This work was supported by the MND Research Institute of Australia and the Cure for MND Foundation [GIA 1638], the Snow Foundation, and Macquarie University [MQRDG 9201401462]. Imaging was carried out at the Microscopy Facility in the Department of Biomedical Sciences, Macquarie University. Other members of the MND research center are thanked for their contributions to the development of these methods and fish lines.

NOT: Hayvan deneylerinde tasarımı, yürütülmesi ve raporlama güncel kılavuzlarda 15 dikkate almak zorundadır. Böyle bir çalışma, yerel hayvan koruma otorite tarafından önceden onaylanmış olmalıdır (bizim durumumuzda, Macquarie Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Komitesi). 1. Montaj ve UV Hücre Ablasyon için Zebra balığı hazırlayın <ol><li> Zebrafish (Danio rerio) floresan proteinleri ifade oluşturun. <ol><li> , Zebra balığı ilgi floresan proteinleri ifade Zebra balığı yumurta tek hücreli aşamaya plazmid enjeksiyonları gerçekleştirmek (başka yerde 16 açıklandığı gibi) ya da floresan transgenik hatları kullanın. Birden fazla hücre tiplerini etiketlemek için, ilgi soruya uygun kurulmuş transgenik hatları geçerek bileşik transgenik zebrafish hatları oluşturmak. Akşamları bir yanlış alt çifti çiftleşme tankının her iki tarafında bir erkek ve bir kadın zebrafish yerleştirin ve ışığın başlangıcı ile bölücü kaldırmak(başka yerde 17 ayrıntılı olarak) Ertesi sabah. 28 ° C zebrafish tutmak ve kurulan protokolleri 17, 18 göre bunları idare. </li><li> plastik çay süzgecinden embriyoları içeren tankı suyun süzme başarılı yumurtlama sonrası embriyolar toplayın. Sistem su ile yumurta durulayın ve bir Petri kabındaki yumurta su içine aktarabilirsiniz. </li><li> döllenmeyi belirlemek için bir ışık mikroskobu altında inceleyin. Mağaza bir Petri kabındaki yumurta döllenir ve 28 ° C 18 bir inkübatör koyun. </li></ol></li><li> İsteğe bağlı: Belirli hücre popülasyonlarının etiket bir mikroenjeksiyon gerçekleştirin. Not: Bu, stabil transgenik çizgiler yükseltmek gerek kalmadan, ifade ve protein görünüm için izin veren bir alternatif bir yöntemdir. İlgili protein, toksik olan ve dengeli bir trans üretilmesini engeller, bu yöntem de avantajlıdırgen çizgiler. <ol><li> Başka bir yerde 19, 20, 21 tarif edilen şekilde, zebra balığı embriyoların tek hücreli aşamada plazmid yapıları enjekte edilir. Not: Bu yöntem, ilgilenilen proteinin mozaik ifadesi ile sonuçlanır. İlgili protein seçim promotöründen yapılır Tol2 çevrili (örneğin, 25 ya da MPEG1 26 araya 24, -3mnx1 23 22 islet1) tekrarlar 20 ters. </li></ol></li><li> İstenilen büyüklükte balık yaş. <ol><li> 3 balık yükseltmek - 5 gün sonrası fertilizasyon (dpf) ve floresan bileşik mikroskop altında koyun. Uygun fluorofor ifade hayvanları Ekran ve parlak etiketli balık seçin. Geç gömmek için yumurta su ile başka bir çanak içine uygun larvaları ayırın(28 ° C inkübatör deposunda) üzerine r. İsteğe bağlı: Embriyolar pigmentasyon oluşumunu inhibe 24 saat sonra döllenme (HPF) bir 0.2 mM 1-fenil-2-thioures (PTU) Ringer çözeltisi içine yerleştirilebilir. toksik ve yan fizyolojik, genetik veya morfolojik etkileri olabilir olarak bakım, PTU ile alınmalıdır. </li><li> Erken gelişim aşamasında çalışmalar için (&lt;2 dpf), elle keskin forseps kullanarak embriyolar dechorionate. enzimatik olarak yumurta su pronase (2 mg / ml) eklenmesi ve 28 ° C &#39;de 10 dakika boyunca inkübe edilerek embriyo sayıda Dechorionate. </li><li> dechorionation kolaylaştırmak için plastik Pasteur pipeti ile periyodik embriyolar geçirin. embriyoların çoğunluğu yumurta su ile onları birkaç kez yıkayarak kendi chorions ortaya çıkmıştır zaman süreci sonlandırmak. </li></ol></li><li> agaroz Zebra balığı gömme için çözümler hazırlayın. <ol><li> 4 g / L MS222 ekleyerek anestezi solüsyonu hazırlayın (tricaine stok çözeltisi, pH 7.0)Yumurta su içeren bir Petri kabı ilave edildi. 50 mg / ml dozu ile, tavsiye edilen bir başlangıç noktası (Şekil 1A) &#39;dir. </li><li> yumurta suda - (% 1.5 0.8) ve 1.5 mL mikrosantrifüj tüpler içine bölmeyin düşük erime agaroz bir stok hazırlayın. Önceden ısıtılmış bir ısıtma bloğu içinde bir kısım yerleştirin (38-40 ° C) ve bu ayar sıcaklığına gelmesini sağlar (~ 30 dak; Şekil 1B). </li><li> İsteğe bağlı: uzun vadeli görüntüleme (&gt; 4 saat) için, 35 mm cam alt Petri kabı içinde küçük bir agaroz daire hazırlamak ve (Ek Şekil 1) ayarlamanıza olanak verir. NOT: Bu fazladan adım daha uzun zaman dilimlerinde üzerinde zebrabalıkları ile tüm agaroz damla herhangi bir hareketi önlenmesinde etkili oldu. <ol><li> Bunu yapmak için, cam alt çanak iç çemberin boyunca agaroz yer ~ 300 uL balık yerleştirmek için hangi ortasında küçük bir açıklığı olan bir halka şekilli daire hazırlamak için (adım 1.5.3; Ek Şekil 1) . </li></ol></li></ol></li><li> mikroskopi için agaroz zebrafish monte edin. <ol><li> Seç 1 - ablasyon ön elemeden balık 3 ve anestezi solüsyonu ile bir çanak içine (bir transfer pipet kullanarak) onlara aktararak larvaları uyutmak (adım 1.4.1; Şekil 1C, yaklaşık 5 dakika). NOT: balıklar sığ solungaç hareketi ve azalmış kalp hızı gösterdiğinizde anestezi ve artık dokunmatik uyarılmış kaçış tepkisi sergilerler (teer; başarısızlık uzakta sonra yavaşça yüzmek bir fırça ile kendi kuyruk dokunmadan). balık etik tedavisi için uygun anestezi sağlamak ve floresan ışığa agaroz veya maruz içine transfer edildiği seğirmesi önlemek için. </li><li> Anestezi onaylandıktan sonra (için ~ 30 uL set cut-off 200 mcL ucu ile) ayarlanabilir bir pipet kullanarak bir larva emmek ve ucu dibine çöker edelim. ile sıvı bir damla bırakarak önceden ısıtılmış agaroz (adım 1.4.2) içine larva transferiagaroz içine larva (agaroz girmeden yumurta su miktarını en aza indirmeye çalışın; Şekil 1D). </li><li> agaroz çevrili balık emmek. önceden hazırlanmış cam alt 35 mm çanak içine hızlı bir şekilde dağıtın. </li><li> Tarafında (solda kafa) böylece vücut ve kuyruk düz (Şekil 1E) agaroz içinde hayvan konumlandırmak için bir diseksiyon mikroskobu ve standart bir boya fırçası (uzun astar, boyut 1) kullanın. Birden çok balık ile çalışan, bunlar daha sonra kolayca konfokal mikroskop kullanılarak bulunan, böylece çanak tüm balık hizalayın. NOT: Hızla konumlandırma ve hizalama bu yordamı gerçekleştirmek (agaroz soğuk sıcaklıklara maruz