LHB foi financiado pelo programa celular PhD Wellcome Trust dinâmico; KAR foi financiado pela subvenção de projecto MRC MR / L002566 / 1 (atribuído a EJR e CLH) e CLH foi financiado pela áruk concessão 19479. Também gostaríamos de agradecer a facilidade Wolfson BioImaging para o conselho de imagem.

Todos os passos dentro do protocolo de seguir a Universidade de cuidados com os animais de Bristol e diretrizes de bem-estar e os do UK Home Office. 1. Visualização de Musculoskeletal anatomia NOTA: Para visualizar a forma dos elementos esqueléticos, para quantificar muscular e para identificar o posicionamento exato dos anexos musculares, imunocoloração (seção 1.1) peixes na idade apropriada para a miosina esquelético (que revela muscular) e colágeno tipo II (para visualizar cartilagem). Alternativamente, visualizar a anatomia do músculo-esquelético usando linhas repórter fluorescentes transgênicos, como o colágeno repórter a1 COL2A1: mCherry 13,14 para visualizar a cartilagem eo lento miosina de cadeia pesada smyhc repórter: GFP 15 para visualizar a posição de anexos musculares (ponto 1.2). linhas alternativas que marcam cartilagem e músculo poderia funcionar igualmente bem. <ol><li> fluorescente Immunostaining <ol><li> Fix larva em excesso de paraformaldeído a 4% (PFA) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 1 h. Lavar em PBS com 0,1% de Tween 20 (PBT) e desidratar em 50% de metanol (MeOH) em PBT e MeOH a 100% durante 5 min, respectivamente. Cuidado: PFA é tóxico e deve ser tratado de acordo com a folha de segurança material. NOTA: Larva podem ser armazenados em 100% de MeOH até ser necessário. </li><li> Reidratar larva em 50% de MeOH em PBT durante 5 min. Lavar em PBT durante 5 min. </li><li> Permeabilizar larva em 0,25% de tripsina em PBT em gelo durante 5-6 minutos. Lavar em 4x PBT durante 5 minutos cada. </li><li> Bloquear para 2-3 horas em soro 5% em PBT. </li><li> Incubar larva na diluição recomendada de coelho anti-colagénio do tipo 2 e de ratinho anti-miosina anticorpos no soro a 5% em PBT durante 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. NOTA: O intervalo de diluição recomendada é normalmente na folha de dados de anticorpos. Escolha anticorpos que são dirigidos contra espécies diferentes entre si e que também são difealugar ao tecido. </li><li> Lave 6x larva por 15 minutos em PBT. </li><li> Bloquear durante 1-2 horas em soro 5% em PBT. </li><li> Incubar em anticorpos secundários no escuro. Use marcado por fluorescência anti-rato (550) e anti-coelho (488) anticorpos secundários para uma diluição adequada em 5% de soro e PBT para o anticorpo específico. </li><li> Lavar 6X por 10 minutos cada em PBT e imagem em um microscópio confocal 10X mais rapidamente possível. </li></ol></li><li> Imagiologia Musculoskeletal Geometry <ol><li> Montar as larvas ventrally em uma lamela em agarose morna 0,3-0,5% de baixo ponto de fusão (LMP) em solução de Danieau 16. NOTA: peixes transgénicos terá de ser sedado em 0,02% MS222 (tricaina metanossulfonato, pH 7) antes da montagem e durante o exame. </li><li> Dê uma pilha de imagens confocal da região de interesse usando a lente objetiva de 10X eo zoom digital de cerca de 2,5 vezes. Preparação de imagens do canal verde e vermelho usando a 488 nm e 561 nm lasers respectivamente. Imagem com uma resolução de 512 x 512 com um intervalo entre os planos z de 1,3 mm e 3 médias de linha. A pilha resultante irá compreender de cerca de 100 fatias z. </li><li> Exportar os dados como uma série tiff. Projecções máximas dos elementos do músculo e da cartilagem a partir de uma larva de peixe-zebra 5dpf são mostrados na Figura 1. </li></ol></li></ol> 2. Gerar uma superfície 3D <ol style="margin-left: 40px;"><li> Escolha um conjunto de dados representativo para cada ponto de tempo em 3, 4 e 5 dpf (escolha após a visualização de múltiplas amostras). </li><li> Abrir 3-dimensional pilha tiff e selecione todos os canais de software de análise. Clique direito sobre o canal de cartilagem e selecione filtro de imagem e suavização: Gaussian (Figura 2B). </li><li> Em vista do projeto com o botão direito na imagem filtrada e selecione &#39;segmentação de imagem &quot;e depois&quot; editar nova etiqueta&#39;. Criar um novo rótulo para cada material, ou seja, cartilagem e jonto. Selecione a região de cartilagem da imagem (Figura 2C, sinal branco, esboço roxo) com a ferramenta varinha mágica. Use a ferramenta pincel para remover o ruído dos contornos. NOTA: Se usando a ferramenta varinha mágica, clique em &quot;Todos os slices &#39;. </li><li> Selecione a região em conjunto com a ferramenta pincel e atribuir a um componente de articulação (Figura 2C, contorno azul) </li><li> várias fatias suaves ao mesmo tempo, selecionando a segmentação no menu superior e etiquetas lisas. Botão direito do mouse na imagem e selecione gerar superfície para produzir uma superfície 3D rendem do componente (Figura 2D). </li><li> Clique na superfície e salvar os dados como um arquivo hmascii para importação para software articulada. </li></ol> 3. Cálculo das Forças músculo a ser utilizado no modelo FE <ol style="margin-left: 40px;"><li> Contar o número de fibras musculares de imagens confocal de smyhc: GFP peixes-zebra transgénicos (Figura 1A, seta, 1C) e medir a diameter das fibras para calcular a área de secção transversal (πr 2). </li><li> Identificar força por unidade de área adequado músculo a partir da literatura. A força muscular máxima gerada por unidade de área para os músculos esqueléticos de peixe-zebra larval (40 nN / ^ m 2) foram utilizados 17. </li><li> Calcular as forças para cada grupo muscular anatómica multiplicando o número de fibras e a sua área pela força por unidade de área. Ver Tabela 1. </li></ol> 4. Gerando