This work was supported by the MND Research Institute of Australia and the Cure for MND Foundation [GIA 1638], the Snow Foundation, and Macquarie University [MQRDG 9201401462]. Imaging was carried out at the Microscopy Facility in the Department of Biomedical Sciences, Macquarie University. Other members of the MND research center are thanked for their contributions to the development of these methods and fish lines.

HINWEIS: Planung, Durchführung und Berichterstattung von Tierversuchen muss 15 unter Berücksichtigung der aktuellen Leitlinien nehmen. Solche Arbeiten müssen von der lokalen Tierschutzbehörde (in unserem Fall der Tierethikkommission der Macquarie University) im Voraus genehmigt werden. 1. Bereiten Sie die Zebrabärblinge für Montage und UV Zellablation <ol><li> Generieren Zebrabärbling (Danio rerio) exprimieren , fluoreszierende Proteine. <ol><li> Fluoreszierende Proteine von Interesse in Zebrabärbling zum Ausdruck bringen, Plasmid - Injektionen in die ein Zellstadium des Zebrabärbling Ei (wie an anderer Stelle 16 beschrieben) , oder verwenden fluoreszierende transgenen Linien durchzuführen. Um mehrere Zelltypen erstellen Verbindung transgenen Zebrabärbling Linien durch Kreuzung etablierten transgenen Linien relevant für die Frage von Interesse beschriften. Legen Sie eine männliche und eine weibliche Zebrabärbling auf jeder Seite eines falschen Boden Paar Paarung Tank am Abend und entfernen Sie den Teiler mit dem Beginn der LichtAm nächsten Morgen (wie an anderer Stelle 17 beschrieben). Halten Sie den Zebrabärbling bei 28 ° C und behandeln sie entsprechend den etablierten Protokollen 17, 18. </li><li> Sammeln Sie die Embryonen nach einer erfolgreichen Laich durch das Tankwasser belasten die Embryonen durch eine Kunststoff-Teesieb enthält. Spülen Sie die Eier mit System Wasser und übertragen sie in Ei Wasser in einer Petrischale. </li><li> Untersuchen sie unter einem Lichtmikroskop Befruchtung zu bestimmen. Shop befruchteten Eier in einer Petrischale und legen Sie sie in einem Inkubator bei 28 ° C 18. </li></ol></li><li> Optional: Führen Sie eine Mikroinjektions spezifische Zellpopulationen zu beschriften. ANMERKUNG: Dies ist eine alternative Methode, die für die Expression und Visualisierung von Proteinen ermöglicht, ohne die Notwendigkeit, stabile transgene Linien zu erhöhen. Dieses Verfahren ist auch vorteilhaft, wenn das interessierende Protein toxisch ist und verhindert die Erzeugung eines stabilen transgene Linien. <ol><li> Injizieren Sie die Plasmid - Konstrukte in die ein Zellstadium der Genaktivität, wie an anderer Stelle beschrieben 19, 20, 21. Hinweis: Dieses Verfahren führt in dem Mosaik Expression des Proteins von Interesse. Das Protein von Interesse aus einem Promotor der Wahl angetrieben wird (zB islet1 22, -3mnx1 23, 24, traf 25 oder MPEG1 26) , flankiert von Tol2 invertierten Wiederholungen 20. </li></ol></li><li> Alter Die Fische auf die gewünschte Größe. <ol><li> Heben Sie den Fisch auf 3 - 5 Tage nach der Befruchtung (dpf) und legen Sie sie unter einem Fluoreszenz-Mikroskop Verbindung. Bildschirm, um die Tiere für geeignete Fluorophore Ausdruck und wählen Sie den hell markierten Fisch. Trennen Sie die entsprechende Larven in ein anderes Gericht mit Ei Wasser zum Einbetten spätr auf (Speicher in einem 28 ° C Inkubator). Optional: Embryos in eine 0,2 mM 1-phenyl-2-thioures (PTU) Ringers-Lösung bei 24 h nach der Befruchtung (hpf) platziert werden, um die Bildung von Pigmentierung zu hemmen. Sorgfalt muss mit PTU genommen werden, da es toxisch ist und nachteilige physiologische haben kann, genetischen oder morphologische Effekte. </li><li> Für Studien in einem frühen Entwicklungsstadium (&lt;2 dpf), dechorionate die Embryonen manuell scharf Pinzette. Dechorionate große Anzahl von Embryonen enzymatisch durch Zugabe von Pronase (2 mg / ml) zu dem Ei Wasser und Inkubieren sie für 10 min bei 28 ° C. </li><li> Führen Sie die Embryonen in regelmäßigen Abständen durch eine Kunststoff-Pasteurpipette zu erleichtern dechorionation. Beenden Sie den Prozess, wenn