The authors thank Dr. Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) for support and discussion, Ms. Ann Kim for optimizing the B cell isolation protocol, Dr. Joseph Brzostowski for his help with microscopy, and Ms. Mirna Pe&#241;a for maintaining the animals used. This study was supported by the Intramural Research Programs of the National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, and National Heart, Lung, and Blood Institute.

Tüm hayvan deneyleri NIAID Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı LIG-4 hayvan protokolüne uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Reaktiflerin 1. Hazırlık <ol><li> Manyetik ayırma (MS) tamponu hazırlayın:% 0.5 BSA, 2 mM EDTA ve% 0.5 BSA ile takviye edilmiş, otomatik ayırma çözeltisi ile takviye edilmiş PBS (pH 7.2). 2-8 ° C&#39;de steril filtre (0.22 um) ve mağaza. </li><li> RF10 orta hazırlayın: RPMI 1640 ortam,% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu, 50 U / ml penisilin, 50 uM streptomisin, 1 mM sodyum piruvat, 2 mM L-glutamin, 0.1 mM temel olmayan amino asitler ile takviye edilmiş 50 uM 2 p-merkaptoetanol, 10 mM HEPES. Steril reaktif kullanın. 2-8 ° C&#39;de steril filtre ve mağaza. </li><li> 1 mM sodyum piruvat, 2 mM L-glutamin ve 25 mM glukoz ile desteklenmiş XF taban ortamı: mitokondriyal stres testi hazırlarlar. </li><li> glikoliz stres testi ortamı hazırlayın: XF taban orta supplemen2 mM L-glutamin ile ted. </li><li> 2-8 ° C&#39;de 7.4, steril filtre ve mağaza için mitokondriyal ve glikoliz stres testi medya hem de pH ayarlayın. kullanım (37 ° C&#39;de pH ölçümleri yürütmek) önce 37 ° C ve sıcak ortam pH&#39;ı yeniden ayarlayın. Not: XF ortamının kullanılması, bikarbonat yoksun önemlidir. Hücre dışı akı analizörü atmosfer sadece ortam CO 2 içerdiğinden, orta herhangi bikarbonat, glikoliz bir yan ürünü olarak piyasaya proton bağlanması üzerine CO 2 ve su oluşturur ayırmak olacaktır. CO 2 olacak glikolitik asitlenme sinyalini belirsiz olacağını pH sürükleniyor neden deney sırasında gazdan arındırın. </li><li> oligomycin hazırlayın: 10 mm DMSO stok çözeltisi hazırlayın; -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> 2,4-DNP hazırlayın: DMSO 1 M stok çözeltisi hazırlayın; -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> antimisin hazırlayın: 10 mm DMSO stok çözeltisi hazırlayın; -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> rotenone hazırlayın: 10 mM s hazırlayınDMSO içinde tak solüsyonu; -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> glikoz hazırlayın: 250 mM çözelti oluşturmak üzere glikoliz stres testi ortamında glukozu eritin; Her deneyden önce taze hazırlamak ve donma yok. </li><li> 2-DG hazırlayın: 500 mM çözelti oluşturmak üzere glikoliz stres test ortamında 2-DG katı eritin; Her deneyden önce taze hazırlamak ve donma yok. </li></ol> 2. fareler ile Hasat dalak ve lenf düğümlerinde <ol><li> Servikal dislokasyon tarafından takip CO 2 boğulma fare Euthanize. </li><li> % 70 etanol ile fare püskürtün. </li><li> sonraki T hücre izolasyonu için, dalak, yüzeysel servikal, yüzeysel / derin aksiller, çene, kasık ve mezenterik lenf düğümleri hasat. </li><li> sonraki B hücre izolasyonu için, hasat sadece dalak. NOT: Bir biyogüvenlik kabini kullanın ve işleme kadar buz üzerinde PBS veya RF10 medyada hasat organları tutmak. tüm işlem ve isol için steril laboratuar aletlerinin ve steril tekniği kullanıntirme adımlar. izolasyon verimliliğini artırmak ve hücre ölümünü azaltmak için buz üzerinde tüm tamponları ve medya tutun. </li></ol> 3. Doku İşleme <ol><li> 50 ml&#39;lik konik bir tüp üzerinde 70 mikron hücre süzgeç yerleştirin ve süzgeç üzerine organları aktarın. T hücre izolasyonu için, tüm organları birleştirmek ve B hücre izolasyonu transferi sadece dalak için. </li><li> steril 3 ml şırınga pistonu kullanarak, süzgecinden doku ezin. ezme esnasında, filtre ve organlar her zaman nemli olduğundan emin olun ve MS tampon ekleyerek gerektirdiği gibi onları ıslatın. Bu, hem yüksek hücre viyabilitesini tutmak ve filtrenin tıkanmasını engeller. </li><li> ezme sonra, 5-10 uygulamak ml MS hücre kurtarma artırmak için filtreye tampon. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de süspansiyon santrifüjleyin. (Belirtilmedikçe, bu koşullar altında diğer tüm santrüfüj yürütmek). </li><li> Sıvı süzün ve 5 mi ACK alyuvar lisiz tamponu içinde tekrar süspansiyon pelet. incuBuz üzerinde 5 dakika boyunca kesmek (bunlar manyetik ayırma ile müdahale için kırmızı kan hücreleri kaldırılması gerekir), kırmızı kan hücreleri lize etmek için. 10-20 ekle ml MS tampon ve santrifüj. </li><li> 1 ml MS tamponu (eritrosit lizis enkaz kaldırmak bu filtrasyon) ile 15 ml konik tüp üzerinde 30 mikron hücre filtresi yerleştirin ve prime. santrifüj tüpten çıkan sıvı tortusundan ayırma, tampon ve filtre içinden geçmek 5 mi MS pelet tekrar süspansiyon. Hücre kurtarma artırmak ve filtreyi durulayın bu kullanmak için 4 ml MS tamponu ile ilk tüp yıkayın. </li><li> Hemasitometre veya otomatik hücre sayacı, hücrelerin toplam sayısını belirler. Bu hücre sayısı, splenositler daha sonra hücre dışı akı deneyinde kullanılacak ise, Bölüm 4&#39;te gerekli manyetik ayırma reaktifleri miktarının belirlenmesi için kullanılan bu zamanda hücrelerin uygun sayıda kenara olacaktır. </li><li> süspansiyon Santrifüj ve manyetik ayırma geçin. Süspanse Splenositler kullanılmazve 5 ml RF10 B hücre izolasyonu için hücre dışı akı analize kadar buz üzerinde tutmak. </li></ol> B hücreleri ve naif CD4 + T hücrelerinin 4. Manyetik Ayırma <ol><li> biyotin-antikor kokteyli, anti-biyotin mikro-ve MS tampon gerekli hacimleri belirler. Bir kılavuz olarak 10 8 hücreleri için aşağıdaki miktarlar kullanın ve büyütmek ya da gerektiğinde aşağı. Not: bir buzdolabında çok buz üzerinde daha antikor bağlanma etkinliği ve daha uzun inkübasyon süreleri gerekli olabilir azaltabilir buz üzerinde inkübe yana örnekleri inkübe edin. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> Naif CD4 + T hücre ayrılması için reaktifler </td><td> 10 8 hücreleri için hacim </td></tr><tr><td> (uygun ölçek) </td></tr><tr><td> Biotin-antikor kokteyli </td><td> 100 ul</td></tr><tr><td> birinci kuluçkalamada MS tamponu </td><td> 400 ul </td></tr><tr><td> Anti-biyotin mikro- </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> CD44 mikroboncuklarının </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> ikinci inkübasyon için MS tampon </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td colspan="2"> 5 dakika boyunca 4 ° C &#39;de, biyotin-antikor kokteyli ve hücreler inkübe edin. anti-biyotin mikroboncukları, CD44 mikroboncukları ekleme MS tamponu ve 15 dakika boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </td></tr></tbody></table> Tablo 1: T hücre izolasyonu hacimleri ve talimatlar. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> B hücre ayrılması için reaktifler </td><td> 10 8 hücreleri için hacim </td></tr><tr><td> (uygun ölçek) </td></tr><tr><td> Biotin-antikor kokteyli </td&gt; <td> 100 ul </td></tr><tr><td> birinci kuluçkalamada MS tamponu </td><td> 400 ul </td></tr><tr><td> Anti-biyotin mikro- </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> ikinci inkübasyon için MS tampon </td><td> 300 ul </td></tr><tr><td colspan="2"> 15 dakika boyunca 4 ° C &#39;de, biyotin-antikor kokteyli ve hücreler inkübe edin. biyotin-antikor kokteyli ve MS tamponu uygun hacimde ekleyin ve 15 dakika boyunca 4 ° C&#39;de karışım inkübe edin. anti-biyotin mikroboncuk uygun hacimde ilave edin ve MS tamponu ve 15 dakika boyunca 4 ° C&#39;de karışım inkübe edin. ikinci bir inkübasyondan sonra, MS tamponu ve santrifüj ile tüp doldurun. </td></tr></tbody></table> Tablo 2: B hücre izolasyon hacimleri ve talimatlar. <ol start="2"><li> MS tamponu pelletini: el ayrılması için 500 ul, otomatik ayırma 3-4 ml. </li><li> manuel veya otomatik ayrımları ya devamaşağıdaki gibi: <ol><li> Manuel Ayırma: <ol style="margin-left: 40px;"><li> 3 mi MS tamponu ile yıkanarak akışı ve asal kolon toplamak için aşağıdaki steril bir 15 ml konik bir tüp yerleştirmek ayırma mıknatıs bir LS sütun ekle. akış atmak. </li><li> astarlanmış LS sütun hücre süspansiyonu aktarın ve geçmesine izin; MS tampon ve aynı zamanda sütun üzerinden bu geçiş 3 ml inkübasyon sırasında kullanılan tüp yıkayın. Eluat saflaştırılmış hücreleri içerir. B hücre izolasyonu için, yeni bir 15 ml tüp içine sütunu içinden ikinci kez saflaştırılmış