- (PeReNE, Interreg 4A ERDF) Bu çalışma Biyotıp Araştırma ve Yenilik Enstitüsü (IRIB), Normandiya Hücre Görüntüleme Platformu (PRIMACEN), Inserm, IBiSA, Rouen Üniversitesi, Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu tarafından desteklenen LARC-Nörobilim Ağ ve Région Haute-Normandie.

Hayvanlar (erkek veya dişi Wistar sıçanlar) bakım ve laboratuar hayvanlarının kullanımı için Fransız kılavuza göre, doğduğu ve akredite hayvan tesisi (onay B.76-451-04) yetiştirildi. Deneyler Avrupa Topluluğu Konsey Direktifi (22 Eylül 2010/63 / UE 2010) ve Fransa Tarım Bakanlığı uyarınca yetkili müfettişler (MB, DV ve LG) gözetiminde yapılmıştır. Medya ve Araçlar 1. Hazırlık <ol><li> Bir biyolojik güvenlik kabini, MgCI2 olmayan CaCl2 (1.85 g / l) / MgSO 4 (0,9767 g / l) ihtiva eden 10x stok çözeltisinden steril su içinde 1x Hank BSS (HBSS) hazırlanması. HBSS çözeltisi 1x NaHCO 3 (350 ug / ml) ilave et. </li><li> Biyolojik güvenlik kabini içinde, N2 (100X&#39;lik bir stok çözeltiden), ek ve penisilin (100 birim / ml) -streptomycin (0.1 mg / ml) Dulbecco&#39;nun modifiye edilmiş Eagle ortamında (DMEM) besin karışımına solüsyonu ekleyinTüre, F-12 (1: 1). </li><li> Steril koşullarda, DMSO içinde sitoplazmik fluoresan boya olarak adlandırılan hücre izci yeşil bir kısım (25 ul, 2 mM) (1 mg 1.075 mi) hazırlanır. 15 ml konik bir tüp içinde 5 ml DMEM bir kısım ile seyreltilir. </li><li> 4 ° C&#39;de medyayı tutmak için doldurulmuş buz kovası hazırlayın. </li><li> % 70 etanol ile laboratuvar tezgah üstleri ve araçları dekontamine. </li></ol> P10 Rats adlı Serebellumunda 2. Diseksiyon <ol><li> Hızla omurilik başlangıcını almak için kulakların arkasında kavisli işletim makas ile sıçan yavrular (P10) başını kesmek. </li><li> Kellesi başın arka tarafında, ince iris makası ile burun boyun derinin orta hat kesi yapmak ve ince iris makas ve Dumont 3. forseps ile kafatası cilt ayırmak. </li><li> Ince kafatası rostral bölgeye tabanından iki yan kesiler yapmak için ince iris makas kullanın. İki 3. forseps ile disseke kafatası çıkarın. Sutyen ayırınAynı forseps kullanarak kafatası ile herhangi bir bağlılık dan. </li><li> Buz soğukluğunda HBSS ortam 2 ml içeren bir Petri kabı, bir spatula (çapı 35 mm) kaşık ucu ile beyin aktarın. </li><li> Stereomikroskopta aşamasına buz ve transfer dolu büyük bir Petri kabındaki beyin içeren Petri kabı (Ø 100 mm) koyun. </li><li> Bir stereomikroskop altında, iki arasında 3 forseps kullanarak dilaceration ile beyinden beyincik izole. Benzer şekilde, rezidüel omurilik ve pial-membran kaldırmak. </li><li> Bir spatula kaşık ucu ile yeni bir HBSS dolu Petri kabındaki serebellum (Ø 35 mm, 2 ml) aktarın ve buz üzerinde tutmak. </li></ol> Akut Serebellar Dilimleri 3. hazırlanması <ol><li> İki başkanları tarafından belirtildiği gibi stereomicroscope altında, vermis ve sağ hemisfer arasında beyincik kesti standart neşter sapı 3. katı ve 15. cerrahi bıçak ile Şekil 2A ok. </li><li> Mavi bir damla koyunoacrylate vibratome numune disk üzerinde tutkal ve toksik solvent buharının ortadan kaldırmak için 15-25 sn bekleyin. </li><li> Bir spatula kaşık ucu ile kesme beyincik toplayın ve temiz bir kağıt havlu ile fazla HBSS çıkarın. </li><li> Örnek diske yakın beyincik getirin. Örnek diske kesme kenarı sabitleyin ve 10 sn bekleyin. </li><li> Manipülatör ile tampon tepsisine örnek diskini yerleştirin ve böylece beyincik enine ekseni bıçak tutucu dik döndürün. Bir Allen anahtarı ile numune diski sabitleyin ve beyincik kaplıdır kadar hafifçe HBSS orta tampon tepsisini doldurun. </li><li> Yük soğutma banyoya buz ezilmiş. </li><li> Herhangi bir yağ ortadan kaldırmak için% 70 etanol ile bıçak üç kez temizleyin. </li><li> Bıçak tutucu içine bıçağı yerleştirin ve vida sıkma ile sabitleyin. </li><li> Numunenin (kullanıcının görünümü) arka kenarı arkasında bıçak kenarı sağa yerleştirin ve bir başlangıç ​​noktası olarak