Sunulan protokol, oral biyofilmleri kontrol etmek için doğal ürünlerdeki biyoaktif adayların doğru taranır ve analiz edilir. Ayrıca diğer biyofilm araştırma alanlarındaki uygulamalar için de uyarlanabilir. Bu nişaste tarama ve analiz yöntemi, biyoaktif bileşenlerin aynı anda çıkarılmasını mümkün klar.
Diş çürükleri biyofilm diyeti türetilmiş, oldukça yaygın, kronik bir hastalıktır. Bu protokol, biyofilmleri ve dolayısıyla diş çürüklerini kontrol etmek için doğal ürünlerin tanımlanmasına yardımcı olabilir. Ekstraksiyon çözücüsüyü hidroalkolik bir karışımla hazırlayarak başlayın.
Ekstraksiyon çözücüsunun mililitresi başına 50 ila 100 miligram arasında konsantrasyonları örneklersiniz ve mikrotüplerde 15 dakikalık ultrason destekli ekstraksiyonlar gerçekleştirirsiniz. Çıkarma işlemini üç kez tekrarlayın. Her ekstraksiyon adımından sonra, katı kalıntının kafasını kesmek ve süpernatantı çıkarmak için numuneyi santrifüj edin.
Her ekstraksiyon adımındaki süpernatantları birleştirin ve filtreleyin. Aliquot'ları kimyasal analiz ve biyoassaylar için sakla. Fraksiyonasyon için, ilk ekstraksiyon çözücüsünü kullanarak mililitre çözeltisi başına 100 miligram elde etmek için ham ekstrakt örneğini seyreltin.
Ardından, bu numunenin bir mililitresini bir gram Emici ve altı mililitre kapasiteli ön koşullanmış bir katı faz çıkarma kartuşuna aktarın. Her ekstraksiyon LUN'un yaklaşık üç ölü hacmini kullanarak kesirleme gerçekleştirin ve LUN bileşimine göre bir kesir toplayın. Aliquotları kimyasal analiz ve biyoassaylar için sakla.
Çözücüyü vakum, azot akışı veya lyophilization altında çıkarın ve ağırlığı ve verimi kaydedin. Kuru maddeyi mümkün olan en iyi çözücülerle yeniden inşa edin. Metin el yazmasındaki formülü kullanarak stok çözeltisi için çözücü konsantrasyonunu hesaplayın.
S.mutans UA 159'un mikrobiyal suşunu kan agarı üzerinde yeniden etkinleştirin ve sıvı kültür ortamında kültür edin. Aynı kültür ortamını kullanarak başlangıç kültürünün bir ila 20 seyreltilmesini gerçekleştirin ve orta kütük büyüme aşamasına ulaşana kadar kuluçkaya yatırın. TYEG'de tanımlanmış bir popülasyona sahip inoculumu anti-mikrobiyal tahliller için ve biyofilm tahlilleri için %1 sakkaroz ile TYE hazırlayın.
Anti-mikrobiyal aktivite için, analiz için numunenin konsantrasyonu tanımlayın ve 96 kuyulu bir plakaya ekleyin. Metin taslağında açıklandığı gibi, her plakaya bir dizi denetim ekleyin. TYEG kullanarak hacmi 100 mikrolitreye ayarlayın, 100 mikrobiyal kültürü aşılayın ve plakayı %5 karbondioksitte 37 santigrat derecede 24 saat kuluçkaya yatırın.
Kuyuların görsel muayenesi ile bulanıklığa göre bakteri üremesini analiz edin. Belirli agar plakalarında istenen seyreltmenin bir aliquotunu kopyalarda aşılayın ve plakaları kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra koloni sayımları gerçekleştirin.
Hidroksiapatit boncukları mikrotüplerde tartın ve sterilize edin. Daha sonra boncukları yıkayın, adsorpsiyon tamponu kullanarak Ab.Bir tükürük filmi oluşturmak için mikrotüplere 500 mikrolitre tükürük ekleyin ve 40 dakika boyunca dakikada 24 dönüşle 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Tükürük süpernatantını çıkarın ve boncukları aşağı akış testlerine hazırlamak için Ab ile üç kez yıkayın.
Tükürük peliküllü boncuk içeren her mikrotüp içine numunenin veya kontrolün 500 mikrolitresini ekleyin ve 30 dakika boyunca dakikada 24 dönüş ve 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Boncukları Ab ile üç kez yıkayın.Her mikrotüpe 500 mikrobiyal kültür ekleyin ve tüpleri bir saat boyunca benzer koşullarda kuluçkaya yatırın. Ardından ilişkisiz hücreleri Ab arabelleği ile üç kez yıkayın.
Her numuneyi bir mililitre Ab arabelleğiyle yeniden dirildi ve 30 saniye boyunca yedi Watt'ta centicade. Her süspansiyonun aliquotlarını seri olarak seyreltin, on kat ve belirli agar plakalarına plakalayın. Plakaları %5 karbondioksitte 37 santigrat derecede 48 saat kuluçkaya yatırın ve kolonileri sayın.
Veri analizi için, biyoassayların ham verilerini bir elektronik tabloya girin ve her tedaviye göre mikrobiyal büyüme inhibisyonunun günlüğünü ve kontrole kıyasla mikrobiyal büyüme inhibisyonunun günlük yüzdesini hesaplayın. Okumaların optik yoğunluğunu düzeltin ve biyokütle inhibisyonunun yüzdesini hesaplayın. Üç çeşit C.sylvestris özünde, yani sylvestris, orta ve lingua'da Clerodane tipi diterpenler ve glikosillenmiş flavonoidlerin miktarı için biyolojik taramanın kimyasal profili burada gösterilmiştir.
Ham verilerin analizinden sonra, dört öz olumlu bir yanıt gösterdi. Bu dört özün kromatografik verileri Clerodane tipi diterpenlerin ve glikosillenmiş flavonoidlerin aynı anda varlığını göstermektedir. Ek olarak, aynı biyom ve çeşitliliği içerirler.
Tedavi edilen planktonik hücrelerin hesaplanan yüzde CFU'su, tedavi edilen biyofilmlerin yüzde biyokütlesi ve tedavi edilen biyofilmin yüzde CFU'su burada gösterilmiştir. Hiçbir ham ekstrakt tükürük pelikül yapışarak S.mutans hücrelerinin uzaklaştırılmasını önemli ölçüde etkilemedi. S.mutans hücrelerinin glukan matrisine yapışmışlığı, ham özlerden üçü tarafından zayıflatıldı.
Her bitki türü optimize edilmiş ve spesifik kimyasal analiz yöntemleri gerektirdiğinden, en iyi çözücü fraksiyonu ve analitik yöntem önceki raporlardan seçilmeli veya deneysel tasarımla tanımlanmalıdır. Biyofilmlerin ve boşlukların gelişmesini önlemek için en aktif ham ekstrakt ve fraksiyonlarla formülasyonlar hazırlamak ve bunları karmaşık modellerde test etmek önemlidir.