hücreleri geçer ve yıkama adımı tekrar edin. Bu saflık ve verim artacaktır. </li></ol></li><li> Otomatik Ayırma: <ol><li> Otomatik separatör açın ve tampon çalışan solüsyonu ve% 70 Etanol durulama düzeylerini kontrol edin. Atık ayırma başlamadan önce boş olduğundan emin olun. </li><li> t tüp boyutuna bağlı olarak uygun soğutulmuş raf seçinO saflaştırılmamış örneği (örneğin, 15 mi). ayırma süreci boyunca canlı hücreleri tutmak için, daha önce 3-4 saat boyunca 2-8 ° C&#39;de soğutulmuş olan rafları kullanın veya kadar soğutucu katı hale gelir. </li><li> Otomatik ayırıcı örnek sahnede soğutulmuş raf monte edin. </li><li> yuva A1, yuva B1 olumsuz kısmı için bir tüp içinde örnek tüp, ve C1 pozitif kısmı için bir tüp yerleştirin. Birden fazla numune toplama, bir sonraki sütunlara (A2, B2, C2, vb) ilave tüpleri. </li><li> dokunmatik ekranda ayırma sekmesini seçin ve raf tüplerin düzenlemeyi göstermektedir. ayırma menüsünden, &quot;tüketir&quot; programı seçin ve yıkama uygun tip programı döngüsünü tamamlamak (aşağıdaki nota bakınız). NOT: &quot;tüketir&quot; programı saflığı ön planda makinenin en hassas modunu kullanarak tükenmesi yürütmektedir. Buna ek olarak, üç farklı yıkama seçeneği vardır: quic, Durulama durulayın ve uyku k. Numuneler aynı kaynaktan gelen ve kombine edilecekse, hızlı durulama seçin. Numuneler ayrı tutulması ise, durulama seçin. başka izolasyonlar o gün yapılacaktır eğer uyku seçeneği seçin ve makine izolasyonu aşağıdaki kapatılacak eğer </li><li> &quot;Çalıştır&quot; tuşuna basarak izolasyon başlatın ve istendiğinde tampon seviyelerini onaylayın. Program sona erdikten sonra, negatif fraksiyon saflaştırılmış hücreler içerir. </li></ol></li><li> MS tampon ve santrifüj ile 15 ml konik tüp kadar doldurun. </li><li> MS tampon ve tekrar süspansiyon hücreleri 5 ml RF10 medyada süzün. Hücre dışı akı analize kadar buz üzerinde hücreleri tutun. NOT: İdeal olarak, hücre dışı akı tahlil izolasyon hemen sonra yapılmalıdır. Ancak, ön deneylerde deney sonuçlarında önemli bir fark taze olarak yalıtılmış olanlar karşı tecrit 3 saat içinde kullanılan hücrelerde gözlendi. </li></ol></li></ol> Not: burada açıklanan protokol aracının 96 oyuklu bir formatta içindir. Başka bir biçim kullanılırsa Ciltler ayarlanması gerekir. <ol><li> Sensör Kartuşu hidrasyon <ol><li> kalibrant çözeltide sensörleri daldırarak, sensör kartuşunu yukarı kaldırın kalibrant çözeltisi 200 ul yarar plakanın Her çukurun dolgu ve yardımcı plaka üzerine sensör kartuşu indirin. NOT: kalibrant çözüm seviyesi batık sensörleri tutmak için yeterince yüksek olduğundan emin olun. Kartuş her bir kuyu için O 2 ve H + ilişkili florofor limanlar; bunları düzgün çalışması için, bu sırayla hidre edilmesi gerekir. </li><li> Olup CO2 veya oksijen / azot ile desteklenmiş 37 ° C kuluçka makinesi içinde kartuşu yerleştirin. belirtilmediği sürece, bu koşullar altında diğer tüm inkubasyon yürütmek. nemlendirmek için gece kartuşu inkübe edin. </li></ol></li><li> preparYapışkan kaplı plakalar arasında ation <ol><li> 0.1 M sodyum bikarbonat içinde 22.4 ug / ml yapışkan çözeltinin 2.5 mi hazırlanması, pH 8.0 (bikarbonat yapıştırıcı adsorpsiyonu için uygun pH sağlar). </li><li> deney plakasının her oyuğuna çözeltisi 25 ul uygulanır ve 20 dakika için oda sıcaklığında tezgah üzerinde inkübe edin. </li><li> Aspire yapıştırıcı ve her bir yıkama iki steril su, 200 ul kullanılmıştır. kuyular hücrelerin ekim önce kuruyana kadar bekleyin. </li></ol></li><li> Yapışkan kaplı plakalar hücreleri tohumlama <ol><li> 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de oda sıcaklığında santrifüje hücreleri. Uygun tahlil ortamı, 5 ml içinde süspanse hücreleri (mitokondriyal stresi ve glukoz gerilme ortam formülasyonu için yukarıya bakınız). deney ortamı istenen konsantrasyonda Santrifüj tekrar hücreleri ve tekrar süspansiyon (tabanda hacmi konsantrasyonuna göre değişir, her kuyu hücre süspansiyonu 180 ul içerecektir). NOT: Uygun tahlil medya ve bileşik süreces dışı akı analizörü aynı anda aynı plaka üzerinde mitokondriyal ve glikoliz stres testleri çalıştırabilirsiniz kullanılmaktadır. </li><li> her bir hücre süspansiyonu 180 ul Plate. arkaplan sıcaklık düzeltmesi için kuyu A1, A12, H1 ve H12 kullanın: bu kuyulardan (hiçbir hücreleri) deney ortamı 180 ul ekleyin. </li><li> 37 ° C&#39;de 25 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> Tüm hücreler tam takılı olmasını sağlamak için hiçbir fren ile 5 dakika boyunca 200 xg&#39;de plaka santrifüj. Görme hücreleri stabil mikroskop altında görüntüleyerek, bir tek tabaka oluşturan, kültür yüzeye yapışık olduğunu doğrulamaktadır. ilave bir 30 dakika boyunca geri plakaları aktarın. </li></ol></li><li> Bileşiklerin 10x Konsantrasyonlarına hazırlanması ve Enjektör Limanlar Yükleme <ol><li> mitokondriyal stres testi için, 10 uM oligomycin, 1mM DNP ve mitokondriyal stresi deney Mediu&#39;nun 10 uM rotenone ve 10 uM antimisin, her bir karışımının her bir 2.5 mL hazırlanmasım. Not: 2,4-DNP konsantrasyonu, daha önce yayınlanan çalışmalara dayanmaktadır; 21, bu genel bir kural olarak, ancak bir araştırmacı tarafından belirlenmelidir kullanılan her hücre tipi için uncoupler konsantrasyonudur. </li><li> glikoliz stres testi için, 2.5 mi, 250 mM glukoz, 10 uM oligomycin ve glikoliz gerilme deney ortamı içinde 500 mM 2-deoksiglukoz (2-DG) her hazırlanması. </li><li> Sıcak 10x 37 ° C solüsyon ve pH 7.4 ayarlanır. </li><li> aşağıdaki gibi bir çok kanallı micropipettor ve yükleme kılavuzları kullanarak kartuşun uygun enjektör portlarına bileşikleri yükleyin: <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Liman </td><td> Mitokondriyal Stres Testi </td><td> Glikoliz Stres Testi </td></tr><tr><td> bir </td><td> 20 ul oligomycin </td><td> 20 ul glukoz </td></tr><tr><td> B </td><td> 22 ul 2,4-DNP </td><td> 22 ul oligomycin </td></tr><tr><td> C </td><td> 25 ul antimisin / rotenon </td><td> 25 p, l 2-DG </td></tr></tbody></table> Tablo 3: Bileşik hacimleri. NOT: portların Her dizi (örneğin, tüm bağlantı noktaları A) aynı ses içermelidir. (Kullanılmayan kuyularda port deney ortamı ile aynı hacmi ile yüklenebilir) olarak bileşimleri enjekte edilmez, belirli bir seriye ait tüm kaynaklar, daha deneyde kullanılan olmayanlar yüklü çok önemlidir. </li><li> Programı kurarken kartuşu kuluçkaya yatmaktadır. </li></ol></li><li> Ekstraselüler Akı Deneyi Protokolleri Kurma <ol><li> Aşağıdaki programı (Tablo 4) ayarlayın. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Adım </td><td> döngü </td></tr&gt; <tr><td> ayarlama </td><td> - </td></tr><tr><td> Dengeleme </td><td> - </td></tr><tr><td> Baseline okumalar </td><td> 3 kez: Tedbir, 3 dakika, 3 dakika karıştırın 0 dakika bekleyin </td></tr><tr><td> bitiş döngü </td><td> - </td></tr><tr><td> Liman A enjekte </td><td> - </td></tr><tr><td> ölçümler </td><td> 3 kez: Tedbir, 3 dakika, 3 dakika karıştırın 0 dakika bekleyin </td></tr><tr><td> bitiş döngü </td><td> - </td></tr><tr><td> Liman B enjekte </td><td> - </td></tr><tr><td> ölçümler </td><td> 3 kez: Tedbir, 3 dakika, 3 dakika karıştırın 0 dakika bekleyin </td></tr><tr><td> bitiş döngü </td><td> - </td></tr><tr><td> Liman C enjekte </td><td> - </td></tr><tr><td> ölçümler </td><td> 3 kez: MEASUR, 3 dakika karıştırın 0 dakika bekleyinE 3 dakika </td></tr><tr><td> bitiş döngü </td><td> - </td></tr><tr><td> bitiş Programı </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tablo 4: Program düzeni. Not: aktif hücreleri kullanıldığında, belirli koşullar altında, örneğin, asidifikasyon saf hücrelerde daha uzun bir süre devam edebilir. Bu nedenle, her ölçüm döngüsü kez daha yukarıdaki programda &quot;bekle&quot; süresini uzatmak veya tekrar etmek gerekebilir. </li><li> Program başlar. (Istendiğinde) kalibrasyon adımından sonra, tahlil plaka için kalibrant plakasını değiştirin. Not Yazılımı kullanılarak, benzer koşullar kuyularda gruplarını işaret etmek mümkündür. Buna ek olarak, kontrol oyukları olan kuyu göstermek için çok önemlidir (Bu protokol, bu plaka, dört köşe) ve boş olan kuyu gösterir. Daha detaylı bilgi için, adım adım bunu makineyi kurmak ve için protokolin yazılım, üreticinin web sitesini danışılmalıdır. </li></ol></li><li> Protein İçeriği Ölçme <ol><li> hücreleri bozmadan her bir kalan deney ortamını çıkarın. NOT: Bu protein konsantrasyonu deneyi devam etmek için uygun değildir, bu analize kadar -20 ° C &#39;de bütün plaka dondurmak mümkündür. donmuş, devam etmeden önce Çözülme. </li><li> (50 ul için yeterli / oyuk) RIPA liziz ortamı içinde proteaz inhibitörleri 1 x çözeltisi (100X&#39;lik bir stok) hazırlayın. </li><li> her bir proteaz inhibitörleri ile takviye edilmiş 50 ul RIPA liziz ortamı ekleyin. 