Bu çalışma, Güney Teksas Teknoloji Yönetimi (POCrr 2009,041), Araştırma Kaynakları Ulusal Merkezi (UL 1RR025767) ile Tıp ve Bilim Entegrasyon Enstitüsü, gelen hibelerle ve Diş &amp; Kraniyofasiyal Araştırmalar Ulusal Enstitüsü (kısmen finanse edildi 5R21DE017294).

1. Fonksiyonlu Slaytlar hazırlanması <ol><li> Çıkarılabilir bir slayt rafa mikroskop yerleştirin ve% 99 etanol (histolojik grade) içeren bir boyama kavanoza daldırarak iki kez yıkayın. Slaytlar sıkıştırılmış azot gazı bir jet kullanarak kağıt havlu (kağıt tozu üretmek için değil sağlanması), ve kuru kullanarak temizleyin. </li></ol> NOT: ince kağıt tozu üretecek olarak slayt silmek için Kim-Mendil kullanmayın. <ol start="2"><li> Gece boyunca oda sıcaklığında konsantre sülfürik asit ve inkübe ile doldurulmuş bir boyama kavanoz slaytlar içeren kayar raf batırmak. </li></ol> NOT: Konsantre asitlere ve toksik ve korozif kimyasallar ile çalışırken Deri ile teması engellemek için, kimyasala dayanıklı eldiven ve koruyucu gözlük kullanın. <ol start="3"><li> 30 dakika boyunca Milli-Q ile 30 dk ve yıkama (MΩ 18) su kaydırağı sonikasyon, bir başka yıkama ile takip edin5 dk için cetone. Bu tedavi Camdaki silanol grupları ortaya koyar. </li><li> Coat, 30 dakika boyunca APTES içinde kayar raf daldırarak her bir yıkama 15 dakika süreyle Milli-Q su ile 3 defa, yıkama ve kabartma tarafından 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) çözeltisi,% 2.5 &#39;i ile temiz bir kaydırak (su içinde hacim / hacim) 110 azından bir fırın içerisinde slaytlar ° C&#39;de 15 dakika süreyle. Pişirme yüzeyinin-NH2-fonksiyonlandırmalar sonuçlanan APTES bir çapraz bağlantı sağlar. </li></ol> NOT: tercihen cam kap duvarlarında APTES mevduat yana plastik bir kapta APTES çözüm olun. <ol start="5"><li> Hidrofobik kaplama 6 arasında bir mono-tabaka elde etmek için% 1 (toluen içinde ağırlık / hacim) polistiren-Co-maleyik anhidrid (PS-MA) (Sigma) ile bir sıkma kaplayıcı, kaplama slaytlar kullanılması. 30 s için 3000 rpm&#39;de bir spin lak ve kat üzerine monte temiz bir cam slayt üzerine PS-MA 2.0 mL ekleyin. Bu koşullar, kaplama gibi spin kaplama parametreleri yüzden göre değişebilirDirekt Ekspres, zemin, kaplama kalınlığı ve aşağıdaki denklemi 7 tarafından yönetilir </li></ol><img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/3845/3845eq1.jpg" /> h film kaplama kalınlığı burada, E buharlaşma oranı, η, C ve ρ, sırasıyla, kaplama solüsyonu viskozite, konsantrasyon ve yoğunluğu, ve ω açısal hız olup. NOT: çeker ocak uzun bir zaman ve kullanım için solunduğunda Toluen zararlıdır önerilir. <ol start="6"><li> 8 ° C - slaytlar 2 kuru ve tozsuz bir ortamda bir ay kadar bir slayt rafta saklanabilir </li></ol> 2. Maya inokulum ve Kollajen Encapsulation hazırlanması <ol><li> C. bir gecede kültür hazırlayın Maya pepton dekstroz albicans soyu SC5314, [YPD; 10 g / L maya ekstresi, 20 g / L pepton ve 20 g / L dekstroz] C. tek bir koloni inokulastonu ile sıvı ortamın al10 içine bicans - YPD 8, 20 mL. 30 ° C&#39;da - orbital çalkalayıcı (200 rpm 150) kültür inkübe edin. 10 mM fosfat tamponu, 2.7 mM potasyum klorid,; Hasat 1 mL Candida albicans maya gece boyunca YPD kültürleri (5-10 dakika boyunca 5000 rpm&#39;de santrifüje edilerek) hücreleri ve steril 1 ml fosfat içinde 10 dakika süreyle iki defa yıkayıp (PBS tamponlu salin 137 mM sodyum klorid, yıkama başına pH 7.4) (Sigma). Hasat 10 dakika boyunca 1900 rpm&#39;de santrifüje edilerek ayrıca hücreleri yıkanmıştır. 