die Mehrheit der Embryonen aus ihrem Chorion entstanden sind, indem sie mehrmals mit Ei Wasser waschen. </li></ol></li><li> Bereiten Sie Lösungen für Zebrabärbling Einbettung in Agarose. <ol><li> Bereiten Sie eine Anästhesie-Lösung durch Zugabe von 4 g / L MS222 (Tricaine Stammlösung, pH 7,0)tropfenweise zu einer Petrischale Ei Wasser enthält. Eine Dosis von 50 mg / L ist ein empfohlenes Ausgangspunkt (1A). </li><li> Bereiten Sie einen Vorrat von niedrig schmelzenden Agarose (0,8-1,5%) in Ei Wasser und Aliquotierung es in 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Einen aliquoten in einen vorgeheizten Wärmeblock (38 - 40 ° C) und lassen Sie es auf die eingestellte Temperatur ins Gleichgewicht (~ 30 min; 1B). </li><li> Optional: Für längerfristige Bildgebung (&gt; 4 h), ein wenig Agarose - Kreis innerhalb der Glasbodenschale Petri 35-mm vorbereiten und lassen Sie es (Supplementary Abbildung 1) zu setzen. HINWEIS: Dieser zusätzliche Schritt bei der Vermeidung einer Bewegung des gesamten Agarose-Tropfen mit dem Zebrabärbling über einen längeren Zeitrahmen wirksam war. <ol><li> Dazu Ort ~ 300 &amp; mgr; l Agarose entlang dem inneren Kreis der Glasbodenschale einen Donut-förmigen Kreis mit einer kleinen Öffnung in der Mitte herzustellen , in denen die Fische zu setzen (Schritt 1.5.3; Ergänzende Abbildung 1) . </li></ol></li></ol></li><li> Montieren Sie den Zebrabärbling in Agarose für die Mikroskopie. <ol><li> Wählen Sie 1 - 3 von der vorselektierten Fisch für die Ablation und betäuben die Larven von ihnen zu übertragen (unter Verwendung einer Transferpipette) in eine Schale mit der Anästhesie - Lösung (Schritt 1.4.1; 1C; ca. 5 min). HINWEIS: Die Fische werden betäubt, wenn sie eine flache opercularen Bewegung und eine verminderte Herzfrequenz und nicht mehr eine Fluchtreaktion Touch-evozierte Anzeige (TEER; Versagen zu schwimmen weg nach sanft berühren ihren Schwanz mit einem Pinsel). Stellen Sie sicher, geeignete Anästhesie für die ethische Behandlung der Fische und zu verhindern Zucken bei der Übertragung in Agarose oder durch Einwirkung von Fluoreszenzlicht. </li><li> Nach der Anästhesie bestätigt wird, saugen eine Larve mit einer einstellbaren Pipette (mit einem cut-off von 200 ul Spitze auf ~ 30 &amp; mgr; l) und lassen Sie es an der Unterseite der Spitze sinken. Übertragen die Larve in vorgeheizte Agarose (Schritt 1.4.2), indem ein Tropfen der Flüssigkeit mit der freisetzLarve in die Agarose (versuchen , die Menge von Ei Wasser geht in die Agarose zu minimieren; 1D). </li><li> Saugen die durch Agarose umgeben Fisch. Dispense es schnell in die zuvor hergestellten Glasboden 35-mm-Schale. </li><li> Verwenden Sie ein Präpariermikroskop und eine Standard - Pinsel (lange Liner, Größe 1) , um das Tier in der Agarose auf der Seite zu positionieren (Kopf nach links) , so dass Körper und Schwanz sind flach (Abbildung 1E). Wenn mit mehreren Fisch arbeiten, richten alle Fische in der Schale so, daß sie das konfokale Mikroskop später leicht entfernt werden. HINWEIS: Schnell dieses Verfahren zum Positionieren und Ausrichten durchführen (es kann einige Übung erfordern, wie die Agarose sofort zu kälteren Temperaturen nach der Belichtung beginnt zu setzen). </li><li> Lassen Sie die Agarose eingebettete Fisch 10 - 15 min, bis die Agarose fest eingestellt ist. Nachfüllen vorsichtig die 35-mm - Petrischale mit ~ 2 ml Ei Wasser enthält Tricaine (1F). </li></ol></li></ol> 2. dem konfokalen Mikroskop und Bildgebungsparameter einrichten <ol><li> Legen Sie die Petrischale mit dem eingebetteten Larve auf dem konfokalen Mikroskop Bühne und konzentrieren sich auf die Rückenseite des Tieres Rückenmark (Hellfeld). Untersuchen Sie das Tier unter der entsprechenden Vergrößerung (40X) und fluoreszierende Einstellung und visualisieren die Struktur von Interesse (zB Fluoreszenzintensität der markierten Neuronen oder Mikroglia - Bewegung) , um zu bestätigen , dass alle Bildparameter wie für die nachfolgende Ablation benötigt wird (Abbildung 2). Wir verwenden routinemäßig die 40X Ziel unserer