uma Malha <ol style="margin-left: 40px;"><li> Importar o modelo 3D gerado na secção 2 (acima) para um pacote de software capaz de gerar uma malha de elementos finitos. </li><li> Gerar A2d malha da cartilagem e superfícies articulares, utilizando a ferramenta envoltório do psiquiatra no menu 2D. Escolha um tamanho de elemento apropriado. Nota: Use um tamanho de elemento entre 1,5-2,5. Se necessário, gerar um intervalo de superfície 2D diferente tamanho malhas para realizar a otimização da malha 3D (Seção 4.4). </li><li> Efectuar controlos de qualidade malha encontradas embaixo dos 2D&gt; Ferramentas&gt; Verificar elementos &quot;painel para verificar se há elementos duplicados, inserções e penetrações na malha. Corrigir ângulos diedros usando a guia utilidade em árvore do modelo. </li><li> Gerar uma malha 3D a partir das malhas de superfície 2D de diferentes tamanho do elemento utilizando o subpainel 3D&gt; Tetramesh. NOTA: Comparar os resultados de diferentes tamanhos de malha e selecione o modelo FE com a malhagem menor que converge após novas simulações e não compromete definição de recurso. O exemplo na Figura 3 contém 1,5 milhões de elementos tetraédricos para as cartilagens de maxilas inferiores e tinha um tamanho de elemento de 2D de 2,0. </li><li> Transformar a malha de modo modelo de mandíbula é escalar como por pilha confocal utilizando a geometria&gt; Distância subpainel. NOTA: Certifique-se a cartilagem e componentes comuns são conectados no modelo através da exportação de um modelo mesclado ou usando laços. </li></ol> 5. Elementos Finitos Model Construção <ol><li> Usando software comercial de elementos finitos (FE), criar um modelo de FE. Usando o músculo e da cartilagem 3D marcado pilhas confocal gerados na secção 1, como um guia, atribuir nós que correspondem aos pontos de fixação do músculo. Criar um vector de entre dois nós que representam a origem e a inserção de cada um dos músculos (Figura 3). </li><li> Criar um coletor de carga do tipo &quot;história&quot; para aplicar um &#39;load C&#39; para cada músculo. Especificar a magnitude em newtons (calculado no passo 3.3) e atribuir o vector associado. A Figura 3 mostra os pontos de fixação para o mandibulae adutor (AM), hyoideus transferidor (PH) e intermandibularis (IM). NOTA: Para estes músculos da mandíbula, força contráctil máxima é distribuído entre a origem e a inserção de modo a que apenas 50% de cada carga é aplicada em cada local. </li><li> Atribuir propriedades do material isotrópico elásticas adequadas conforme determinado pela literatura. Módulo de Young para a cartilagemeo interzona neste modelo foram de 1,1 MPa e 0,25 MPa, respectivamente, e razão de Poisson foi de 0,25 tanto para 18,19. </li><li> Criar um coletor de carga do tipo &#39;limite&#39; para aplicar restrições iniciais do modelo. Vá até a aba Análise&gt; Restrições e no subpainel criar, escolher os nós no modelo que deseja restringir. Selecione os graus de liberdade (DOF) que o movimento limite do modelo para a melhor aproximação da sua área natural de movimento. NOTA: O modelo da Figura 3 foi constrangido em todos os eixos de movimento (DOF: 1, 2, 3 representam X, Y e Z, respectivamente) no ceratohyal para o ancorar no espaço a um ponto médio no modelo e na eixo y e Z no ponto em que o palatoquadrate liga ao resto do crânio peixe-zebra (Figura 3, Tabela 1). O modelo deve ser limitado em todas as três DOF ​​em um nó menos. </li><li> Criar uma &quot;etapa Load &#39;, para cada tipo de movimento que pretende simulcomeu (ou seja, a abertura, fechamento), sob o menu de análise e selecione todas as cargas relevantes (feitas na Seção 5.2) e as restrições (feito na Seção 5.4) para simular o movimento. Selecione &#39;Static&#39; a partir do menu drop-down quando ela aparece. </li><li> modelo de exportação, incluindo os de malha, cargas, restrições e propriedades do material em um formato de arquivo adequado, neste caso formato &quot;.INP&quot;. </li><li> modelo de carga em software de análise de FE. Criar e executar um trabalho para o modelo utilizando o módulo de Job. </li><li> Analisar a saída para o stress, tensão, deslocamento, etc. encontrada na guia resultados e menu de visualização (Figura 4 e 5). </li></ol> 6. Validação de Jaw Deformação / Deslocamento Distâncias <ol><li> Escolha 3-6 Tg (Col2a1aBAC: mCherry) peixes-zebra transgénicos. </li><li> Levemente anestesiar as larvas com 0,02% MS222 até que eles deixam de responder ao toque, mas seu coração ainda está batendo. </li><li> monteas larvas lateralmente (enquanto anestesiado) em lamelas em tépida agarose LMP 1% (composta em solução de Danieau). </li><li> Remova a agarose em torno da cabeça e mandíbula com fórceps. </li><li> Lave solução fresca de Danieau (sem MS222) sobre a cabeça da larva para remover a anestesia utilizando uma pipeta Pasteur até movimentos normais da boca retomada. </li><li> Use um software de captura de filme para tirar de campo brilhante vídeos em alta velocidade de movimentos da boca. Tome filmes de cerca de um minuto de duração na taxa de quadros mais alta, ou suficiente para gravar vários ciclos de abertura da mandíbula. </li><li> Escolha quadros que mostram a mandíbula aberta para o seu deslocamento máximo. Medir a distância entre a ponta anterior da cartilagem de Meckel e a maxila superior (ponta da placa etmóide) em uM. </li><li> Calcular o deslocamento médio de larvas de peixes múltipla. </li><li> Extrai dados de deslocamento a partir do modelo. Use o deslocamento médio calculado em 6,8 a verificar o comportamento de deslocamento do modelo ( <strong&gt; Figura 4). Se o modelo afasta-se, a análise de sensibilidade esperada executar sequencialmente, alterando as propriedades dos materiais e cargas musculares. </li></ol>

