Protokolümüz, iskelet kası gibi dokuların boyutlarını nasıl düzenlediğini incelememize izin verir, bu da önemli fizyolojik ve tıbbi etkileri olan hücre ve gelişim biyolojisinde kilit bir soru olmaya devam etmektedir. Tekniğimizin temel avantajı, hücresel büyümenin canlı hayvanlarda in vivo olarak yüksek derecede mekansal ve zamansal doğrulukla gözlemlenebilmesi ve ölçülebilmesidir. Erken kas büyümesinin temel anlayışındaki ilerleme, erken kas problemlerinin gelişimsel kökenlerini vurgulayabilir ve yaşlılarda ve kas israfı bozukluğu olan hastalarda kas kaybına karşı korunmak için Novo Therapeutics'in keşfine yol açabilir.
1,5 mililitrelik bir tüpte% 1 LMA hazırlayın ve tekrarlanan kullanım için 37 santigrat derecelik bir ısı bloğunda tutun. Monte edilecek balıkları seçin ve her balığı geçici olarak uyuşturun. Isı şokunu önlemek için, LMA aliquot'u ısı bloğundan çıkarın ve ayarın hemen üstüne soğumaya bırakın.
% 1'lik bir LMA tabakası ile kaplanmış 60 mililitrelik bir Petri kabı alın ve diseksiyon mikroskobunun sahnesine yerleştirin. Larvaları bir mililitrelik plastik Pasteur pipetle 60 milimetre kaplı bir Petri kabına aktarın ve mümkün olduğunca fazla transfer edilen ortamı çıkarın. Daha sonra, hala Pasteur pipetini kullanarak, balığın üzerine birkaç damla LMA yerleştirin ve larvaları, LMA ayarlanmadan önce forseps veya ateşle cilalı, ince cam bir iğne kullanarak, yataydan 10 derece uzaktaki anteroposterior ve dorsoventral ekseni ile LMA'nın üst yüzeyine yakın bir yere hızla yönlendirin.
Alternatif olarak, bir mililitrelik plastik Pasteur pipet kullanın. Larvaları minimum balık ortamıyla toplayın ve larvaları soğutulmuş LMA'nın aliquot'una aktarın. Larvaların tamamen LMA ile çevrili hale gelmesi için beş saniye boyunca batmasına izin verin.
Sonra larvaları alın ve bir damla LMA içinde agaroz kaplı Petri kabına aktarın. Larvaları daha önce gösterildiği gibi hızlı bir şekilde konumlandırın. Larvalar agaroz damlasının yüzeyine yatay olarak doğru şekilde monte edilmezse, çıkarılır ve yeniden gömülürse, larvalar bir mililitrelik plastik Pasteur pipet kullanılarak nazik bir emme ile kolayca alınabilir ve LMA kimyasal mendiller kullanılarak nazikçe çıkarılabilir.
LMA ayarlanana kadar yaklaşık 10 dakika bekleyin. Yemeği yaklaşık 10 mililitre trikain içeren balık ortamı ile doldurun. Konfokal yığınları yakalamak için, agaroz şişmesi meydana geldiğinden, taramadan önce monte edilmiş balığın en az 10 dakika dinlenmesine izin verin.
Numune kabını konfokal sistemin aşamasına yükleyin. Larvaları bulun ve istenen somite odaklanın. Somite 17, anal havalandırma deliğine yakın lokalizasyon kolaylığı ve görüntüleme kolaylığı nedeniyle seçilebilir.
Anteriordan somitleri sayarak kontrol edin. YZ görüntülerini yakalamak için, bir Z yığını yakalarmış gibi ayarlayın. Balığın üst ve alt noktalarını tanımlayarak başlayın.
Hem sol hem de sağ taraflar istenildiği gibi yakalanabilir ve tüm hızlı YZ taramalarının istenen bölgeleri yakalamasını sağlar. Konfokal yazılımın izin verdiği şekilde balıklar için tarama alanını yönlendirin. Balıkları, görüntü dex eksenine paralel anteroposterior eksen ve dorsoventral eksen, alanın merkezinde somit 17 ile Y eksenine paralel olarak konumlandırın.
En üstteki miyotomda, tüm epaxial ve hypaxial somit yarımlarının, dikey ve yatay miyosepta ile birlikte görülebildiği ve yüksek çözünürlüklü bir XY görüntüsü yakaladığı orta seviyeli bir düzleme odaklanın. Dosyayı adlandırın ve görüntüyü kaydedin. YZ görüntülerini yakalamak için, balığın anteroposterior eksenine dik olarak, seçilen somit boyunca ventral çizgiye hassas bir sırt çizin.
Seçilen bir anteroposterior konumu ekleyin, sonra bir Z yığın çizgisi taraması gerçekleştirin. YZA, YZM ve YZP'yi yakalamak için seçilen miyotom boyunca tanımlanmış anteroposterior pozisyonlarda YZ hattı taramasını üç kez tekrarlayın. Bu görüntüleri adlandırın ve ilgili XY görüntüsüyle kaydedin.