Zeitrafferstudien durchzuführen. </li><li> Optional: Um eine Zeitraffer-Studie für mehrere Stunden durchzuführen, ist es ratsam , eine einzelne oder wenige Zeitpunkten vor der Aufzeichnung der ungestörte physiologische Reaktion der Zelle und ihrer Umgebung (zB Mikroglia - Bewegung zu etablieren Basisgeschwindigkeit zu etablieren Ablation und Motilität). </li><li> Bestimmen Sie die Dicke der Strukturure von Interesse für die UV-Laserablation. <ol><li> Mit dem Z-Antrieb, überprüfen Sie die oben und unten an der Struktur von Interesse (zB die Zellsoma) durch manuelles Fokussieren auf und ab. Notieren Sie die z-Ebene , die ( zum Beispiel das Zentrum der Zelle) abgetragen wird. HINWEIS: Aus Erfahrung war diese Methode am effektivsten durch Rückenmarksneuronen Targeting , die hell markiert wurden (ein hohes Signal-Rausch - Verhältnis , das einfach Zeitraffer Visualisierung nach der Ablation ermöglicht, zB Abbildung 4) und durch die Mitte des Abtragungs Zellsoma. Zellkern-Fluoreszenz kann von Vorteil sein, um die korrekte Ausrichtung und hohe Abtragseffizienz gewährleisten. </li></ol></li></ol> Führen 3. Gezielte Laser Ablation einzelner Zellen im Zebrabärbling Spinal Cord HINWEIS: Für diese Ablation und Visualisierung Ansatz, ein konfokales Mikroskop (Leica SP5) verwendet wurde. Die Ablationsverfahren unter Verwendung eines 405-nm-Diode für die zellspezifische destruction wird detailliert nach der Software (Leica Application Suite, v2.7.3.9723). jedes herkömmliche konfokale Mikroskop jedoch, die mit einem 405-nm-Laser und einer FRAP (Frap) oder Bleich-Modul ermöglicht es, die Leistung der gleichen Zelle Manipulationen, aber möglicherweise mit leicht unterschiedlichen Einstellungen, Parameter und Bezeichnungen versehen. <ol><li> Starten Sie den FRAP - Assistenten , indem der Software - Menü oben auf das Dropdown - Menü klicken (3A, 1 und 2). Beachten Sie ein neues Fenster mit verschiedenen Schritten, die den Aufbau der spezifischen Parameter für die Laser - Ablation ermöglicht (3B, 3). </li><li> Bestimmen , die Bildparameter für die Ablation Ansatz durch Auswahl des Formats, Abtastgeschwindigkeit (3B, 4), und Mitteln (3B, 5). Ein Bildformat von 1024 x 1024 bei einer Abtastgeschwindigkeit von 400 Hz und einer Liniedurchschnittlich 4 war am besten anwendbar. HINWEIS: Es ist in der Regel nicht erforderlich, um die spektrale Detektion (wie die Anregungs- oder Emissionsparameter) zu ändern, wie sie in den vorherigen Erwerb bestimmt wurden. <ol><li> Wenn die z-Ebene für die Ablation nicht bereits ausgewählt wurde (wie in Schritt 2.4 beschrieben.), Drücken Sie die &quot;Live&quot; und konzentrieren sich durch die Probe, bis die Leuchtstoffstruktur oder die z-Ebene gewünscht, das abgetragen werden soll ist im Fokus. </li></ol></li><li> Sobald die allgemeine Bildparameter eingestellt sind, greifen Sie auf die &quot;Bleach&quot; Schritt (3C, 6) die spezifischen Ablation Komponenten zu steuern. HINWEIS: Eine Kombination der Laserintensität (3C, 8), der Abtastgeschwindigkeit und der Mittelung , die in Schritt 3.2 (3B, 4 und 5) sowie die Anzahl der Wiederholungen festgelegt wurde , die in festgelegt werden Schritt 3.5 (3E,12), wird die gesamte Verweilzeit der UV - Laser an der ROI, bestimmen und somit die Bleicheffizienz. <ol><li> Aktivieren Sie die 405-nm - Laser , indem sie es für die Bleichverfahren (3C, 8) zu aktivieren. HINWEIS: - 80% in unserem Versuchsaufbau Die meisten Erfolg mit den oben genannten Einstellungen wurde zwischen 60 mit 405-nm-Laserintensitäten erreicht. Beachten Sie, dass diese Laserausgangsleistung ist gerätespezifisch und wird für jeden konfokalen Aufbau unterscheiden. </li><li> Verwenden Sie die &quot;Zoom in&quot; Option (3C, 7) , um die Bleichintensität bei der gewählten ROI zu maximieren , indem das Scanfeld reduziert, daher Verweilzeit zu maximieren. Alternativ können Sie die &quot;Bleach Punkt&quot; Option der Software der Wahl für diesen Prozess. </li></ol></li><li> Wählen Sie eine oder mehrere ROIs (3D, 10) für die Ablation durch eine der Ziehwerkzeuge in der