tanımlayabilirsiniz. İleri kullanın t tanımlamak komutunuO numunenin ön kenarı sonra bitiş noktası. </li><li> 2.5 hızı kesit ve 180 mikron de 8. Seçin kırparak kalınlıkta frekansı kesit seçin. Doku bölümlendirilmeleri başlatın. </li><li> Buz üzerinde tutulmalıdır Petri kabı (Ø 35 mm) HBSS içeren Pasteur pipet ve transfer kesildi geniş çaplı bir camını kullanarak her bölüm Pick up. </li><li> Bıçak ile müdahale sırasında iki 5. forseps kullanarak, beyincik dikkatlice meninksler çıkarın. Beyincik başına 5 dilimleri (Şekil 2B, C), maksimum toplayın. </li><li> Dikkatle stereomicroscope altında iki 5. forseps ile serebellar dilim meninksler çıkarın ve daha sonda yükleme için hafifçe lobülleri ayırın. </li></ol> Yaşam internöronlar 4. Floresan Boyama <ol><li> 6-plaka (kuyu başına maksimum 3 dilim /) için geniş çaplı cam kesildi Pasteur pipeti ile serebellar dilim aktarın. HBSS orta aspire. </li><li> L, 5 ml dilimleri (3 max) inkübefloresan boya oading çözeltisi (10 uM). </li><li> Işıktan korumak için alüminyum folyo ile örtünüz. Hücre etiketleme kolaylaştırmak için oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 35 rpm&#39;de bir cayro hareketli tabla üzerine koy. </li><li> Geniş çaplı bir cam kesildi Pasteur pipeti ile, bir Transwell membranı üzerinde Aktarım dilimleri (Şekil 2D 3.0 um gözenek boyutu) takın. Pipet ile yükleme ortamı aspire. </li><li> Parçayı çıkarın ve DMEM 1.9 ml kuyu doldurun. Yuvasını yerine ve doku kapsayacak şekilde dilimin üstüne DMEM 100 ul ekleyin. </li><li> Kuluçka bölmesinde kültür ekleri ML GC&#39;lerin gözlemlemek için yeterli olan, 2 saat boyunca (37 ° C,% 5 CO2) içeren plaka koyun. Insert membran (Şekil 2E) eki izin düz dokuları Lie. Dilimler kurutma değil emin olun. </li></ol> Konfokal Makroskopi sayesinde 5. ex vivo Görüntüleme <ol><li> Olmadan plaka aktarınBir kuvöz içine plastik kapak konfokal macroscope standı bağlı. Macroscope plaka insert bir cam kapağı yerleştirin. 37.0 ° C &#39;de odanın sıcaklığını tutmak ± 0.5 ° C ve sürekli gaz akımının (% 95 O2,% 5 CO2) plaka ekleme yoluyla, pH sabit tutmak için olan dilim tedarik. Time-lapse deneyden önce 2 ek saat bekleyin. </li><li> Doku dilimleri GC göç görselleştirmek bir X2, kuru amacı ile donatılmış bir konfokal lazer tarama macroscope ile bir lazer diyotu vasıtası ile 488 nm dalga boyu ışık ile hazırlanmasını aydınlanması için (çalışma mesafesi: 39 mm, çap: 58 mm, NA = 0.234), ve 500 &#39;den 530 nm&#39;ye kadar flüoresans emisyon algılar. <ol><li> Ince GC&#39;ler hareketini gidermek için, 1,5-2,0 ek bir optik zum faktörü ile görüntüler elde. Tek bir odak düzlemi veya z ekseni boyunca 10 farklı odak düzlemleri kadar 12 saat boyunca her 30 dakika kadar GNS görüntüleri toplayın. </li></ol></li&gt; <li> Gerektiğinde, cam kapağını çıkarın ve GC göç üzerindeki etkilerini incelemek için bir 10 ul pipet ile DMEM biyolojik aktivatörleri veya inhibitörlerinin küçük hacimli (1-10 ul) ekleyin. </li></ol> 6. Hücre Takibi <ol><li> Filmin her zaman için, ImageJ Ecart tipi modu ile z-yığın projeksiyonu gerçekleştirin. Kontrast modüle ve ardışık görüntülerin parlaklık seviyesi tespiti ve etiketli GClerin izlemeyi kolaylaştırmak için. Harita (t = 0) referans anlık elle her pozisyon. <ol><li> Analiz Parçacık Menüsünde &quot;Manuel izleme&quot; eklentisi kullanın ve time-lapse sırasında her hücre vücudun ağırlık noktasını tıklayarak belirler. Bir elektronik ham izleme verileri aktarın. </li></ol></li><li> Her hücre ve ilişkili pozisyonlarını belirlemek (PHP kodu ile yazılmış http://primacen.fr) akıllı ev yapımı program ile ImageJ ihraç ham izleme verilerini yeniden düzenleyebilirler. Programı kullanarak, calculatToplam seyahat mesafesi ve her hücre için göç ortalama hızı e. Sınıflandırmak ve aynı programı kullanarak uygun filtrelerin altında kontrol ve tedavi koşullarında hücre göçü özelliklerini karşılaştırmak. </li></ol>

