Name: building finite element models to investigate zebrafish jaw biomechanics
Uploaded: 2016-12-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics at JoVE.com

LHB è stato finanziato dal programma di dottorato cellulare Wellcome Trust dinamico; KAR è stata finanziata dal MRC progetto di sovvenzione MR / L002566 / 1 (assegnato a EJR e CLH) e CLH è stato finanziato da Aruk concessione 19479. Vorremmo anche ringraziare l&#39;impianto Wolfson Bioimmagini per un consiglio di imaging.

Tutti i passaggi all&#39;interno del protocollo seguono l&#39;Università di cura degli animali di Bristol e le linee guida di assistenza sociale e quelli del Regno Unito Home Office. 1. Visualizzazione muscoloscheletrico Anatomia NOTA: per visualizzare la forma degli elementi scheletrici, per quantificare muscolare e per identificare l&#39;esatto posizionamento delle inserzioni muscolari, immunostain (punto 1.1) pesci all&#39;età appropriata per miosina scheletrica (che rivela muscolare) e collagene di tipo II (per visualizzare cartilagine). In alternativa, visualizzare l&#39;anatomia muscolo-scheletrico utilizzando linee transgeniche reporter fluorescente, come il collagene A1 giornalista COL2A1: mCherry 13,14 di visualizzare la cartilagine e il lento miosina catena pesante giornalista smyhc: GFP 15 per visualizzare la posizione delle inserzioni muscolari (sezione 1.2). linee alternative che segnano cartilagine e muscolo potrebbe funzionare altrettanto bene. <ol><li> fluorescente Immunostavorazio <ol><li> Fix larva superiore 4% paraformaldeide (PFA) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per 1 ora. Lavare in PBS con 0,1% Tween 20 (PBT) e disidratare in metanolo al 50% (MeOH) in PBT e 100% MeOH per 5 min, rispettivamente. Attenzione: PFA è tossico e deve essere maneggiato secondo il foglio di materiale di sicurezza. NOTA: Larva può essere immagazzinato in 100% MeOH fino all&#39;utilizzo. </li><li> Reidratare larva nel 50% MeOH in PBT per 5 min. Lavare in PBT per 5 min. </li><li> Permeabilize larva a 0,25% tripsina in PBT in ghiaccio per 5-6 min. Lavare a 4x PBT per 5 minuti ciascuna. </li><li> Bloccare per 2-3 ore a 5% di siero in PBT. </li><li> Incubare larva nella diluizione raccomandata di coniglio anti-collagene di tipo 2 e mouse anticorpi anti-miosina in 5% di siero in PBT per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. NOTA: L&#39;intervallo di diluizione raccomandata è normalmente sulla scheda tecnica degli anticorpi. Scegli anticorpi che vengono sollevate contro le specie diverse tra loro e che sono anche diffenoleggiare al tessuto. </li><li> Lavare 6x larva per 15 minuti in PBT. </li><li> Bloccare per 1-2 ore a 5% di siero in PBT. </li><li> Incubare in anticorpi secondari nel buio. Utilizzare fluorescente anti-topo (550) e anti-coniglio (488) anticorpi secondari ad una diluizione appropriata in 5% di siero e PBT per l&#39;anticorpo specifico. </li><li> Lavare 6X per 10 minuti ciascuno in PBT e immagine su un microscopio confocale 10 volte il più presto possibile. </li></ol></li><li> Imaging muscoloscheletrico Geometria <ol><li> Montare le larve ventrale su un vetrino in condizioni di scarsa agarosio tiepida 0,3-0,5% punto di fusione (LMP) in soluzione di Danieau 16. NOTA: i pesci transgenici dovrà essere sedato a 0,02% MS222 (Tricaine metanosolfonato, pH 7) prima del montaggio e durante l&#39;imaging. </li><li> Prendete una immagine Pila confocale della regione di interesse utilizzando il 10X lente dell&#39;obiettivo e lo zoom digitale di circa 2,5 volte. Preparare le immagini del canale verde e rosso con il 488 nm e 561 nm Laser rispettivamente. Immagine ad una risoluzione pixel 512 x 512 con un intervallo tra z piani di 1,3 micron e 3 medie linea. Lo stack risultante sarà composta da circa 100 fette z. </li><li> Esportare i dati come una serie tiff. Proiezioni massime degli elementi muscolari e cartilagine da una larva zebrafish 5dpf sono mostrati in Figura 1. </li></ol></li></ol> 2. Creazione di una superficie 3D <ol style="margin-left: 40px;"><li> Scegliere un set di dati rappresentante per ogni punto di tempo a 3, 4 e 5 dpf (scegliere dopo la visualizzazione di campioni multipli). </li><li> Aprire pila tiff 3-dimensionale e selezionare tutti i canali di software di analisi. Fare clic destro sul canale cartilagine e selezionare il filtro immagine e levigante: gaussiana (Figura 2B). </li><li> In vista del progetto tasto destro del mouse sull&#39;immagine filtrata e selezionare &#39;segmentazione&#39; e poi &#39;editare nuova etichetta&#39;. Creare una nuova etichetta per ogni materiale, vale a dire, cartilagine e jmisto. Selezionare la regione cartilagine dell&#39;immagine (Figura 2C, il segnale bianco, contorno viola) utilizzando lo strumento bacchetta magica. Utilizzare lo strumento pennello per rimuovere il rumore dagli schemi. NOTA: Se si utilizza strumento bacchetta magica, clicca su &#39;Tutte le sezioni. </li><li> Selezionare la regione congiunta con lo strumento pennello e assegnare a un componente comune (Figura 2C, blu contorno) </li><li> Smooth più sezioni contemporaneamente selezionando la segmentazione nel menu in alto e le etichette lisce. Fare clic destro sull&#39;immagine e selezionate generare superfici per produrre un rendering 3D di superficie del componente (Figura 2D). </li><li> Fare clic sulla superficie e salvare i dati come file hmascii per l&#39;importazione in software meshing. </li></ol> 3. Calcolo delle forze muscolari per essere utilizzati nel modello FE <ol style="margin-left: 40px;"><li> Contare il numero di fibre muscolari da immagini confocale di smyhc: GFP zebrafish transgenico (Figura 1A, punta di freccia, 1C) e misurare il diametroeter delle fibre per calcolare la loro area di sezione trasversale (πr 2). </li><li> Identificare adatto forza per unità di area muscolare dalla letteratura. La forza muscolare massima generata per unità di superficie per i muscoli scheletrici zebrafish larvali (40 nN / micron 2) sono stati utilizzati 17. </li><li> Calcolare le forze per ogni gruppo muscolare anatomica moltiplicando il numero di fibre e la loro area dalla forza per unità di