Bildaufnahme unter Verwendung Window (3D, 9). Ziel der Axonhügel, zum Beispiel mit dem Kreiszeichenwerkzeug von ca. 4 - 8 um. HINWEIS: Die Ablationsbereich von einem einzelnen Pixel zu einer größeren Fläche, je nach Anwendung einstellbar ist. </li><li> Nach den ROI Gründung, wählen Sie die &quot;Time Course&quot; Taste (Abbildung 3E, 11) und die Anzahl der Zyklen der ROIs gescannt / abgetragenen (Abbildung 3E, 12) bestätigen wird. Wählen Sie den &quot;Pre-Bleach&quot; und &quot;Post-Bleach&quot; Rahmen nach Wunsch einen Überblick über das gesamte Bild zu ermöglichen, unmittelbar vor und unmittelbar nach dem Bleichprozess. </li><li> Nachdem alle notwendigen Ablationsparameter Festlegung, drücken Sie &quot;Run Experiment&quot; (Abbildung 3E, 13) und die Effizienz der Ablation zu überwachen. HINWEIS: In unserem FRAP-Setup, ein einzelnes Bild wird mit dem entsprechenden Laser e vor und nach dem FRAP Zyklus genommen werdenxcitation (beispielsweise 488-nm - Anregung für EGFP-exprimierenden Zellen). Diese Pre- und Post-Ablation Bilder ermöglichen eine schnelle Beurteilung, wie zufriedenstellend war der ROI gebleicht und wie effektiv die gewählten Ablationsparameter waren. </li><li> Wiederholen des Prozesses durch Einstellen der Laserintensität (3C, 8), Abtastgeschwindigkeit und Mittelung (3B, 4 und 5), und Wiederholungen (3E, 12) , falls der ausgewählte ROI zeigt noch eine hohe Fluoreszenzintensität nach Beendigung der FRAP-Zyklus. </li></ol> Führen 4. Follow-up-Verfahren, einschließlich Fisch &quot;Rescue&quot; oder Entsorgung <ol><li> Wenn das Experiment Terminal ist, euthanize das Tier mit einer Überdosis Tricaine. Entfernen Sie das Ei Wasser und ersetzen Sie es mit der Anästhesie-Stammlösung für 10 min. Um sicherzustellen, Euthanasie, überprüfen Sie unter dem Mikroskop für die Einstellung des Herzschlags. </li><li> Optional:Wenn das Experiment nicht Terminal ist, entfernen Sie den Fisch vorsichtig aus der Agarose mit einer feinen Pinzette und einer Bürste. Den Fisch in frisches Ei Wasser und lassen Sie es 15 Minuten lang unter Beobachtung zu erholen. Wenn normale Schwimmverhalten zurückkehrt, kehren die Fische in den Inkubator. </li><li> Entsorgen transgene Tiere nach den anerkannten GVO-Abfallstrom Institution. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Laserablation Approaches Lasergestützte Ablation Techniken ermöglichen die genaue Ausrichtung der einzelne oder kleine Gruppen von Zellen. diese Technik mit der hochauflösenden Mikroskopie und genetische Manipulationen in Tiermodellen wie Zebrabärbling Die Kombination ermöglicht es den Forschern, das Schicksal einer einzelnen Zelle und die Wechselwirkungen nach der Verletzung systematisch zu untersuchen. Die UV (405 nm) Laser-Ablation Protokoll hier skizziert beschrieben, wie einzelne Zellen (in dosisabhängiger Weise) selektiv hervorgehoben oder getötet werden, während Neuronen benachbarten, Glia und Axone unversehrt gelassen werden. Wir haben diesen Ansatz erfolgreich in Zellkulturexperimenten verwendet und beschreiben hier die detaillierte Vorgehensweise für den Zebrabärbling Rückenmark. Wir zeigen die Umsetzung dieses Ansatzes in der Zebrabärbling Rückenmark durch selektiv ein einzelnes Neuron in einem Netzwerk von anderen Zellen betont (Abbildung 5, A und <strong&gt; B), oder durch ein einzelnes Neuron sofort und ohne Rückgewinnung (Abbildung 5, C und D) zu töten. Zuvor spezialisierte Lasersystemen, wie gepulsten Stickstofflaser oder Zweiphotonen - Lasersystemen, waren erforderlich , um eine Gewebeschädigung und motorischen Nervenquerschnitten erhalten 10, 11, 12, 13 induzieren. Diese Lasersysteme wurden erfolgreich zu bewirken , eine Zellschädigung verwendet, wie Thrombose in Arterien und Venen 6, akutem Nierenversagen 7, Herzschädigung 8 und Calcium Wellen und Mikroglia - Antwort nach einer Hirnschädigung 9 zu studieren. Darüber hinaus verwendet Soustelle und Kollegen eine konventionelle konfokale Einrichtung (351-nm und 364-nm - UV - Laser) Schaden zu induzieren 14 bis epithelialen und Gliazellen in Drosophila &lt;/ Sup&gt;. Relevanz von Zebrabärbling Modelle für ALS (und andere menschliche Krankheiten) zu verstehen Zebrabärblinge sind ein weit verbreitetes Modell Organismus, vor allem für Entwicklungsstudien 28, 29, 30. Während sie bestimmte Einschränkungen haben, ihr Potenzial Krankheit beim Menschen und geben ein Verständnis von pathogenen molekularen Mechanismen zu modellieren, ist enorm. Zebrabärbling - Modelle wurden für die Untersuchung von MND gut etabliert und haben zu wichtigen molekularen Erkenntnisse 31, 32, 33, 34. Transgene Zebrabärblinge Linien schnell erzeugt werden kann (4 - 5 Monate) und ermöglichen die gezielte Verfolgung eines bestimmten Zelltyp, Eigenschaften, die sie eine wertvolle Ergänzung zu aktuellen Tiermodellen von ALS zu machen. Zebrabärbling-Embryonen / Larven sind optisch transparent und bieten einzigartige Erfahmentalen Vorteile, die langfristige Live-Bildgebung auf Einzelzellebene im Gehirn oder Rückenmark, die in Nagetiermodellen ermöglichen (oder beim Menschen) leicht erreicht werden können. Wenn mit molekularen Techniken kombiniert werden , wie zum Beispiel Single-Cell - Ablation bietet dies eine einzigartige experimentelle Plattform für in vivo präzise molekulare Mechanismen zu studieren. Motor Neurons Selektiv kann unter Verwendung UV-Laserablation Gezielte Spinal - Neuronen in Zebrabärbling beginnen innerhalb von 10 Stunden nach der Geburt zu entwickeln und sind nach 35 ca. 48 h eingestellt, 36. Diese rasante Entwicklung ermöglicht die Visualisierung dieser Neuronen in kurzen Zeitrahmen und mit hohem Durchsatz. Motor Neuronen bilden die wesentliche Verbindung zwischen Gehirn und Muskeln und im ALS, betroffen sind in der motorischen Kortex (oberen motorischen Neuronen), Hirnstamm und Rückenmark (unterer Motor Neuronen). Verlust dieser Neuronen führt zwangsläufig zu muscle Atrophie und Schwäche. Motoneuronen im Rückenmark von Zebrabärbling können durch ihre unterschiedlichen Projektionen und durch die Verwendung von Motor-Neuron - spezifische Promotoren wie -3MNX1 identifiziert werden. Targeting der Zellsoma solcher Projizieren Neuronen zeigten die anterograde Degeneration entlang der axonalen Projektions im Laufe der Zeit (Abbildung 4 und Video 1). Einzellige auflösende Bildgebung von spinalen motorischen Neuronen zusätzlich Phosphatidylserin Translokation bestätigt und damit Annexin V-Kennzeichnung nach der Laser - Ablation (siehe Abbildung 4 und Ergänzungs Video 3 in Referenz 27). Obwohl wir die Aktivierung von Annexin V in sterbenden Neuronen nach unserer UV-Laserablation Ansatz zu melden, können wir nicht sicher sein, dass die Kaskade des Todes, die genau während dieser beschleunigten Prozess ausgelöst wird, um den neuronalen Tod übereinstimmt, die während der Neurodegeneration oder normalen Zellhomöostase auftritt. Während diese Ablation Ansatz ist sehr gut reproduzierbarund spezifische, unterschiedliche Einbettungs Strategien könnten auch die Wirksamkeit des UV-Ablation beeinflussen. Nach unserer Erfahrung war es erfolgreichsten die Schicht aus Agarose zu minimieren wir unsere Fisch eingebettet in. Dickere Schichten des Einbettungsmedium mit einer zusätzlichen Schicht von Ei Wasser kann die UV-Leistung verringern letztlich durch die Zelle aufgrund Dämpfungs- und Streuungseffekte erhalten, die auftreten, entlang des Strahlengangs. In Zukunft wird es der Überquerung von verschiedenen transgenen Fischlinien für die Visualisierung der unmittelbaren und kurzfristige (bis 12 h) Reaktionen von anderen betroffenen Zellen, wie Glia, dem laserinduzierten Zellzerstörung. Beispielsweise Astrozyten und nicht-zellautonomen Toxizität bei neurodegenerativen Erkrankungen wie ALS wurden in der Forschung Rampenlicht und werden in der Pathogenität von sporadischer und familiärer ALS 37, 38 stark verwickelt. Allerdings zugrunde liegenden Mechanismen Glia-Toxizität und Selektivitätin Richtung Motorneuronen bleiben unklar. Wir und andere haben kürzlich Vorteil dieses Ansatzes die Phagozytose von sterbenden Neuronen durch Mikroglia zu studieren und visualisiert die Clearance von neuronalen Reste 27, 39, 40. die Ablation Technik mit hochauflösender Mikroskopie und Marker für neuroinflammation Kombination ermöglicht es Forschern in Zukunft das Verständnis der einzelnen Zellfunktion und miteinander verbundenen Zellsysteme zu erweitern. Charakterisierung dieser Prozesse in einem in vivo - Einstellung ist kritisch , nicht nur in Entwicklungs- Einstellungen , sondern auch in Modellen neurodegenerativer Erkrankungen, einschließlich MND, wo zelluläre Interaktionen 3 beeinträchtigt werden können, 41.

