu bulunmuştur. FE analizi (FEA) fo kemiğin sırasında iskelet elemanları üzerinde etki gösterenler dahil, biyolojik örnekler üzerinde etkili suşları modellemek için istismar edilmiştirım 10. Teorik biyomekanik güçler 11,12 maruz kalmıştır ve civciv diz eklemi morfolojilerinden 8 sırasında mevcut suşları desen göstermek için sonra diğer kalkınma uygulamaları eklem şeklini tahmin etmek kullanımını da kapsar. Bu protokol gelişmekte olan dokulara mekaniğini anlamak için bir bakış açısıyla konfokal görüntüleri 3 boyutlu yüzeyler, kafesleri ve Sonlu Elemanlar modellerinin üretilmesi deneyim paylaşımı amaçlanıyor. Biz de in vivo gerçek eklem değiştirme bilgileri yakalayan rağmen FE modelleri doğrulayarak yollarını göstermektedir. Biz bir örnek olarak Zebra balığı çene kullanırken aynı teknikler kas-iskelet sistemi yapısı üzerinde 3D bilgiler konfokal veya multiphoton görüntüleme ile elde edilebilir olan herhangi bir küçük bir biyolojik sistemde kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Coll2</td><td>Abcam</td><td>ab34712</td><td>Type II collagen antibody - stains all cartilage</td></tr><tr><td>A4.1025 / MF20</td><td>Developmental studies hybridoma bank</td><td>A4.1025</td><td>Skeletal mysoin antibody - marks all skeletal muscle&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Low melt agarose</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>A9414-5G</td><td>For mounting zebrafish</td></tr><tr><td>MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate )</td><td>Sigma</td><td>E10521-10G</td><td>To make anesthetic</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Fisher</td><td>T/3760/48</td><td>sample permeablilisation</td></tr><tr><td>Dylight 488 Mouse IgG</td><td>Thermofisher</td><td>35502</td><td>Secondary antibody</td></tr><tr><td>Dylight 550 Rabbit IgG</td><td>Thermofisher&amp;nbsp;</td><td>84541</td><td>Secondary antibody</td></tr><tr><td>SP8/SP5 or SPE confocal</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td></td><td>For imaging&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LAS Leica capture software</td><td>Leica</td><td></td><td>Imaging software</td></tr><tr><td>Aviso (version 7.0.0)</td><td>FEI Visualization Science Group</td><td></td><td>3D image analysis software (Section 2)</td></tr><tr><td>Hypermesh part of the Hyperworks package (version 10)</td><td>Altair Engineering</td><td></td><td>FE model generating software (Section 4-5)</td></tr><tr><td>Abaqus (version 6.14)</td><td>SIMULIA</td><td></td><td>FE analysis software (Section 5.7-5.8)</td></tr></tbody></table>

building finite element models to investigate zebrafish jaw biomechanics

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical strain. Skeletal joints are subjected to dynamic mechanical loading. Finite element analysis (FEA) is a computational method, frequently used in engineering that can predict how a material or structure will respond to mechanical input. By dividing a whole system (in this case the zebrafish jaw skeleton) into a mesh of smaller 'finite elements', FEA can be used to calculate the mechanical response of the structure to external loads. The results can be visualized in many ways including as a 'heat map' showing the position of maximum and minimum principal strains (a positive principal strain indicates tension while a negative indicates compression. The maximum and minimum refer the largest and smallest strain). These can be used to identify which regions of the jaw and therefore which cells are likely to be under particularly high tensional or compressional loads during jaw movement and can therefore be used to identify relationships between mechanical strain and cell behavior. This protocol describes the steps to generate Finite Element models from confocal image data on the musculoskeletal system, using the zebrafish lower jaw as a practical example. The protocol leads the reader through a series of steps: 1) staining of the musculoskeletal components, 2) imaging the musculoskeletal components, 3) building a 3 dimensional (3D) surface, 4) generating a mesh of Finite Elements, 5) solving the FEA and finally 6) validating the results by comparison to real displacements seen in movements of the fish jaw.