1 ml yeniden tampon (2.2% (ağırlık / hacim) sodyum bikarbonat ve% 4.8 (ağırlık / hacim) HEPES, pH 7.2 ile 0.2 N NaOH) içinde yıkanmış hücreleri yeniden süspanse edin. </li></ol> NOT: C. albicans Risk Grubu 1/BSL1 mikroorganizmadır. Her zaman bu mikroorganizma ile çalışmak için iyi aseptik / steril teknikler kullanmak ve biyolojik tehlikeli malzemelerin uygun şekilde bertaraf edilmesi için kurumsal prosedürleri takip etmeyi unutmayın. <ol start="2"><li> Bir hemocyt kullanarak hücreleri hesaplamaparlak bir alan mikroskobu Ometer ve 5 hücre yoğunluğu × 10 7 hücre / ml için ayarlayın. </li><li> Daha da 10 ilavesiyle süspansiyonu on kat seyreltik × RPMI-1640 L-glutamin ve takviye morpholinepropanesulfonic (MOPS) asit (pH 7.2) ile tampon. </li><li> Kolajen (1.8 mg / mL) ile RPMI-1640 yılında hücre süspansiyonu ile karıştırılması kollajen maya hücrelerinin saklanması (fare kuyruk gelen tipi 1, BD Biosciences, Bedford, MA) / 4 arasında bir nihai konsantrasyon x 10 hücreleri 6 elde etmek için ml. Yazdırmadan önce kollajen jelleşme önlemek için buz üzerinde kollajen-hücre süspansiyonu tutun. </li></ol> 3. Ca BChip hazırlanması <ol><li> Temizleyin ve% 70 izopropanol silerek kaynak plaka istasyonu, yıkama ve vakum istasyonu, vakum slayt tabağı ve baskı odası da dahil olmak üzere microarrayer tüm yüzeyleri, dezenfekte edin. </li><li> Mic slayt güvertesinde PS-MA-kaplı cam istenilen sayıda koyun ve vakum ile tutunroarrayer. </li><li> Vorteks hücre kuvvetlice kollajen süspansiyon ve sadece baskı öncesinde, bir 96-kuyulu plakalı bir kuyuya iyi karıştırılmış süspansiyonun 100 uL aspire. Yükleme istasyonu bu kaynak plaka yerleştirin. </li><li> Baskı sürecinde mikroarray odasında% 100 bağıl nem korumak için nemlendirici açın. </li><li> Konik konik 190 mikron delikli seramik ipuçlarını kullanarak temassız birikimi sonucu mikroarray gözcü (Omnigrid Micro, Digilab Inc, Holliston, MA) kullanılarak 1.2 mm aralıklı noktalar ile 48 satır ve 16 sütun bir dizi hücre süspansiyonu 50 nL yazdır (Digilab). </li><li> Başbakan baskı her turdan sonra uçları iki kez durulayın ve vakum-kurulayın. </li><li> Hemen baskıdan sonra, bir hava-sıkı, nemli odasına (Hibridizasyon kaset, ArrayIt Corporation, Sunnyvale, CA) slayt koyun ve 37 ° C biyofilm oluşumuna imkan vermek için 24 saat inkübe edin. </li></ol> 4. Pr Duyarlılık TestiAntifungal Ajanlar Karşı Ca BChip içinde eformed Biyofilmler <ol><li> Antifungal ilaçların stok solüsyonları veya toz itibaren, RPMI-1640 ortamı içinde çalışan bir solüsyon hazırlanır. Çalışma çözeltisi, tipik maksimum konsantrasyon 1024 ug / ml ve flukonazol için amfoterisin B 5 için 16 ug / ml &#39;dir. Diğer konsantrasyonları farklı ajanlar için kullanılabilir. </li><li> Ortasında bileşiğinin yaklaşık IC50 ile bir aralık yayılma, iki misli dilüsyonları içinde stok çözeltisi seyreltilmesiyle bileşiğin farklı konsantrasyonları sekiz hazırlayın. </li><li> Biyofilm büyüme 24 saat sonra, en azından, (20 dakika süreyle sodyum hipoklorit ile muamele) pozitif (sadece ortam hiçbir ilaç, yani hücre) ve negatif birlikte, kontrol ilaçların sekiz farklı konsantrasyonları 50 nL yazdırmak için microarrayer kullanımı Altı biyofilmlerin üstüne çoğaltır. </li></ol> NOT: add ise lekelerin kurumasını önlemek için% 100 nispi nemi koruyunilaçlar ing. <ol start="4"><li> Kısa bir süre ilaç eklendikten sonra, 24 saat süreyle 37 ° C sıcaklıkta nemlendirilmiş bir odacık içinde ilaçları ile çip inkübe edilir. </li><li> CaBChip 2 dakika 3-5 kez PBS içinde her zaman dunking tarafından uyuşturucu yıkayın ve 37 0.5 mM FUN1 ile 30 ° C min 9 Ca BChip kuluçkaya leke. </li><li> Yıkayın her dunk 1-3 dakika PBS Ca BChip 3-5 kez smaç tarafından kapalı leke ve bir azot akımı kullanarak Ca BChip kurulayın. 