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Os autores não têm nada para revelar. Alguns dados nas Figuras 3-5 foi reproduzido a partir J.Biomech, 48 (12), Brunt et al., Modelagem de elementos finitos prevê mudanças na forma conjunta e comportamento celular devido à perda de tensão muscular no desenvolvimento da mandíbula, 3112-22. de 2015, com a permissão de Elsevier 15.

Modelos de elementos finitos tenha sido utilizado para relacionar as áreas de elementos esqueléticos que estão sob tensão com aqueles submetidos a formação de osso 10, bem como para mapear as áreas sob tensão durante a ossificação endocondral e morfogénese conjunta 8,12,21. Outros estudos também têm sido capazes de aplicar modelos de crescimento teóricas para replicar as alterações durante o desenvolvimento conjunto 11,12. Aqui nós mostramos o protocolo para a construção de modelos FE para um sistema relativamente simples, a mandíbula zebrafish 20. Ao contrário dos métodos alternativos de recolha de imagens RAW para os modelos FE, como a tomografia computadorizada 22, imagem confocal de linhas transgénicas ou peixe-zebra histoquímica permite múltiplos tecidos a serem estudados. Pode, por conseguinte, proporcionará informação directa sobre os pontos de fixação do músculo em relação à cartilagem. Entre os modelos de vertebrados peixe-zebra são particularmente passíveis de manipulação genética e farmacológica. A geração de modelos FE para peixe-zebracartilagem craniofacial agora abre-se a possibilidade de um estudo mais aprofundado da interação entre biomecânica e genética na morfogênese conjunta. Há um número de etapas críticas para o processo de criação de um modelo de FEC; a primeira é a geração de uma representação tridimensional precisa do sistema. Isso exige de imagem com resolução alta o suficiente para definir claramente as fronteiras. Note-se que, mesmo com imagens de alta resolução para fazer uma boa superfície que se pode ter para suavizar algumas regiões. Outro passo fundamental é definir o posicionamento correto da carga e as restrições corretas. Um modelo insuficientemente restrita irá falhar para resolver e colocação incorrecta das cargas irá causar movimento anormal. Alguns processamento dos dados em bruto (Figura 2) é necessária como uma superfície gerada a partir dos dados brutos seria difícil de malha (Figura 2B). Nós filtrada a dados utilizando um filtro gaussiano (Figura 2C </strong&gt;) e realizamos alguns suavização manual das curvas para produzir um conjunto de linhas limpas que podem ser convertidos em uma superfície 3D. Demasiada suavização pode produzir uma superfície &quot;derreteu&quot; que perdeu muitas das suas características. Escolhendo o tamanho do elemento correto é um processo iterativo que escolher muito pequeno um tamanho de elemento cria muito grande de uma malha que é computacionalmente intensiva. No entanto, a escolha de um tamanho muito grande elemento irá produzir uma malha que falha para recapitular a forma correcta da estrutura. A malha correta tinha o tamanho do elemento menor que capturou a forma correta da mandíbula e convergiram para uma solução correta, verificada por meio do deslocamento da mandíbula. Também pode ser necessário modificar as propriedades do material de carga ou de cálculos para melhor imitar o deslocamento correcto como espécies diferentes idades e terá propriedades substancialmente diferentes. É importante lembrar que sempre existem limitações para um modelo hipotético e umssumptions feitas nos modelos FE. Quando apenas modelar um ou um pequeno número de amostras é essencial para garantir que uma amostra representativa é escolhida como não são susceptíveis de ser pequenas variações entre indivíduos. Uma vez que apenas alguns dos elementos da maxila e os músculos foram incluídos, o modelo é uma versão simplificada do sistema músculo-esquelético craniofacial peixe-zebra. Portanto, as restrições tiveram de ser posicionada para explicar onde os elementos da mandíbula modelados iria se conectar com o resto do crânio e o modelo foi artificialmente restrita no centro de corrigi-lo no &quot;espaço&quot;. Esta restrição artificial não teve impacto sobre a interpretação a partir dos modelos como o ceratohyal em si não foi analisada. A inclusão de mais da estrutura craniofacial, especialmente outros músculos abertura da mandíbula, como os sternohyals e sua cartilagem anexo 23, poderia ter acrescentado ao modelo, mas as limitações incluem a capacidade de modelos maiores para ser executado no software Finite Element. s = &quot;jove_content&quot;&gt; Outra limitação é que não temos modelada inserção do ligamento, embora isto poderia ser alcançado através da inserção de molas 8. Uma outra suposição feita neste caso foi que o modelo iria se comportar de forma linear. As magnitudes das tensões nos modelos eram comparáveis aos dos modelos publicados e aplicado a células in vitro 10,24, estirpes com estando abaixo de 3500 e -5000 μɛ acima para além de pontos de restrição e de ligação do músculo. Portanto, as estirpes com as regiões relevantes do modelo foram consideradas dentro de um intervalo aceitável para um modelo linear. Cartilagem não se comportam como um material inteiramente linear e foi previamente modelado como um material poroelástico, que permitiu a análise do comportamento de fluido no modelo 25. Espalhando os pontos de fixação muscular entre um conjunto de nós locais iria distribuir as forças de pico e representar com mais precisão a inserção do músculo para determinados músculos. ent &quot;&gt; O uso de FE permite uma avaliação das tensões e pressões que actuam sobre uma estrutura. Como uma técnica que é frequentemente usado em muitas disciplinas biociências incluindo ortopedia, paleontologia e, mais recentemente, biologia do desenvolvimento. Aqui nós descrevemos como construir FE para o peixe-zebra mandíbula inferior. no futuro desses modelos poderia ser alargado a olhar para toda a mandíbula, incluindo o paladar. técnicas similares poderiam ser usados ​​para modelar a biomecânica da coluna vertebral em peixes, que até à data têm sido quase sempre estudadas por meio cinemáticas.