superficie. Vedere la Tabella 1. </li></ol> 4. Generazione di una Mesh <ol style="margin-left: 40px;"><li> Importare il modello 3D generato nella sezione 2 (sopra) in un pacchetto software in grado di generare una mesh di elementi finiti. </li><li> Genera A2D maglie della cartilagine e superfici articolari tramite funzione termoretraibile nel menu 2D. Scegli una dimensione di elemento appropriato. Nota: utilizzare una dimensione elemento tra 1,5-2,5. Se necessario, generare una serie di superficie 2D in modo diverso dimensioni maglie di effettuare l&#39;ottimizzazione mesh 3D (sezione 4.4). </li><li> Effettuare controlli di qualità maglia trovati sotto &#39;2D&gt; Strumenti&gt; Controlla gli elementi&#39; pannello per verificare la presenza di elementi duplicati, inserzioni e degli attraversamenti di mesh. Fissare angoli diedri utilizzando la scheda di utilità nella struttura ad albero modello. </li><li> Generare una mesh 3D da maglie di superficie 2D di diverse dimensioni dell&#39;elemento utilizzando il pannello secondario 3D&gt; Tetramesh. NOTA: Confrontare i risultati di diverse dimensioni di maglia e selezionare il modello FE con la dimensione di maglia più bassa che converge dopo ulteriori simulazioni e non comprometta la definizione caratteristica. L&#39;esempio in figura 3 contiene 1,5 milioni di elementi tetraedrici per le cartilagini mascella inferiore e aveva una dimensione di elemento 2D di 2,0. </li><li> Trasformare la rete in modo mascella modello è in scala, come per ogni stack confocale utilizzando la geometria&gt; Distanza pannello secondario. NOTA: Assicurarsi che la cartilagine e componenti comuni sono collegati nel modello esportando un modello di fusione o utilizzando legami. </li></ol> 5. Finite Element ModEL costruzione <ol><li> Utilizzando il software commerciale ad elementi finiti (FE), creare un modello FE. Usando il muscolo 3D e cartilagine etichettati pile confocale generati nella sezione 1 come guida, assegnare nodi che corrispondono ai punti di attacco muscolare. Creare un vettore tra due nodi che rappresentano l&#39;origine e l&#39;inserimento di ciascun muscolo (Figura 3). </li><li> Creare un collezionista carico di tipo &#39;storia&#39; di applicare un &#39;carico C&#39; per ogni muscolo. Specificare la grandezza in newton (calcolati in fase 3.3) e assegnare il vettore associato. La figura 3 mostra i punti di fissaggio per il mandibulae adduttore (AM), goniometro hyoideus (PH) e intermandibularis (IM). NOTA: Per questi muscoli della mascella, massima forza contrattile è distribuita tra l&#39;origine e l&#39;inserimento in modo che solo il 50% di ciascun carico viene applicato in ogni sito. </li><li> Assegnare opportune proprietà elastiche del materiale isotropo come determinato dalla letteratura. modulo di Young per la cartilaginee il Interzone in questo modello sono stati 1,1 MPa e 0,25 MPa, rispettivamente, e il rapporto di Poisson è stato 0,25 per entrambi 18,19. </li><li> Creare un collezionista carico di tipo &#39;di confine&#39; di applicare i vincoli iniziali sul modello. Vai alla scheda Analisi&gt; Vincoli e nel pannello secondario creare, raccogliere i nodi sul modello che si desidera limitare. Selezionare i gradi di libertà (DOF) che il movimento limite del modello per la migliore approssimazione della sua gamma di movimento naturale. NOTA: Il modello in figura 3 è vincolato in tutti gli assi di moto (DOF: 1, 2, 3 rappresentano x, y, z, rispettivamente) alla ceratohyal per ancorarlo nello spazio in un punto intermedio nel modello e nel assi yez nel punto in cui la palatoquadrate collega al resto del cranio zebrafish (Figura 3, Tabella 1). Il modello deve essere vincolato in tutti e tre DOF in almeno un nodo. </li><li> Creare un &#39;carico passo&#39;, per ogni tipo di movimento che si desidera simulate (cioè, apertura, chiusura), sotto il menu di analisi e selezionare tutti i carichi rilevanti (realizzati nella sezione 5.2) e dei vincoli (made in Sezione 5.4) per simulare questo movimento. Seleziona &#39;Static&#39; dal menu a tendina quando viene visualizzato. </li><li> modello di esportazione comprese le maglie, i carichi, i vincoli e le proprietà del materiale in un formato di file appropriato, in questo formato caso &quot;.inp&quot;. </li><li> Modello di carico in software di analisi FE. Creare ed eseguire un lavoro per il modello utilizzando il modulo di lavoro. </li><li> Analizzare l&#39;uscita per lo stress, affaticamento, spostamento, ecc trovato nei risultati scheda e il menu di visualizzazione (figura 4 e 5). </li></ol> 6. Validazione di Jaw Deformazione / Displacement Distanze <ol><li> Selezionare 3-6 Tg (Col2a1aBAC: mCherry) zebrafish transgenico. </li><li> Leggermente anestetizzare le larve con 0,02% MS222 fino a che non cessano di rispondere al tatto, ma i loro cuori sono ancora battendo. </li><li> Montarele larve lateralmente (mentre anestetizzato) su vetrini in tiepida 1% LMP agarosio (composto in soluzione di Danieau). </li><li> Rimuovere l&#39;agarosio dalla intorno alla testa e la mandibola con una pinza. </li><li> Lavare soluzione fresca di Danieau (senza MS222) sopra la testa della larva di rimuovere l&#39;anestesia con una pipetta Pasteur fino normali movimenti della bocca riprendere. </li><li> Utilizzare il software di acquisizione di film a prendere campo chiaro video ad alta velocità dei movimenti della bocca. Prendere i film di circa un minuto nella durata al massimo frame rate, o sufficiente per registrare più cicli di apertura della mascella. </li><li> Scegli fotogrammi che mostrano la mascella aperta al suo spostamento massimo. Misurare la distanza tra la punta anteriore della cartilagine di Meckel e la mascella superiore (punta della piastra ethmoid) in micron. </li><li> Calcolare la cilindrata media da più larve di pesci. </li><li> Estrarre i dati di spostamento dal modello. Utilizzare lo spostamento medio calcolato in 6.8 per verificare il comportamento dello spostamento del modello ( <strong&gt; Figura 4). Se il modello si discosta da aspettarsi, analisi di sensitività gestito alterando in sequenza le proprietà del materiale e dei carichi muscolari. </li></ol>