380 PMT kazancı ile 532 nm dalga boyunda bir mikroarray tarayıcı (GenePix 4100A, Axon Instruments, CA) kullanılarak floresans yoğunluğu okuyun. </li><li> Pozitif kontrol (ilaç) ve% 100 ve% 0 ölü (çamaşır suyu ile tedavi) biyofilm lekelerin floresans şiddeti, sırasıyla ayarlayın. </li><li> Aşağıdaki denklem kullanılarak kontrol lekelerin ortalama göreli floresans yoğunluğunu (F) &#39;in redüksiyon oranı ile inhibisyonunu belirleme </li></ol><img alt="Denklem 2" src="/files/ftp_upload/3845/3845eq2.jpg" /> F, F max ve F o çiğ floresan uyuşturucu tedavi yoğunluk, hiçbir ilaç kontrolü ve çamaşır suyu ile tedavi edilen noktalar, sırasıyla nerede. Tarayıcı ayarlarını sırasıyla F max ve 30000 ve 4000 RFU F o, elde etmek ayarlandı. <ol start="9"><li> GraphPad Prism Software (La Jolla, CA) kullanılarak değişken eğimi Tepesi denklemi takılması ile% 50 inhibitör konsantrasyonu veya IC50 hesaplamak. </li></ol> 5.. Temsilcisi Sonuçlar 48 oluşan bir temsilci Ca BChip, × C nano-biyofilmlerin 16 dizi albicans, Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. Aydınlık alan mikroskobu nano-biyofilm genel bir mimari özellik gösterir. Mantar hifleri matris içinde gömülü olduğu biyofilm göstermektedir taramalı elektron mikroskobik görüntüleriçapı yaklaşık 2 um ile 100 nm olan elyafları kolajen, sırasıyla. FUN1 lekeli mikroarray tarayıcı görüntüleri fungal biyofilm karakteristik maya ve hifal formlar, göstermektedir. FUN1 lekeli biyofilmlerin 2D ve 3D-konfokal floresans görüntüleri dışı matriks (tarafından da üretilen exopolymeric malzeme kapsülleme malzemesi ve büyük ihtimalle de kollajen oluşmaktadır içinde serpiştirilmiş metabolik olarak aktif hücre bölgeleri ile, mekansal heterojen olması görülebilir metabolik boya ile boyanan değildir biyofilm hücreleri). Biyofilm kalınlığı yaklaşık 50 mikron olarak tahmin edilmiştir. Ca BChip iki ilaç, flukonazol ve amfoterisin B antifungal duyarlılık tahmin etmek için kullanıldı ve sonuçları Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. Endüstri standardı 96-plaka deneyleri yayınlanan raporlar ile uyumlu olarak, biyofilm flukonazol 10 ve hesaplanan IC 50 dayanıklı<html> amfoterisin B 0.3 mg / mL 11&#39;dir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3845/3845fig1.jpg" /> Ca BChip imalatı için Şekil 1. Akış çizelgesi. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3845/3845fig2.jpg" /> Şekil 2. Baskılı yüksek thoughput Ca BChip, bir resmi bir robot microarrayer kullanarak ve PS-MA-kaplı slaytlar üzerinde 768 lekeler içeren. Her yarım küre spot çapı yaklaşık 700 mikron ve noktalar arasında 1.2 mm ayrılması ile, hacmi 50 nL olduğunu. Ayrıca (saat yönünde) gösterilen ışık mikroskobu, mikroarray tarayıcı, 2D ve 3D-floresan mikroskobu ve Ca BChip üzerinde bireysel biyofilmlerin elektron mikroskobu görüntüleri taramak vardır. 25.000 x yüksek büyütmede SEM rakam genişliği 2 um hifal filament gösterir. Şekil 3 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3845/3845fig3.jpg &quot;/&gt; Şekil 3. Ca BChip kullanarak (A) flukonazol ve (B) amfoterisin B için IC50 değerleri antifungal duyarlılık testi ve kararlılık Sonuçları. Amfoterisin B-arıtılmış biyofilmlerin floresans mikroskobu görüntüleri (C) &#39;de gösterilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart hata 10 içeren iki ayrı yongaları için ortalama olarak her bir durum için çoğaltır.