kaldıktan sonra hemen ayarlamak başlar gibi, bazı pratik gerekebilir). </li><li> Agaroz sıkıca ayarlanana kadar 15 dakika - 10 agaroz gömülü balık bırakın. Dikkatle ~ 2 mL yumurta su içeren tricaine (Şekil 1F) ile 35 mm Petri kabı kontör. </li></ol></li></ol> 2. Konfokal Mikroskop ve Görüntüleme parametreleri ayarlama <ol><li> konfokal mikroskop sahnede gömülü larva ile Petri kabı yerleştirin ve (parlak alanını kullanarak) hayvan omurilik dorsal tarafına odaklanmak. Uygun büyütme (40X) ve floresan ayarı altında hayvan inceleyin ve ilgi yapısını görselleştirmek (örneğin, etiketli nöronların veya mikroglial hareketin floresan yoğunluğu) sonraki ablasyonu (Şekil 2) için gerekli tüm görüntüleme parametreleri onaylamak için. Biz rutin zaman atlamalı çalışmalar yapmak 40X objektif kullanın. </li><li> İsteğe bağlı: birkaç saat boyunca zaman atlamalı çalışma gerçekleştirmek için, bu hücrenin ve çevresinin soğukkanlı fizyolojik yanıtı kurmak için ablasyona tek ya da birkaç zaman noktaları öncesinde kayıt tavsiye edilir (örneğin, mikroglial hareket bazal hız kurmak ve hareketliliği). </li><li> yapının kalınlığını belirlemekUV lazer ablasyon ilgi ure. <ol><li> Z-sürücü kullanarak, manuel olarak odaklama ve aşağı tarafından ilgiyle yapısı (örneğin, hücre soma) üst ve alt doğrulayın. Ablasyon edilecek z-düzlemi not edin (örneğin, hücrenin merkezi). NOT: deneyim, bu yöntem parlak etiketli omurilik nöronlar (ablasyon sonrası kolay time-lapse görselleştirme sağlayan yüksek sinyal-gürültü oranı, örneğin, Şekil 4) hedefleyerek en etkili ve orta ablasyon ile hücre soma. Hücre çekirdeği floresan doğru hedefleme ve yüksek ablasyon etkinliğini sağlamak için avantajlı olabilir. </li></ol></li></ol> 3. Lazer Ablasyon Zebra balığı Omurilik Bireysel Hücreler Hedefli gerçekleştirin NOT: Bu ablasyon ve görselleştirme yaklaşımı için, bir konfokal mikroskop (Leica SP5) kullanıldı. hücreye özel dest için 405 nm diyot kullanarak ablasyon işlemiruction yazılımı (Leica Application Suite, v2.7.3.9723) göre ayrıntılı. Ancak, 405-nm lazer ve sıkı bağlamak (photobleaching sonra floresan kurtarma) ya da ağartıcı modülü ile donatılmış herhangi bir geleneksel konfokal mikroskop ancak potansiyel biraz farklı ayarlar parametreleri ve isimleri ile, aynı hücre manipülasyonlar performansını sağlayacaktır. <ol><li> Yazılım menüsü (Şekil 3A, 1 ve 2) üstündeki açılır menüden üzerine tıklayarak sıkı bağlamak sihirbazını başlatın. Lazer ablasyon için spesifik parametreler kurulumunu izin veren farklı adımlarla yeni bir pencere gözlemlemek (Şekil 3B, 3). </li><li> Biçimi, tarama hızı (Şekil 3B, 4) seçerek ve ortalamasını alarak ablasyon yaklaşım görüntü parametreleri belirlemek (Şekil 3B, 5). 400 Hz ve bir çizgi tarama hızında 1024 x 1.024 bir resim biçimi4 ortalama en uygun oldu. NOT: önceki edinme olarak belirlenmiştir (örneğin uyarma veya emisyon parametreleri gibi) spektral algılama değiştirmeye gerek, genellikle vardır. <ol><li> (Adım 2.4 açıklandığı gibi.) Ablasyon z-düzlemi zaten seçili değilse, &quot;Canlı&quot; butonuna basın ve floresan yapı veya kesilip olacak istenen z-düzlemi kadar numune ile odak odakta. </li></ol></li><li> Genel görüntü parametreleri ayarlandıktan sonra, &quot;Bleach&quot; adımı (Şekil 3C, 6) özel ablasyon bileşenlerini kontrol etmek erişir. Not: Lazer yoğunluğunun kombinasyonu (Şekil 3C, 8), tarama hızı ve aşama 3,2 (Şekil 3B, 4 ve 5) &#39;de ayarlanır tekrarlama, sayısı olarak ayarlanmış olan ortalama 3.5 (Şekil 3E adım12), bu nedenle ağartma verimliliği ROI UV lazer toplam bekleme zamanını belirlemek ve edecektir. <ol><li> Ağartma prosedürü (Şekil 3C, 8) için aktive ederek 405-nm lazer Engage. NOT: - Bizim deney düzeneği içinde% 80 yukarıda belirtilen ayarlarla çoğu başarı 60 arasında 405 nm lazer yoğunlukları ile elde edilmiştir. Bu lazer güç çıkışı enstrüman özgüdür ve her konfokal kurulum için farklı olacağını unutmayın. </li><li> Bu nedenle bekleme süresini maksimize tarama alanını azaltarak seçilen ROI ağartma yoğunluğunu en üst düzeye çıkarmak için bir seçenek &quot;zoom&quot; (Şekil 3C, 7) kullanın. Alternatif olarak, bu işlem için seçim yazılımı &quot;Bleach noktası&quot; seçeneğini kullanın. </li></ol></li><li> Görüntü elde etme rüzgarda çizim araçlarından birini kullanarak ablasyonu için bir ya da birden fazla ROI&#39;leri (Şekil 3B, 10) seçinizOw (Şekil 3D, 9). 8 mikron - yaklaşık 4 dairesel çizim aracı ile, örneğin, akson tepecik hedefleyin. NOT: ablasyon alan uygulamaya bağlı olarak daha geniş bir alana tek bir pikselin, ayarlanabilir. </li><li> ROI kurduktan sonra, &quot;Zaman Kursu&quot; tuşuna (Şekil 3E, 11) seçin ve ROI (Şekil 3E, 12) ablasyon / taranır döngü sayısını onaylayın. ağartma işleminden sonra hemen önce ve hemen tüm görüntünün bir bakış izin istendiği gibi &quot;Ön Bleach&quot; ve &quot;Post-Bleach&quot; kare seçin. </li><li> Gerekli tüm ablasyon parametreleri, basın &quot;Run Experiment&quot; (Şekil 3E, 13) ve ablasyon etkinliğini izlemek kurduktan sonra. NOT: Bizim sıkı bağlamak kurulumunda, tek bir görüntü öncesi ve uygun lazer e sıkı bağlamak devrinden sonra alınacakxcitation (EGFP ifade eden hücreler için, örneğin, 488 nm eksitasyon). Bunlar öncesi ve sonrası ablasyon resimler seçilen ablasyon parametreleri ne kadar tatmin edici ROI ağartılmış ve ne kadar etkili bir hızlı bir yargıya izin verir. </li><li> Lazer yoğunluğu ayarlanarak tekrarlayın (Şekil 3C, 8), bir tarama hızı ve ortalama (Şekil 3B, 4 ve 5) ve bir durumda tekrar (Şekil 3E, 12) seçilen YG de tamamlanmasından sonra, yüksek floresans yoğunluğunu gösterir sıkı bağlamak çevrimi. </li></ol> 4. &quot;Rescue&quot; veya Bertaraf balık dahil, Takip Prosedürü uygulayın <ol><li> Deney terminali ise, Tricaine aşırı dozda hayvan euthanize. Yumurta suyu çıkarmak ve 10 dakika boyunca anestezi stok solüsyonu ile değiştirin. ötenazi sağlamak için, kalp atışı kesilmesi için mikroskop altında kontrol edin. </li><li> İsteğe bağlı:Deney terminali değilse, ince forseps ve bir fırça ile agaroz dikkatlice balık çıkarın. Taze yumurta suda balık yerleştirin ve 15 dakika boyunca gözlem altında kurtarmak için izin verir. Normal yüzme davranışı dönerse, inkübatör balık dönün. </li><li> Kurumun onaylanan GDO&#39;lu atık akımının göre transgenik hayvanlar imha ediniz. </li></ol>