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	<li>Rayfield, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finite+Element+Analysis+and+Understanding+the+Biomechanics+and+Evolution+of+Living+and+Fossil+Organisms.">Finite Element Analysis and Understanding the Biomechanics and Evolution of Living and Fossil Organisms.</a> Annu. Rev. Earth Planet. Sci. 35, 541-576 (2007).</li><li>Rao, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Finite Element Method in Engineering: Fifth Edition. , (2010).</li><li>Taylor, M., Prendergast, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+decades+of+finite+element+analysis+of+orthopaedic+devices:+Where+are+we+now+and+what+are+the+opportunities.">Four decades of finite element analysis of orthopaedic devices: Where are we now and what are the opportunities.</a> J Biomech. 48, 767-778 (2015).</li><li>Button, D. J., Rayfield, E. J., Barrett, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+biomechanics+underpins+high+sauropod+diversity+in+resource-poor+environments.">Cranial biomechanics underpins high sauropod diversity in resource-poor environments.</a> Proc Royal Soc London B: Biol Sci. 281. 281, (2014).</li><li>Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+and+developmental+control.">Mechanobiology and developmental control.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 27-61 (2013).</li><li>Shwartz, Y., Farkas, Z., Stern, T., Aszodi, A., Zelzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+contraction+controls+skeletal+morphogenesis+through+regulation+of+chondrocyte+convergent+extension.">Muscle contraction controls skeletal morphogenesis through regulation of chondrocyte convergent extension.</a> Dev biol. 370, 154-163 (2012).</li><li>Rolfe, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mechanosensitive+genes+during+skeletal+development:+alteration+of+genes+associated+with+cytoskeletal+rearrangement+and+cell+signalling+pathways.">Identification of mechanosensitive genes during skeletal development: alteration of genes associated with cytoskeletal rearrangement and cell signalling pathways.</a> BMC genomics. 15, 48 (2014).</li><li>Roddy, K. A., Kelly, G. M., van Es, M. H., Murphy, P., Prendergast, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+patterns+of+mechanical+stimulation+co-localise+with+growth+and+cell+proliferation+during+morphogenesis+in+the+avian+embryonic+knee+joint.">Dynamic patterns of mechanical stimulation co-localise with growth and cell proliferation during morphogenesis in the avian embryonic knee joint.</a> J Biomech. 44, 143-149 (2011).</li><li>Haudenschild, D. R., Chen, J., Steklov, N., Lotz, M. K., D'Lima, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+chondrocyte+actin+cytoskeleton+in+living+three-dimensional+culture:+response+to+anabolic+and+catabolic+stimuli.">Characterization of the chondrocyte actin cytoskeleton in living three-dimensional culture: response to anabolic and catabolic stimuli.</a> Mol cell biomech. 6, 135-144 (2009).</li><li>Nowlan, N. C., Murphy, P., Prendergast, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+pattern+of+mechanical+stimulation+promotes+ossification+in+avian+embryonic+long+bones.">A dynamic pattern of mechanical stimulation promotes ossification in avian embryonic long bones.</a> J Biomech. 41, 249-258 (2008).</li><li>Giorgi, M., Carriero, A., Shefelbine, S. J., Nowlan, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiological+simulations+of+prenatal+joint+morphogenesis.">Mechanobiological simulations of prenatal joint morphogenesis.</a> J Biomech. 47, 989-995 (2014).</li><li>Heegaard, J. H., Beaupre, G. S., Carter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+modulated+cartilage+growth+may+regulate+joint+surface+morphogenesis.">Mechanically modulated cartilage growth may regulate joint surface morphogenesis.</a> J Ortho Res. 17, 509-517 (1999).</li><li>Hammond, C. L., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+populations+of+endochondral+osteoblasts+with+differential+sensitivity+to+Hedgehog+signalling.">Two populations of endochondral osteoblasts with differential sensitivity to Hedgehog signalling.</a> Development. 136, 3991-4000 (2009).</li><li>Mitchell, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+osteoarthritis+genetics+in+zebrafish.">New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish.</a> Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarth Res Soc. 21, 269-278 (2013).</li><li>Elworthy, S., Hargrave, M., Knight, R., Mebus, K., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+multiple+slow+myosin+heavy+chain+genes+reveals+a+diversity+of+zebrafish+slow+twitch+muscle+fibres+with+differing+requirements+for+Hedgehog+and+Prdm1+activity.">Expression of multiple slow myosin heavy chain genes reveals a diversity of zebrafish slow twitch muscle fibres with differing requirements for Hedgehog and Prdm1 activity.</a> Development. 135, 2115-2126 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Danieau's+solution+(30&#215;).">Danieau's solution (30&#215;).</a> Cold Spring Harb Prot. , (2011).</li><li>Iorga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromechanical+function+of+myofibrils+isolated+from+skeletal+and+cardiac+muscles+of+the+zebrafish.">Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish.</a> J Gen physiol. 137, 255-270 (2011).</li><li>Tanck, E., Blankevoort, L., Haaijman, A., Burger, E. H., Huiskes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+muscular+activity+on+local+mineralization+patterns+in+metatarsals+of+the+embryonic+mouse.">Influence of muscular activity on local mineralization patterns in metatarsals of the embryonic mouse.</a> J Ortho Res. 18, 613-619 (2000).</li><li>Tanck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+consequences+of+mineralization+in+embryonic+bone.">The mechanical consequences of mineralization in embryonic bone.</a> Bone. 35, 186-190 (2004).</li><li>Brunt, L. H., Norton, J. L., Bright, J. A., Rayfield, E. J., Hammond, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finite+element+modelling+predicts+changes+in+joint+shape+and+cell+behaviour+due+to+loss+of+muscle+strain+in+jaw+development.">Finite element modelling predicts changes in joint shape and cell behaviour due to loss of muscle strain in jaw development.</a> J Biomech. 48, 3112-3122 (2015).</li><li>Roddy, K. A., Prendergast, P. J., Murphy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+influences+on+morphogenesis+of+the+knee+joint+revealed+through+morphological,+molecular+and+computational+analysis+of+immobilised+embryos.">Mechanical influences on morphogenesis of the knee joint revealed through morphological, molecular and computational analysis of immobilised embryos.</a> PloS one. 6, e17526 (2011).</li><li>Cuff, A. R., Bright, J. A., Rayfield, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+experiments+on+finite+element+models+of+an+ostrich+(Struthio+camelus)+cranium.">Validation experiments on finite element models of an ostrich (Struthio camelus) cranium.</a> Peer J. 3, 1294 (2015).</li><li>Schilling, T. F., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Musculoskeletal+patterning+in+the+pharyngeal+segments+of+the+zebrafish+embryo.">Musculoskeletal patterning in the pharyngeal segments of the zebrafish embryo.</a> Development. 124, 2945-2960 (1997).</li><li>Dowthwaite, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+underlying+the+movement+requirement+for+synovial+joint+cavitation.">A mechanism underlying the movement requirement for synovial joint cavitation.</a> Matrix biol. 22, 311-322 (2003).</li><li>Nia, H. T., Han, L., Li, Y., Ortiz, C., Grodzinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poroelasticity+of+cartilage+at+the+nanoscale.">Poroelasticity of cartilage at the nanoscale.</a> Biophys J. 101, 2304-2313 (2011).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare. Alcuni dati delle figure 3-5 è stato ristampato da J.Biomech, 48 (12), Brunt et al., Elemento di modellazione Finite prevede cambiamenti di forma congiunta e il comportamento delle cellule a causa della perdita di tensione muscolare in fase di sviluppo della mascella, 3112-22. 2015, con il permesso di Elsevier 15.