<ol>
	<li>Edmond, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+bloodstream+infections+in+United+States+hospitals:+a+three-year+analysis.">Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis.</a> Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).</li><li>Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+multidrug+efflux+pumps+in+relation+to+fluconazole+resistance+in+Candida+albicans+biofilms.">Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms.</a> J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).</li><li>Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+High-Throughput+Candida+albicans+Biofilm+Chip.">Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip.</a> PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).</li><li>Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+biofilm+formation+by+Candida+albicans.">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).</li><li>Pierce, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+reproducible+96-well+plate-based+method+for+the+formation+of+fungal+biofilms+and+its+application+to+antifungal+susceptibility+testing.">A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing.</a> Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).</li><li>Lee, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cellular+microarray+for+high-throughput+toxicology+assays.">Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).</li><li>Meyerhofer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+resist+films+produced+by+spinning.">Characteristics of resist films produced by spinning.</a> Journal of Applied Physics. 49, (1978).</li><li>Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+method+for+in+vitro+antifungal+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+biofilms.">Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).</li><li>Chandra, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+by+the+fungal+pathogen+Candida+albicans:+Development,+architecture,+and+drug+resistance.">Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance.</a> Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).</li><li>Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+biofilms+and+drug+resistance.">Fungal biofilms and drug resistance.</a> Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).</li><li>Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+activity+of+amphotericin+B,+caspofungin+and+posaconazole+on+Candida+albicans+biofilms+in+intermediate+and+mature+development+phases.">Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases.</a> Mycoses. 53, 208-214 (2010).</li></ol>