<ol>
	<li>Becker, T. S., Rinkwitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+genomics+model+for+human+neurological+and+polygenic+disorders.">Zebrafish as a genomics model for human neurological and polygenic disorders.</a> Dev Neurobiol. 72 (3), 415-428 (2012).</li><li>Wilt, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+light+microscopy+for+neuroscience.">Advances in light microscopy for neuroscience.</a> Annu Rev Neurosci. 32, 435-506 (2009).</li><li>Philips, T., Robberecht, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation+in+amyotrophic+lateral+sclerosis:+role+of+glial+activation+in+motor+neuron+disease.">Neuroinflammation in amyotrophic lateral sclerosis: role of glial activation in motor neuron disease.</a> Lancet Neurol. 10 (3), 253-263 (2011).</li><li>Robberecht, W., Philips, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+scene+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Nat Rev Neurosci. 14 (4), 248-264 (2013).</li><li>White, D. T., Mumm, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nitroreductase+system+of+inducible+targeted+ablation+facilitates+cell-specific+regenerative+studies+in+zebrafish.">The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish.</a> Methods. 62 (3), 232-240 (2013).</li><li>Jagadeeswaran, P., Paris, R., Rao, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-induced+thrombosis+in+zebrafish+larvae:+a+novel+genetic+screening+method+for+thrombosis.">Laser-induced thrombosis in zebrafish larvae: a novel genetic screening method for thrombosis.</a> Methods Mol Med. 129, 187-195 (2006).</li><li>Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+of+the+zebrafish+pronephros+to+study+renal+epithelial+regeneration.">Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration.</a> J Vis Exp. (54), e2845 (2011).</li><li>Matrone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-targeted+ablation+of+the+zebrafish+embryonic+ventricle:+a+novel+model+of+cardiac+injury+and+repair.">Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair.</a> Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).</li><li>Sieger, D., Moritz, C., Ziegenhals, T., Prykhozhij, S., Peri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+Ca2++waves+transmit+brain-damage+signals+to+microglia.">Long-range Ca2+ waves transmit brain-damage signals to microglia.</a> Dev Cell. 22 (6), 1138-1148 (2012).</li><li>Lewis, G. M., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+nerve+transection+and+time-lapse+imaging+of+glial+cell+behaviors+in+live+zebrafish.">Motor nerve transection and time-lapse imaging of glial cell behaviors in live zebrafish.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li><li>Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nerve-macrophage+interactions+following+peripheral+nerve+injury.">In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury.</a> J Neurosci. 32 (11), 3898-3909 (2012).</li><li>Villegas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+degeneration+and+regeneration+in+developing+zebrafish+peripheral+axons+reveals+a+requirement+for+extrinsic+cell+types.">Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types.</a> Neural Dev. 7, 19 (2012).</li><li>O'Brien, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li><li>Soustelle, L., Aigouy, B., Asensio, M. L., Giangrande, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV+laser+mediated+cell+selective+destruction+by+confocal+microscopy.">UV laser mediated cell selective destruction by confocal microscopy.</a> Neural Dev. 3, 11 (2008).</li><li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+bioscience+research+reporting:+the+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research.">Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> PLoS Biol. 8 (6), 1000412 (2010).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J Vis Exp. (69), e4196 (2012).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).Vol.4th ed. , (2000).</li><li>Clark, K. J., Urban, M. D., Skuster, K. J., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+zebrafish+using+transposable+elements.">Transgenic zebrafish using transposable elements.</a> Methods Cell Biol. 104, 137-149 (2011).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Higashijima, S., Hotta, Y., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cranial+motor+neurons+in+live+transgenic+zebrafish+expressing+green+fluorescent+protein+under+the+control+of+the+islet-1+promoter/enhancer.">Visualization of cranial motor neurons in live transgenic zebrafish expressing green fluorescent protein under the control of the islet-1 promoter/enhancer.</a> J Neurosci. 20 (1), 206-218 (2000).</li><li>Arkhipova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+regulation+of+the+hb9/mnx1+beta-cell+progenitor+specific+enhancer+in+zebrafish.">Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish.</a> Dev Biol. 365 (1), 290-302 (2012).</li><li>Flanagan-Steet, H., Fox, M. A., Meyer, D., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+synapses+can+form+in+vivo+by+incorporation+of+initially+aneural+postsynaptic+specializations.">Neuromuscular synapses can form in vivo by incorporation of initially aneural postsynaptic specializations.</a> Development. 132 (20), 4471-4481 (2005).</li><li>Hall, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+candyfloss+mutant+implicates+extracellular+matrix+adhesion+failure+in+laminin+alpha2-deficient+congenital+muscular+dystrophy.">The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (17), 7092-7097 (2007).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), 49-56 (2011).</li><li>Morsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+microglial+engulfment+of+dying+neurons+in+the+zebrafish+spinal+cord.">In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord.</a> Front. Cell. Neurosci. , (2015).</li><li>Grunwald, D. J., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Headwaters+of+the+zebrafish+--+emergence+of+a+new+model+vertebrate.">Headwaters of the zebrafish -- emergence of a new model vertebrate.</a> Nat Rev Genet. 3 (9), 717-724 (2002).</li><li>Lele, Z., Krone, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+system+in+developmental,+toxicological+and+transgenic+research.">The zebrafish as a model system in developmental, toxicological and transgenic research.</a> Biotechnol Adv. 14 (1), 57-72 (1996).</li><li>Veldman, M. B., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+developmental+model+organism+for+pediatric+research.">Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research.</a> Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).</li><li>Kabashi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain+and+loss+of+function+of+ALS-related+mutations+of+TARDBP+(TDP-43)+cause+motor+deficits+in+vivo.">Gain and loss of function of ALS-related mutations of TARDBP (TDP-43) cause motor deficits in vivo.</a> Hum Mol Genet. 19 (4), 671-683 (2010).</li><li>Laird, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progranulin+is+neurotrophic+in+vivo+and+protects+against+a+mutant+TDP-43+induced+axonopathy.">Progranulin is neurotrophic in vivo and protects against a mutant TDP-43 induced axonopathy.</a> PLoS One. 5 (10), 13368 (2010).</li><li>Lemmens, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+mutant+superoxide+dismutase+1+causes+a+motor+axonopathy+in+the+zebrafish.">Overexpression of mutant superoxide dismutase 1 causes a motor axonopathy in the zebrafish.</a> Hum Mol Genet. 16 (19), 2359-2365 (2007).</li><li>Ramesh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+in+zebrafish+displays+phenotypic+hallmarks+of+motoneuron+disease.">A genetic model of amyotrophic lateral sclerosis in zebrafish displays phenotypic hallmarks of motoneuron disease.