<ol>
	<li>Komuro, Y., Kumada, T., Ohno, N., Foote, K. D., Komuro, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+in+the+Cerebellum.">Migration in the Cerebellum.</a> Cellular Migration and Formation of Neuronal Connections: Comprehensive Developmental Neuroscience. 2, 281-297 (2013).</li><li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development of the cerebellar system in relation to its evolution, structure, and functions. , (1997).</li><li>Komuro, H., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+modes+of+neuronal+migration+in+different+domains+of+developing+cerebellar+cortex.">Distinct modes of neuronal migration in different domains of developing cerebellar cortex.</a> Journal of Neuroscience. 18 (4), 1478-1490 (1998).</li><li>Komuro, H., Yacubova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+cerebellar+granule+cell+migration.">Recent advances in cerebellar granule cell migration.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (6), 1084-1098 (2003).</li><li>Fahrion, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+neuronal+migration+deficits+in+a+mouse+model+of+fetal+Minamata+disease+by+increasing+neuronal+Ca2++spike+frequency.">Rescue of neuronal migration deficits in a mouse model of fetal Minamata disease by increasing neuronal Ca2+ spike frequency.</a> Proceedings of National Academy of Sciences USA. 109 (13), 5057-5062 (2012).</li><li>Raoult, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide+(PACAP)+stimulates+the+expression+and+the+release+of+tissue+plasminogen+activator+(tPA)+in+neuronal+cells:+involvement+of+tPA+in+the+neuroprotective+effect+of+PACAP.">Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) stimulates the expression and the release of tissue plasminogen activator (tPA) in neuronal cells: involvement of tPA in the neuroprotective effect of PACAP.</a> Journal of Neurochemistry. 119 (5), 10-1111 (2011).</li><li>Cameron, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+cortical-layer-specific+control+of+neuronal+migration+by+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide.">Cerebellar cortical-layer-specific control of neuronal migration by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide.</a> Neuroscience. 146 (2), 697-712 (2007).</li><li>Renaud, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plexin-A2+and+its+ligand,+Sema6A,+control+nucleus-centrosome+coupling+in+migrating+granule+cells.">Plexin-A2 and its ligand, Sema6A, control nucleus-centrosome coupling in migrating granule cells.</a> Nature Neuroscience. 4, 440-449 (2008).</li><li>Komuro, H., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+granule+cell+migration:+a+confocal+microscopic+study+in+acute+cerebellar+slice+preparations.">Dynamics of granule cell migration: a confocal microscopic study in acute cerebellar slice preparations.</a> Journal of Neuroscience. 15 (2), 1110-1120 (1995).</li><li>Nielsen, H. S., Hannibal, J., Fahrenkrug, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+pituitary+adenylate+cyclase+activating+polypeptide+(PACAP)+in+the+postnatal+and+adult+rat+cerebellar+cortex.">Expression of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in the postnatal and adult rat cerebellar cortex.</a> Neuroreport. 9 (11), 2639-2642 (1998).</li><li>Hannibal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+adenylate+cyclase-activating+peptide+in+the+rat+central+nervous+system:+an+immunohistochemical+and+in+situ+hybridization+study.">Pituitary adenylate cyclase-activating peptide in the rat central nervous system: an immunohistochemical and in situ hybridization study.</a> Journal of Comparative Neurology. 453 (4), 389-417 (2002).</li><li>Garcia-Rocha, M., Avila, J., Armas-Portela, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-type+plasminogen+activator+(tPA)+is+the+main+plasminogen+activator+associated+with+isolated+rat+nerve+growth+cones.">Tissue-type plasminogen activator (tPA) is the main plasminogen activator associated with isolated rat nerve growth cones.</a> Neuroscience Letters. 180 (2), 123-126 (1994).</li><li>Ware, J. H., DiBenedetto, A. J., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+tissue+plasminogen+activator+mRNA+in+the+developing+rat+cerebellum+and+effects+of+inhibiting+tissue+plasminogen+activator+on+granule+cell+migration.">Localization of tissue plasminogen activator mRNA in the developing rat cerebellum and effects of inhibiting tissue plasminogen activator on granule cell migration.</a> Journal of Neurobiology. 28 (1), 9-22 (1995).</li><li>Friedman, G. C., Seeds, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+plasminogen+activator+mRNA+expression+in+granule+neurons+coincides+with+their+migration+in+the+developing+cerebellum.">Tissue plasminogen activator mRNA expression in granule neurons coincides with their migration in the developing cerebellum.</a> Journal of Comparative Neurology. 360 (4), 658-670 (1995).</li><li>Seeds, N. W., Siconolfi, L. B., Haffke, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+extracellular+proteases+facilitate+cell+migration,+axonal+growth,+and+pathfinding.">Neuronal extracellular proteases facilitate cell migration, axonal growth, and pathfinding.