Modelli ad elementi finiti sono stati utilizzati per collegare le aree di elementi scheletrici che sono sotto sforzo con quelli in fase di formazione ossea 10, così come per mappare le aree sotto sforzo durante encondrale e morfogenesi giunto 8,12,21. Altri studi sono stati anche in grado di applicare modelli di crescita teorici per replicare le modifiche durante lo sviluppo congiunto 11,12. Qui vi mostriamo il protocollo per la costruzione di modelli FE per un sistema relativamente semplice, la mascella zebrafish 20. A differenza dei metodi alternativi di raccolta immagini RAW per i modelli FE, come la TAC 22, l&#39;imaging confocale di linee transgeniche o zebrafish immunostained consente più tessuti da studiare. Si può, quindi, di fornire informazioni dirette sui punti di attacco muscolare in relazione alla cartilagine. Tra i modelli vertebrati zebrafish sono particolarmente suscettibili di manipolazione genetica e farmacologica. La generazione di modelli FE per zebrafishcartilagine craniofacciale ora apre la possibilità di un ulteriore studio della interazione tra biomeccanica e genetica nella morfogenesi congiunta. Ci sono un certo numero di fasi critiche del processo di creazione di un modello FE; il primo sta generando una accurata rappresentazione tridimensionale del sistema. Ciò richiede l&#39;imaging a una risoluzione abbastanza alta per definire chiaramente i confini. Si noti che anche con imaging ad alta risoluzione per fare una buona superficie di uno può avere per appianare alcune regioni. Un altro passo importante è la definizione del corretto posizionamento del carico e vincoli corretti. Un modello sufficientemente vincolato mancherà di risolvere e scorretto posizionamento dei carichi provoca movimenti anomali. Alcuni elaborazione dei dati grezzi (Figura 2) è necessario come superficie generata dai dati grezzi sarebbe difficile maglia (Figura 2B). Abbiamo filtrato i dati utilizzando un filtro gaussiano (Figura 2C </sTrong&gt;) e abbiamo effettuato alcune levigatura manuale delle curve per la produzione di una serie di linee pulite che può essere convertito in una superficie 3D. Troppo lisciatura può produrre una superficie &quot;fuso&quot; che ha perso molte delle sue caratteristiche. La scelta della dimensione di elemento corretto è un processo iterativo come la scelta troppo piccola una dimensione elemento crea troppo grande una maglia che è computazionalmente intensive. Tuttavia, la scelta troppo grandi dimensioni elemento produrrà una maglia che non riesce ricapitolare la corretta forma della struttura. La maglia corretta aveva la dimensione più piccolo elemento che ha catturato la corretta forma della mascella e convergenti su una soluzione corretta, verificata utilizzando lo spostamento della mascella. Può anche essere necessario modificare le proprietà del materiale o calcoli del carico di emulare meglio lo spostamento corretto come diverse età e specie avranno sostanzialmente diverse proprietà. È importante ricordare che ci sono sempre limitazioni un modello ipotetico essumptions fatto per i modelli FE. Quando solo modellare uno o un piccolo numero di campioni è fondamentale per garantire che un campione rappresentativo viene scelto come ci saranno probabilmente piccole variazioni tra gli individui. Poiché solo alcuni degli elementi a ganascia e muscoli sono stati inclusi, il modello è una versione semplificata del sistema muscolo-scheletrico craniofacciale zebrafish. Pertanto, i vincoli dovevano essere posizionato per spiegare dove gli elementi a ganascia modellati sarebbero collegarsi con il resto del cranio e il modello fu artificialmente vincolate al centro per fissarlo in &#39;spazio&#39;. Questo vincolo artificiale non ha impatto sull&#39;interpretazione disegnato dai modelli come il ceratohyal in sé non è stato analizzato. L&#39;inclusione di più della struttura cranio-facciale, in particolare altri apertura della mascella muscoli come i sternohyals e la sua cartilagine allegato 23, potuto aggiungere al modello, ma le limitazioni includono la capacità di modelli più grandi per l&#39;esecuzione del software degli elementi finiti. s = &quot;jove_content&quot;&gt; Un&#39;altra limitazione è che non abbiamo modellato inserimento legamento, anche se ciò potrebbe essere ottenuto mediante l&#39;inserimento di molle 8. Un&#39;altra ipotesi fatte in questo caso era che il modello sarebbe comportato linearmente. Le grandezze dei ceppi sui modelli erano paragonabili a quelle di modelli pubblicati e applicati alle cellule 10,24 in vitro, con ceppi di essere al di sotto di 3500 e sopra -5.000 μɛ parte di vincolo e di attacco muscolare punti. Pertanto, i ceppi alle regioni rilevanti del modello sono state considerate all&#39;interno di un range accettabile per un modello lineare. La cartilagine non si comporta esclusivamente come materia lineare ed è stata precedentemente modellato come un materiale poroelastic, che ha permesso l&#39;analisi del comportamento del fluido nel modello 25. Diffusione i punti di attacco muscolare tra un gruppo di nodi locali avrebbe distribuito le forze di picco e rappresentano più accuratamente l&#39;inserzione muscolo per alcuni muscoli. ent &quot;&gt; L&#39;utilizzo di FE consente una valutazione delle tensioni e sollecitazioni che agiscono su una struttura. Come tecnica è spesso utilizzato in molte discipline bioscienze tra cui ortopedia, paleontologia e, più recentemente, la biologia dello sviluppo. Qui si descrive come costruire FE per il pesce zebra mascella inferiore. in futuro questi modelli potrebbe essere esteso a guardare il corpo della mandibola, compreso il palato. tecniche simili potrebbero essere utilizzate per modellare biomeccanica della colonna vertebrale nei pesci, che fino ad oggi sono in gran parte stati studiati con mezzi cinematici.