</a> Dis Model Mech. 3 (9-10), 652-662 (2010).</li><li>Hanneman, E., Trevarrow, B., Metcalfe, W. K., Kimmel, C. B., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmental+pattern+of+development+of+the+hindbrain+and+spinal+cord+of+the+zebrafish+embryo.">Segmental pattern of development of the hindbrain and spinal cord of the zebrafish embryo.</a> Development. 103 (1), 49-58 (1988).</li><li>Lewis, K. E., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cells+to+circuits:+development+of+the+zebrafish+spinal+cord.">From cells to circuits: development of the zebrafish spinal cord.</a> Prog Neurobiol. 69 (6), 419-449 (2003).</li><li>Ilieva, H., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-cell+autonomous+toxicity+in+neurodegenerative+disorders:+ALS+and+beyond.">Non-cell autonomous toxicity in neurodegenerative disorders: ALS and beyond.</a> J Cell Biol. 187 (6), 761-772 (2009).</li><li>Philips, T., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Glial cells in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Exp Neurol. 262, 111-120 (2014).</li><li>Mazaheri, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+BAI1+and+TIM-4+in+the+engulfment+of+dying+neurons+by+microglia.">Distinct roles for BAI1 and TIM-4 in the engulfment of dying neurons by microglia.</a> Nat Commun. 5, 4046 (2014).</li><li>van Ham, T. J., Kokel, D., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cells+are+cleared+by+directional+migration+and+elmo1-+dependent+macrophage+engulfment.">Apoptotic cells are cleared by directional migration and elmo1- dependent macrophage engulfment.</a> Curr Biol. 22 (9), 830-836 (2012).</li><li>Radford, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+established+and+emerging+roles+of+astrocytes+and+microglia+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+dementia.">The established and emerging roles of astrocytes and microglia in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia.</a> Front Cell Neurosci. 9, 414 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Lazer Ablasyon Yaklaşımlar Lazer destekli ablasyon teknikleri hücrelerin bireysel ya da küçük gruplar hassas hedefleme sağlar. yüksek çözünürlüklü mikroskopi ve zebrabalıkları gibi hayvan modellerinde görülen genetik manipülasyonlar ile birleştirme tekniği araştırmacılar sistematik tek bir hücre kaderine ve yaralanma sonrası etkileşimleri çalışma sağlar. Burada tarif edilen UV (405 nm) lazer ile kesip alma protokolü tek tek hücreler stresli veya öldürülmüş seçici (doza bağlı bir şekilde), nöronlar, glia komşu iken, aksonlar zarar görmeden kalır nasıl özetlenmektedir. Biz başarıyla hücre kültürü deneylerinde bu yaklaşımı kullanılmıştır ve burada Zebra balığı omurilik ayrıntılı bir yaklaşım açıklar var. Biz seçici diğer hücreler (Şekil 5, A ve bir ağ içinde tek bir nöron vurgulayarak Zebra balığı omurilikteki bu yaklaşımın uygulanmasını göstermek <strong&gt; B) ya da hemen ve kurtarma olmayan tek bir nöronu öldürerek (Şekil 5, C ve D). Daha önce, bu tür darbeli azot lazer ya da iki-fotonlu lazer sistemleri gibi özel lazer sistemleri, doku hasarı ve motor sinir transection 10, 11, 12, 13 oluşturmak için gereken edildi. Bu lazer sistemleri başarıyla tür arterler ve venler 6 tromboz, akut böbrek hasarı 7, kardiyak hasar 8 gibi hücre hasarına, neden ve kalsiyum dalgaları ve beyin hasarı 9 sonra mikrogliyal tepkisini incelemek için kullanılmıştır. Ayrıca, Soustelle ve arkadaşları Drosophila 14 &lt;içinde epitel hasarı ve glial hücreler ikna etmek için geleneksel bir konfokal kurulum (351 nm ve 364 nm UV lazerler) kullanılır/ Sup&gt;. ALS Anlamak için Zebra balığı Modeller Uygunluk (ve Diğer İnsan Hastalıkları) Balığı, özellikle gelişim çalışmalarında 28, 29, 30 için, yaygın olarak kullanılan bir model organizma olarak. belli sınırlamalar varken, insan hastalığı modellemek ve patojenik moleküler mekanizmaları bir anlayış vermek için kendi potansiyeli çok büyüktür. Balığı modeller MSB&#39;nin çalışma için iyi kurulmuş ve önemli moleküler Insights 31, 32, 33, 34 yol açmıştır. Transgenik zebrafish hatları hızla oluşturulabilir (4-5 ay) ve belirli bir hücre tipi, onları ALS mevcut hayvan modellerinde değerli bir katkı yapmak özelliklerin seçici izleme sağlar. Zebra balığı embriyolar / larva optik şeffaf ve benzersiz bu deneyimlerden teklifbeyin veya kolayca kemirgen modellerinde elde edilen (ya da insanlarda) olamaz omurilik, tek hücre düzeyinde uzun vadeli canlı görüntüleme sağlayan zihinsel avantajları. Bu tür tek hücreli ablasyonu gibi moleküler teknikler ile kombine edildiğinde, bu in vivo kesin moleküler mekanizmaları çalışmak için eşsiz bir deneysel bir platform sağlar. Motor Nöronlar Seçici UV Lazer Ablasyonunu kullanma Hedefli Olabilir Zebra balığı spinal nöronlar doğumdan sonraki 10 saat içinde gelişmeye başlar ve sonra yaklaşık 48 saat 35 36 kurulmuştur. Bu hızlı gelişme, kısa zaman dilimlerinde ve yüksek verimlilik ile bu nöronların görselleştirme sağlar. Motor nöronlar ALS, motor korteks (üst motor nöronlar), beyin sapı ve omurilik (alt motor nöronlar) etkilendiğini, beyin ve kaslar arasında gerekli bağlantıyı sağlamak ve. Bu nöronların kaybı kaçınılmaz mu yol açarSistemik lupus atrofi ve güçsüzlük. Zebrafish omurilikteki motor nöronlar, ayırt edici projeksiyonları tarafından ve -3MNX1 gibi motor-nöron özel promoterlerin kullanımı ile tespit edilebilir. Bu tür çıkıntı nöronların hücre soma Hedefleme zaman (Şekil 4 ve Video 1) üzerinden aksonal projeksiyon boyunca ileriye dejenerasyon saptandı. Spinal motor nöronlarının Tek hücreli çözünürlüklü görüntüleme ayrıca lazer ablasyon (Şekil 4 ve Referans 27 Ek video 3&#39;e bakınız) sonra fosfatidilserin translokasyon ve buna bağlı olarak Annexin V-etiketleme doğruladı. Bizim UV lazer ablasyon yaklaşımı sonra nöronlar ölüyor içinde Annexin V aktivasyonunu rapor olmasına rağmen bu hızlandırılmış süreçte tetiklenir ölüm kaskad tam nörodejenerasyon veya normal hücre homeostazında sırasında meydana nöron ölümünü eşleştiğini, belli olamaz. Bu ablasyon yaklaşımı son derece tekrarlanabilir ikenve özel, farklı gömme stratejileri de UV ablasyon verimliliğini etkileyebilir. bizim deneyim, biz bizim balık gömülü agaroz katmanı en aza indirmek için en başarılı oldu. nedeniyle zayıflama ve meydana gelen saçılma etkileri sonuçta hücre tarafından alınan UV gücünü azaltabilir yumurta su ilave tabaka ile orta gömme kalın tabakalar ışın yolu boyunca. Gelecekte, farklı transjenik balık hatlarının kesiştiği lazerle indüklenen hücre yıkımı için, örneğin glia gibi etkilenmiş hücrelerin, tepkileri (12 saat kadar) anında ve kısa dönem gözlenmesi için izin verir. Örneğin, ALS gibi nörodejeneratif hastalıklarda astrosit olmayan hücreli bağımsız toksisite araştırması spot edilmiş ve büyük ölçüde düzensiz ve ailesel ALS 37, 38 arasında patojenite rol oynar. Bununla birlikte, mekanizma glial toksisite ve seçicilik yatanMotorun doğru nöronlar belirsizliğini koruyor. Biz ve diğerleri son zamanlarda mikroglia tarafından nöronları ölen yutulmasına incelemek için bu yaklaşımın yararlandı ve nöronal kalıntıları 27, 39, 40 temizlenmesini görüntülendi. yüksek çözünürlüklü mikroskopi ve nöro için işaretleri ile ablasyon tekniği birleştiren gelecekte araştırmacılar tek hücre fonksiyonu ve birbirine pili sistemlerinin anlaşılmasını genişletmek için izin verecektir. In vivo ortamda bu işlemlerin karakterizasyonu gelişim ortamlarda hem de hücresel etkileşimler 3 bozulmuş olabilir MSB, 41 dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalıkların, modellerinde, sadece önemlidir.