Modelagem de elemento finito (FE) é uma técnica de engenharia que podem computacionalmente calcular e mapear a magnitude ea localização das cepas que actuam sobre uma estrutura 1. O modelo consiste na estrutura 3D, representado por uma malha de &quot;elementos finitos&quot;, e o resultado final da análise é governada por uma série de factores, incluindo a estrutura e o número de elementos na malha, a magnitude e a localização da mecânica cargas e as propriedades do material. As propriedades dos materiais descrevem certos aspectos do comportamento de um material em um determinado tipo de carga; O módulo de Young (E) descreve a elasticidade do material, enquanto que o coeficiente de Poisson descreve o decréscimo proporcional na largura de um material para o seu comprimento, quando uma amostra é alongada. modelagem FE pode ser utilizado para calcular uma variedade de variáveis, incluindo o deslocamento, tensão, pressão e agir pressão sobre o modelo, tendo em conta os dados de entrada originais sobre a estrutura &#39;; S forma, localização e magnitude das cargas e as propriedades dos materiais específicos. Modelagem FE é amplamente utilizado em engenharia 2 e cada vez mais para ortopédicos 3 e paleontológicos aplicações 4. No desenvolvimento de forças biomecânicas são conhecidos por actuarem como um estímulo em muitas células para activar respostas celulares 5-8 e é útil para prever a ambas as posições relativas e as magnitudes de estímulos mecânicos no desenvolvimento de sistemas de órgãos, no entanto, actualmente modelagem Fe tem sido pouco usado para o desenvolvimento do peixe-zebra. Tanto a cartilagem e osso foram mostrados para ser materiais mechanosensitive. Por exemplo, a compressão in vitro tem sido encontrado para activar vias condrogénicas, enquanto que a tensão foi demonstrado ser necessário para a formação óssea 9. FE análise (FEA) tem sido explorada para modelar estirpes agindo em amostras biológicas, incluindo aqueles que agem em elementos esqueléticos durante óssea formação 10. Outras aplicações incluem a sua utilização de desenvolvimento para prever a forma de uma junta depois de ter sido exposto a forças biomecânicas teóricos 11,12 e para mostrar o padrão de estirpes presentes durante a morfogénese do joelho pintainho articulação 8. Este protocolo destina-se a compartilhar a experiência de geração de superfícies em 3 dimensões, malhas e modelos de elementos finitos a partir de imagens confocal, com vista a compreender a mecânica de tecidos em desenvolvimento. Nós também mostram formas de validar os modelos FE embora a captura de informações deslocamento da articulação reais in vivo. Enquanto que utilizar a mandíbula peixe-zebra como um exemplar as mesmas técnicas podem ser utilizadas em qualquer pequeno sistema biológico para o qual a informação sobre a estrutura 3D do sistema músculo-esquelético pode ser obtido por imagem confocal ou multifotônica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="937">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Coll2</td>
			<td style="width:237px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab34712</td>
			<td style="width:365px;">Type II collagen antibody - stains all cartilage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">A4.1025 / MF20</td>
			<td style="width:237px;">Developmental studies hybridoma bank</td>
			<td style="width:119px;">A4.1025</td>
			<td>Skeletal mysoin antibody - marks all skeletal muscle&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Low melt agarose</td>
			<td style="width:237px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A9414-5G</td>
			<td>For mounting zebrafish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate )</td>
			<td style="width:237px;">Sigma</td>
			<td>E10521-10G</td>
			<td>To make anaesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td>T/3760/48</td>
			<td>sample permeablilisation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dylight 488Mouse IgG</td>
			<td style="width:237px;">Thermofisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">35502</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dylight 550 Rabbit IgG</td>
			<td style="width:237px;">Thermofisher&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">84541</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SP8/SP5 or SPE confocal</td>
			<td style="width:237px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;LAS Leica capture software&#160;</td>
			<td style="width:237px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aviso (version 7.0.0)</td>
			<td style="width:237px;">FEI Visualization Science Group</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>3D image analysis software (Section 2)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hypermesh part of the Hyperworks package (version 10)</td>
			<td style="width:237px;">Altair Engineering</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>FE model generating software (Section 4-5)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Abaqus (version 6.14)</td>
			<td style="width:237px;">SIMULIA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>FE analysis software (Section 5.7-5.8)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