Finite Element (FE) modellazione è una tecnica di ingegneria che può computazionalmente calcolare e mappare la grandezza e la posizione di ceppi che agiscono su una struttura di 1. Il modello consiste della struttura 3D, rappresentato da una maglia di &quot;Elementi finiti&quot;, e il risultato finale dell&#39;analisi è governata da una serie di fattori, tra cui la struttura e il numero di elementi della rete, l&#39;entità e la posizione del meccanico carichi e le proprietà del materiale. Le proprietà del materiale descrivono alcuni aspetti del comportamento di un materiale in una determinata tipologia di carico; modulo di Young (E) descrive l&#39;elasticità del materiale mentre il rapporto di Poisson descrive la diminuzione proporzionale alla larghezza di un materiale di sua lunghezza quando un campione viene allungato. FE modellazione può essere usato per calcolare una serie di variabili incluso lo spostamento, lo stress, la pressione e la tensione che agisce sul modello tenendo conto dei dati di ingresso unici sulla struttura &#39;; S forma, la posizione e la grandezza dei carichi e le proprietà dei materiali specifici. FE modellazione è ampiamente utilizzato in ingegneria 2 e sempre per ortopedici 3 e paleontologici applicazioni 4. Nello sviluppo forze biomeccaniche sono noti per agire come stimolo in molte cellule di attivare risposte cellulari 5-8 ed è utile per prevedere entrambe le posizioni relative e grandezze di stimoli meccanici all&#39;interno sviluppare sistemi di organi, tuttavia, attualmente FE modellazione è stato poco usato per lo sviluppo di zebrafish. Sia la cartilagine e ossa hanno dimostrato di essere i materiali meccanosensibili. Ad esempio, la compressione in vitro è stato trovato per attivare percorsi condrogeniche, mentre la tensione ha dimostrato di essere necessario per la formazione ossea 9. FE analisi (FEA) è stata sfruttata per modellare ceppi agendo su campioni biologici, compresi quelli che agiscono sugli elementi scheletrici durante l&#39;osso FOrmazioni 10. Altre applicazioni di sviluppo includono il suo uso per prevedere la forma di un giunto dopo che è stato esposto a forze biomeccaniche teorici 11,12 e per mostrare il modello di ceppi presenti durante pulcino ginocchio morfogenesi giunto 8. Questo protocollo ha lo scopo di condividere l&#39;esperienza di generare superfici 3-dimensionale, maglie e modelli ad elementi finiti dalle immagini confocali al fine di comprendere i meccanismi di tessuti in via di sviluppo. Mostriamo anche modi di validazione dei modelli FE se l&#39;acquisizione di informazioni reale spostamento giunto in vivo. Mentre usiamo mascella zebrafish come esemplare le stesse tecniche possono essere utilizzati su qualsiasi piccola sistema biologico per il quale le informazioni 3D sulla struttura del locomotore può essere ottenuta tramite microscopia confocale o multiphoton.