Kas (Şekil 1A) ve kıkırdağın (Şekil 1B) veya transgenik muhabir görüntüleme immün (Şekil 1C) ilişkili kas birlikte, çene 3 boyutlu yapısı görüntülenmiştir sağlar. Yüksek çözünürlükte görüntüleme ile çene üç boyutlu bir şekil (Şekil 2) ve konumunu ve yüklerin yerleştirme (Şekil 3) hem de yakalayan bir model oluşturmak mümkün olmuştur. Yüksek hızlı video yakalama keflfe in vivo değiştirmeler (Şekil 4) kullanarak biz modelde hareket açıklığı gerçekçi bir aralıkta olduğunu doğruladı. Run kez FE modelleri, stres (Şekil 5A), minimum ve maksimum asal gerinim (- K Şekil 5B) gibi veriler, bir dizi görüntülemek için kullanılabilir. Bu sonuçlar, üç loş<html> İlgili görünümleri (Şekil 5F, 5G, 5J, 5K) ve dijital (Şekil 5E kesitli &#39;, 5E&#39; &#39;5I&#39;, 5I elde etmek döndürülmüş böylece modeli detay ince desenleri (Şekil 5E, 5I) görmek için büyütülmüş olabilir boyutlu, &#39;&#39;) göstermek için nasıl bir model boyunca stres, gerginlik veya basınç değişikliği desenleri. Bu modelden nicel veri ayıklamak için de mümkündür (gösterilmemiştir). modeli doğrulamak ve şekli en doğru malzeme özellikleri, yükler kullanılarak ve örgü ile FE model geliştirme o pencereden sırasında hücreler tarafından yaşanan mekanik çevrenin en iyi tahmini keşfetmek için kullanılabilir. Modelin sonucu doğrudan hücresel davranış ve gen 20 değişikliklere karşılaştırılabilir. <html> 1 re &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54811 / 54811fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1:. 5 dpf&#39;e zebrabalıkları alt çene iskelet elemanlarının Temsilcisi görüntüleri 5dpf larvalarının alt çenenin Temsilcisi konfokal yığınları tüm iskelet miyozinin lekeleri A4.1025 için immün top anterior (A) (B) ile gösterilen transgenik gazetecilere col2a1 ifade eden bir canlı larva tüm kıkırdak (C) Stack işaretler Tip II kollajen için immün: GFP yavaş kas (yeşil): mCherry kıkırdak (kırmızı) ve smyhc işaretleme. IA: intermandibularis ön PH: iletki hyoideus, AM: adduktor mandibula&#39;nın, Havai: hyoideus aşağı, Havai: hyoideus üstün, CH: sternohyoideus MC: Meckel kıkırdağı, PQ: Palatoquadrate, CH:. Ceratohyal <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig1large.jpg" target="_blank">görmek için lütfen buraya tıklayınız daha büyük bir versiyonu bu rakamın.</a> &quot;Fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig2.jpg" /> Şekil 2: konfokal verilerden 3B yüzey Nesil ortak bölgenin yüksek büyütme ile Zebra balığı alt çene için 3 boyutlu yüzey içine konfokal veri geçişi gösteren görüntüler.. (A) Ham konfokal veri; (B) bir Gauss filtresinin uygulanması sonrasında Veri kümesi; (C) Filtreli anahat; (D) 3 boyutlu yüzey. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54811/54811fig3.jpg" /> Şekil 3: kısıtları ve kuvvet vektörleri gösteren temsili kafes (A) ağız kapama ve bir 5 dpf larva Temsilcisi kafes.