building finite element models to investigate zebrafish jaw biomechanics

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical strain. Skeletal joints are subjected to dynamic mechanical loading. Finite element analysis (FEA) is a computational method, frequently used in engineering that can predict how a material or structure will respond to mechanical input. By dividing a whole system (in this case the zebrafish jaw skeleton) into a mesh of smaller 'finite elements', FEA can be used to calculate the mechanical response of the structure to external loads. The results can be visualized in many ways including as a 'heat map' showing the position of maximum and minimum principal strains (a positive principal strain indicates tension while a negative indicates compression. The maximum and minimum refer the largest and smallest strain). These can be used to identify which regions of the jaw and therefore which cells are likely to be under particularly high tensional or compressional loads during jaw movement and can therefore be used to identify relationships between mechanical strain and cell behavior. This protocol describes the steps to generate Finite Element models from confocal image data on the musculoskeletal system, using the zebrafish lower jaw as a practical example. The protocol leads the reader through a series of steps: 1) staining of the musculoskeletal components, 2) imaging the musculoskeletal components, 3) building a 3 dimensional (3D) surface, 4) generating a mesh of Finite Elements, 5) solving the FEA and finally 6) validating the results by comparison to real displacements seen in movements of the fish jaw.

Imunocoloração para o músculo (Figura 1A) e da cartilagem (Figura 1B) ou imagiologia de repórteres transgénicos (Figura 1C) permite que a estrutura 3D da mandíbula para ser visualizado, juntamente com a massa muscular associada. Por imagem com uma resolução elevada, foi possível construir um modelo que capta tanto a forma tridimensional da maxila (Figura 2) e a localização e colocação de cargas (Figura 3). Utilizando em deslocamentos vivo pode ser visto através de captura de vídeo de alta velocidade (Figura 4) verificou-se que a amplitude de movimento no modelo foi dentro de um intervalo realista. Os modelos FE uma vez a corrida pode ser usado para exibir uma variedade de dados, tais como estresse (Figura 5A), mínimo e deformação principal máxima (Figura 5B - K). Estes resultados são três-dim<html> ensional modo que o modelo pode ser ampliado para ver padrões finos de detalhes (Figura 5E, 5I) rodado para obter pontos de vista relevantes (Figura 5F, 5G, 5J 5K) e digitalmente seccionados (Figura 5E &#39;, 5E&#39; &#39;, 5I&#39;, 5I &#39;&#39;) para mostrar como os padrões de tensão, deformação ou alteração da pressão ao longo do modelo. Também é possível extrair dados quantitativos a partir do modelo (não representado). Ao verificar o modelo e utilizando as mais precisas as propriedades do material, cargas e malha forma o modelo FE pode ser usado para explorar a melhor estimativa do ambiente mecânico que está sendo experimentado pelas células durante essa janela de desenvolvimento. Os resultados do modelo pode ser directamente comparada com alterações no comportamento celular e a expressão do gene 20. <html> re 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54811 / 54811fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1:. Imagens representativas dos elementos músculo-esqueléticas da mandíbula peixe-zebra em 5 dpf pilhas confocal representativos da mandíbula inferior de larvas 5dpf tudo mostrado com anterior ao início (A) imunocoloração para A4.1025 que mancha toda a miosina esquelético (B) imunocoloração para colágeno Tipo II que marca toda a cartilagem (C) Stack a partir de uma larva viva expressar os repórteres COL2A1 transgênicos: muscular lenta GFP (verde): mCherry cartilagem (vermelho) e smyhc marcação. IA: intermandibularis anterior, PH: transferidor hyoideus, AM: mandibulae adutor, HI: hyoideus inferior, HI: hyoideus superior, CH: sternohyoideus, MC: cartilagem de Meckel, PQ: Palatoquadrate, CH:. Ceratohyal <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> &quot;Fo: manter-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig2.jpg" /> Figura 2: Geração de uma superfície 3D a partir de dados confocal Imagens que mostram a transição de dados confocal em uma superfície 3D para o maxilar inferior do peixe-zebra com maior ampliação da região conjunta.. (A) os dados confocal Raw; (B) do conjunto de dados após a aplicação de um filtro de Gauss; (C) esboço filtrada; Superfície (D) 3D. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig3.jpg" /> Figura 3: malhas representativos mostrando as limitações e vetores de força malhas representativos para uma larva 5 dpf para (A) de fecho e boca.(B) a abertura da boca. Pontos brancos denotar lugares em que o modelo é restritas e em que as dimensões (por exemplo, X e Y ou X, Y e Z). linhas brancas denotam posições musculares, com o vetor de força muscular indicado por setas brancas. Red mostra cartilagem e amarelo da Interzone. Este valor foi modificado a partir do material suplementar publicado anteriormente em Brunt et al. 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig4.jpg" /> Figura 4:. Os testes de sensibilidade FE-modelo simulando o deslocamento da mandíbula no peixe-zebra 5dpf para a cartilagem diferente e Interzone módulos de Young. Mandíbula deslocamento (aberto para fechado em um) está marcado na mandíbula; gravados utilizando a tecla de cor. Cada modelo (A - G) tem uma combinação diferente de cartilagem (C = 1,1, 3,1, ou 6,1 MPa) ou interzona (i = de 0,25, 0,5, 0,75, 1 ou propriedades MPa). Seta preta horizontal destaca o valor do deslocamento da mandíbula na ponta da cartilagem de Meckel (representado pela seta preta vertical). M e N alambiques de vídeos de 5 dpf larvas mostrando mínimos, ou seja, mandíbula fechada (M) e máxima, ou seja, mandíbula totalmente aberta (N) com os dois sobrepostos (o) - linha branca em o representa o deslocamento (de 43 m). Neste caso em relação propriedades de cartilagem de 1,1 com um interzona de 0,25 (A) melhor jogo, os deslocamentos visto em peixes vivos (O). Painéis AL desta figura foram previamente publicados em Brunt et al. 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma vers maiores</a>ion desta figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig5.jpg" /> Figura 5: Os dados representativos dos modelos FE simulação FE-modelo de todos os músculos aplicados de 5 dpf larva (A - C).. (A) Von Mises (EMaxmin) (B) tensão mínima Principal (E Min. P, μɛ) (C) deformação principal máxima (E máx. P., μɛ). simulação FE-modelo de cepas máximas e mínimas principais durante a abertura da mandíbula. (D - K): deformação principal máxima (. E Max P., μɛ) em (D) vista mandíbula ventral e (E) visão conjunta ventral (E) mostra a localização das zonas proximal-distal através da cartilagem de Meckel conjunta eo interzona em (e &#39;) e (e&#39; &#39;), respectivamente. (F): de lateralmandíbula vista. (G): Vista lateral da junta. (H - K): tensão mínima Principal (. E Min P, μɛ) em (H) vista mandíbula ventral e (I) ventral visão conjunta. (I) mostra a localização das secções proximal-distal por meio de cartilagem articular de Meckel e INTERZONE em (I &#39;) e (I&#39; &#39;), respectivamente, (J): vista lateral da mandíbula. (K): Vista lateral da junta. Este número foi publicado anteriormente em Brunt et al. 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Número de fibras musculares </td><td> Área da fibra muscular (? M 2) </td><td> área grupo muscular (mm2) </td><td> Força (N) </td></tr><tr><td> 5 dpf intermandibularis anterior </td><td> 5 </td><td> 23,8 </td><td> 119 </td><td> 4.76e-6 </td></tr><tr><td> 5 dpf transferidor hyoideus </td><td> 6 </td><td> 23,8 </td><td> 142,8 </td><td> 5.71e-6 </td></tr><tr><td> 5 dpf adutor mandibulae </td><td> 9 </td><td> 23,8 </td><td> 214,2 </td><td> 8.57e-6 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Quantificação muscular. Calculado forças muscular médio para o Intermandibularis anterior, Adutor mandibulae e transferidor Hyoideus a 5 dpf usando 40 nN / mm 2 (valor por unidade de área tirado de referência 17). (Lorga et al., 2011) (n = 3).