<table><tbody><tr><td>Coll2</td><td>Abcam</td><td>ab34712</td><td>Type II collagen antibody - stains all cartilage</td></tr><tr><td>A4.1025 / MF20</td><td>Developmental studies hybridoma bank</td><td>A4.1025</td><td>Skeletal mysoin antibody - marks all skeletal muscle&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Low melt agarose</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>A9414-5G</td><td>For mounting zebrafish</td></tr><tr><td>MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate )</td><td>Sigma</td><td>E10521-10G</td><td>To make anesthetic</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Fisher</td><td>T/3760/48</td><td>sample permeablilisation</td></tr><tr><td>Dylight 488 Mouse IgG</td><td>Thermofisher</td><td>35502</td><td>Secondary antibody</td></tr><tr><td>Dylight 550 Rabbit IgG</td><td>Thermofisher&amp;nbsp;</td><td>84541</td><td>Secondary antibody</td></tr><tr><td>SP8/SP5 or SPE confocal</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td></td><td>For imaging&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LAS Leica capture software</td><td>Leica</td><td></td><td>Imaging software</td></tr><tr><td>Aviso (version 7.0.0)</td><td>FEI Visualization Science Group</td><td></td><td>3D image analysis software (Section 2)</td></tr><tr><td>Hypermesh part of the Hyperworks package (version 10)</td><td>Altair Engineering</td><td></td><td>FE model generating software (Section 4-5)</td></tr><tr><td>Abaqus (version 6.14)</td><td>SIMULIA</td><td></td><td>FE analysis software (Section 5.7-5.8)</td></tr></tbody></table>

building finite element models to investigate zebrafish jaw biomechanics

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical strain. Skeletal joints are subjected to dynamic mechanical loading. Finite element analysis (FEA) is a computational method, frequently used in engineering that can predict how a material or structure will respond to mechanical input. By dividing a whole system (in this case the zebrafish jaw skeleton) into a mesh of smaller 'finite elements', FEA can be used to calculate the mechanical response of the structure to external loads. The results can be visualized in many ways including as a 'heat map' showing the position of maximum and minimum principal strains (a positive principal strain indicates tension while a negative indicates compression. The maximum and minimum refer the largest and smallest strain). These can be used to identify which regions of the jaw and therefore which cells are likely to be under particularly high tensional or compressional loads during jaw movement and can therefore be used to identify relationships between mechanical strain and cell behavior. This protocol describes the steps to generate Finite Element models from confocal image data on the musculoskeletal system, using the zebrafish lower jaw as a practical example. The protocol leads the reader through a series of steps: 1) staining of the musculoskeletal components, 2) imaging the musculoskeletal components, 3) building a 3 dimensional (3D) surface, 4) generating a mesh of Finite Elements, 5) solving the FEA and finally 6) validating the results by comparison to real displacements seen in movements of the fish jaw.