5 dakika süre ile bir çalkalama plakası ajitasyon ve daha sonra tam olarak lize hücrelere 30 dakika süreyle buz üzerinde inkübe levhasını. </li><li> bunlar bisinkoninik asit (BCA) deneyi karışmaz şekilde plakanın alt lipidler ve diğer moleküller getirmek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de plaka dönerler. </li><li> üreticiye göre BCA protein konsantrasyonu ölçmek &amp;# 39; ın önerileri. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Motz, G. T., Coukos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+and+reversing+tumor+immune+suppression.">Deciphering and reversing tumor immune suppression.</a> Immunity. 39 (1), 61-73 (2013).</li><li>Akkaya, M., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+pathogens+drive+the+evolution+of+paired+receptors?.">How do pathogens drive the evolution of paired receptors?.</a> Eur J Immunol. 43 (2), 303-313 (2013).</li><li>Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+activation.">T cell activation.</a> Annu Rev Immunol. 27, 591-619 (2009).</li><li>Dinarello, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+cytokines.">Proinflammatory cytokines.</a> Chest. 118 (2), 503-508 (2000).</li><li>Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+B+cells.">Memory B cells.</a> Nat Rev Immunol. 15 (3), 149-159 (2015).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li><li>Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fueling+immunity:+insights+into+metabolism+and+lymphocyte+function.">Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function.</a> Science. 342 (6155), 1242454 (2013).</li><li>Gerriets, V. A., Rathmell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+pathways+in+T+cell+fate+and+function.">Metabolic pathways in T cell fate and function.</a> Trends Immunol. 33 (4), 168-173 (2012).</li><li>Doughty, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+receptor-mediated+changes+in+glucose+metabolism+in+B+lymphocytes:+role+of+phosphatidylinositol+3-kinase+signaling+in+the+glycolytic+control+of+growth.">Antigen receptor-mediated changes in glucose metabolism in B lymphocytes: role of phosphatidylinositol 3-kinase signaling in the glycolytic control of growth.</a> Blood. 107 (11), 4458-4465 (2006).</li><li>Caro-Maldonado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+is+required+for+antibody+production+that+is+suppressed+in+anergic+but+exaggerated+in+chronically+BAFF-exposed+B+cells.">Metabolic reprogramming is required for antibody production that is suppressed in anergic but exaggerated in chronically BAFF-exposed B cells.</a> J Immunol. 192 (8), 3626-3636 (2014).</li><li>Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+flux+analysis+to+monitor+glycolytic+rates+and+mitochondrial+oxygen+consumption.">Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption.</a> Methods Enzymol. 542, 125-149 (2014).</li><li>Mookerjee, S. A., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+and+Analysis+of+Extracellular+Acid+Production+to+Determine+Glycolytic+Rate.">Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate.</a> J Vis Exp. (106), e53464 (2015).</li><li>Chacko, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+defining+distinct+bioenergetic+profiles+in+platelets,+lymphocytes,+monocytes,+and+neutrophils,+and+the+oxidative+burst+from+human+blood.">Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood.</a> Lab Invest. 93 (6), 690-700 (2013).</li><li>Klein, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+different+cell+isolation+techniques+on+lymphocyte+viability+and+function.">Impact of different cell isolation techniques on lymphocyte viability and function.</a> J Immunoassay Immunochem. 27 (1), 61-76 (2006).</li><li>Hsueh, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Characterization+of+Mouse+Splenic+B+Lymphocytes.">Purification and Characterization of Mouse Splenic B Lymphocytes.</a> AfCS Research Reports. 1 (1), 1-11 (2012).</li><li>Zambrano, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+ex+vivo+expansion+and+differentiation+of+naive+murine+CD43+B+splenocytes.">Prolonged ex vivo expansion and differentiation of naive murine CD43 B splenocytes.</a> Biotechnol Prog. , (2016).</li><li>Costa, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+rare+populations+of+murine+antigen-specific+T+lymphocytes+by+retroviral+transduction+for+potential+application+in+gene+therapy+for+autoimmune+disease.">Targeting rare populations of murine antigen-specific T lymphocytes by retroviral transduction for potential application in gene therapy for autoimmune disease.</a> J Immunol. 164 (7), 3581-3590 (2000).</li><li>Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+characterization+and+isolation+of+rare+memory+B+cells+with+antigen+tetramers.">Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers.</a> Blood. 118 (2), 348-357 (2011).</li><li>Schneider, D. F., Glenn, C. H., Faunce, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+lymphocyte+subsets+and+their+immunoregulatory+roles+in+burn+injury+and+sepsis.">Innate lymphocyte subsets and their immunoregulatory roles in burn injury and sepsis.</a> J Burn Care Res. 28 (3), 365-379 (2007).</li><li>Reeves, J. P., Reeves, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+lymphoid+organs.">Removal of lymphoid organs.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 1, Unit 1 9 (2001).</li><li>Akkaya, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple,+Versatile+Antibody-Based+Barcoding+Method+for+Flow+Cytometry.">A Simple, Versatile Antibody-Based Barcoding Method for Flow Cytometry.</a> J Immunol. 197 (5), 2027-2038 (2016).</li><li>Traba, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fasting+and+refeeding+differentially+regulate+NLRP3+inflammasome+activation+in+human+subjects.">Fasting and refeeding differentially regulate NLRP3 inflammasome activation in human subjects.</a> J. Clin. Invest. 125 (12), 4592-4600 (2015).</li><li>Wick, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+Primary+Metabolic+Block+Produced+by+2-Deoxyglucose.">Localization of the Primary Metabolic Block Produced by 2-Deoxyglucose.</a> J. Biol. Chem. 224 (2), 963-969 (1957).</li><li>Linnett, P. E., Beechey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+the+ATP+synthetase+system.">Inhibitors of the ATP synthetase system.</a> Methods Enzymol. 55, 472-518 (1979).</li><li>Terada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncouplers+of+oxidative+phosphorylation.">Uncouplers of oxidative phosphorylation.</a> Environmental Health Perspectives. 87, 213-218 (1990).</li><li>Mookerjee, S. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+Maximum+Glycolytic+Capacity+Using+Extracellular+Flux+Measurements.">Determining Maximum Glycolytic Capacity Using Extracellular Flux Measurements.</a> PLOS ONE. 11 (3), e0152016 (2016).</li><li>Lai, L., Alaverdi, N., Maltais, L., Morse, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+cell+surface+antigens:+nomenclature+and+immunophenotyping.">Mouse cell surface antigens: nomenclature and immunophenotyping.</a> J Immunol. 160 (8), 3861-3868 (1998).</li><li>Gerberick, G. F., Cruse, L. W., Miller, C. M., Sikorski, E. E., Ridder, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+modulation+of+T+cell+memory+markers+CD62L+and+CD44+on+murine+draining+lymph+node+cells+following+allergen+and+irritant+treatment.">Selective modulation of T cell memory markers CD62L and CD44 on murine draining lymph node cells following allergen and irritant treatment.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 146 (1), 1-10 (1997).</li><li>Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contributions+of+respiration+and+glycolysis+to+extracellular+acid+production.">The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production.</a> Biochim. Biophys. Acta - Bioenergetics. 1847 (2), 171-181 (2015).</li><li>Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+metabolism+drives+immunity.">T cell metabolism drives immunity.</a> J Exp Med. 212 (9), 1345-1360 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests. Open Access fees for this article were provided by Agilent Technologies.