</a> Cell and Tissue Research. 290 (2), 367-370 (1997).</li><li>Basham, M. E., Seeds, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasminogen+expression+in+the+neonatal+and+adult+mouse+brain.">Plasminogen expression in the neonatal and adult mouse brain.</a> Journal of Neurochemistry. 77 (1), 318-325 (2001).</li><li>Bourgault, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+conformational+determinants+of+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide+(PACAP)+for+activation+of+the+PAC1+receptor.">Molecular and conformational determinants of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) for activation of the PAC1 receptor.</a> Journal of Medical Chemistry. 52 (10), 3308-3316 (2009).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokol Transwell sistemi ve konfokal makroskopi yoluyla doğum sonrası gelişimi sırasında hücre göçü incelemek için yeşil floresan boya ile GC floresan etiketleme akut P10 sıçan serebellar dilim kültürü anlatılmaktadır. Bu protokol, 12 saat ve deney sırasında agonistleri veya nöropeptid antagonistler, enzim inhibitörler, hücre sinyal modülatörlerinin veya toksik maddeler de dahil olmak üzere göç faktörlerin düzenlenmesinde olası rollerinin testine kadar bir süre için, hücre göçünün gözlemler sağlar. Bir pipet ucu ile membran geçme küçük bir delik, kuluçkalama ortamı içinde bileşiklerin uygulanmasını kolaylaştırmak için gereklidir. Bir ev yapımı kavisli uç pipet çözeltisi iletimini kolaylaştırmak için kullanılabilir. Doku dilimleri canlı hücre göçü çalışmalardan biri sorunu dokusunun kendisi hareketleri hücre zor izleme yapabilirsiniz olmasıdır. Önceki yaklaşımlar hafifçe SLI stabilize etmek için önerdi OysaBir naylon ces mesh veya fare kuyruk kolajeni 7,17 ince bir tabaka, bu teknolojinin büyük bir avantaj hedefi altında CO2 inkübatör membran ekler serebellar dilim içeren bir 6-yuvalı kültür plakasının basit ve doğrudan transferi konfokal macroscope evi. Entegre sıcaklık ve CO 2 kontrolörleri de hücre migrasyonu 9 için gerekli uygun ve sabit çevre parametreleri sağlamak. Bu nedenle, kültür koşulları dilimleri de zar insert bağlı beri en aza indirilmiştir gözlemler ve doku hareketleri sırasında tutulur. Doku stabilizasyonu edinimi sırasında referanslar sabit olmalıdır dilim kenarları veya Purkinje hücrelerinin konumunu takip tarafından doğrulanmadı. Buna ek olarak, plaka 6 kuyucuklarına dağıtılmış ve serebellar dilimleri (12 ila 18), hızlı bir şekilde, bir motorlu kaide ile bir optik zoom ile ayrıntılı olarak görülmektedir. Nedeniyle kuru hedefi, epi büyük çalışma mesafesi (X2, 39 mm)Kültür ortamı daha kolay olarak * Gözlem bileşiklerinin daldırma ve uygulama imkanı mevcuttur. Bu nedenle, CO 2 kuvöz ve konfokal çevre parametreleri ve kültür destek benzerlikler biyolojik numune maksimum koruma yol makroskopi. Protokol diğer bir avantajı, büyük görüş alanı ve aynı zamanda görülebilir hücre dolayısıyla büyük bir sayıdır. Örneğin, daha önce ML radyal göç floresan GC&#39;ler yoğunluğu 1124 ± 138 hücre / mm 2 18 olduğunu tespit ettik. Konfokal Makroskopi (X2, NA 0,234 =) konfokal mikroskobu ile karşılaştırıldığında daha düşük bir yan çözünürlüğe sahip (40X NA = 1.25), ancak iki teknolojik 7,18 yaklaşır arasındaki hücre GClerin organları kolaylıkla takip edilebilir ve göç ortalama hızı karşılaştırılabilir . Görüntü satın almalar, doku dilimleri ve th kalitesi için teknik gelişme yanındaetiketleme e kalitesi başarılı deneyler için kilit noktalarıdır. Her zaman diseksiyon süreçlerinde buz üzerinde medya ve dokuları korumak, vibratome bıçaklar yağ ortadan kaldırmak ve tutkal ile temas doku dilimleri kullanmak yok. Sagital ve enine kesitler sırasıyla radyal ve teğet göç adapte edilir. Serebellumun farklı kortikal katmanları uygun tespiti için inkübasyon farklı uzunluklara kullanın. (8 saat kadar) uzun inkübasyon süreleri, PCL ve Igl çok sayıda GClerin geçişini tespit etmek için gereklidir. GC göç özgü uzay-zamansal pencereleri sırasında fizyolojik süreç olduğundan, pozitif kontrol hücreleri düzgün göç etmek zorunda olmasıdır. Özellikle, ML çok sayıda aks GC sajital serebellar dilimleri için başlıca sağlık göstergesi biridir. Deney çalıştırmak için, ML GC hareketlerinin izlenmesi önerilmiştir. Gerçekten de, dikey olarak uzatılmış hücre gövdesi ile GC şekli, AC başlatmak için bir referans noktası olarak göz önüne alınmalıdırbirbirini takip eden kumanda (2 saat) ve tedavi (2 saat) kolayca ML yapılabilir dönemlerle edinirken. Hücre Tracker aile ya da genetik yapıları aracılığıyla ifade floresan proteinleri gibi Floresan boyalar hücre göçü çalışmaları için izleyiciler olarak kullanılabilir. Nedeniyle GC göç (1 yığın her 30 dk) yavaş kinetiği için, renkli deneyler de sistemde 4 lazerler kiriş (405, 488, 532 ve 633 nm) beri sıralı modunda kullanılabilir olan yapılabilmektedir. Diğer internöronlar izleme, merkezcil ve merkezkaç radyal göç dikkate alındığında da 18 gerçekleştirilebilir. Özellikle, daha az sayıda hücre tipi daha kolay geniş bir görüş alanı ile lokalize edilebilir. Son olarak, bu protokol, serebellar gelişme için diğer aşamalarında değil, aynı zamanda diğer beyin bölgelerinde hücre göçü incelemek için kullanılabilir.