Floresan mikroskobu uzun zebrabalıkları MSS transgenlerin, kalkınma 1 özellikle etkileri etkilerini incelemek için kullanılır olmuştur. Yüksek çözünürlüklü mikroskopi beyin gelişimi, kas üretimi, ve diğer birçok gelişimsel olayların 2 katılan hücresel süreçlerin detaylı haritalama izin verdi. Tek bir hücrenin ölümünü incelenmesi esas olarak standart görüntüleme işlemleri sırasında seçici hücre ölümünü teşvik teknik zorluklar, daha zor olmuştur. Ancak, tek hücreli çözünürlükte görüntüleme ve yüksek hedefli ablasyon tekniklerinin birleşimi sonucu hücre-hücre etkileşimleri yanı sıra, stres ve yaralanma anında hücresel yanıtları soruşturma sağlar. Bu süreçlerin daha iyi anlaşılması, özellikle, nöron glia etkileşimleri ilerlemesine katkıda bulunduğu gösterilmiştir motor nöron hastalığı (MSB), nörodejeneratif hastalıklar, kritikHastalığın 3. MSB, ya da Amyotrofik lateral skleroz (ALS), beyin sapı, motor korteks ve omurilikteki motor nöronlarını etkileyen yıkıcı bir nörodejeneratif bir hastalıktır. Bu nöronların kaybı, kas kaybına yol açar ve hastalar 3 içinde ölür - tanı 4 5 yıl. kas lifleri omurilik renkli motor nöron ve kas kasılması kolaylaştıran bir rol oynamaktadır. Bu nöronların bu iletişim veya ölüm başarısızlığı giderek kasları zayıflatır ve yutmak yürümek, konuşmak ve nefes hastanın yeteneğini etkiler. canlı bir hayvanda bir motor nöron ve kısa vadeli sonuçların ölümünü görselleştirme daha normal hücre homeostazında ve hastalıkta rol dinamik süreçleri anlamak için mükemmel bir fırsat sağlar. Balığı nörodejeneratif hastalıklar 1 çalışma için cazip bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır. BuBu dış döllenme kısa gelişim süresi, sinir sistemine bir optik erişim ve transgenesis kolaylığı gibi, bu model organizma sunduğu avantajlardan kaynaklanmaktadır. Buna ek olarak, kolay bileşiği, transjenik zebrafish oluşturma yeteneği, farklı hücre tipleri çok markalama stratejileri sağlar. Genetik ablasyon spesifik hücre tipleri oldukça geniş rahatsızlık verir, ancak tek tek hücrelerin 5 hedefleme iyi denetim eksikliği öldürmek için yaklaşımlar. Lazer destekli teknikleri, diğer taraftan, ince geçici ve aralıklı kontrolünün sağlar ve farklı hayvan modellerinde kullanılmıştır. Iken gibi çoğu yaklaşımlar kullanmak özel ekipman, lazer yazıcılarını 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ya da iki-foton set-up&#39;lar 13 darbeliaraştırma grupları son zamanlarda geleneksel konfokal mikroskoplar 14 UV lazer avantajı almış. Burada anlatılan teknik, seçilen motor nöronlarda doza bağlı bir şekilde hücre stres veya ölüme neden UV lazer kaynaklı yaklaşım yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi birleştirir. Bu, hücre kültüründe ve yaşam hayvanlarda başarıyla test edilmiştir yaygın olarak yüklenmiş 405-nm lazer kullanımına dayanır ve bu nöronal ölümünden sonra mikrogliyal açıklık gibi hücresel etkileşimleri, detaylı karakterizasyonu sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="655">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Agarose low melting</td>
			<td style="width:81px;">Fisher-Scientific</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:191px;">Dissolve in egg water with tricaine (0.02%) at 0.8-1.5%</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Tricaine</td>
			<td style="width:81px;">Argent Labs</td>
			<td style="width:136px;">MS-222</td>
			<td align="right" style="width:191px;">0.02%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Harvard standard wall Borosilicate with filament Capillary Glass</td>
			<td style="width:81px;">World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:136px;">GC100F-10 (short) 
			GC100F-15 (long)</td>
			<td style="width:191px;">Pull to a resistance of 2 -7 M&#937;</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:247px;">Egg water&#160;</td>
			<td style="width:81px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:191px;">0.6 g Instant Ocean sea salt, 4ml of 1mg/ml methylene blue in 10 l deionized water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td>
			<td style="width:81px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">P7629</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Pronase</td>
			<td style="width:81px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:136px;">10165921001</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:247px;">Heat block</td>
			<td style="width:81px;">Select BioProducts</td>
			<td style="width:136px;">Digital block heater (SBD110_)</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:247px;">Microinjection apparatus</td>
			<td style="width:81px;">World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:191px;">Microinjection was performed by hand under a steromicroscope (Leica) with a loaded glass needle and a Picospritzer II (General Valve corporation)</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:247px;">Stereoscope</td>
			<td style="width:81px;">Leica</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:191px;">Bright field illumination microscopy was performed on a Leica M165FC stereo dissection microscope (Leica)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Microscope</td>
			<td style="width:81px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:136px;">SP5</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:247px;">35mm glass bottom dish</td>
			<td style="width:81px;">MatTek Corporation</td>
			<td style="width:136px;">P35G-0-20-C</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