Die Fluoreszenzmikroskopie ist seit langem verwendet worden , um die Auswirkungen von Transgenen in der Zebrabärbling ZNS zu untersuchen, insbesondere deren Auswirkungen auf die Entwicklung ein. Hochauflösende Mikroskopie hat eine detaillierte Abbildung der zellulären Prozessen beteiligt in der Entwicklung des Gehirns, Muskel Generation erlaubt, und viele andere Entwicklungsereignisse 2. Das Studium der Tod einer einzelnen Zelle war eine größere Herausforderung, vor allem aufgrund der technischen Schwierigkeiten bei der Induktion selektiven Zelltod während der Standard-Bildgebungsverfahren. Allerdings erlaubt die Kombination von Single-Cell-auflösende Bildgebung und sehr gezielte Ablation Techniken, um die Untersuchung der unmittelbaren zellulären Reaktionen auf Stress und Verletzungen sowie der daraus resultierenden Zell-Zell-Interaktionen. diese Prozesse zu verstehen, ist kritisch, insbesondere für neurodegenerative Erkrankungen wie Motoneuronerkrankung (MND), wobei Neuron-Glia-Wechselwirkung gezeigt wurden dem Fortschreiten beizutragender Erkrankung 3. MND oder amyotropher Lateralsklerose (ALS) ist eine verheerende neurodegenerative Erkrankung, die motorischen Neuronen in Hirnstamm, motorischen Cortex und Rückenmark betrifft. Der Verlust dieser Neuronen führt zu Muskelabbau, und die Patienten sterben innerhalb von 3 - 5 Jahre nach der Diagnose 4. Motorneuronen im Rückenmark Link zu den Muskelfasern und spielen eine wesentliche Rolle bei der Muskelkontraktion zu erleichtern. Der Ausfall dieser Mitteilung oder den Tod dieser Neurone schwächt sich allmählich die Muskeln und wirkt sich auf die Fähigkeit des Patienten zu schlucken, gehen, sprechen und atmen. den Tod eines motorischen Neurons Visualizing und die kurzfristigen Folgen in einem lebenden Tier bietet eine hervorragende Gelegenheit, die dynamischen Prozesse in normalen Zelle Homöostase und Krankheit beteiligt besser zu verstehen. Zebrabärblinge haben als attraktives Modellsystem entstanden zu neurodegenerativen Erkrankungen 1 studieren. Diesist auf die von diesem Modellorganismus, wie externe Befruchtung, kurze Entwicklungszeit, optischen Zugang auf das Nervensystem und die einfache Transgenität angebotenen Vorteile. Darüber hinaus ermöglicht die Fähigkeit, leicht zu erzeugen Verbindung transgene Zebrafisch für mehrere Markierungsstrategien verschiedener Zelltypen. Genetische Ablation nähert sich spezifische Zelltypen erlauben ziemlich breite Störung zu töten, aber es fehlt die Feinsteuerung von Targeting einzelnen Zellen 5. Lasergestützte Techniken, andererseits bieten feine zeitliche und räumliche Steuerung und haben für verschiedene Tiermodelle verwendet. Während die meisten Ansätze verwenden spezielle Ausrüstung, wie beispielsweise gepulste Laser 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 oder Zweiphotonen Aufbauten 13, sonstigeForschungsgruppen haben vor kurzem die Vorteile eines UV - Lasers in herkömmlichen konfokalen Mikroskopen 14 entnommen. Die hier beschriebene Technik kombiniert hochauflösende konfokale Mikroskopie mit einem UV-Laser-vermittelten Ansatz zellulären Stress und Tod in einer dosisabhängigen Weise in ausgewählten motorischen Neuronen verursachen. Es beruht auf der Verwendung der üblicherweise 405-nm-Laser installiert ist, erfolgreich in Zellkultur getestet und in lebenden Tieren und ermöglicht die detaillierte Charakterisierung von zellulären Wechselwirkungen, wie Mikroglia-Clearance nach neuronalen Tod.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="655">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Agarose low melting</td>