Gelişmekte olan beyincik, nöron sekiz farklı tipte ikinci embriyonik haftada ve kemirgenler 1 ikinci doğum sonrası hafta arasında sırayla üretilmektedir. Başlangıçta birincil germinal bölge hareketle, olgun olmayan granül hücreleri (GC), dış granüler tabaka (EGL), ikinci bir germinal bölge 2 üretilebilir son nöronlardır. İlk üç sonrası hafta boyunca, serebellar korteks EGL, moleküler tabakanın (ML) dahil olmak üzere dört katman olarak düzenlenen bir yapraklanmış bir yapıdır, Purkinje hücresi tabakası (PCL) ve iç granüler tabaka (IGL) (Şekil 1). Merkezcil göç, olgunlaşmamış GC&#39;ler, glutamaterjik internöronların sayesinde, yaklaşık 2 gün içinde Igl ulaşır. Üçüncü doğum sonrası haftasında, EGL kaybolur ve IGL yetişkin beyincik granüler tabaka (GL) ne denir oluşturmaktadır. GL, GC&#39;ler yosunlu elyaf ve unipolar fırça hücrelerinden eksitatör sinaptik girişleri alabilir veGolgi hücre aksonlarından inhibitör sinaptik girdiler. ML ise, GC aksonları Purkinje hücreleri, sepet hücreleri, stellat hücreler ve golgi hücrelerinin 2 olmak üzere GABAerjik nöronlar ile sinaps eksitatör yapmak. Erken doğum sonrası kemirgenler elde edilen akut serebellar dilimleri içinde hücre hareketi Gerçek zamanlı gözlem GC&#39;ler serebellar korteks 3 onların rota boyunca göç yöntemi ve hız değişiklikleri ile eş zamanlı olarak kendi şeklini değiştirmek olduğunu göstermektedir. İlk iki doğum sonrası hafta boyunca, GC öncüleri aktif EGL üstündeki çoğalır. EGL orta kısmında, postmitotic GC&#39;ler onların büyük sürecinde yönünde teğet göç ederler. EGL-ML sınırında, GC&#39;ler onların hareketlerini yavaş hücreler ML içine kısa dikey inen sürecine girmeye başlar. ML yılında GC&#39;ler dikey uzatılmış hücre gövdesi, ince firar süreci ve daha hacimli lider süreci ve Bergmann glial lifleri boyunca radyal göç. IçindePCL, GC&#39;ler kendi hareketini durdurmak ama uzun bir sabit faz (2 saat) sonra, onlar PCL-IGL sınırını geçmeye. Igl yılında GC&#39;ler glial lif desteğinin yokluğunda tabakasının altına doğru göç ederler. Giden süreçte uçları kez IGL-beyaz cevher (WM) sınır, GC&#39;ler yavaş yaklaşmak ve onların hareketini durdurun. Sagital dilim ML, PCL ve Igl göçü radyal adanmıştır ise beyincik enine kesitler EGL de teğet göç çalışmaları için tercih edilmektedir. (Örneğin, somatostatin, PACAP) şimdiye kadar tespit edilmiştir nöropeptid ancak her kortikal katmanda GC göç uzay-zamansal kontrolünde yer alan komple mekanizmalar da dahil olmak üzere GC hareketlerinin bazı düzenleyici faktörler hala büyük ölçüde bilinmeyen 1,4,5,6 vardır. GC göç acu için izole kültürlü hücreleri veya floresan tespiti için ya iletilen ışık aydınlatma kullanarak video ve konfokal mikroskopi sayesinde son 20 yılda çalışılmıştırte serebellar dilimleri. Başlangıçta lipofilik DII ve son zamanlarda &quot;Hücre Takibi&quot; boyalar ve hücre-ifade floresan proteinleri konfokal ya da iki-fotonlu mikroskopi 7,8 kullanılmıştır. Başarılı deneyler protokol basit ama kolay değil yapmak belirli prosedürlerin sayısına bağlıdır. Özellikle, akut dilimler bir ev yapımı naylon örgü ağı 9 genellikle gözlem sırasında stabilize edilmesi gerekir. ışık aydınlatma şiddeti çoklu tarama konfokal mikroskop yaklaşım tarafından önerilen fototoksisite ve photobleaching önlemek için mümkün olduğunca düşük olması gerekir. Buna ek olarak, sıcaklık ve CO2 nöronal göç etkileyebilir istikrarsızlık beri önemli çevresel parametrelerdir. Kolaylaştırmak ve deneysel prosedürleri rafine etmek, biz, dilim hareketlerini sınırlayan sabit çevre parametreleri sağlar, photobleaching azaltır ve consequ (milimetre mertebesinde) görüş alanını artıran bir konfokal makroskopi protokolü geliştirdikgörüntü analizi yoluyla izlenebilir hücreleri (onlarca) sayısını isteğinizle. Bu durumda, 180 mikron kalınlığında kesitler membran ekler üzerinde kültürlenmiştir ve 6 oyuklu plakalar doğrudan büyük bir inkübasyon odası, sıcaklık ve CO2 kontrolör ve bir sarsıntı kontrol sistemi ile donatılmış bir ticari konfokal macroscope bir 2X objektif altında motorlu aktarılır. Zaman zaman aşımına uğrar ve z-yığınlarının daha sonra birkaç saat ve farmakolojik araçlar üzerinden gerçekleştirilir ya da biyolojik olarak aktif moleküllerin ilave ya da kuluçka ortamı içinde verilebilir. Bu yöntem, aynı zamanda, farklı gelişim aşamalarında serebellum ya da beyin nöron diğer tiplerinin hareketini incelemek için adapte edilebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified eagle medium (DMEM) nutrient mixture F-12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution 10X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACAP38</td>
			<td>INRS, Canada</td>
			<td></td>
			<td>Bourgault et al., 200919</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAI-1</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>528208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Fisher Scientific / Gibco/ invitrogen</td>
			<td>O973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanoacrylate glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Tracker Green CMFDA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C2925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyester Transwell-Clear inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture cluster</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish 35 mm diameter</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish 100 mm diameter</td>
			<td>Thermo SCIENTIFIC</td>
			<td>130182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylen tube (15 ml)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>E/0800DF/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biological safety cabinet fume hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MSC9 Class II A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adjustable-volume pipette (0,5-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4910 000.018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gyro-rocker, SSL3</td>
			<td>Stuart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator, Hera Cell 150</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibrating blade microtome, VT1000S</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>confocal macroscope, TCS LSI</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>temperature controller</td>
			<td>PeCon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-controller</td>
			<td>PeCon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope, M205 C</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors, curved, blunt/blunt</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>03.03.17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened fine iris scissors, straight, sharp/sharp</td>
			<td>FST</td>
			<td>149090-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3 and #5 forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11293-00 and 11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome injector blades/single edge</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>39053250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard scalpel handle #3 solid</td>
			<td>FST</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical blade #15</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>205</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo imaging of postnatal cerebellar granule cell migration using confocal macroscopy