protokolünün ardından glikoliz ve mitokondriyal solunum performans farklılıkları değerlendirmek üzere farklı konsantrasyonlarda hücre dışı akı analizde kullanılmıştır saf ve uygun bir lenfosit alt, etkin izolasyonu için izin geliştirilmiştir. Bu protokol, lenfositler için özel olarak tasarlanmış ve, düşük bazal metabolizma aktivitesi, kırılganlık, düşük frekanslı olarak bu hücre tipleri, ilişkili özel durumlar adreslerini ve yetersizlik deney plakalara yapışmaya edilir. Bu nedenle, daha önce yayınlanmış protokolleri 11,12 oranla, bizim yöntem immünoloji alanında çalışan araştırmacılar için daha uygun ve daha iyi optimize edilmiş rehber sunuyor. Saf ve canlı hücre popülasyonları elde optimum izdiham hücreleri kaplama ve her bir protein konsantrasyonuna dışı akı tahlil ölçümleri standartlaştırılması da dahil olmak üzere bu protokolü birkaç kritik adımlar vardır. benikisi de ışık mikroskobu ile görüntülendi edilebilir ve kaplama hücrelerin nitial sayısı protein konsantrasyonu ölçümleri kullanılarak ölçülebilir. Hücre sayısı ve protein konsantrasyonu arasında doğrusal bir ilişki protein konsantrasyonu, gerçekten de, farklı kuyular arasında hücre sayıları değişikliklerin etkilerini standardize etmek için bir yol olarak kullanılabileceğini teyit etti. Protein konsantrasyonları ECAR ve OCR sonuçları standartlaştırma ile, gösterdiğimiz, bu daha düşük hücre izdiham rağmen birkaç 5 ila 10 x 2.5 olarak hücre / oyuk veri kaliteden ödün vermeden en tahlillerinde kullanılabilir şekilde. Ancak, hücre tipleri ve tahliller arasında değişmektedir kullanılan olabilir hücrelerin alt sınırı. Gibi az 5, 10 x 1.25 hücre, B hücre OCR ölçümleri, daha 2.5 x 10 5 hücre / için kullanılabilir Örneğin, iyi, aynı hücre tipinin glikolitik performansını değerlendirmek için yeterli değildi. Bu yüzden, uzun bir hücre sayısı, sınırlayıcı bir faktör olmadığı için üzerinde en kaplamaYaklaşık 5 x 10 5 lenfositlere karşılık% 90 birleştiği, / de tercih edilir. Ayrıntılı optimizasyon gerekli olabilir zaman hücreleri farklı boyutlarda-böyle önceden etkinleştirilmiş ve kısmen farklılaşmış lenfositler-Kullanılan olarak. Daha önce kültürlenmiş primer lenfositler ile, ayrıca, ölü yana hücre sayısının bir ölçüsü olarak protein konsantrasyonu güvenilirliğini azaltacaktır farklı tedavi koşulları arasında hücre canlılığında bir varyasyon olabilir veya ölmekte olan hücre, aynı zamanda, ölçülen protein düzeyleri katkıda . Bu gibi durumlarda, sitometri dışı akı deneyleri yapılmadan önce akışı ile canlı hücreleri sıralamak için yararlı olabilir. taze izole ve son derece canlı lenfosit toplulukları kullanarak tahlillerde, biz de OCR ve ECAR ölçümleri için güvenilir işlevsel veriler elde. Tüm hücre tipleri mitokondriyal stres testinde benzer davrandığını iken, hücre tipleri arasında çarpıcı farklar vardıglikoliz stres testinde gözlenen. Örneğin, saf T hücrelerinin glikolitik performansı splenositler veya B hücreleri ile karşılaştırıldığında düşük ve oligomycin ilavesi ile değişmemiştir. Bu gözlem, bizim protokol geçerliliğini teyit önceden yayınlanmış çalışmalarla 7,30 ile uyumludur. Sonuç olarak, yöntem, bir hücre dışı akış analiz cihazı kullanılarak lenfosit metabolik aktivitesi test etkili ve uygun bir yol sunar ve bu aktivasyon, hücre farklılaşması veya son bağlı bağışıklık hücreleri metabolik değişiklikleri keşfetmek immünolojik çalışmalar çeşitli yararlı olabilir böyle enfeksiyon, otoimmünite ve hematolojik kanserlerde olduğu gibi hastalık fenotipleri.