Immunocolorazione per il muscolo (Figura 1A) e della cartilagine (Figura 1B) o imaging reporter transgenici (Figura 1C) consente alla struttura 3D della mandibola da visualizzare, insieme alla muscolatura associata. Con immagini ad alta risoluzione è stato possibile costruire un modello che cattura sia la forma tridimensionale della mandibola (Figura 2) e la posizione e la disposizione dei carichi (figura 3). Utilizzando in spostamenti vivo visto attraverso la cattura di video ad alta velocità (Figura 4) abbiamo verificato che la gamma di movimento nel modello era all&#39;interno di una gamma realistica. I modelli FE volta corsa può essere utilizzato per visualizzare una serie di dati, come ad esempio lo stress (Figura 5A), minima e massima deformazione principale (Figura 5B - K). Questi risultati sono tre-dim<html> ensional in modo che il modello può essere ingrandita a vedere i modelli sottili di dettaglio (Figura 5E, 5I) ruotato per ottenere i pareri (Figura 5F, 5G, 5J, 5K) e in digitale sezionati (Figura 5E &#39;, 5E&#39; &#39;, 5I&#39;, 5I &#39;&#39;) per mostrare come i modelli di stress, tensione o variazione di pressione in tutto il modello. È anche possibile estrarre dati quantitativi dal modello (non mostrato). Verificando il modello e utilizzando le più accurate proprietà del materiale, carichi e mesh forma il modello FE può essere utilizzato per esplorare la migliore stima dell &#39;ambiente meccanico viene sperimentato da cellule durante quella finestra di sviluppo. I risultati del modello sono direttamente confrontabili ai cambiamenti nel comportamento cellulare e l&#39;espressione genica 20. <html> re 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54811 / 54811fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1:. Immagini rappresentative degli elementi muscolo-scheletrici del pesce zebra mascella inferiore a 5 dpf pile confocale rappresentativi della mandibola di larve 5dpf tutto mostrato con anteriore in alto (A) immunocolorazione per A4.1025 che colora tutta la miosina scheletrica (B) immunocolorazione per il collagene di tipo II che segna tutta la cartilagine (C) Pila da una larva dal vivo che esprime i giornalisti transgenici COL2A1: mCherry marcatura cartilagine (rosso) e smyhc: GFP lento muscolare (verde). IA: intermandibularis anteriore, PH: goniometro hyoideus, AM: adduttore mandibulae, HI: hyoideus inferiore, HI: hyoideus superiore, CH: sternohyoideus, MC: la cartilagine di Meckel, PQ: Palatoquadrate, CH:. Ceratohyal <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> &quot;Fo: together.within-page keep-=&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig2.jpg" /> Figura 2: generazione di una superficie 3D da dati confocali immagini che mostrano la transizione dai dati confocali in una superficie 3D per la zebrafish mascella inferiore con elevato ingrandimento della regione di giunzione.. (A) i dati confocale prime; (B) Dataset dopo l&#39;applicazione di un filtro gaussiano; (C) contorno filtrata; Di superficie (D) 3D. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig3.jpg" /> Figura 3: maglie rappresentativi mostrano vincoli e vettori di forza maglie rappresentativi per una larva 5 dpf per (A) di chiusura della bocca e.(B) apertura della bocca. Punti bianchi indicano luoghi in cui il modello è vincolata ed in cui le dimensioni (ad esempio, x ed y oppure x, y, z). Linee bianche indicano posizioni muscolari, con il vettore della forza muscolare indicato con frecce bianche. Rosso mostra la cartilagine e giallo il Interzone. Questa cifra è stata modificata dal materiale supplementare precedentemente pubblicato in Brunt et al. 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig4.jpg" /> Figura 4:. Test di sensibilità FE-modello che simula lo spostamento della mascella in zebrafish 5dpf per diversi cartilagine e interzone moduli di Young. Mascella spostamento (aperto a chiuso in micron) è segnato sulla mascella; registrati utilizzando il tasto di colore. Ogni modello (A - L) presenta una diversa combinazione di cartilagine (c = 1,1, 3,1 o 6,1 MPa) o interzone (i = 0,25, 0,5, 0,75, o 1 proprietà MPa). Orizzontale freccia nera mette in evidenza il valore dello spostamento della mascella sulla punta della cartilagine del Meckel (rappresentato dalla freccia nera verticale). M e N alambicchi dal video di 5 DPF minimo che mostra le larve, vale a dire, la mascella chiusa (M) e il massimo, vale a dire, mascella completamente aperto (N) con i due sovrapposti (O) - linea bianca sul O rappresenta lo spostamento (43 micron). In questo caso relativa proprietà della cartilagine di 1.1 con un Interzone di 0,25 (A) migliore corrispondenza gli spostamenti visti in pesci vivi (O). I pannelli AL di questa figura sono stati precedentemente pubblicati in Brunt et al. 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare un vers più grandi</a>ione di questa figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig5.jpg" /> Figura 5: i dati rappresentativi dei modelli FE simulazione FE-modello di tutti i muscoli applicate in 5 dpf larva (A - C).. (A) di Von Mises (EMaxmin) (B) ceppo minimo principale (E min. P, μɛ) (C) ceppo massima principale (E Max. P., μɛ). simulazione FE-modello di ceppi massimi e minimi principali durante l&#39;apertura della mascella. (D - K): ceppo massima principale (. E Max P., μɛ) a (D) vista mascella ventrale e (E) ventrale vista comune (E) indica la posizione delle sezioni prossimale-distale attraverso la cartilagine del Meckel congiunta e il Interzone in (e &#39;) e (e&#39; &#39;), rispettivamente. (F): lateralemascella vista. (G): vista laterale congiunta. (H - K): ceppo minimo principale (. E Min P, μɛ) a (H) vista ventrale mascella e (I) ventrale vista comune. (I) indica la posizione delle sezioni prossimale-distale attraverso congiunta cartilagine di Meckel e Interzone a (I &#39;) e (I&#39; &#39;), rispettivamente (J): vista laterale della mascella. (K): vista laterale congiunta. Questo dato è stato pubblicato in precedenza in Brunt et al. 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig5large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Numero di fibre muscolari </td><td> Area di fibra muscolare (micron 2) </td><td> zona gruppo muscolare (micron2) </td><td> Forza (N) </td></tr><tr><td> 5 dpf intermandibularis anteriore </td><td> 5 </td><td> 23.8 </td><td> 119 </td><td> 4.76e-6 </td></tr><tr><td> 5 dpf goniometro hyoideus </td><td> 6 </td><td> 23.8 </td><td> 142.8 </td><td> 5.71e-6 </td></tr><tr><td> 5 dpf adduttore mandibulae </td><td> 9 </td><td> 23.8 </td><td> 214.2 </td><td> 8.57e-6 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Muscle quantificazione. Calcolato forze muscolari medi del Intermandibularis anteriore, adduttore Mandibulae e goniometro Hyoideus a 5 dpf utilizzando 40 nN / micron 2 (valore per unità di superficie preso da riferimento 17). (Iorga et al., 2011) (n = 3).

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Costruire modelli a elementi finiti per studiare la biomeccanica della mascella del pesce zebra | Biologia dello sviluppo | Video

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Finite Element Analysis is a frequently used tool to investigate the mechanical performance of structures under load. Here we apply its use to modeling the biomechanics of the zebrafish jaw.

Costruire modelli ad elementi finiti per Indagare Zebrafish Jaw Biomeccanica

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

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9.2K Views.  University of Bristol. Finite Element Analysis is a frequently used tool to investigate the mechanical performance of structures under load. Here we apply its use to modeling the biomechanics of the zebrafish jaw. 

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Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microperla impianto nel zebrafish

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

Il trattamento di droga e<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging di osteoblasti-osteoclasti interazioni in un modello di Medaka pesce osteoporosi

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be difficult to study, and can lead to confounding results. The protocol described here is a straightforward breeding paradigm to increase and decrease penetrance in lethal zebrafish skeletal mutants. Because lethal mutants cannot be selectively bred directly, the classic selective breeding strategy of progeny testing is employed. This method also includes protocols for Kompetitive Allele Specific PCR (KASP) genotyping zebrafish and staining larval zebrafish cartilage and bone. Applying the husbandry strategy described here can increase the penetrance of an interesting skeletal phenotype enabling more reproducible results in downstream applications. In addition, decreasing the mutant penetrance through this selective breeding strategy can reveal the developmental processes that most crucially require the function of the mutated gene. While the skeleton is specifically considered here, we propose that this methodology will be useful for all zebrafish mutant lines.

The goal of this protocol is to alter the penetrance of lethal skeletal mutant phenotypes in zebrafish by selective breeding. Lethal mutants cannot be grown to adulthood and bred themselves, therefore this protocol describes a method for tracking and selecting penetrance through multiple generations by progeny testing.