Jose L. Lopez-Ribot ve antifungal ajanlar geliştiriyor MicrobeHTS Technologies, Inc, Anand K. Ramasubramanian kendi öz. MicrobeHTS Technologies, Inc bu çalışmalar için mali destek sağladı.

Biz Candida albicans biyofilmlerin nanoliter ciltten oluşan hücre tabanlı yüksek yoğunluklu mikroarray, Ca BChip geliştirdik. Mikroarray olmayan yayılan, hemisferik 3D jel için gerekli hidrofobluğu sağlarken kollajen jel lekelerin sağlam eki için izin modifiye cam malzeme üzerine basılmıştır. A tek bir Ca BChip yaklaşık sekiz 96-kuyucuklu plaklar yerini alabilir ve birkaç yongaları aynı anda basılır ve işlenebilir. Çip, nano ölçekli kültürler kullanır kolay ve h?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 440140 </td></tr><tr><td> Polistiren-Co-maleyik anhidrid (PS-MA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 426946 </td></tr><tr><td> Cam mikroskopi slaytlar </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-549-3 </td></tr><tr><td> Fare kuyruk kolajeni tip I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354236 </td></tr><tr><td> Robotik Microarrayer </td><td> Omnigrid Micro </td><td> MICROSYS4000/4100A </td></tr><tr><td> Mikroarray Tarayıcı </td><td> Genepix Kişisel 4100A </td><td> GENEPIX4100A </td></tr><tr><td> Hibridizasyon Kaset </td><td> ArrayIt Şirketi </td><td> AHCXD </td></tr><tr><td> FUN1 [2-klorro-4-(2,3-dihidro-3-metil-(benzo -1,3-tiyazol-2-il)-metilliden)-1-fenil quinoliniumiodide] </td><td> Invitrogen Corp </td><td> F-7030 </td></tr><tr><td> Flukonazol </td><td> Sicor Pharmaceuticals, Inc </td><td> J02AC01 </td></tr><tr><td> Amfoterisin B </td><td> Sigma </td><td> A2411 </td></tr><tr><td> RPMI-1640 </td><td> Mediatech, Inc </td><td> 50-020-PC </td></tr><tr><td> Seramik İpucu 190 mikron orifis </td><td> Digilab </td><td> 60020441-00 </td></tr><tr><td> GraphPad Prism Yazılımı </td><td> GraphPad Software, Inc </td><td></td></tr><tr><td> Genepix Pro V4.1 </td><td> Molecular Devices </td><td></td></tr></tbody></table>

candida albicans biofilm chip (cabchip) for high-throughput antifungal drug screening

Candida albicans şu anda ABD hastanelerinde 1 dördüncü en sık görülen nozokomiyal kan dolaşımı enfeksiyonu temsil kandidiazis ana etyolojik ajan kalır. Bu fırsatçı enfeksiyonlar tehlikeye bireylerin sayısının artmasıyla için büyüyen bir tehdit ve kabul edilemez yüksek mortalite oranları taşırlar. Bu en sık kullanılan antifungal ajanlara karşı direncin ortaya çıkmasına da antifungal ilaçların sınırlı cephaneliği nedeniyle kısmen, ama. Ileri tedavi komplike kandidiyazis tezahürleri çoğunluğu biyofilmlerin oluşumu ile ilişkili olduğu bir gerçektir ve bu biyofilm içindeki hücrelerin klinik olarak en kullanılan antifungal ajanlar 2 direnç seviyelerinin artmasına göstermektedir. Burada C. oluşan bir yüksek yoğunluklu mikroarray geliştirilmesi tarif Biz Ca BChip 3 adında var albicans nano-biyofilmlerin. Kısaca, bir robot microarrayer t kullanılırC. o baskı maya hücreleri sağlam bir zemin üzerine albicans. Baskı sırasında, maya hücreleri gibi nL 50 kadar düşük ve uygun bir kaplama ile birlikte bir cam zemin üzerinde immobilize bir birimi kullanılarak, üç boyutlu bir matris içine alınır. İlk baskıdan sonra, slaytlar biyofilm geliştirilmesi için izin vermek için 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. Bu dönemde noktalar olgun C ile ilişkili tipik yapısal ve fenotipik özellikleri göstermeyen tam gelişmiş &quot;nano-biyofilm&quot; içine büyümek albicans biyofilm (yani morfolojik karmaşıklığı, üç boyutlu mimari ve ilaç direnci) 4. Genel olarak, Ca BChip ~ 750 eşdeğeri ve mekansal farklı biyofilm oluşur; birden fazla fiş baskılı ve aynı anda işlenebilir olduğu ek avantaj. Hücre canlılığı FUN1 metabolik floresan yoğunluğu mikroarray tarayıcı kullanarak lekeyi ölçerek tahmin edilmektedir. Bu mantar çip ideal u için uygundurantifungal ilaç keşfi için gerçek yüksek verimlilik tarama se. Mevcut standartlar (yani biyofilm 5 96-mikrotiter plate modeli) ile karşılaştırıldığında, fungal biyofilm çip ana avantajları otomasyon, minyatür, miktarı ve reaktifler ve analizler zaman maliyet tasarrufu, hem de işçiliğinin ortadan kaldırılmasına olan yoğun adımları. Biz çip önemli antifungal ilaç keşfi sürecini hızlandırmak inanıyorum.