antijenlere karşı bağışıklık tepkisi, bağışıklık aktivasyonu ve bağışıklık bastırılması arasında sıkı bir şekilde düzenlenmiştir dengedir. Bağışıklık bastırılması, sadece bu olayları engellemekte ve bu nedenle gereksiz immün yanıtları 1-6 önlenmesi açısından önemlidir ise immün aktivasyonu, uyarıcı yanıt olarak hızlı hücre proliferasyonunu ve göçünü, hem de sitokin üretimi, antikor sekresyonu ve artan fagositozu sürer. Son çalışmalar, bir doğrudan bağ, bağışıklık hücrelerinin aktivasyon durumu ve çeşitli metabolik yolların 7 aktivitesi arasında var olduğunu göstermiştir. Bağışıklık hücreleri ve kapalı enerji üreten yollar geçiş yaparak dinlenme ve aktive devletler arasında geçiş yapabilirsiniz. Ayrıca, farklı bağışıklık hücre tipleri aktivasyonu sırasında artan enerji ihtiyaçlarını yakıt farklı metabolik stratejiler kullanabilir gözlenmiştir. Örneğin, ise T lenfositlerin aktivasyonu neredeyse tamamen glikolitik durum 8 içine hücreleri yönlendirir </su&gt; p aktive B lenfositleri glikoliz ve oksidatif fosforilasyon 9,10 bir denge kullanın. Bu çalışmalar hücre metabolizması üzerinde bağışıklık hücre aktivasyonu etkilerini araştıran önemine işaret etmektedir. Gerçek zamanlı, oksidatif fosforilasyon ve glikoliz göstergeleri olarak oksijen tüketim hızı (OCR) ve hücre dışı asitleşme oranı (ECAR), eşzamanlı ölçümler, enerji üreten yolların 11-13 durumlarını gidermek için bir ortak stratejidir. Bu amaca ulaşmak için, bu tür Hippocampus XF 96 gibi bir hücre dışı akı Analiz Cihazı, rutin olarak kullanılır. Böyle bir alet hızla hücre tipleri arasında veya farklı stimülasyon koşullarına bağlı OCR ve ECAR değişiklikleri karşılaştırabilirsiniz. Şimdiye kadar, bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli hücre tipleri, bu cihazlar kullanılarak incelenmiştir. Bununla birlikte, özellikle bağışıklık hücreleri için tasarlanmış optimize edilmiş bir protokol kullanılamaz. Bağışıklık hücreleri, özellikle lenfositler, ot farklıpek çok kritik yollarla onu hücre tipleri. Lenfositler ex vivo koşullar 14-16 uzun süreli hayatta olmayan hassas hücrelerdir. Bu, optimal büyüme ortamı örneğin hücre dışı bir akış analizi kullanılanlar gibi, gerekli besinleri yoksun kültürlenmiştir daha büyük bir sorundur. makrofajlar ve pek çok hücre çizgileri farklı olarak, lenfositler, plastik yüzeylere yapışmayan; nedenle stresi oluşturmadan analiz plaka bunları takmak için kritik öneme sahiptir. Son olarak, bazı lenfosit alt popülasyonlar son derece nadir olabilir ve gerekli optimum miktarda onları hasat 17-19 zor olabilir. Burada, özellikle lenfositler için geliştirilmiş bir optimize edilmiş bir protokol sağlar. Biz ayırıcı onların istirahat devlet glikoliz ve oksidatif fosforilasyon özelliklerini göstermek 20 düğümleri fare dalak ve lenf yalıtılmış splenositlerin B lenfositleri ve naif CD4 + T lenfositleri kullanılarakT hücre yoğunlukları. Veriler, hücre sayıları ile doğru orantılı olduğu son deney hücre lisatı, protein konsantrasyonları, ölçülerek her biri için başlangıç ​​Hücre sayılarındaki farklılıklar için normalize edildi. Bizim protokol sadece hücre dışı akı deneyleri için canlı lenfositlerin hızlı izolasyonu için yönergeleri sağlar, ama aynı zamanda veri kalitesinden ödün vermeden optimal hücre konsantrasyonları çalışma sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="740">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">PBS (pH 7.2)</td>
			<td style="width:139px;">Gibco-ThermoFisher</td>
			<td style="width:104px;">20012-050</td>
			<td style="width:283px;">To make MACS buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Bovine Serum Albumin BSA</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A3803</td>
			<td style="width:283px;">To make MACS buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">0.5M EDTA, pH 8</td>
			<td style="width:139px;">Quality Biological</td>
			<td>10128-446</td>
			<td style="width:283px;">To make MACS buffer</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">autoMACS rinsing solution</td>
			<td style="width:139px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:104px;">130-091-222</td>
			<td style="width:283px;">Instead of PBS + EDTA to make MS buffer. Also used in autoMACS Pro Separator.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:139px;">Gibco-ThermoFisher</td>
			<td style="width:104px;">11875-093</td>
			<td style="width:283px;">Contains phenol red and L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:139px;">Gibco-ThermoFisher</td>
			<td style="width:104px;">10437-028</td>
			<td style="width:283px;">For heat-inactivation, thaw frozen stock bottle in a 37 &#176;C water bath and then inactivate at 56 &#176;C for 30 minutes. Aliquot heat-inactivated serum for storage (e.g., in 50 mL conical tubes) and freeze at -20 &#176;C until needed.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin (Pen Strep)</td>
			<td style="width:139px;">Gibco-ThermoFisher</td>
			<td style="width:104px;">15140-122</td>
			<td style="width:283px;">Combine Pen Strep with L-Glut 1:1 (if making 500mL media, make a total of 12 mL Pen Strep/L-Glut); keep aliquots at -20 &#176;C until ready to make media.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">L-Glutamine 200mM (L-Glut)</td>
			<td style="width:139px;">Gibco-ThermoFisher</td>
			<td style="width:104px;">25030-081</td>
			<td style="width:283px;">Component of RF10 and stress test media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sodium pyruvate 100mM</td>
			<td style="width:139px;">Gibco-ThermoFisher</td>
			<td style="width:104px;">11360-070</td>
			<td style="width:283px;">Component of RF10 and stress test media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">HEPES 1M</td>
			<td style="width:139px;">Gibco-ThermoFisher</td>
			<td style="width:104px;">15630-080</td>
			<td style="width:283px;">Component of RF10</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td style="width:139px;">Gibco-ThermoFisher</td>
			<td style="width:104px;">11140-050</td>
			<td style="width:283px;">Component of RF10</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">2-Mercaptoethanol (55 mM)</td>
			<td style="width:139px;">Gibco-ThermoFisher</td>
			<td style="width:104px;">21985-023</td>
			<td style="width:283px;">Component of RF10</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Falcon 70 &#956;m cell strainer</td>
			<td style="width:139px;">Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td style="width:104px;">87712</td>
			<td style="width:283px;">Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Monoject 3 mL Syringe, Luer-Lock Tip</td>
			<td style="width:139px;">Covidien</td>
			<td style="width:104px;">8881513934</td>
			<td style="width:283px;">Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td style="width:104px;">14-959-53A</td>
			<td style="width:283px;">Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td style="width:104px;">14-432-22</td>
			<td style="width:283px;">Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td style="width:139px;">Lonza</td>
			<td style="width:104px;">10-548E</td>
			<td style="width:283px;">Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">CellTrics 30 &#956;m cell filter, sterile, single-packed</td>
			<td style="width:139px;">Partec CellTrics</td>
			<td>04-004-2326</td>
			<td style="width:283px;">Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">B Cell Isolation Kit, mouse</td>
			<td style="width:139px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-862</td>
			<td style="width:283px;">Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Na&#239;ve CD4+ T cell isolation kit, mouse</td>
			<td style="width:139px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-453</td>
			<td style="width:283px;">Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">LS Column</td>
			<td style="width:139px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td style="width:283px;">Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">MidiMACS separator</td>
			<td style="width:139px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td style="width:283px;">Magnet for separation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">MACS MultiStand</td>
			<td style="width:139px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td style="width:283px;">Holder for magnets</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">autoMACS Rinsing Solution</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>130-091-222</td>
			<td style="width:283px;">Rinsing solution for autoMACS Pro Separator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">autoMACS Pro Separator Instrument</td>
			<td style="width:139px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:104px;">N/A</td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">2-Deoxy-D-glucose (2-DG)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8375-5G</td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Cell-Tak</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:104px;">354240</td>
			<td style="width:283px;">Cell adhesive. Take care to note concentration, as each lot is different (package is 1 mg).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">75351</td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">2,4 Dinotrophenol (2,4-DNP)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">D198501</td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A8674</td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Rotenone</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">R8875</td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">G8270</td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Halt Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">78429</td>
			<td style="width:283px;">Supplied as 100X cocktail, combine with RIPA to form 1X solution for lysis.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">RIPA Buffer</td>
			<td style="width:139px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:104px;">BP-115</td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">23225</td>
			<td style="width:283px;">Follow manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td style="width:139px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:104px;">101085-004</td>
			<td style="width:283px;">Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Seahorse XF Base Medium</td>
			<td style="width:139px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:104px;">102353-100</td>
			<td style="width:283px;">Used to prepare stress test media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer</td>
			<td style="width:139px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Stericup Sterile Vacuum Filter Units, 0.22 &#956;m</td>
			<td style="width:139px;">EMD Millipore-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">SCGPU10RE</td>
			<td style="width:283px;">Used to sterile filter media.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">487031</td>
			<td style="width:283px;">Dissolved to 0.1M and used to dilute Cell-Tak.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes

Lenfositler da hızlı bir hücre proliferasyonu, migrasyon ve farklılaşma ve sitokin üretimine yol açan hücre içi sinyal yollarını aktive ederek çeşitli uyaranlara karşı yanıt. Bütün bu olaylar sıkıca hücrenin enerji durumuna bağlı ve bu nedenle enerji üreten yollarını inceleyerek bu hücrelerin genel işlevselliği hakkında ipuçları verebilir. hücre-dışı akı analiz, birçok hücre tipinde glikoliz ve mitokondriyal solunum performansını değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan bir cihazdır. Bu sistem birkaç yayınlanan raporlarda bağışıklık hücrelerini incelemek için kullanılır olmuştur, ancak lenfositler için özellikle optimize kapsamlı bir protokol yoktur. Lenfositler ex vivo koşullarda kötü hayatta kırılgan hücrelerdir. Çoğu zaman lenfosit alt grupları nadirdir ve düşük hücre sayıları ile çalışan kaçınılmazdır. Bu yüzden, bu problemlere yöneliktir deneysel strateji gereklidir. Burada, bir protokol sağlarBu lenfoid dokulardan uygulanabilir lömfositlerinin hızlı izolasyonu sağlar ve hücre dışı akı analizatöründe metabolik durumlarının analizi için. Ayrıca, farklı hücre yoğunluğunda birkaç lenfosit alt tipleri metabolik aktiviteleri karşılaştırıldığı deneylerin sonuçlarını verir. Bu gözlemler, protokol daha düşük hücre konsantrasyonlarında tutarlıdır ve iyi standardize edilmiş sonuçlar elde etmek için kullanılabilir ve bu nedenle bağışıklık hücreleri metabolik olaylar karakterizasyonu odaklanarak daha sonraki çalışmalarda geniş uygulamalara sahip olabileceğini göstermektedir.

