Hematopoetik kök ve ata hücrelerindeki metabolik değişiklikler, kan oluşumu taleplerini sürdürmek için, kuskan hallerinden farklılaşma durumuna geçiş yapmalarını sağlar. Hematopoetik kök ve ata hücrelerinin metabolik plastisitesinde değişiklik hematolojik bozukluklara yol açar. Protokolümüz kan gelişimi ve hastalıkları sırasında metabolik regülasyon ve hematopoetik kök ve ata hücrelerinin sağlığının ölçülmeye yardımcı olacaktır.
Kırılgan ve nadir popülasyonoldukları için hematopoetik kök ve ata hücrelerinin mitokondriyal solunum ve glikoliz analizi zordur. Optimize edilmiş protokolümüz, daha yüksek miktarda hematopoetik kök ve ata hücrelerinin rüri kemik iliğinden izolasyonuna olanak sağlar, kuluçka sırasında canlılıklarını artırır, non-yapışık HSPC'lerin hücre dışı akı analizini kolaylaştırır ve oksidatif fosforilasyonun yanı sıra glikolitik yolları hedefleyen ilaç için optimize edilmiş enjeksiyon parametreleri sağlar. Bu prosedüre başlamak için, yardımcı plaka nın kuyularını ve kuyuların etrafındaki odaları steril suyla doldurun.
Sensör kartuşu, sensörlerin tamamen suyla kaplı olduğundan emin olmak için yardımcı plakaya batırın. Daha sonra kartuşun yardımcı plakaya batırılmış bir co2 kuluçka makinesine 37 santigrat derecede bir gecede kuluçkaya yatırın. Sınıf II biyogüvenlik kabininde, her bir asayplakasına 40 mikrolitre ticari olarak kullanılabilir %0,1 PLL çözeltisi ekleyin.
Kitte verilen kapakla teşp plakayı kapatın ve kapalı plakayı kaputun altında oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, aşırı çözeltikaldırmak ve hava kaputun altında plaka kuru kaldırmak için steril bir vakum tabanlı aspiratör kullanın. Mononükleli murin kemik iliği hücrelerini hasat etmek için, 15 mililitrelik konik tüpe beş mililitre yoğunluk gradyan orta ekleyin.
Yavaş yavaş hücrelerin yoğunluk gradyan orta üzerinde bir tabaka olarak kalmasını sağlamak için kemik iliği hücre süspansiyon beş mililitre ekleyin. Santrifüj 500 kez g ve oda sıcaklığında 30 dakika santrifüj mümkün olan en düşük ivme olduğundan emin olun. Taze bir 15 mililitrelik tüp içine mononükleli hücrelerin orta arayüzü Hasat.
Daha sonra hücreleri %2 FBS içeren 1X PBS'lik beş mililitre ile yıkayın. 500 kez g ve beş dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüj. Süpernatant çıkarın ve% 2 FBS içeren 1X PBS 300 mikrolitre hücreleri yeniden askıya.
Daha sonra, bir FACS tüpünde lekesiz veya tek renkli kontrol için hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresi. Mononükleli mürin kemik iliği hücrelerinden LSK HSPC'leri toplamak için, 300 mikrolitre mononükleli kemik iliği hücresine 15 mikrolitre biyotin antikor kokteyli ekleyin. Mononükleli mürin kemik iliği hücrelerinden LSK HSPC'leri toplamak için, 300 mikrolitre mononükleli kemik iliği hücresine 15 mikrolitre biyotin antikor kokteyli ekleyin.
Tüpleri buzdolabında bir çalkalayıcının üzerine yerleştirilmiş bir buz kovasına yerleştirin ve 30 dakika boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra hücrelere %2 FBS içeren önceden soğutulmuş 1X PBS 10 mililitre ekleyin. 500 kez g ve beş dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüj.
Supernatant atın ve hücre pelet in 400 mikrolitre 1X PBS içeren 2% FBS. Kısaca kullanmadan önce anti-biotin mikroboncuklar girdap. Her numuneye 80 mikrolitre mikroboncuk ekleyin ve iyice karıştırın.
Ajitasyon ile dört santigrat derecede ek bir 20 dakika kuluçka. Bundan sonra, hücrelere% 2 FBS içeren önceden soğutulmuş PBS 10 mililitre ekleyin. Tüpü 500 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin.
Supernatant atın ve% 2 FBS içeren PBS bir mililitre hücre pelet resuspend. Manyetik ayırma ünitesini kurarken hücre süspansiyonuna 4 santigrat derecede saklayın. Dört santigrat derecede manyetik destekli hücre sıralama ayırıcı için bir manyetik alana sütun yerleştirin.
Dört santigrat derece yerçekimi akışı altında% 2 FBS içeren 1X PBS üç mililitre ile durulayarak manyetik ayırma için sütun hazırlayın. Hücre süspansiyonuna Dört santigrat derecede ıslak ön sütuna ekleyin. Tüm hücrelerin dört santigrat derece sütun geçmesine izin ve 15 mililitrekonik tüp içinde atık toplamak.
Daha sonra, dört santigrat derece 1X PBS ve% 2 FBS üç mililitre ile sütun yıkayın. Bu yıkamayı üç kez tekrarlayın. Akışı toplayın ve dört santigrat derecede tutun.
500 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca akışı içeren konik tüp santrifüj. Supernatant atın ve 1X PBS 0.5 mililitre içinde hücreleri yeniden askıya 2% FBS ve bir FACS tüpü için süspansiyon aktarın. Sonra her 10 milyon hücre ye 24 mikrolitre LSK antikor kokteylekleyin.