triggering cell stress and death using conventional uv laser confocal microscopy

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and cell-cell interactions in the CNS in real-time. Previously, studying these cell-specific responses after injury often required complicated setups or the transfer of cells or animals into different, non-physiological environments, confounding immediate and short-term analysis. For example, drug-mediated ablation approaches often lack the specificity that is required to study single-cell responses and immediate cell-cell interactions. Similarly, while high-power pulsed laser ablation approaches provide very good control and tissue penetration, they require specialized equipment that can complicate real-time visualization of cellular responses. The refined UV laser ablation approach described here allows researchers to stress or kill an individual cell in a dose- and time-dependent manner using a conventional confocal microscope equipped with a 405-nm laser. The method was applied to selectively ablate a single neuron within a dense network of surrounding cells in the zebrafish spinal cord. This approach revealed a dose-dependent response of the ablated neurons, causing the fragmentation of cellular bodies and anterograde degeneration along the axon within minutes to hours. This method allows researchers to study the fate of an individual dying cell and, importantly, the instant response of cells-such as microglia and astrocytes-surrounding the ablation site.

Burada tarif edilen yöntem, ticari konfokal mikroskop FRAP modülü kullanılarak zebra balığı omurilikteki motor nöron ablasyon sağlar. Gibi özel promotörlerin kontrolü altında nöronlarda yeşil floresan protein ifade eden bir transjenik zebra balığı hatları - 3mnx1, islet1 veya araya kullanılmıştır. (Örneğin -3mnx1 veya tanıştığımız) motor nöron organizatörü tarafından tahrik GFP ifade hücre gövdeleri, ana akson ve kaslara uzanan çevresel dalları (Şekil 4 ve Video 1) yüksek çözünürlüklü görselleştirme sağlar. 3. Başarılı ablasyon olduğunu adımda açıklanan% 70 ~ bir lazer gücü ve genel ayarlarda 80 sn - 3- 5 gün yaşlı balıkların omurilikte Nöronlar başarıyla 60 genel bir bekleme süresi ile ablasyon edilmiştir floresan ablasyonu sonrası hemen kaybolur zaman eldeve asla (Şekil 5, C ve D) devam eder. (Örneğin 488 nm lazer çizgisi gibi) diğer lazer hatları ile ablasyon girişimleri kalıcı solma neden olmadı, ve floresan kısa zaman dilimleri içinde restore edilmiştir. Önemli olarak, bu yöntem, Annexin V varlığında lizozomal dejenerasyon görünen morfolojik değişiklikler ve ablasyon nöron 27 aksonal blebbing UV ablasyon nöronların apoptotik hücre ölümünün karakteristik özelliklerini ortaya koymuştur. Bu yaklaşımın özgüllük hücresel belirtileri olmadan tek bir hedef sinir dönüştürüldü photoconvertible fluorofor Kaede (yani, UV ışığına maruz kaldıktan sonra yeşilden kırmızıya olan emisyonunu geçer), (Şekil 5 A ve B) kullanılarak yapılan deneyler ile teyit edilir birkaç saat içinde yok. Daha yüksek lazer gücü kullanımı yerine t açarO, kesip çıkarılacak bölgede (Şekil 5, C ve D) yakın hücreler (~ 20 mm) hedeflenen nöron (ölüm olmaksızın) (Resim Fotoçevrim veya floresan yeniden ortaya çıkma) ve Fotoçevrim yok oluşu. Bu lazer kaynaklı ablasyon tekniğinin önemli bir avantajı yaklaşım doz bağımlılığı. Farklı yoğunluklarda ile hedef hücrelere, ince ayar çok katmanlı (8 Şekil 3C), tarama hızı ve hat ortalama (Şekil 3B, 4 ve 5), ROI boyutu ablasyon için lazer gücünü ayarlayarak kullanılabilir (Şekil 3D, 10) ve tekrar (Şekil 3E, 12). Özellikle, bu yaklaşım aynı zamanda, hücrenin ölümünü teşvik bireysel hücrelerin hücresel stresi uygulamak için kullanılabilir. Örneğin, ince ayar olmuşturBir nöronun ölümüne sırasında hücresel süreçleri değerlendirmek için oldukça değerli. Düşük UV lazer yoğunlukları ile ablasyon yapıldı uzun akson projeksiyonlar motor nöronların karakteristik &quot;blebbing&quot; hedefli soma de başlamış ve zamanla akson boyunca (40 devam etmiştir (oluşumu ve hücresel veziküllerin parçalanması), ortaya - 90 dakika; Şekil 4 ; 3D) video 1 Bu ablasyon filmi render. Sonuç olarak, farklı lazer ablasyon parametreler ve dolayısıyla indüklenen hücre stresi ve ölüm zaman sürecini modüle araştırmacılara deney esneklik, yüksek düzeyde sağlar. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54983/54983fig1.jpg" /> Şekil 1: canlı görüntüleme için zebrafish gömülmesi. (AF) canlı görüntüleme prosedürü gömülmesi: (A) Tricaine zebra balığı A uyuşturan yumurta suya eklenir<html> 50 mg / L ta başlangıç ​​doz oranı. (B), düşük ısıda eriyen agaroz (0,8-1,5%) hazırlanmış ve 38 kadar ısıtılır - 40 ° C. Bir transfer pipeti kullanarak (C), filtrelenmiş ve seçilen zebra balığı tricaine çözeltisi ile bir çanak içine aktarılmaktadır. Başarılı sedasyon sonra, balık önceden ısıtılmış agaroz (D) aktarılır (sığ solungaç hareketi, kalp hızı, dokunmatik uyarılmış yanıt eksikliği azalma). sonraki seyreltme önlemek için agaroz aktarılır yumurta su miktarını en aza indirin. Bir cam alt 35 mm tabak üzerine zebrafish ihtiva eden - (50 uL ~ 30) (E) agaroz bir damla aktarın. Diseksiyon mikroskobu altında gerçekleştirin ve yavaşça tercih yönelimine zebrafish hizalamak için bir fırça kullanın. Agaroz ayarlamak kadar 15 dakika ve çanak (F) tricaine çözeltinin ~ 2 mL ekleyin - 10 bekleyin.ank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54983/54983fig2.jpg" /> Şekil 2: 3-dpf&#39;e zebrafish omurilik nöronların görselleştirilmesi ve mikroglia. 3 günlük eski transgenik zebrafish omurilikte mikroglia ve nöronlar görselleştirme ifade (A) GFP pozitif nöronlar (islet1: GFP) ve (B) mCherry-pozitif mikroglia (MPEG1: GAL4, UAS: mCherry). (C) birlikte parlak alan görüntü ile nöron ve mikroglia kanalının Kompozit görüntü. (C) şematik uç balık yönünü göstermektedir ve sunulan bölgeyi özetliyor. Ölçek çubuğu 30 mikron =. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54983/54983fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Şekil 3: (protokolde tarif edilen, aşama 3), UV lazer ablasyon işleminde Adım. Adımlar konfokal yazılımı (Leica Application Suite) FRAP yazılım modülünü kontrol etmek. (A) UV lazer ablasyon gerçekleştirmek için bir araç olarak sıkı bağlamak modülü başlatılıyor. Lazerin bekleme süresi belirleyecek biçimi, hız ve ortalama alma gibi ablasyon ve diğer sıkı bağlamak ayarları z-düzlemi kurma (B). Lazer yoğunluğu ve ağartma verimliliği maksimize etmek &quot;seçeneği yakınlaş&quot; (C) Kontrol. Ablasyon olacaktır (D) (ROI), bir ya da birden fazla bölgelerin seçimi. Beyazlatma zaman sürecini ayarlanması (E) ağartıcı döngüleri ve ROI de genel lazer bekleme süresini belirler. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54983/54983fig3large.jpg" target="_blank">Onu tıklayınız</a><html> E bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54983/54983fig4.jpg" /> Şekil 4: UV ablasyon nöronun anterograd dejenerasyon. UV-ablasyon spinal nöronun nörodejenerasyonun Time-lapse görüntüleme. (AF), tek bir omurga nöronun UV ışınlaması (buluştu: GAL4, UAS: EGFP; A; daire) aksonal parçalanma, ardından (AC) daralma ve zamanla yuvarlama nöronun soma sonuçlandı (CF; ok başları) . Aksonal dejenerasyon soma (ablasyon sitesi) başlayan ve nihayet, soma floresan kayboldu ve tüm akson &quot;blebbing&quot; (DF) gösterene kadar akson uzak ucuna doğru anterograd ilerledi. Ölçek çubukları 20 mikron =. Bu ablasyon 3D render time-lapse film video 1&#39;de gösterilmiştir.es / ftp_upload / 54983 / 54983fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54983/54983fig5.jpg" /> Şekil 5: Bir motor nöron bir photoconvertible flüorofor (Kaede) ile tek hücreli UV ışıması etkisinin doğrulanması. Bir nöron içinde photoconvertible fluorofor Kaede aktivasyonu yoluyla tek hücreli UV ışınlaması Doğrulama. Kaede ile etiketlenmiş nöronların (AD), UV ışınlama. 10 saniye için% 30 bir lazer gücü ile tek bir nöron (daire) (A) Fotoçevrim sadece hedeflenen tek tek nöron (B) (yeşilden kırmızıya) Kaede bir Fotoçevrim yol açtı. dönüştürülmüş hücre birkaç saat hayatta ve bozulma hiçbir görsel işaretler, örneğin blebbing olarak veya yukarı yuvarlama gösterdi unutmayın. Tek bir nöronun Ablasyon (Cı<html> ; daha yüksek bir lazer gücünün (10 s için% 95) olan bir daire), yaklaşık 20 um&#39;lik bir yarıçaptaki nöronların küçük bir sayı olduğu nöron (D hemen yok olması) ve Kaede sonraki Fotoçevrim sonuçlandı. Ölçek çubukları 20 mikron =. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54983/54983fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/54983/54983vid1.jpg" /> Video 1: Şekil 4&#39;te gösterildiği UV ablasyon nöronun 3D yüzey render (Imaris). Şekil 4&#39;te gösterilen nöron time-lapse video görselleştirme yazılımı (Imaris, Bitplane) kullanılarak işlenen yüzeydir. Bu anterogradely hücrenin uzak ucuna doğru aksonal parçalanma ardından ablasyon soma küçülme sürecini vurgular.euron_ablation-3D_rendered.mov &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bu dosyayı indirmek için tıklayınız. Ek Şekil 1: Uzun süre görüntüleme için isteğe bağlı agaroz döküm. uzun vadeli satın alma sırasında balık ve agaroz hareketini önlemek için bir donut cam alt 35 mm çanak (A) ortasında kenarları boyunca agaroz şeklindeki daire hazırlar. 10 dakika ~ için agaroz set edelim ve agaroz (B) bir damla iç daire içine balık transfer. katıştırma için agaroz miktarını en aza indirmek (balık yönlendirici sonra dışarıya aşırı agaroz fırça) deneyin. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54983/Supplementary_Figure_1.jpg" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy at JoVE.com