(B) ağız açıklığı. Beyaz noktalar modeli kısıtlıdır yerleri belirtmek ve hangi ölçüler (örneğin, x ve y veya x, y ve z). Beyaz çizgiler beyaz oklarla gösterilen kas kuvveti vektörü ile, kas pozisyonları ifade etmektedir. Kırmızı kıkırdak gösterir ve sarı interzone. Bu rakam daha önce Brunt ve ark., 15 yılında yayınlanan ek malzemeden modifiye edilmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54811/54811fig4.jpg" /> Şekil 4:. Duyarlılık testi farklı kıkırdak ve interzone Young modüllerine için 5dpf Zebra balığı çene deplasman simüle FE-modeli. çene işaretlenir (um kapalı açık) yer değiştirmesini çene; renk anahtarı kullanılarak kaydedildi. Her model (A - L) kıkırdak farklı bir kombinasyon (c = 1.1, 3.1 ya da 6.1 MPa) ya da interzone (0.25 i = 0.5, 0.75, veya 1 Mpa) özelliklere sahiptir. Yatay siyah ok (dikey siyah okla temsil edilen) Meckel kıkırdağı ucundaki çene deplasman değerini vurgulamaktadır. M ve N larva gösteren asgari dpf&#39;e 5 videolardan fotoğraflar, yani çene (M) kapalı ve maksimum, yani çene üst üste iki ile (K) tam açık (O) - O beyaz çizgi (43 mikron) yer değiştirmesini ifade eder. Değiştirmeler canlı balık görülen 0.25 (A) en iyi maç bir Interzone ile 1.1 Bu durumda göreceli kıkırdak özelliklerinde (O). AL bu rakamın paneller daha önce Brunt et al., 15 yayınlanmıştır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig4large.jpg" target="_blank">Daha büyük bir vers görmek için buraya tıklayınız</a>Bu rakamın iyon. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54811/54811fig5.jpg" /> Şekil 5: FE modelleri Temsilcisi veri larva dpf bir 5&#39;te uygulanan tüm kasların FE-modeli simülasyon (A - C).. (A) Von Mises (EMaxmin) (B) Asgari Anapara suş (E Min. P, μɛ) (C) Maksimum asıl suş (E Max. P., μɛ). çene açılması sırasında maksimum ve minimum temel suşlar FE model simülasyonu. (D - K): Maksimum asıl suş (. E Max P., μɛ) (D) ventral çene görünümü ve (E), ventral eklem görünümü (E) Meckel kıkırdağı ile proksimal-distal bölümlerinin yerini göstermektedir eklem ve interzone (E &#39;) ve (E&#39;) &#39;de, sırasıyla,. (F): Lateralgörünümü çene. (G): Lateral eklem görünümü. (H - K): Minimum Anapara suş (. E Min P, μɛ) (H) ventral çene görünümü ve (I), ventral eklem görünümü. (I) Meckel kıkırdak eklem içinden proksimal-distal bölümlerinin yerini göstermektedir ve (I &#39;) ve (I&#39; &#39;) sırasıyla, (J) interzone: Yanal çene görünümü. (K): Lateral eklem görünümü. Bu rakam daha önce Brunt et al. 15 yayımlanarak yürürlüğe girmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Kas liflerinin sayısı </td><td> Kas liflerinin alanı (mikron 2) </td><td> Kas grubu alanı (mikron2) </td><td> Kuvvet (N) </td></tr><tr><td> 5 dpf intermandibularis ön </td><td> 5 </td><td> 23.8 </td><td> 119 </td><td> 4.76e-6 </td></tr><tr><td> 5 dpf iletki hyoideus </td><td> 6 </td><td> 23.8 </td><td> 142.8 </td><td> 5.71e-6 </td></tr><tr><td> 5 dpf Adduktor mandibula&#39;nın </td><td> 9 </td><td> 23.8 </td><td> 214.2 </td><td> 8.57e-6 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Kas ölçümü. 40 NN / mikron 2 (referans 17 alınan birim alan başına değeri) kullanılarak dpf&#39;e 5 ° Intermandibularis Anterior, Adduktör Mandibulae ve İletki Hyoideus için ortalama kas kuvvetleri hesaplanmıştır. (Lorga ve diğ., 2011) (n = 3).