			<td style="width:81px;">Fisher-Scientific</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:191px;">Dissolve in egg water with tricaine (0.02%) at 0.8-1.5%</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Tricaine</td>
			<td style="width:81px;">Argent Labs</td>
			<td style="width:136px;">MS-222</td>
			<td align="right" style="width:191px;">0.02%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Harvard standard wall Borosilicate with filament Capillary Glass</td>
			<td style="width:81px;">World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:136px;">GC100F-10 (short) 
			GC100F-15 (long)</td>
			<td style="width:191px;">Pull to a resistance of 2 -7 M&#937;</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:247px;">Egg water&#160;</td>
			<td style="width:81px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:191px;">0.6 g Instant Ocean sea salt, 4ml of 1mg/ml methylene blue in 10 l deionized water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td>
			<td style="width:81px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">P7629</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Pronase</td>
			<td style="width:81px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:136px;">10165921001</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:247px;">Heat block</td>
			<td style="width:81px;">Select BioProducts</td>
			<td style="width:136px;">Digital block heater (SBD110_)</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:247px;">Microinjection apparatus</td>
			<td style="width:81px;">World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:191px;">Microinjection was performed by hand under a steromicroscope (Leica) with a loaded glass needle and a Picospritzer II (General Valve corporation)</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:247px;">Stereoscope</td>
			<td style="width:81px;">Leica</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:191px;">Bright field illumination microscopy was performed on a Leica M165FC stereo dissection microscope (Leica)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Microscope</td>
			<td style="width:81px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:136px;">SP5</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:247px;">35mm glass bottom dish</td>
			<td style="width:81px;">MatTek Corporation</td>
			<td style="width:136px;">P35G-0-20-C</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

triggering cell stress and death using conventional uv laser confocal microscopy

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and cell-cell interactions in the CNS in real-time. Previously, studying these cell-specific responses after injury often required complicated setups or the transfer of cells or animals into different, non-physiological environments, confounding immediate and short-term analysis. For example, drug-mediated ablation approaches often lack the specificity that is required to study single-cell responses and immediate cell-cell interactions. Similarly, while high-power pulsed laser ablation approaches provide very good control and tissue penetration, they require specialized equipment that can complicate real-time visualization of cellular responses. The refined UV laser ablation approach described here allows researchers to stress or kill an individual cell in a dose- and time-dependent manner using a conventional confocal microscope equipped with a 405-nm laser. The method was applied to selectively ablate a single neuron within a dense network of surrounding cells in the zebrafish spinal cord. This approach revealed a dose-dependent response of the ablated neurons, causing the fragmentation of cellular bodies and anterograde degeneration along the axon within minutes to hours. This method allows researchers to study the fate of an individual dying cell and, importantly, the instant response of cells-such as microglia and astrocytes-surrounding the ablation site.