Doğum sonrası gelişimi sırasında, olgunlaşmamış granül hücreleri (eksitatör internöron) serebellar korteksin iç granüler tabaka ulaşmak için moleküler tabaka ve Purkinje hücre tabakası dış granüler tabakasında teğet göç ve ardından radyal göç gösterirler. Göç süreçlerinde Standart çeşitli serebellar fonksiyonları açıklarına yol hücre ölümü ya da nöronların risklerinin ya uyarır. Merkezcil granül hücre göçü nihai konumuna doğru hücreleri yönlendirmek için böyle kemotaksisinin ve hücre dışı matriks bozulması gibi çeşitli mekanizmalar, içerir, ancak her kortikal katmanda hücre göçü düzenleyen faktörler sadece kısmen bilinmektedir. Bizim yöntemde, akut serebral dilimleri P10 sıçan hazırlanır, granül hücreleri fluoresan bir sitoplazmik bir işaretleyici ile etiketlenir ve dokular 37 ° C&#39;de konfokal makroskopi hücre göçünün gerçek zamanlı izleme başlamadan önce 4 ila 10 saat membran ekler üzerinde kültürlenmiştir içindeCO 2 varlığı. Beyincik farklı kortikal tabakalar halinde kendi göç sırasında, granül hücrelerinin nöronal göç düzenlenmesinde olası rolünü araştırmak için nöropeptid agonistleri veya antagonistleri, proteaz inhibitörleri, hücre içi efektörlerinin veya alkol ya da Methylmercury bile toksik maddelerin bloker maruz kalabilir .