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Construindo modelos de elementos finitos para investigar a biomecânica da mandíbula do peixe-zebra | Biologia do Desenvolvimento | Vídeo

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Finite Element Analysis is a frequently used tool to investigate the mechanical performance of structures under load. Here we apply its use to modeling the biomechanics of the zebrafish jaw.

Construindo Modelos de Elementos Finitos para investigar Zebrafish Jaw Biomecânica

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

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9.0K visualizações.  University of Bristol. Finite Element Analysis is a frequently used tool to investigate the mechanical performance of structures under load. Here we apply its use to modeling the biomechanics of the zebrafish jaw. 

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Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

Utilizando Análise de confocal<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Para Investigar moduladores de Wnt e Shh morfogénio gradientes

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Biologia do Desenvolvimento

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Deficitária e Abordagem de ganho de função para Investigar celular precoce Destino Determinantes na pré-implantação embriões de camundongos

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema and diminished visual acuity. However, human CECs are prone to compromised proliferative potential. Furthermore, stimulation of cell growth is often complicated by gradual endothelial-mesenchymal transition (EnMT). Therefore, understanding the mechanism of EnMT is necessary for facilitating the regeneration of CECs with competent function. In this study, we prepared a primary culture of bovine CECs by peeling the CECs with Descemet's membrane from the corneal button and demonstrated that bovine CECs exhibited the EnMT process, including phenotypic change, nuclear translocation of &#946;-catenin, and EMT regulators snail and slug, in the in vitro culture. Furthermore, we used a rat corneal endothelium cryoinjury model to demonstrate the EnMT process in vivo. Collectively, the in vitro primary culture of bovine CECs and in vivo rat corneal endothelium cryoinjury models offers useful platforms for investigating the mechanism of EnMT.