Watch this Scientific Journal Video about Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening at JoVE.com

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Biz 3D nano-biyofilm oluşan yüksek yoğunluklu mikroarray platformu geliştirdi<em&gt; C. albicans</em&gt; Denir<em&gt; Ca</em&gt; BChip. Ilaç duyarlılık profili bir test<em&gt; Ca</em&gt; BChip mantar çip ideal antifungal ilaçların gerçek yüksek verimli görüntüleme için uygundur düşündüren, geleneksel 96-plaka modeli ile karşılaştırılabilir.

Yüksek verim Antifungal İlaç Tarama Candida albicans Biyofilm Chip (Ca BChip)

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

candida-albicans-biofilm-chip-cabchip-for-high-throughput-antifungal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

13.6K Görüntüleme.  University of Texas at San Antonio. Biz 3D nano-biyofilm oluşan yüksek yoğunluklu mikroarray platformu geliştirdi C. albicans Denir Ca BChip. Ilaç duyarlılık profili bir test Ca BChip mantar çip ideal antifungal ilaçların gerçek yüksek verimli görüntüleme için uygundur düşündüren, geleneksel 96-plaka modeli ile karşılaştırılabilir.

Video: Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates. It is ideal for medium- to high-throughput screens in academic settings. It has an integrated fluid transfer module equipped with a multi-channel pipetter and the machine reads one column at a time to monitor fluorescence changes of a variety of fluorescent reagents. For example, FlexStation 3 has been used to study the function of Ca2+-permeable ion channels and G-protein coupled receptors by measuring the changes of intracellular free Ca2+ levels. Transient receptor potential (TRP) channels are a large family of nonselective cation channels that play important roles in many physiological and pathophysiological functions. Most of the TRP channels are calcium permeable and induce calcium influx upon activation. In this video, we demonstrate the application of FlexStation 3 to study the pharmacological profile of the TRPA1 channel, a molecular sensor for numerous noxious stimuli. HEK293 cells transiently or stably expressing human TRPA1 channels, grown in 96-well plates, are loaded with a Ca2+-sensitive fluorescent dye, Fluo-4, and real-time fluorescence changes in these cells are measured before and during the application of a TRPA1 agonist using the FLEX mode of the FlexStation 3. The effect of a putative TRPA1 antagonist was also examined. Data are transferred from the SoftMax Pro software to construct concentration-response relationships of TRPA1 activators and inhibitors.

This video provides a detailed protocol for studying the pharmacological profile of human TRPA1 channels using FlexStation 3. The protocol covers details of cell preparation, dye loading and operation of the microplate reader, FlexStation 3.

FlexStation kullanarak 3 TRP Kanal İşlevleri Yüksek Verimli Tarama Orta Hücre tabanlı Kalsiyum Testi

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Biyomühendislik

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Biyomalzemelerin Yüksek Verimli Discovery için Polimer Mikroarray&#39;ler

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) within the drug-loaded protein, based on the differential fluorescence signal emitted by the Au NCs. Albumin proteins such as human serum albumin (HSA) and bovine serum albumin (BSA) are selected as the model proteins. Four small molecular drugs (e.g., ibuprofen, warfarin, phenytoin, and sulfanilamide) of different binding affinities to the albumin proteins are tested. It was found that the formation rate of fluorescent Au NCs inside the drug loaded albumin protein under denaturing conditions (i.e., 60 &#176;C or in the presence of urea) is slower than that formed in the pristine protein (without drugs). Moreover, the fluorescent intensity of the as-formed NCs is found to be inversely correlated to the binding affinities of these drugs to the albumin proteins. Particularly, the higher the drug-protein binding affinity, the slower the rate of Au NCs formation, and thus a lower fluorescence intensity of the resultant Au NCs is observed. The fluorescence intensity of the resultant Au NCs therefore provides a simple measure of the relative binding strength of different drugs tested. This method is also extendable to measure the specific drug-protein binding constant (KD) by simply varying the drug content preloaded in the protein at a fixed protein concentration. The measured results match well with the values obtained using other prestige but more complicated methods.