Watch this Scientific Journal Video about Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics at JoVE.com

Zebra Balığı Çene Biyomekaniğini Araştırmak İçin Sonlu Eleman Modelleri Oluşturmak | Gelişim Biyolojisi | Video

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Finite Element Analysis is a frequently used tool to investigate the mechanical performance of structures under load. Here we apply its use to modeling the biomechanics of the zebrafish jaw.

Zebra balığı Çeneli Biyomekanik Araştırma Sonlu Elemanlar Modelleri Bina

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

building-finite-element-models-to-investigate-zebrafish-jaw

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Developmental Biology

Human Biology

Musculoskeletal System

SCIENTISTS IN ACTION

9.1K Görüntüleme.  University of Bristol. Finite Element Analysis is a frequently used tool to investigate the mechanical performance of structures under load. Here we apply its use to modeling the biomechanics of the zebrafish jaw. 

Video: Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Zebra balığı Embriyo microbead İmplantasyonu

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Gelişim Biyolojisi

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many myopathies affecting skeletal muscle function can be quickly and easily assessed in zebrafish over the first few days of embryogenesis. By 24 hr post-fertilization (hpf), wildtype zebrafish spontaneously contract their tail muscles and by 48 hpf, zebrafish exhibit controlled swimming behaviors. Reduction in the frequency of, or other alterations in, these movements may indicate a skeletal muscle dysfunction. To analyze swimming behavior and assess muscle performance in early zebrafish development, we utilize both touch-evoked escape response and locomotion assays.
Touch-evoked escape response assays can be used to assess muscle performance during short burst movements resulting from contraction of fast-twitch muscle fibers. In response to an external stimulus, which in this case is a tap on the head, wildtype zebrafish at 2 days post-fertilization (dpf) typically exhibit a powerful burst swim, accompanied by sharp turns. Our method quantifies skeletal muscle function by measuring the maximum acceleration during a burst swimming motion, the acceleration being directly proportional to the force produced by muscle contraction.
In contrast, locomotion assays during early zebrafish larval development are used to assess muscle performance during sustained periods of muscle activity. Using a tracking system to monitor swimming behavior, we obtain an automated calculation of the frequency of activity and distance in 6-day old zebrafish, reflective of their skeletal muscle function. Measurements of swimming performance are valuable for phenotypic assessment of disease models and high-throughput screening of mutations or chemical treatments affecting skeletal muscle function.

Zebrafish are an excellent model to study muscle function and disease. During early embryogenesis zebrafish begin regular muscle contractions producing rhythmic swimming behavior, which is altered when the muscle is disrupted. Here we describe a touch-evoked response and locomotion assay to examine swimming performance as a measure of muscle function.

Dokunmatik uyarılmış Yanıt ve Hareket Deneyleri kullanarak Zebra balığı kas Performans ve fonksiyonunu değerlendirmek için

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be difficult to study, and can lead to confounding results. The protocol described here is a straightforward breeding paradigm to increase and decrease penetrance in lethal zebrafish skeletal mutants. Because lethal mutants cannot be selectively bred directly, the classic selective breeding strategy of progeny testing is employed. This method also includes protocols for Kompetitive Allele Specific PCR (KASP) genotyping zebrafish and staining larval zebrafish cartilage and bone. Applying the husbandry strategy described here can increase the penetrance of an interesting skeletal phenotype enabling more reproducible results in downstream applications. In addition, decreasing the mutant penetrance through this selective breeding strategy can reveal the developmental processes that most crucially require the function of the mutated gene. While the skeleton is specifically considered here, we propose that this methodology will be useful for all zebrafish mutant lines.

The goal of this protocol is to alter the penetrance of lethal skeletal mutant phenotypes in zebrafish by selective breeding. Lethal mutants cannot be grown to adulthood and bred themselves, therefore this protocol describes a method for tracking and selecting penetrance through multiple generations by progeny testing.

Zebra balığı öldürücü iskelet Mutant alellerle test döl tarafından değişen

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

Kemik doku Yenileyici prednizolon etkilerini incelemek için yetişkin zebra balığı yaralanma modelleri

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians. The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal pair and a longer maxillary pair. Barbel tissue contains cells of ectodermal, mesodermal and neural crest origin, including skin cells, glands, taste buds, melanocytes, circulatory vessels and sensory nerves. Unlike most adult tissue, the maxillary barbel is optically clear, allowing us to visualize the development and maintenance of these tissue types throughout the life cycle. 
This video shows early development of the maxillary barbel (beginning approximately one month post-fertilization) and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration in the adult appendage (&gt;3 months post-fertilization). Briefly, the left maxillary barbel of an anesthetized fish is elevated with sterile forceps just distal to the caudal edge of the maxilla. A fine, sterile spring scissors is positioned against the forceps to cut the barbel shaft at this level, establishing an anatomical landmark for the amputation plane. Regenerative growth can be measured with respect to this plane, and in comparison to the contralateral barbel. Barbel tissue regenerates rapidly, reaching maximal regrowth within 2 weeks of injury.
Techniques for analyzing the regenerated barbel include dissecting and embedding matched pairs of barbels (regenerate and control) in the wells of a standard DNA electrophoresis gel. Embedded specimens are conveniently photographed under a stereomicroscope for gross morphology and morphometry, and can be stored for weeks prior to downstream applications such as paraffin histology, cryosectioning, and/or whole mount immunohistochemistry. These methods establish the maxillary barbel as a novel in vivo tissue system for studying the regenerative capacity of multiple cell types within the genetic context of zebrafish.

The zebrafish maxillary barbel is an integumentary sense organ containing ectodermal, mesodermal and neural crest derivatives. Importantly, the adult barbel can regenerate after proximal amputation. This video introduces maxillary barbel development and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration, followed by collection, embedding and downstream imaging of barbel specimens.

Zebra balığı Maksiller Bärbel Çalışma Yöntemleri

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians.  The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal ...