Farklı kortikal katmanları 1 (Şekil 1) çapraz olarak erken doğum sonrası beyincik ise, GC&#39;ler kendi modu ve göç hızı önemli değişiklikler gösterirler. Bu bölüm, doğal hücresel ortamda GC göç incelenmesiyle elde edilebilir sonuçlarının örneklerini göstermektedir. Yeşil floresan boya ile etiketlenmiş P10 sıçan serebellar doku dilimleri konfokal macroscope (Şekil 3A) altında incelenir ve biz GC&#39;ler 18 mikron / saat ortalama hız (Şekil 3B, C) ​​ML radyal göç olduğunu göstermektedir. Bugüne kadar, etkileşimlerin rolü / düzenleyici faktörler ve her kortikal katmanda hücre migrasyonu kontrolünde rol oynayan moleküler mekanizmalar da dahil olmak üzere nöronal ve glial hücreler arasındaki iletişimi büyük ölçüde bilinmemektedir. Sonuç olarak, ana sorun bu kortikal tabaka-speci bir rol oynayabilir neuropeptides, nörotransmitter, nörotrofinleri ve hücre dışı matriks bileşenlerini tespit etmektirgöç sürecinde hız fic değişir. Hipofiz adenilat siklaz aktive polipeptit (PACAP) ama aynı zamanda ML ve Igl kemirgenler 7,10,11 ilk iki doğum haftasında, PCL ağırlıklı olarak algılanır. Kültür ortamına PACAP38 (10 -6 M) Uygulama ML GC bir% 79 hız azalmasına neden olmuştur. Örneğin, ML GClerin hareket hızı PACAP38 (Şekil 4A) ve daha sonra 2.5 um / saat kontrol koşullarında 11.9 um / saat arasında düştü. Doku tipi plasminojen etkinleştiricisi (tPA) gibi hücre yapışma molekülleri ya da laminin 12,13 gibi hücre dışı matris (EM) bileşenlerinin bozunmasına neden proteolitik kaskadımn bir üyesi. tPA ve plasminojen, tPA bir alt-tabaka, doğum sonrası serebellum 14,15,16 gelişimi sırasında kortikal katmanları olarak tespit edilir. PAI-1 (10 7 M), endojen tPA bir inhibitörü, verilmesi% 78 GC azaltılabilirML göç. Örneğin, GC&#39;ler PAI-1 (Şekil 4B) ilave edildikten sonra 4.2 um / saat kontrol koşullarında 19.2 um / saat arasında ML geçiş hızı azalır. Bu sonuçlar, PACAP GC hareketleri ve serin proteaz tPA gelişmekte olan sıçan serebellumun ML GClerin göç kolaylaştırdığı direkt bir inhibisyon etkisi gösterdiğini işaret etmektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig1.jpg" /> Şekil 1: doğum sonrası beyincik korteksinde GC göç 3D gösterimi. Igl 1-4, EGL GC süreçleri ve teğet göç Uzatma. 5, Bergmann glial lifleri boyunca ML Radyal göç. 6, PCL geçici durağan faz. 7, Glial bağımsız radyal göç. 8, Tamamlama . kırmızı IGL GC GC göç, granül hücrenin; EGLDış granüler tabakası; koyu mor B, Bergmann glia; G, Golgi hücresi, sarı, cf, tırmanma lifleri, mavi, g, postmigratory granül hücrelerinin, açık yeşil, Igl, iç granüler tabaka; mft, yosun tutmuş lif Terminal, koyu yeşil, PCL, Purkinje hücre tabakasının, açık mor P, Purkinje hücresine; ML, moleküler katmanın. Bu şekil 5 ile modifiye edilmiştir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52810/52810fig2.jpg" /> Şekil 2: P10 serebellar dilim ex vivo kültür (A) P10 sıçandan Dissected Serebellum.. Ölçek çubuğu = 6 mm. Stereomikroskobi ile 180 mikron kalınlığında serebellar dilim yaşam (B) Mikrografik. Ölçek çubuğu = 3 mm. (C) endaha yüksek bir büyütme, beyincik dört kortikal katmanları (EGL, ML, PCL, IGL) zaten ayırt edilebilir. Ölçek çubuğu = 1 mm. Flüoresan etiketleme sonra (D) doku dilimleri 6-çukurlu plaka kültürü ekler (24 mm çapında) yerleştirilir. (E) doku kültürü tedavi polyester membran ile bir kültür ucun şematik. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52810/52810fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52810/52810fig3.jpg" /> Şekil 3: Sıçan P10 beyincik kortikal tabakalar halinde GC&#39;ler Dinamik göç GC&#39;ler yeşil sitoplazmik floresan boya ile etiketlenmiş edildiği bir P10 sıçan serebellar dilim (A) Macroconfocal görünüm (xyz, 2D projeksiyon).. Ölçek çubuğu 75 mikron =. (B) GC gösteren Time-lapse görüntülemeKontrol koşullarında 4 saat konfokal makroskopi tarafından ML hareketleri. Yıldız (*) sembolü GC soma işaretler. Geçen süre (dk) her fotomikrografisinin alt belirtilir. Ölçek çubuğu 10 mikron =. (C) GC soma tarafından katedilen mesafeye Sıralı değişir. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52810/52810fig4.jpg" /> Şekil 4:. GC göç nöropeptid ve proteaz inhibitör (A) GC 2 kontrol koşullarında saat ve konfokal makroskopi göre ML izlenen daha sonra pitüiter adenilat siklaz aktive polipeptid (PACAP) varlığında 2 saat karıştırıldı. (B) GC kontrol koşullarında 2 saat süre ile konfokal makroskopi göre ML izlenen ve daha sonra da plazminojen etkinleştirici inhibitör-1 (PAI-1) varlığında 2 saat karıştırıldı.