Bu protokol dört dilimli yöntem olarak adlandırılmıştır ve görüntüler Zen yazılımı veya ImageJ kullanılarak analiz edilebilir. Bir stimülasyon odası oluşturmak için, altı x 35 milimetrelik bir kuyu plakası alın ve dar bir havya kullanarak her bir kuyucuğun her iki tarafında bir santimetre arayla, çapı beş milimetreden küçük iki küçük açıklık oluşturun. Bir kez oluşturulduktan sonra, stimülasyon odası tekrar kullanılabilir.
Her bir kuyucuğun açıklıklarından bir çift gümüş veya platin tel geçirin. Yeniden kullanılabilir yapışkan malzeme, telleri yerinde tutmak ve teller arasında bir santimetre mesafe sağlamak için açıklıkların yanına uygulanabilir. Döllenmeden sonraki üç günde, balıkları üç koşula, balık orta kontrolüne, aktif olmayan ve aktif olmayan artı gövdeye bölün.
İnaktif ve inaktif artı kök grupları için, larvaları döllenmeden 72 saat sonra 0.6 milimolar trikain ile uyuşturun. Balıklar için orta kontrol balıkları, onları unnesthetized bırakın. Balık ortamında 60 mililitre% 2 agaroz hazırlayın.
Bir mikrodalga kullanarak iyice eritin ve soğumaya bırakın. Daha sonra trikain ekleyin ve stimülasyon odasının her bir kuyucuğuna en az dört mililitre dökün. Hemen elektrotlar arasına ısmarlama, dört kuyucuklu taraklar ekleyin.
Jelin ayarlanması için 10 dakika bekleyin. Dört dikdörtgen kuyucuk oluşturmak için tarakları dikkatlice çıkarın. Her bir kuyucuğu trikain suyuyla doldurun ve bir mikro pipet kullanarak her bir kuyucuğa, anteroposterior erişimleri elektrotlara dik olacak şekilde tek bir anestezi uygulanmış, inaktif artı kök larvası yerleştirin.
Diseksiyon floresan mikroskobu altında, her bir balığın her bir oda içinde tamamen uyuşturulup uyuşturulmadığını kontrol edin. Ayarlanabilir bir elektrofizyolojik, desen üreten uyarıcıyı, odanın bir tarafındaki her elektroda bağlı timsah klipslerini kullanarak bir polarite kontrolörü aracılığıyla odaya bağlayın. Daha sonra metin el yazmasında açıklandığı gibi balıkları teşvik edin.
Balıkların uyarıldığını doğrulamak için mikroskop altında düzenli olarak kontrol edin. Elektriksel uyaran, açıklanan parametreleri takip eden her beş saniyede bir görünür bir bilateral kasılmaya ve hafif bir harekete neden olmalıdır. Stimülasyondan sonra, balıkları plastik bir pipetle hafifçe yıkayarak her bir kuyucuktan dikkatlice çıkarın ve taze, trikain içeren bir balık ortamında inkübatöre geri dönün.
Trikain suyunu odanın içinden dökün ve agarozu her bir kuyucuktan kesmek ve çıkarmak için forseps kullanın, kuyucukları musluk suyuyla durulayın ve kurumasını bekleyin. Dört dilimli yöntem olarak adlandırılan kas büyüklüğünün analizi için zebra balığı larva kasının XY ve YZ görüntüleri elde edildi ve somit hacmi hesaplandı. Dört dilim ve tam yığın yöntemleri arasında güçlü bir korelasyon gözlendi, ancak dört dilim yöntemi biraz daha büyük bir hacim tahmini verdi.
16 ve 18 numaralı somitlerin bitişik miyotomlarının hacimsel analizi, her bir somitin arkadakine göre yaklaşık% 7 daha büyük olduğunu ortaya koymuştur. Daha ileri araştırmalar, sadece tek bir YZ ölçümü gerektiren iki dilimli bir yöntemin, miyotom hacminin makul derecede doğru bir tahminini verdiğini ortaya koymuştur. Miyotomun uzunluğu ve enine kesit alanı döllenmeden iki ila beş gün sonra tespit edilebilir şekilde büyüdü ve hacimde istikrarlı bir artışa yol açtı.
Döllenme sonrası üçüncü ve dördüncü gün arasında anestezik trikain tarafından inaktif hale getirilen kas, larva kas büyümesinin aktiviteye bağlı olduğunu gösteren hacmi önemli ölçüde azaltmıştır. Döllenmeden sonraki dört günde miyotom hacmini ölçerken, döllenmeden sonraki üç ve dört günde her bir balığın ölçülmesine kıyasla, miyotoz boyutunun azaltılmasında daha büyük bir değişiklik gözlenmiştir. Bununla birlikte, miyotom ölçümlerinin her iki yöntemi arasında miyotom hacminde anlamlı bir fark gözlenmedi.
Miyotom içindeki lif sayısının ve ortalama lif hacminin ölçülmesi, aktivitenin büyümenin her iki hücresel yönünü de kontrol ettiğini ortaya koymuştur. Larvaların taze hazırlanmış trikain kullanılarak tamamen uyuşturulduğundan emin olun. Parsiyel anestezi değişken sonuçlara yol açacaktır.
Bildiğimiz gibi, larvalar elektriksel stimülasyona daha güçlü tepki verir. Bu yöntem, aşağı akış transkriptomikleri ve farmakolojik deneylerle birleştirildiğinde, kuvvet algılamanın iskelet kasında büyümeyi nasıl yönlendirdiğine dair yeni bilgiler ortaya koymuştur.