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

A primary culture of bovine corneal endothelial cells was used to investigate the mechanism of corneal endothelial-mesenchymal transition. Furthermore, a rat corneal endothelium cryoinjury model was used to demonstrate corneal endothelial-mesenchymal transition in vivo.

In vitro e in vivo em modelos para o Estudo de Transição da córnea endotelial-mesenquimal

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

Análise de vasos coronarianos nos corações embrionárias Cancelado

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Acute and Chronic Models of Hyperglycemia in Zebrafish: A Method to Assess the Impact of Hyperglycemia on Neurogenesis and the Biodistribution of Radiolabeled Molecules

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological problems after stroke and is shown to impair neurogenic processes. Interestingly, the adult zebrafish has recently emerged as a relevant and useful model to mimic hyperglycemia/diabetes and to investigate constitutive and regenerative neurogenesis. This work provides methods to develop zebrafish models of hyperglycemia to explore the impact of hyperglycemia on brain cell proliferation under homeostatic and brain repair conditions. Acute hyperglycemia is established using the intraperitoneal injection of D-glucose (2.5 g/kg bodyweight) into adult zebrafish. Chronic hyperglycemia is induced by immersing adult zebrafish in D-glucose (111 mM) containing water for 14 days. Blood-glucose-level measurements are described for these different approaches. Methods to investigate the impact of hyperglycemia on constitutive and regenerative neurogenesis, by describing the mechanical injury of the telencephalon, dissecting the brain, paraffin embedding and sectioning with a microtome, and performing immunohistochemistry procedures, are demonstrated. Finally, the method of using zebrafish as a relevant model for studying the biodistribution of radiolabeled molecules (here,[18F]-FDG) using PET/CT is also described.

This work describes methods to establish acute and chronic hyperglycemia models in zebrafish. The aim is to investigate the impact of hyperglycemia on physiological processes, such as constitutive and injury-induced neurogenesis. The work also highlights the use of zebrafish to follow radiolabeled molecules (here, [18F]-FDG) using PET/CT.

Modelos agudos e crônicos de hiperglicemia no peixe-zebra: um método para avaliar o impacto da hiperglicemia na neurogênese e a biodisponibilidade das moléculas radiomarcadas

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

Estabelecimento de Zebrafish Larval como um modelo Animal para investigar Trypanosoma cruzi motilidade In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

Modelos de lesão adulto Zebrafish para estudar os efeitos de prednisolona na regeneração de tecido ósseo

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic regeneration, which involves blastema formation and intramembranous ossification analyzed by fluorescence immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography (&#956;CT). Mammalian regeneration is restricted to amputations transecting the distal region of the terminal phalanx (P3); digits amputated at more proximal levels fail to regenerate and undergo fibrotic healing and scar formation. The regeneration response is mediated by the formation of a proliferative blastema, followed by bone regeneration via intramembranous ossification to restore the amputated skeletal length. P3 amputation is a preclinical model to investigate epimorphic regeneration in mammals, and is a powerful tool for the design of therapeutic strategies to replace fibrotic healing with a successful regenerative response. Our protocol uses fluorescence immunohistochemistry to 1) identify early-and-late blastema cell populations, 2) study revascularization in the context of regeneration, and 3) investigate intramembranous ossification without the need for complex bone stabilization devices. We also demonstrate the use of sequential in vivo &#956;CT to create high resolution images to examine morphological changes after amputation, as well as quantify volume and length changes in the same digit over the course of regeneration. We believe this protocol offers tremendous utility to investigate both epimorphic and tissue regenerative responses in mammals.

Here, we present a protocol of adult mouse terminal phalanx amputation to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification, analyzed by fluorescent immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography.

Amputação e regeneração de dígitos adultos do mouse: um modelo simples para investigar a formação de blastema de mamíferos e a ossificação intramembranosa

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

Hibridização em Embriões de Zebrafish e Ensaio de Formação de Tubos em iPSC-CEs para estudar o papel da endoglina no desenvolvimento vascular

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

Traduzindo a Purificação da Afinidade ribossófica (TRAP) para investigar o desenvolvimento raiz arabidopsis thaliana em uma escala específica de tipo de célula

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...