Ökaryotik hücreler glikoliz entegre ağ kullanımı trikarboksilik asit (TCA) döngüsü ve oksidatif fosforilasyon enerji talep çoğunluğu karşılamak ve hücre büyümesi ve çoğalması için gerekli olan ara maddeler elde edildi. Bu yollar, daha sonra piruvata içine işlenmiş alır glikoz-6-fosfatı formunda serbest glukoz hücre yakalama ile başlar. Piruvat ya azalmış laktat ya da asetil koenzim A oluşturan mitokondri, (CoA) taşınır etmektir. Asetil CoA sonra TCA döngüsü içine girer. TCA döngüsünün yüksek enerjili ara sırayla iç mitokondrial membran genelinde bir H + degrade oluşturmak için mitokondriyal matrisinden H + dışarı attıktan elektron taşıma zinciri (ETC), elektronların hareketini itmek. Oksijen nihai elektron alıcısı olarak hareket eder ve H + K O / F &lt;aracılığıyla mitokondrial matriks geri dönmekalt potansiyel enerjisi ATP (Şekil 1A) oluşturmak için kullanılır&gt; 1 kompleksi. Hücre dışı akı testinin çalışma prensibi belirli noktalarda glikoliz ve oksidatif fosforilasyon ile müdahale ve ortaya çıkan etkilerini değerlendirmek bağlıdır. Bu amaçla, engellemek için, aç hücrelerde glikoliz ve heksokinaz tarafından 2-deoksiglukoz-6-fosfat, fosfoglukoizomeraz 23 rekabetçi bir önleyicisi dönüştürülür 2-deoksiglukoz (2-DG), yaymak için glukoz kullanılır glikoliz. Rotenon (ETC kompleks I spesifik bir inhibitör), (ATP sentaz 24 inhibitörü) oligomycin, A (bir kompleks ETC III spesifik inhibitörü) antimycin ve sökme maddesi 2,4-dinotrophenol (DNP) 25 idi ulaşım, proton degrade ve ATP sentezini (Şekil 1A) elektron ilgili belirli olayları müdahale için kullanılır. Bunun yerine 2,4-DNP bölgesinin karbonil cyasiyanid-4- (triflorometoksi) fenilhidrazon (FCCP) da kullanılabilir, ama daha fazla optimizasyon gerekli olabilir. Her iki durumda da, eşleşmeyenler her zaman gerekli optimal konsantrasyonunu belirlemek için kullanılmadan önce, belirli bir hücre tipi için titre edilmelidir. Glikoliz stres testi (Şekil 1B), daha önce aç hücrelerinde hücre dışı asidifikasyon oranı (ECAR) bir temel değer ölçümü başlar. Bu hücreler bazal en az, ve bu nedenle pratik olmayan glikolitik olarak kabul edilebilir olduğundan, bu noktada ölçülen ECAR olmayan glikolitik asitleştirme olarak adlandırılır. Ve H + - Bu asitlenme muhtemelen TCA döngüsünde oluşturulan solunum CO 2 HCO 3 dönüştürülür karşılık gelir. Bu, laktat oluşmasına hücre dışı asitleşme bir artış olarak kendini gösteren, glikoliz aktif hale getirmek için glukoz enjeksiyonu takip eder.Bu artış glikoliz normal hızını temsil eder. Hücreler daha sonra, blok oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP üretimi oligomycin enjeksiyonu ile zorlanmaktadır. Hücreler maksimum seviyeye glikoliz aktive ederek ATP üretimi bu dramatik düşüşün tepki ve bu ECAR düzeyinde (glikolitik rezerv) ikincil bir artış ile sonuçlanır. Test glikoz analog non-glikolitik düzeye ECAR döndürür 2-DG kullanarak glikoliz toplam önlenmesi ile sonlandırılır. İlginçtir, o üreticinin tavsiyelerine aykırı, maksimal glikoliz mutlaka 26 oligomycin enjeksiyonu ile elde edilmez, ileri sürülmektedir. ATP talepte önemli bir artış yoksa yüksek glikolitik kapasiteye sahip hücrelerde, glikoliz bu up-regüle olması gerek kalmadan mitokondriyal ATP kaybı ile baş mükemmel mümkün olabilir. oligomycin ile glikolitik oranı, solunum inhibitörleri eklenerek aştı olabilirBöyle oligomycin üzerinde birkaç faydalar sağlayan rotenone ve myxothiazol gibi: Onlar ATP Sentaz&#39;ın ters neden olarak 1) Onlar 26 mitokondrial membran potansiyeli kurtarmak için bir girişim protonları pompalamak için, ATP hidrolizi ile, ATP talebi arttırmak; 2) Bu ECAR sonuçları (aşağıya bakınız) etkilemesi için orta, solunum asitleştirme engeller. ATP talebi artırmak için diğer yöntemler, plazma membran ATPazların 26 ile ATP hidroliz uyaran bileşiklerin ilave edilmesi yer alır. Bir glikoliz stres testi planlarken tüm bu araştırmacılar tarafından dikkate alınmalıdır. Mitokondriyal stres testi (Şekil 1C) olmayan hasret hücrelerde oksijen tüketim oranı (OCR) bir taban ölçüsü ile başlar. Bu F O / F 1 kompleksi ile protonların geri dönüşünü engelleyen oligomycin enjeksiyonu izledi ve böylece hızla hyperpolariz edilirmitokondriyal membran es. Hiperpolarizasyon solunum kompleksleri sayesinde pompalama ileri proton ve solunum hızı azalır önler. Kalan solunum lipidler ya da diğer kanallardan protonların akışını temsil eden proton sızıntısı, denir. Bu hiperpolarize durumu hızlı bir şekilde bir proton iyonofor olarak hareket sökme maddesi 2,4-DNP eklenmesiyle ters çevrilir. Buna karşılık, hücreler kendi maksimum elektron transport hızını artırarak bir beyhude girişimi zar potansiyelini kurtarmak için deneyin ve bu da OCR arttırır. Son olarak, iki ETC inhibitörleri (antimisin ve rotenone) eklenmesi ile, mitokondriyal solunum tamamen durur ve OCR en düşük seviyesine düşer. Bu seviyede, oksijen tüketimi mitokondriyal aktivite (non-mitokondrial) bağlı değildir. Bu inhibitörleri tarafından oluşturulan OCR fark bazal solunum ve yedek kapasite toplamı maksimum mitokondriyal solunum denir. <pfo class = &quot;jove_content&quot;: keep-together.within sayfa = &quot;1&quot;&gt; B ve T hücre izolasyonları son derece canlı, saf lenfosit toplulukları verim. Protokol Bölüm 4&#39;te tarif edilen B hücreleri ve naif CD4 + T hücrelerinin izole edildi ve splenositler, sadece Bölüm 3.3 de tarif edildiği gibi, kırmızı kan hücrelerinin lize edilmesi ile elde edilmiştir. hücre tipi özel, metabolik deneyleri duyarlılığı canlılığı ve başlangıç ​​hücrelerinin saflığı bağlıdır. Bu nedenle, izole edilmiş bir fare T-hücreleri, splenositler, ve B hücreleri ve T ve B hücrelerinin saflığı canlılığı teyit etmek için, hücre az miktar akış sitometrik analizi (Şekil 2) için boyandı. Yan dağılım alan vs ileri dağılım-alanda (FSC-A SSC-A vs) arsa, lenfositler kapılı edildi ve bu kapıdan öne dağınık yüksekliğe diyagonal boyunca nüfus içindeFSC-A arsa vs t (FSC-H) singletlerin olarak belirlendi. Tekli nüfus içinde, canlılık canlı / ölü işaretleyici (Şekil 2A) için negatif boyanan hücreler yolluk ölçüldü; T hücresi canlılığı splenosit yaşayabilirliği% 92, ve B hücre yaşayabilirliği% 94,% 97.9 idi. CD4 + grubu 27,% 98.3 (Şekil 2B) olan -, CD44 ile ölçülen, CD4 + T hücre saflık ise B hücresi saflığı B220 + CD19 + popülasyonunun 26 ile ölçüldüğünde,% 99 idi. Hücre lizatının protein konsantrasyonu, kaplanmış hücre sayısının doğrudan bir göstergesi olarak da kullanılabilir. İzole edilen lenfositlerin ve splenositler, / 5 x 10 5 hücre bir yapışkan ile kaplanmış 96 oyuklu deney plakası 2.5 x 10 5 hücre / göz, 1.25 x 10 5 hücre / göz ve 0.625 x 10 kaplandı <sup&gt; 5 hücre / göz. Üç hücre tipleri, her plaka yoğunluğunda izdiham ışık mikroskobu (Şekil 3A) altında görüntülendi. Beklendiği gibi, kesişme ilk kaplama yoğunlukları ile bağlantılıydı. hücre-dışı akış testinin tamamlanmasının ardından, kaplama hücreler lize edildi ve protein konsantrasyonları BCA deneyi kullanılarak ölçüldü. Tüm hücre tipleri için, lizat protein konsantreleri doğrusal hücre dışı akış verileri yorumlanırken lizat protein konsantreleri hücre sayıları normalleştirilmesi için kesin bir ölçü olarak kullanılabilir doğrulamaktadır ilk kaplama yoğunlukları (Şekil 3B) ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Bu deneyde kullanılan kaplama yoğunlukları naif, uyarılmamış lenfositler için optimize edilmiştir. uyarılmış ya da önceden kültürlenmiş hücreler kullanılacak ise, daha fazla optimizasyon gerekebilir. Mitokondriyal ve glikolitik stress tahlilleri plakalı hücre sayısına bağlıdır. OCR hücre dışı akı analizörü her hücre tipi ve plaka yoğunluğunda ölçülmüştür. Beklendiği gibi, daha yüksek hücre sayısı daha yüksek ölçülmüş OCR, hem de daha dramatik yanıt oligomycin için, 2,4-DNP ve antimisin / rotenon (Şekil 4A) sahiptir. Her bir numune, protein konsantrasyonu OCR ölçümleri standartlaştırılması, genel olarak, hücrelerin daha büyük sayıda daha doğru OCR ölçümleri neden olduğunu ortaya koymaktadır. 5 ve 2.5 x 10 5 hücre Kaplama / oyuk, T hücreleri ve dalak ve 5 1.25 x 10 5 hücre içindeki normalize OCR ölçümleri ile sonuçlanmıştır / B hücreleri (Şekil 4B) içindeki normalize OCR ölçümleri elde edilmiştir. Normalize B hücresine ufak farklar OCR ölçümleri B hücreleri / diğer hücre yoğunlukları ile karşılaştırıldığında 2.5 x 10 5 hücre daha iyi performans gösterdiğini dolaylı göstergesi olabilir. Tüm önlemlere göre, 0.625 x 10 5 hücre / kuyu bu kaplama yoğunluğu yetersiz olduğunu gösteren, optimal sonuçlar verdi. Temel dönemi solunumu, proton sızıntısı maksimum mitokondriyal solunum olmayan mitokondriyal solunum ve ATP üretimi doğrusal, tüm hücre tipleri (Şekil 4C) için kaplama yoğunlukları ile korelasyon. üç hücre türünden düşük proton sızıntısı belirtildiği gibi Ayrıca, bazal solunum çoğu, ATP sentezlemek doğru kullanılır. mitokondriyal stres deney odak noktası OCR değişiklikleri ölçmek için ise, ECAR tahlil başarıyla gerçekleştirildi sağlamak için kaydetmek için yine de yararlıdır. OCR benzer şekilde, iki daha yüksek kaplama yoğunluğu yüksek ECAR ve oligomycin daha dramatik tepkiler 2,4-DNP ve antimisin / rotenone (Şekil 4D) ile sonuçlanmıştır. 2,4-DNP ilavesi üzerine ECAR ve antimisin / rotenone dramatik değişiklikler, g değişikliklerin yanı sıra solunum değişikliklere bağlı olabilirve H + - lycolysis, CO TCA döngüsünde oluşturulan 2 yana HCO 3 dönüştürülür. Bu konu son zamanlarda ele, ve gerçek glikolitik oranı 12,29 elde etmek için, oksijen tüketim verileri kullanılarak toplam hücre dışı asitlenme sinyalini düzeltmek için basit bir yöntem söz konusudur edilmiştir. Glikoliz stres tahlil yüksek kaplama yoğunluğu (Şekil 5A, B) en başarılı oldu. Tüm hücre tiplerinde, 5 x 10 5 hücre / göz örnekleri oligomycin, glukoz ilave edildikten sonra ECAR en büyük değişiklik vardı, ve 2-DG (Şekil 5B). Ayrıca, protein konsantrasyonu normalleştirilmesi düşük konsantrasyonlar özellikle 0.625 x 10 5 hücre / kuyu-did sağlam bir glikolitik rezerv kapasitesini göstermez iken, tüm hücre tipleri için, 5 x 10 5 hücre / kuyu örnekleri, optimum sonuçlar vermiştir olduğunu göstermiştir. Sigara glycolytiCı asitleştirme, glikoliz ve belirgin glikolitik kapasitesi doğrusal, tüm hücre tipleri (Şekil 5C) için kaplama yoğunlukları ile korelasyon. glikoliz gerilme deneyi için, OCR grafiği glukoz biraz sonra oligomycin muamele ile engellenmektedir mitokondriyal solunum, uyardığını göstermektedir; 2-DG eklenmesi OCR (Şekil 5D) etkilememiştir. OCR grafik glikoliz stres deney başarıyla gerçekleştirildi başka bir göstergesi olarak kullanılabilir. Ayrıca, OCR grafiği mitokondriyal stres testi 12,29 halinde, yukarıda açıklandığı gibi, gerekirse ECAR grafik düzeltmek için kullanılabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54918/54918fig1.jpg" /> Şekil 1:. (Solda) glikoliz dışı akı tahlillerin Anahat (A) İllüstrasyon ve oksidatif fosforilasyon (sağda) eylem gösterenhücre-dışı akı deneylerinde kullanılan metabolik ilaçlar. (B), hücre dışı asidifikasyon oranı (ECAR) grafiğinin şematik; oksijen tüketim hızı (OCR) grafiğin (C) şematik. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54918/54918fig2.jpg" /> . Şekil 2, T hücreleri, B hücreleri ve canlılığı ve saflığı belirlemek için splenositlerin Aşamalı yolluk sitometrisi T hücreleri, dalak ve B hücrelerinin canlılığı (A) gösteren grafikleri akış; ve T ve B hücreleri (B) &#39;nin saflığı. Sonuçlar en az üç bağımsız deneyler temsilcisi vardır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig2large.jpg" target="_blank">Th büyük halini görmek için tıklayınız</a>rakamdır. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54918/54918fig3.jpg" /> Şekil 3:. Celi izdiham farklı kaplama yoğunluklarında, her hücre tipinin lisatı, protein konsantrasyonları ile ilişkilidir (A) x 10 5 hücre 5 x 10 5 hücre / kuyucuktan 0.625 arasında değişen kaplama yoğunluklarında deney plakası gözleri içindeki hücreler hafif mikrograflan / iyi. Ölçek çubukları 50 uM belirtir. BCA deneyi ile ölçülen farklı kaplama yoğunluklarında (B) Lizat protein konsantreleri. Sonuçlar en az üç bağımsız deneyler temsilcisi vardır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54918/54918fig4.jpg" /> Şekil 4:<html> Her bir hücre tipi ve kaplama yoğunluğu için mitokondriyal stresi deneyi. Ham (A) ve standart (B) OCR gösterilmiştir. (C) başlangıç maksimum mitokondriyal olmayan mitokondriyal solunumun seviyeleri, hem de proton sızıntısı veya ATP üretimi bağlanmış olan oksijen tüketimi Hücre sayısı bağımlı değişiklikler, her hücre türü için gösterilmiştir. Mitokondriyal stres testlerinden elde edilen (D) Ham ECAR değerleri gösterilmiştir. Her veri noktası, standart sapma 7-8 çanağın ortalamasını temsil eder. Etiketli oklar oligomycin enjeksiyonları (O), 2,4-DNP (D), rotenon / A (R / A) antimycin ifade etmektedir. Sonuçlar en az üç bağımsız deneyler temsilcisi vardır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> _upload / 54918 / 54918fig5.jpg &quot;/&gt; Şekil 5:., Her bir hücre tipinde ve kaplama yoğunluğu için Glikolitik gerilme deneyi Ham (A) ve standart (B) ECAR gösterilmiştir. (C) olmayan glikolitik asitleştirme, glikoz ile uyarılan glikoliz ve toplam glikolitik kapasitesi ECAR hücre sayısı bağımlı değişiklikler gösterilmektedir. Glikolitik stres testlerinden elde edilen (D) Ham OCR değerleri gösterilmiştir. Her veri noktası, standart sapma 7-8 çanağın ortalamasını temsil eder. Etiketli oklar, glikoz (G), oligomycin (O) ve 2-deoksiglukoz (2-DG) enjeksiyonları ifade etmektedir. Sonuçlar en az üç bağımsız deneyler temsilcisi vardır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes at JoVE.com