A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

Protein-Hedefleme Küçük Molekül İlaç Tarama için hızlı ve Nicel florimetrik Yöntemi

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Tomoauto kullanma: Bir Protokol Yüksek verim Otomatik Cryo-elektron Tomografi için

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.

A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.

Tıbbi Cihazlar Bakterilerin yüksek verimlilik Kimlik Savar Polimerler

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these procedures in basic research and preclinical drug development, it is important to develop protocols for automated generation and analysis under standardized conditions. Here, we present a technique to generate engineered heart tissue (EHT) from cardiomyocytes of different species (rat, mouse, human). The technique relies on the assembly of a fibrin-gel containing dissociated cardiomyocytes between elastic polydimethylsiloxane (PDMS) posts in a 24-well format. Three-dimensional, force-generating EHTs constitute within two weeks after casting. This procedure allows for the generation of several hundred EHTs per week and is technically limited only by the availability of cardiomyocytes (0.4-1.0 x 106/EHT). Evaluation of auxotonic muscle contractions is performed in a modified incubation chamber with a mechanical interlock for 24-well plates and a camera placed on top of this chamber. A software controls a camera moved on an XYZ axis system to each EHT. EHT contractions are detected by an automated figure recognition algorithm, and force is calculated based on shortening of the EHT and the elastic propensity and geometry of the PDMS posts. This procedure allows for automated analysis of high numbers of EHT under standardized and sterile conditions. The reliable detection of drug effects on cardiomyocyte contraction is crucial for cardiac drug development and safety pharmacology. We demonstrate, with the example of the hERG channel inhibitor E-4031, that the human EHT system replicates drug responses on contraction kinetics of the human heart, indicating it to be a promising tool for cardiac drug safety screening.

Here, we show the generation of human engineered heart tissue from induced pluripotent stem cells (hiPSC)-derived cardiomyocytes. We present a method to analyze contraction force and exemplary alteration of contraction pattern by the hERG channel inhibitor E-4031. This method shows high level of robustness and suitability for cardiac drug screening.

Kardiyak İlaç güvenlik Taraması için insan mühendisliği kalp dokusunun Otomatik Büzülme Analizi

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

Enjekte edilebilir rejeneratif terapi ve yüksek-den geçerek uyuşturucu tarama için 3D Microtissues

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Yüksek üretilen iş kullanımı otomatik Microbioreactor sistemi modeli Igg1 CHO hücrelerdeki imalatı için

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well as large-scale high-throughput screening (HTS) campaigns. Though laboratory automation has greatly increased the utility of microplates there remain instances where automation-based instrumentation is not feasible, cost-effective or compatible with microplate formatting needs. In these cases, microplates must be manually prepared. Problematic to manual microplate manipulations is that a number of difficulties can arise pertaining to the accurate tracking of sample operations, data record keeping and quality control (QC) inspection for well artifacts or formatting errors. As microplate well densities increase (i.e., 96-well, 384-well, 1536-well) the potential for introducing errors also drastically increases.&#160; Moreover, for small bench-top laboratory operations there exists a need to improve the ease and accuracy of sample handling in a cost-effective fashion. Herein, we describe a system that acts as a semi-automated pipetting guide referred to as the Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.). &#160;M.A.P.L.E. has multiple uses for supporting compound hit-picking and microplate preparation for assay development in high-throughput screening or laboratory benchtop operations, as well as QC/quality assurance (QA) diagnostic evaluation of microplate quality or visualizing well formatting errors.

Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.) is a computer-driven device that systematically illuminates microtiter wells to provide guidance for the manual preparation of microplates.&#160; M.A.P.L.E. improves the accuracy of microplate preparation while automating data recordkeeping. &#160;In addition, it can assist with examining microplate quality or aid in the detection of errors.&#160; &#160;

Açık Kaynak Mikroplaka Uyumlu Aydınlatma Panelleri Uygulamaları

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...