Bir saat boyunca ajitasyon ile dört derece santigrat karanlıkta folyo ve kuluçka ile tüp kapağı. Bundan sonra, FACS tüpüne %2 FBS ile üç mililitre 1X PBS ekleyin. 500 kez g ve beş dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüj.
Supernatant atın ve% 2 FBS içeren 1X PBS bir mililitre antikor etiketli hücreleri yeniden askıya. Sıralamadan hemen önce, hücre süspansiyonuna mililitre propidium iyodür başına bir miligram lık bir mikrolitre ekleyin ve FACS tüpünün içeriğini filtrelemek için 40 mikrometrelik bir süzgeç kullanın. İlk olarak, toplanan LSK hücrelerini 500 kez g ve oda sıcaklığında beş dakika santrifüj edin.
Supernatant atın ve 40 mikrolitre başına en az 70,000 hücre son konsantrasyona tam ortamda hücreleri yeniden askıya. Bir PLL kaplı sekiz kuyu plaka kuyuları içine bu hücre süspansiyon Tohum 40 mikrolitre tüm köşe kuyuları boş bırakmak için emin olun. 450 kez g ve oda sıcaklığında bir dakika için plaka santrifüj.
Hücrelerin kuyuların dibine bağlı olduğundan emin olmak için ters bir mikroskop kullanın. Bundan sonra, her kuyudaki hücrelere 135 mikrolitre tam ortam ekleyerek her kuyunun son hacmini 175 mikrolitreye çıkarın. Plakanın iki köşesine boşluk olarak 175 mikrolitre tam ortam ekleyin.
Hücreleri CO2 olmayan bir kuluçka makinesinde 37 derecede iki saat kuluçkaya yatırın. Daha sonra, metin protokolünün tablo iki ve tablo üç tablosunda belirtildiği gibi plakanın her kuyusuna ilaç eklemek için analizör için bir program ayarlayın. Mitokondriyal stres testi için, her iyi iki mikromolar oligomisin, 1,5 mikromolar FCCP ve 0.5 mikromolar ya rotenon ve anti-mycin A son konsantrasyonu var gibi inkübatör yarar plakasında sensör kartuşunu almak gerektiği gibi.
Kapağı sensör kartuşundan çıkarın ve alet tepsisinin üzerine yerleştirin. 20 dakika sürecek kalibrasyon işlemine başlayın. Kalibrasyon tamamlandığında, yardımcı plakayı çıkarın ve LSK hücrelerini içeren bir asayme plakası ile değiştirin.
Daha önce ayarlanmış programı başlatmaya devam edin. Program tamamlandığında, verileri alın ve analiz edin. Bu çalışmada, maksimum miktarda canlı murine LSK HSPC izole edilmiş ve glikoli ve mitokondriyal metabolizması hücre dışı akı analizörü ile ölçüldü.
Ekstrasellüler akı analizi geleneksel olarak yapışık hücreler için kullanılmasına rağmen, bu yöntem LSK HSPC'leri hücre dışı akının ölçümü ve böylece LSK HSPC'lerin metabolik sağlığına olanak tanıyan PLL kaplı kuyulara yapışık hale getirir. Bazal ve stres koşullarında hücre dışı asitleşme hızı ile oksijen tüketim hızı ve glikoliz yoluyla mitokondriyal solunumu ölçmek için glikoliz ve mitokondriyal solunumu engelleyen ilaçlar sırayla enjekte edilir. Beklendiği gibi, ekstrasellüler asitleşme oranıbazal düzeyi lsk HSPCs glikoz kültürlü ve negatif ortamda kültürlü olanlara göre pozitif medya pirüvat için daha yüksektir.
Glikoz enjeksiyonu pozitif ortamda kültürlenen hücreler için ekstrasellüler asitleşme oranını değiştirmedi, ancak negatif ortamda hücrelerin glikoliz artırdı. Ancak, bu hücrelerin bazal düzeyi hala pozitif grupta daha düşük kaldı. Oligomisin enjeksiyonu glikoliz pozitif grupta maksimum düzeyde aktive, ancak negatif grubu etkilemedi.
2-DG'de glukoz analogu ile enjeksiyon ekstrasellüler asitleşme oranını glikolitik olmayan düzeylere geri döndürmüş. Mitokondriyal stres testi için, oligomisin enjeksiyonu mitokondriyal membranı hiperpolarize ederek ETC kompleksleri arasında daha fazla proton pompalanmasını önler ve böylece mitokondriyal solunum oranını azaltır. HÜCRELER mitokondriyal membran potansiyelini kurtarmaya çalışırken FCCP enjeksiyonu oksijen tüketim hızını maksimuma çıkarır.
Diğer iki elektron taşıma zinciri inhibitörlü enjeksiyon, mitokondriyal solunumun tamamen durmasına ve böylece oksijen tüketim hızının minimum seviyeye geri döndürülmesini sağlar. Mononükleer hücre izolasyonu için kırmızı hücre lisis tamponu kullanmaktan kaçının. Küme oluşumunu önlemek ve LSK kaybını azaltmak için Ficoll gradyan ayrımını öneriyoruz.
Optimize edilmiş metodumuzu kullanarak, nadir ve kırılgan hematopoetik kök ve progenitor hücrelerin mitokondriyal solunum ve glikoliz ölçebilir ve metabolik ipuçlarının incelenmesi normal ve malign hematopoemi düzenler.