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

Targeted manipulations to cause directed stress or death in individual cells have been relatively difficult to accomplish. Here, a single-cell-resolution ablation approach to selectively stress and kill individual cells in cell culture and living animals is described based on a standard confocal UV laser.

Konvansiyonel UV Lazer konfokal mikroskopi kullanılarak Tetikleme Hücre Stres ve Ölüm

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...

triggering-cell-stress-death-using-conventional-uv-laser-confocal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.4K Görüntüleme.  Macquarie University. Targeted manipulations to cause directed stress or death in individual cells have been relatively difficult to accomplish. Here, a single-cell-resolution ablation approach to selectively stress and kill individual cells in cell culture and living animals is described based on a standard confocal UV laser.

Video: Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The vesicles are then retrieved from the plasma membrane (endocytosis) and grouped together with the general pool of vesicles within the nerve terminal, until they undergo a new exo- and endocytosis cycle (vesicle recycling). These processes have been studied using a variety of techniques such as electron microscopy, electrophysiology recordings, amperometry and capacitance measurements. Importantly, during the last two decades a number of fluorescently labeled markers emerged, allowing optical techniques to track vesicles in their recycling dynamics. One of the most commonly used markers is the styryl or FM dye 1; structurally, all FM dyes contain a hydrophilic head and a lipophilic tail connected through an aromatic ring and one or more double bonds (Fig. 1B). A classical FM dye experiment to label a pool of vesicles consists in bathing the preparation (Fig. 1Ai) with the dye during the stimulation of the nerve (electrically or with high K+). This induces vesicle recycling and the subsequent loading of the dye into recently endocytosed vesicles (Fig. 1Ai-iii). After loading the vesicles with dye, a second round of stimulation in a dye-free bath would trigger the FM release through exocytosis (Fig. 1Aiv-v), process that can be followed by monitoring the fluorescence intensity decrease (destaining).

Although FM dyes have contributed greatly to the field of vesicle recycling, it is not possible to determine the exact localization or morphology of individual vesicles by using conventional fluorescence microscopy. For that reason, we explain here how FM dyes can also be used as endocytic markers using electron microscopy, through photoconversion. The photoconversion technique exploits the property of fluorescent dyes to generate reactive oxygen species under intense illumination. Fluorescently labeled preparations are submerged in a solution containing diaminobenzidine (DAB) and illuminated. Reactive species generated by the dye molecules oxidize the DAB, which forms a stable, insoluble precipitate that has a dark appearance and can be easily distinguished in electron microscopy 2,3. As DAB is only oxidized in the immediate vicinity of fluorescent molecules (as the reactive oxygen species are short-lived), the technique ensures that only fluorescently labeled structures are going to contain the electron-dense precipitate. The technique thus allows the study of the exact location and morphology of actively recycling organelles.

FM dyes have been of invaluable help in the understanding of synaptic dynamics. FMs are normally followed under the fluorescent microscope during different stimulation conditions. However, photoconversion of FM dyes combined with electron microscopy allows the visualization of distinct synaptic vesicle pools, among other ultrastructure components, in synaptic boutons.