Biyoloji

Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish with fluorescently-marked plasma membranes can be scanned in a confocal laser scanning microscope in order to determine the volume of muscle tissue and the number of muscle fibers present. Efficient approaches for the measurement of cell number and size in live animals over time are described and validated against more arduous segmentation methods. Methods are described that permit the control of muscle electrical, and thus contractile, activity. Loss of skeletal muscle contractile activity greatly reduced muscle growth. In larvae, a protocol is described that allows reintroduction of patterned electrical-evoked contractile activity. The described methods minimize the effect of inter-individual variability and will permit analysis of the effect of electrical, genetic, drug, or environmental stimuli on a variety of cellular and physiological growth parameters in the context of the living organism. Long-term follow-up of the measured effects of a defined early-life intervention on individuals can subsequently be performed.

Optical clarity is a major advantage for cell biological and physiological work in zebrafish. Robust methods for measurement of cell growth in individual animals are described that permit novel insights into how growth of skeletal muscle and neighboring tissues are integrated with whole body growth.

Değiştirilmiş elektriksel aktiviteye maruz kalan bireysel canlı zebra balıklarında iskelet kası büyümesinin gerçek zamanlı ve tekrarlanan ölçümü

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish ...

<meta charset="utf8"></head><body>Kültür ve Kemik Biyolojisi Çalışmaları için Zebra Balığı Pullarının Çıkarılması

In Vitro Culturing Technique for Studying Cellular Dynamics in Zebrafish Scales

Zebrafish scales offer a variety of advantages for use in standard laboratories for teaching and research purposes. Scales are easily collected without the need for euthanasia, regenerate within a couple of weeks, and are translucent and small, allowing them to be viewed using a standard microscope. Zebrafish scales are especially useful in educational environments, as they provide a unique opportunity for students to engage in hands-on learning experiences, particularly in understanding cellular dynamics and in vitro culturing methods. The main objective of this protocol is to describe a method for collecting and maintaining zebrafish scales in culture for use in a variety of biological studies using basic laboratory equipment. Additionally, the protocol details their use in understanding bone homeostasis by examining the activity of bone cells involved in bone resorption and deposition. It also includes additional protocols for general techniques, such as the visualization of nuclei and apoptotic cells. The in vitro culturing protocol produces reliable results with minimal reagents and equipment. This article discusses the benefits of using in vitro cultures of zebrafish scales to foster scientific inquiry and outlines the resources needed to support their integration into educational settings.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Zebra Balığı Pulları ile Kemik Hücresi Aktivitesi Araştırmasını Geliştirme

This protocol offers a method to study cellular dynamics using a simple in vitro culture technique. It provides an opportunity for zebrafish researchers and educators to study cellular processes, such as those related to bone homeostasis and basic cell biology, by visualizing fluorescent nuclei and apoptotic cells within the scales.

Zebra Balığı Ölçeklerinde Hücresel Dinamikleri İncelemek için İn Vitro Kültür Tekniği

Zebrafish scales offer a variety of advantages for use in standard laboratories for teaching and research purposes. Scales are easily collected without ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

4D konfokal mikroskopi kullanılarak Zebra balığı Kranyofasiyel morfogenez Analizi

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Zebra balığı Çeneli Biyomekanik Araştırma Sonlu Elemanlar Modelleri Bina

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Zebra balığı Embriyo microbead İmplantasyonu

Dokunmatik uyarılmış Yanıt ve Hareket Deneyleri kullanarak Zebra balığı kas Performans ve fonksiyonunu değerlendirmek için

Zebra balığı öldürücü iskelet Mutant alellerle test döl tarafından değişen

Kemik doku Yenileyici prednizolon etkilerini incelemek için yetişkin zebra balığı yaralanma modelleri

Zebra balığı Maksiller Bärbel Çalışma Yöntemleri

Değiştirilmiş elektriksel aktiviteye maruz kalan bireysel canlı zebra balıklarında iskelet kası büyümesinin gerçek zamanlı ve tekrarlanan ölçümü

Zebra Balığı Ölçeklerinde Hücresel Dinamikleri İncelemek için İn Vitro Kültür Tekniği

Zebra Balığı Ölçeklerinde Hücresel Dinamikleri İncelemek için İn Vitro Kültür Tekniği

Zebra Balığı Ölçeklerinde Hücresel Dinamikleri İncelemek için İn Vitro Kültür Tekniği

4D konfokal mikroskopi kullanılarak Zebra balığı Kranyofasiyel morfogenez Analizi