Lenfositlerde Glikoliz ve Mitokondriyal Solunumu Analiz Etmek İçin Optimize Edilmiş Bir Protokol | İmmünoloji ve Enfeksiyon | Video

An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes

The study of metabolism is becoming increasingly relevant to immunological research. Here, we present an optimized method for measuring glycolysis and mitochondrial respiration in mouse splenocytes, and T and B lymphocytes.

Bir Optimize Protokol Lenfositlerindeki Glikoliz ve Mitokondriyal Solunum Analiz

Lymphocytes respond to a variety of stimuli by activating intracellular signaling pathways, which in turn leads to rapid cellular proliferation, migration ...

an-optimized-protocol-to-analyze-glycolysis-mitochondrial-respiration

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Biology

Immunology and Infection

Cellular Processes

Cellular Respiration

SCIENTISTS IN ACTION

29.5K Görüntüleme.  National Institutes of Health. The study of metabolism is becoming increasingly relevant to immunological research. Here, we present an optimized method for measuring glycolysis and mitochondrial respiration in mouse splenocytes, and T and B lymphocytes.

Video: An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease. During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin production is lost, presumably this results from the destruction of pancreatic beta cells by T cells. Understanding the mechanisms of beta cell death during 
the development of T1D will provide insights to generate an effective cure for this disease. Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays have historically used the 
radionuclide Chromium 51 (51Cr) to label target cells. These targets are then exposed to effector cells and the release of 51Cr from target 
cells is read as an indication of lymphocyte-mediated cell death. Inhibitors of cell death result in decreased release of 51Cr.
 As effector cells, we used an activated autoreactive clonal population of CD8+ Cytotoxic T lymphocytes (CTL) isolated from a mouse stock transgenic for both the alpha and beta chains of the AI4 T cell receptor (TCR). Activated AI4 T cells were co-cultured with 51Cr labeled target NIT cells for 16 hours, release of 51Cr was recorded to calculate specific lysis 
Mitochondria participate in many important physiological events, such as energy production, regulation of signaling transduction, and apoptosis. The study of beta cell mitochondrial functional changes during the development of T1D is a novel area of research. Using the mitochondrial membrane potential dye Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) and confocal microscopic live cell imaging, we monitored mitochondrial membrane potential over time in the beta cell line NIT-1. For imaging studies, effector AI4 T cells were labeled with the fluorescent nuclear staining dye Picogreen. NIT-1 cells and T cells were co-cultured in chambered coverglass and mounted on the microscope stage equipped with a live cell chamber, controlled at 37&deg;C, with 5% CO2, and humidified. During these experiments images were taken of each cluster every 3 minutes for 400 minutes.
Over a course of 400 minutes, we observed the dissipation of mitochondrial membrane potential in NIT-1 cell clusters where AI4 T cells were attached. In the simultaneous control experiment where NIT-1 cells were co-cultured with MHC mis-matched human lymphocyte Jurkat cells, mitochondrial membrane potential remained intact. This technique can be used to observe real-time changes in mitochondrial membrane potential in cells under attack of cytotoxic lymphocytes, cytokines, or other cytotoxic reagents.

Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays can be used to test autoreactive responses and study mechanisms of cell death in vitro. However, using live-cell confocal microscopic imaging techniques with fluorescent dyes, the type and kinetics of cell death as well as the pathways utilized can be studied in greater detail.

Sitotoksik T Lenfositler Beta Hücre Ölümü aracılığı ile değerlendirin yöntemleri

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

Hücre olgunlaşması olmadan Dendritik Hücreler Verimli Transfeksiyon için optimize edilmiş Protokolü

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Whole-cell MALDI-TOF Mass Spectrometry is an Accurate and Rapid Method to Analyze Different Modes of Macrophage Activation

MALDI-TOF is an extensively used mass spectrometry technique in chemistry and biochemistry. It has been also applied in medicine to identify molecules and biomarkers. Recently, it has been used in microbiology for the routine identification of bacteria grown from clinical samples, without preparation or fractionation steps. We and others have applied this whole-cell MALDI-TOF mass spectrometry technique successfully to eukaryotic cells. Current applications range from cell type identification to quality control assessment of cell culture and diagnostic applications. Here, we describe its use to explore the various polarization phenotypes of macrophages in response to cytokines or heat-killed bacteria. It allowed the identification of macrophage-specific fingerprints that are representative of the diversity of proteomic responses of macrophages. This application illustrates the accuracy and simplicity of the method. The protocol we described here may be useful for studying the immune host response in pathological conditions or may be extended to wider diagnostic applications.

This protocol describes the use of whole-cell MALDI-TOF mass spectrometry on eukaryotic cells. Here, we illustrate the accuracy of this technique by analyzing the multiple activation states of macrophages in response to their microenvironment.

Tüm hücre MALDI-TOF Kütle Spektrometre Makrofaj Aktivasyon Farklı Modu analiz için Doğru ve Hızlı Yöntem

MALDI-TOF is an extensively used mass spectrometry technique in chemistry and biochemistry. It has been also applied in medicine to identify molecules and ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

İnfiltratif Lenfositlerinin Analiz Olmayan enzimatik ayırmak Taze İnsan Dokusuna Basit ve Hızlı Protokolü

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells are therefore characterized as an innate T cell population capable of activating and steering adaptive immune responses. The development of improved techniques for the culture and expansion of murine iNKT cells facilitates the study of iNKT cell biology in in vitro and in vivo model systems. Here we describe an optimized procedure for the isolation and expansion of murine splenic iNKT cells.
Spleens from C57Bl/6 mice are removed, dissected and strained and the resulting cellular suspension is layered over density gradient media. Following centrifugation, splenic mononuclear cells (MNCs) are collected and CD5-positive (CD5+) lymphocytes are enriched for using magnetic beads. iNKT cells within the CD5+ fraction are subsequently stained with &#945;GalCer-loaded CD1d tetramer and purified by fluorescence activated cell sorting (FACS). FACS sorted iNKT cells are then initially cultured in vitro using a combination of recombinant murine cytokines and plate-bound T cell receptor (TCR) stimuli before being expanded in the presence of murine recombinant IL-7. Using this technique, approximately 108 iNKT cells can be generated within 18-20 days of culture, after which they can be used for functional assays in vitro, or for in vivo transfer experiments in mice.

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

Fare Dalak Değişmeyen Doğal Öldürücü T Hücreleri İzolasyon ve Yaygınlaştırılması için optimize Yöntemi

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. Surgically removed palatine tonsils provide a convenient accessible source of B and T lymphocytes to study the interplay between foreign pathogens and the host immune system. This video protocol describes the dissection and processing of surgically removed human palatine tonsils, followed by the isolation of the individual B and T cell populations from the same tissue sample. We present a method, which efficiently separates tonsillar B and T lymphocytes using an antibody-dependent affinity protocol. Further, we use the method to demonstrate that human adenovirus infects specifically the tonsillar T cell fraction. The established protocol is generally applicable to efficiently and rapidly isolate tonsillar B and T cell populations to study the role of different types of pathogens in tonsillar immune responses.

Palatine tonsils are a rich source of B and T lymphocytes. Here we provide an easy, efficient and rapid protocol to isolate B and T lymphocytes from human palatine tonsils. The method described has been specifically adapted for studies of the viral etiology of tonsil inflammation known as tonsillitis.

İnsan Palatine Bademcikler B ve T Lenfosit için Verimli İzolasyon Protokolü

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Modüle c-di-GMP sinyal İşte Küçük Moleküller Tarama için Yüksek verim Kur kurulması<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of some of the EVs. Both virions and EVs carry proteins of the cells that generated them and are antigenically heterogeneous. In spite of their diversity, both viruses and EVs were characterized predominantly by bulk analysis. Here, we describe an original nanotechnology-based high throughput method that allows the characterization of antigens on individual small particles using regular flow cytometers. Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles (MNPs) coupled to antibodies recognizing one of the surface antigens. The captured virions or vesicles were incubated with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated on magnetic columns from unbound antibodies and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence. This method has wide applications and can be used to characterize the antigenic composition of any viral- and non-viral small particles generated by cells in vivo and in vitro. Here, we provide examples of the usage of this method to evaluate the distribution of host cell markers on individual HIV-1 particles, to study the maturation of individual Dengue virions (DENV), and to investigate extracellular vesicles released into the bloodstream.

Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles coupled to antibodies recognizing surface antigens. The captured virions or vesicles were labeled with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated in high magnetic field and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence.

Virionlar antijenik Spectra ve ekstrasellüler veziküllerin Analiz Virometry Akış

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain insight into an ongoing disease state.
Here, a simple and efficient method is described to perform BAL on murine lungs without the need of special tools or equipment. BAL fluid is isolated by inserting a catheter in the trachea of terminally anesthetized mice, through which a saline solution is instilled into the bronchioles. The instilled fluid is gently retracted to maximize BAL fluid retrieval and to minimize shearing forces. This technique allows the viability, function, and structure of cells within the airways and BAL fluid to be preserved.
Numerous techniques may be applied to gain further understanding of the disease state of the lung. Here, a commonly used technique for the identification and enumeration of different types of immune cells is described, where&#160;flow cytometry is combined with a select panel of fluorescently labeled cell surface-specific markers. The BAL procedure presented here can also be used to analyze infectious agents, fluid constituents, or inhaled particles within murine lungs.

The health status of the lung is reflected by the type and number of immune cells that are present in the bronchioles of the lung. We describe a bronchoalveolar lavage technique that allows the isolation and study of nonadherent cells and soluble factors from the lower respiratory tract of mice.

İnflamatuvar Hücre İnfiltrasyonunu İncelemek İçin Murin Akciğerlerin Bronkoalveoler Lavajı

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Aşırı Ezme ve İnsanın Saflaştırılması<em&gt; Cis</em&gt; -prenıltransferaz in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...