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy at JoVE.com

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Konfokal Makroskopi kullanarak Postnatal Serebellar Granül Hücre Göç Ex Vivo Görüntüleme

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

ex-vivo-imaging-postnatal-cerebellar-granule-cell-migration-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

9.3K Görüntüleme.  Inserm, IRIB, University of Rouen. During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Video: Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Doğum Sonrası Beyin Nöronal Göç Yüksek Çözünürlüklü Zaman Aşımı Görüntüleme için bir Organotipik Dilim Testi

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Nörobilim

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

FM Boyalar Kültür Serebellar Granül Nöronlar Synaptic veziküllü Havuzu Yenileme Kantitatif Analiz

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

Ex vivo Fare neuroepithelium Tek Hücre Bölümler Canlı Görüntüleme

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

Fare Akut Beyin Dilimleri Neuroblast Göç vivo Doğum Sonrası Elektroporasyonla ve Time-lapse Görüntüleme

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon<em&gt; In Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Nöronal morfoloji ve Göç Eğitim için

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering the molecular signals that cooperatively guide neuronal migration in the embryonic brain is therefore important to understand how the complex neural networks form which later support postnatal life. Facial branchiomotor (FBM) neurons in the mouse embryo hindbrain migrate from rhombomere (r) 4 caudally to form the paired facial nuclei in the r6-derived region of the hindbrain. Here we provide a detailed protocol for wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains suitable to investigate the signaling pathways that regulate FBM migration. In this method, hindbrains of E11.5 mouse embryos are dissected and cultured in an open book preparation on cell culture inserts for 24 hr. During this time, FBM neurons migrate caudally towards r6 and can be exposed to function-blocking antibodies and small molecules in the culture media or heparin beads loaded with recombinant proteins to examine roles for signaling pathways implicated in guiding neuronal migration.

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the neural tube, but migrate to reach appropriate targets. Facial branchiomotor (FBM) neurons are a useful model to study neuronal migration. This protocol describes the wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains to investigate mechanisms that regulate FBM migration.

Fare Beyin<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kültür Yüz Branchiomotor Nöron Göç Eğitim için

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating innate immunity. Primary rodent cell culture models have greatly advanced our understanding of neuronal-glial interactions, but only recently have methods to specifically eliminate microglia from mixed cultures been utilized. One such technique &#8211; described here &#8211; is the use of L-leucine methyl ester, a lysomotropic agent that is internalized by macrophages and microglia, wherein it causes lysosomal disruption and subsequent apoptosis13,14. Experiments using L-leucine methyl ester have the power to identify the contribution of microglia to the surrounding cellular environment under diverse culture conditions. Using a protocol optimized in our laboratory, we describe how to eliminate microglia from P5 rodent cerebellar granule cell culture. This approach allows one to assess the relative impact of microglia on experimental data, as well as determine whether microglia are playing a neuroprotective or neurotoxic role in culture models of neurological conditions, such as stroke, Alzheimer&#8217;s or Parkinson&#8217;s disease.

Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature.

Beyindeki granü hücre kültürlerinden mikroglia zayıflatılması, L-lösin metil ester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the co-existence of glial cells and neurons in CGN culture might lead to biases in the accurate assessment of neuronal viability. Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining has been used to measure cell viability by simultaneously evaluating the viable and dead cells. We used FDA-PI double staining to improve the sensitivities of the colorimetric assays and to evaluate neuronal viability in CGNs. Furthermore, we added blue fluorescent DNA stains (e.g., Hoechst) to improve the accuracy. This protocol describes how to improve the accuracy of assessment of neuronal viability by using these methods in CGN culture. Using this protocol, the number of glial cells can be excluded by using fluorescence microscopy. A similar strategy can be applied to distinguish the unwanted glial cells from neurons in various mixed cell cultures, such as primary cortical culture and hippocampal culture.

This protocol describes how to accurately measure neuronal viability using Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining in cultured cerebellar granule neurons, a primary neuronal culture used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research.

Serebellar Granül Nöron Kültüründe Floresan Diasetat-Propidyum İyodür Çift Boyama Kullanarak Nöronal Canlılığın Değerlendirilmesi

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

Modelleme nöronal ölüm ve fare birincil serebellar granül nöronlar dejenerasyon

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.