Styryl Boyaların Fotoçevrim kullanarak Synaptic veziküllü Havuzları incelenmesi

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Nörobilim

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Ultrasonik Kan-beyin bariyeri bozulması ve Manganez kontrastlı MRG kullanma İşlevsel beyin görüntüleme

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Eşodaklı Işık Sac Mikroskobu ile Tüm Fare Brain mikron çaplı Çözünürlük Optik Tomografi

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Sex Stratified Neuronal Cultures to Study Ischemic Cell Death Pathways

Sex differences in neuronal susceptibility to ischemic injury and neurodegenerative disease have long been observed, but the signaling mechanisms responsible for those differences remain unclear. Primary disassociated embryonic neuronal culture provides a simplified experimental model with which to investigate the neuronal cell signaling involved in cell death as a result of ischemia or disease; however, most neuronal cultures used in research today are mixed sex. Researchers can and do test the effects of sex steroid treatment in mixed sex neuronal cultures in models of neuronal injury and disease, but accumulating evidence suggests that the female brain responds to androgens, estrogens, and progesterone differently than the male brain. Furthermore, neonate male and female rodents respond differently to ischemic injury, with males experiencing greater injury following cerebral ischemia than females. Thus, mixed sex neuronal cultures might obscure and confound the experimental results; important information might be missed. For this reason, the Herson Lab at the University of Colorado School of Medicine routinely prepares sex-stratified primary disassociated embryonic neuronal cultures from both hippocampus and cortex. Embryos are sexed before harvesting of brain tissue and male and female tissue are disassociated separately, plated separately, and maintained separately. Using this method, the Herson Lab has demonstrated a male-specific role for the ion channel TRPM2 in ischemic cell death. In this manuscript, we share and discuss our protocol for sexing embryonic mice and preparing sex-stratified hippocampal primary disassociated neuron cultures. This method can be adapted to prepare sex-stratified cortical cultures and the method for embryo sexing can be used in conjunction with other protocols for any study in which sex is thought to be an important determinant of outcome.

Primary disassociated embryonic hippocampal neuronal cultures are useful for investigating the signaling mechanisms involved in neuron death. Sexing the embryos before the isolation and dissociation of the hippocampus allows the preparation of separate male and female cultures, which enables the researcher to identify and investigate sex-specific cell signaling.

İskemik Hücre Ölümü Pathways Eğitim için seks Katmanlı Nöronal Kültürleri

Sex differences in neuronal susceptibility to ischemic injury and neurodegenerative disease have long been observed, but the signaling mechanisms ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. Structural changes at the NMJ can result in neurotransmission failure, resulting in weakness, atrophy and even death of the muscle fiber. Many studies have investigated how genetic modifications or disease can alter the structure of the mouse NMJ. Unfortunately, it can be difficult to directly compare findings from these studies because they often employed different parameters and analytical methods. Three protocols are described here. The first uses maximum intensity projection confocal images to measure the area of acetylcholine receptor (AChR)-rich postsynaptic membrane domains at the endplate and the area of synaptic vesicle staining in the overlying presynaptic nerve terminal. The second protocol compares the relative intensities of immunostaining for synaptic proteins in the postsynaptic membrane. The third protocol uses Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to detect changes in the packing of postsynaptic AChRs at the endplate. The protocols have been developed and refined over a series of studies. Factors that influence the quality and consistency of results are discussed and normative data are provided for NMJs in healthy young adult mice.

The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.

Nöromusküler Kavşak: Ölçme Synapse Boyut, Konfokal Floresan Mikroskobu kullanılarak sinaptik Protein Yoğunluk Parçalanma ve Değişiklikler

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Konfokal Makroskopi kullanarak Postnatal Serebellar Granül Hücre Göç Ex Vivo Görüntüleme

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced tools currently used to study neurons, have only partly been taken on by oligodendrocyte researchers. Cell type-specific staining by viral transduction is a useful approach to study live organelle dynamics. This paper describes a protocol for visualizing oligodendrocyte mitochondria in organotypic brain slices by transduction with adeno-associated virus (AAV) carrying genes for mitochondrial targeted fluorescent proteins under the transcriptional control of the myelin basic protein promoter. It includes the protocol for making organotypic coronal mouse brain slices. A procedure for time-lapse imaging of mitochondria then follows. These methods can be transferred to other organelles and may be particularly useful for studying organelles in the myelin sheath. Finally, we describe a readily available technique for visualization of unstained myelin in living slices by Confocal Reflectance microscopy (CoRe). CoRe requires no extra equipment and can be useful to identify the myelin sheath during live imaging.

Myelinating oligodendrocytes promote rapid action potential propagation and neuronal survival. Described here is a protocol for oligodendrocyte-specific expression of fluorescent proteins in organotypic brain slices with subsequent time-lapse imaging. Further, a simple procedure for visualizing unstained myelin is presented.

Görselleştirme ve Oligodendrocyte organelleri Adeno ilişkili virüs ve Confocal mikroskobu kullanılarak Organotypic beyin dilimleri içinde canlı görüntüleme

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the transmission of molecules from the nervous system to voluntary muscles, leading to contraction. They are affected in many human diseases, including inherited neuromuscular disorders such as Duchenne muscular dystrophy (DMD), congenital myasthenic syndromes (CMS), spinal muscular atrophy (SMA), and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Therefore, monitoring the morphology of neuromuscular junctions and their alterations in disease mouse models represents a valuable tool for pathological studies and preclinical assessment of therapeutic approaches. Here, methods for labeling and analyzing the three-dimensional (3D) morphology of the pre- and postsynaptic parts of motor endplates from murine teased muscle fibers are described. The procedures to prepare samples and measure NMJ volume, area, tortuosity and axon terminal morphology/occupancy by confocal imaging, and the distance between postsynaptic junctional folds and acetylcholine receptor (AChR) stripe width by super-resolution stimulated emission depletion (STED) microscopy are detailed. Alterations in these NMJ parameters are illustrated in mutant mice affected by SMA and CMS.

This protocol describes a method for morphometric analysis of neuromuscular junctions by combined confocal and STED microscopy that is used to quantify pathological changes in mouse models of SMA and ColQ-related CMS.

Farelerde Nöromüsküler Kavşakların Kombine Konfokal ve Süper Redüksiyonlu Mikroskopi ile Karakterizasyonu

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the ...

Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a cascade of events leading to neurotransmitter release. Moreover, changes in presynaptic calcium levels mediate the activity of many intracellular proteins and play an important role in synaptic plasticity. Studying calcium signaling is also important for finding ways to treat neurodegenerative diseases. The neuromuscular junction is a suitable model for studying synaptic plasticity, as it has only one type of neurotransmitter. This article describes the method for loading a calcium-sensitive dye through the cut nerve bundle into the mice's motor nerve endings. This method allows the estimation of all parameters related to intracellular calcium changes, such as basal calcium level and calcium transient. Since the influx of calcium from the cell exterior into the nerve terminals and its binding/unbinding to the calcium-sensitive dye occur within the range of a few milliseconds, a speedy imaging system is required to record these events. Indeed, high-speed cameras are commonly used for the registration of fast calcium changes, but they have low image resolution parameters. The protocol presented here for recording calcium transient allows extremely good spatial-temporal resolution provided by confocal microscopy.

The protocol describes the method of loading a fluorescent calcium dye through the cut nerve into mouse motor nerve terminals. In addition, a unique method for recording fast calcium transients in the peripheral nerve endings using confocal microscopy is presented.

Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Fare Nöromüsküler Kavşağında Yüksek Zamansal Çözünürlükte Kalsiyum Geçici Maddelerinin Kaydı

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a ...