Lo spostamento di penetranza mutante scheletrica letale di Zebrafish progenie test

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

Modelli di lesione di Zebrafish adulto per studiare gli effetti del Prednisolone nella rigenerazione di tessuto osseo

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians. The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal pair and a longer maxillary pair. Barbel tissue contains cells of ectodermal, mesodermal and neural crest origin, including skin cells, glands, taste buds, melanocytes, circulatory vessels and sensory nerves. Unlike most adult tissue, the maxillary barbel is optically clear, allowing us to visualize the development and maintenance of these tissue types throughout the life cycle. 
This video shows early development of the maxillary barbel (beginning approximately one month post-fertilization) and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration in the adult appendage (&gt;3 months post-fertilization). Briefly, the left maxillary barbel of an anesthetized fish is elevated with sterile forceps just distal to the caudal edge of the maxilla. A fine, sterile spring scissors is positioned against the forceps to cut the barbel shaft at this level, establishing an anatomical landmark for the amputation plane. Regenerative growth can be measured with respect to this plane, and in comparison to the contralateral barbel. Barbel tissue regenerates rapidly, reaching maximal regrowth within 2 weeks of injury.
Techniques for analyzing the regenerated barbel include dissecting and embedding matched pairs of barbels (regenerate and control) in the wells of a standard DNA electrophoresis gel. Embedded specimens are conveniently photographed under a stereomicroscope for gross morphology and morphometry, and can be stored for weeks prior to downstream applications such as paraffin histology, cryosectioning, and/or whole mount immunohistochemistry. These methods establish the maxillary barbel as a novel in vivo tissue system for studying the regenerative capacity of multiple cell types within the genetic context of zebrafish.

The zebrafish maxillary barbel is an integumentary sense organ containing ectodermal, mesodermal and neural crest derivatives. Importantly, the adult barbel can regenerate after proximal amputation. This video introduces maxillary barbel development and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration, followed by collection, embedding and downstream imaging of barbel specimens.

Metodi per lo studio del mascellare Zebrafish Barbel

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians.  The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal ...

Biologia

Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish with fluorescently-marked plasma membranes can be scanned in a confocal laser scanning microscope in order to determine the volume of muscle tissue and the number of muscle fibers present. Efficient approaches for the measurement of cell number and size in live animals over time are described and validated against more arduous segmentation methods. Methods are described that permit the control of muscle electrical, and thus contractile, activity. Loss of skeletal muscle contractile activity greatly reduced muscle growth. In larvae, a protocol is described that allows reintroduction of patterned electrical-evoked contractile activity. The described methods minimize the effect of inter-individual variability and will permit analysis of the effect of electrical, genetic, drug, or environmental stimuli on a variety of cellular and physiological growth parameters in the context of the living organism. Long-term follow-up of the measured effects of a defined early-life intervention on individuals can subsequently be performed.

Optical clarity is a major advantage for cell biological and physiological work in zebrafish. Robust methods for measurement of cell growth in individual animals are described that permit novel insights into how growth of skeletal muscle and neighboring tissues are integrated with whole body growth.

Misurazione in tempo reale e ripetuta della crescita muscolare scheletrica in singoli pesci zebra vivi sottoposti ad alterata attività elettrica

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish ...

<meta charset="utf8"></head><body>Rimozione delle squame di pesce zebra per studi di coltura e biologia ossea

In Vitro Culturing Technique for Studying Cellular Dynamics in Zebrafish Scales

Zebrafish scales offer a variety of advantages for use in standard laboratories for teaching and research purposes. Scales are easily collected without the need for euthanasia, regenerate within a couple of weeks, and are translucent and small, allowing them to be viewed using a standard microscope. Zebrafish scales are especially useful in educational environments, as they provide a unique opportunity for students to engage in hands-on learning experiences, particularly in understanding cellular dynamics and in vitro culturing methods. The main objective of this protocol is to describe a method for collecting and maintaining zebrafish scales in culture for use in a variety of biological studies using basic laboratory equipment. Additionally, the protocol details their use in understanding bone homeostasis by examining the activity of bone cells involved in bone resorption and deposition. It also includes additional protocols for general techniques, such as the visualization of nuclei and apoptotic cells. The in vitro culturing protocol produces reliable results with minimal reagents and equipment. This article discusses the benefits of using in vitro cultures of zebrafish scales to foster scientific inquiry and outlines the resources needed to support their integration into educational settings.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Avanzamento della ricerca sull'attività delle cellule ossee con le squame di pesce zebra

This protocol offers a method to study cellular dynamics using a simple in vitro culture technique. It provides an opportunity for zebrafish researchers and educators to study cellular processes, such as those related to bone homeostasis and basic cell biology, by visualizing fluorescent nuclei and apoptotic cells within the scales.

Tecnica di coltura in vitro per lo studio della dinamica cellulare nelle squame di zebrafish

Zebrafish scales offer a variety of advantages for use in standard laboratories for teaching and research purposes. Scales are easily collected without ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

Analizzando craniofacciale morfogenesi in Zebrafish Uso 4D Microscopia confocale

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Costruire modelli ad elementi finiti per Indagare Zebrafish Jaw Biomeccanica

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Microperla impianto nel zebrafish

Il trattamento di droga e

Lo spostamento di penetranza mutante scheletrica letale di Zebrafish progenie test

Modelli di lesione di Zebrafish adulto per studiare gli effetti del Prednisolone nella rigenerazione di tessuto osseo

Metodi per lo studio del mascellare Zebrafish Barbel

Misurazione in tempo reale e ripetuta della crescita muscolare scheletrica in singoli pesci zebra vivi sottoposti ad alterata attività elettrica

Tecnica di coltura in vitro per lo studio della dinamica cellulare nelle squame di zebrafish

Tecnica di coltura in vitro per lo studio della dinamica cellulare nelle squame di zebrafish

Tecnica di coltura in vitro per lo studio della dinamica cellulare nelle squame di zebrafish

Analizzando craniofacciale morfogenesi in Zebrafish Uso 4D Microscopia confocale