Das hier beschriebene Verfahren erlaubt die Ablation von motorischen Neuronen im Rückenmark Zebrabärbling die FRAP-Modul eines handelsüblichen konfokalen Mikroskop. Transgene Zebrafisch Linien , die ein grün fluoreszierendes Protein , das in Neuronen unter der Kontrolle von bestimmten Promotoren, wie auszudrücken - 3mnx1, islet1 oder erfüllt, wurden verwendet. Die Expression von GFP angetrieben durch den Motor Neuron - Promotor (wie -3mnx1 oder met) ermöglicht hochauflösenden Darstellung der Zellkörper, der Haupt Axonen und den peripheren Zweige zu den Muskeln erstrecken (Figur 4 und Video 1). Neurone im Rückenmark von 3- bis 5-Tage alten Fisch wurden erfolgreich abgetragenen, mit einer Gesamt Verweilzeit von 60 bis 80 s bei einer Laserleistung von ~ 70% und die allgemeinen in Schritt beschriebenen Einstellungen 3. Erfolgreiche Ablation erzielt, wenn die Fluoreszenz sofort nach der Ablation verblaßtund nie wieder aufnimmt (Figur 5, C und D). Versuche zur Ablation mit anderen Laserlinien (wie zum Beispiel die 488-nm-Laserlinie) führte zu keiner permanenten Fading und Fluoreszenz wurde in kurzen Zeitrahmen wiederhergestellt. Wichtig ist , zeigte dieses Verfahren kennzeichnenden Merkmale des apoptotischen Zelltods in den UV-ablatiert Neuronen, wie beispielsweise die Anwesenheit von Annexin V, konsistente morphologische Veränderungen von somal Degeneration und axonalen blebbing des abgetragenen Neuron 27. Die Besonderheit dieses Ansatzes wird in den Experimenten bestätigt Kaede die Photokonvertierbare Fluorophore mit (das schaltet seine Emission von grün auf rot nach der Einwirkung von UV - Licht), wo eine einzelne gezielte Neuron (Abbildung 5, A und B) ohne Anzeichen einer zellulären umgewandelt wurde Zerstörung über mehrere Stunden. Verwendung einer höheren Laserleistung stattdessen führt to Extinktion des Zielneurons (ohne Photo oder Wiederauftreten von Fluoreszenz) und Photokonversion (ohne Tod) der Zellen in der Nähe (~ 20 &amp; mgr; m) an die Ablationsstelle (Abbildung 5, C und D). Ein wichtiger Vorteil dieses laserinduzierten Ablation Technik ist die Dosisabhängigkeit des Ansatzes. In den Zellen , die mit unterschiedlichen Intensitäten, mehrere Schichten von Feinabstimmung Ziel zur Verfügung , indem die Laserleistung eingestellt (3C, 8), der Abtastgeschwindigkeit und Zeilenmittelung (3B, 4 und 5), die Größe des ROI zu ablatierenden (3D, 10), und die Wiederholungen (3E, 12). Bemerkenswert ist, kann dieser Ansatz auch anstelle induzieren Zelltod zu einzelnen Zellen genutzt werden zellulären Stress anzuwenden. Zum Beispiel hat die Feinabstimmung gewesensehr wertvoll während des Todes eines Neurons zellulärer Prozesse zu bewerten. Motor - Neuronen mit langen Axonen Projektionen , die mit niedrigeren UV - Laserintensitäten ablatiert wurden ergab characteristic &quot;blebbing&quot; ( um die Bildung und die Fragmentierung von zellulärer Vesikel), die an der Ziel soma begonnen und fortgesetzt entlang des Axons im Laufe der Zeit (40-90 min; 4 , 3D - gerenderten Film dieser Ablation in Video 1). Folglich werden die verschiedenen Laserablation Parameter zu modulieren und damit die Höhe der induzierten zellulären Stress und den zeitlichen Verlauf des Todes ermöglicht ein hohes Maß an Flexibilität experimentelle Forscher. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54983/54983fig1.jpg" /> Abbildung 1: Einbettung von Zebrabärbling für die Live - Darstellung. (AF) Embedding Verfahren zur Echtzeit- Bildgebung: (A) Tricaine wird Ei Wasser hinzugefügt , um den Zebrabärbling ein zu betäuben<html> ta Anfangsdosisrate von 50 mg / L. (B) Niedrig schmelzenden Agarose (0,8-1,5%) hergestellt und erwärmt auf 38 bis - 40 ° C. (C) Mit Hilfe einer Transferpipette, die überprüft und ausgewählt Zebrabärbling werden in eine Schale mit Tricaine Lösung übertragen. Nach erfolgreicher Sedierung (flache opercularen Bewegung, verminderte Herzfrequenz, das Fehlen eines berührungs evozierten Reaktion), ein Fisch in die vorgewärmte Agarose übertragen wird (D). Minimieren Sie die Menge von Ei-Wasser, das in die Agarose übertragen wird anschließender Verdünnung zu verhindern. (E) Bringen Sie einen Tropfen Agarose (~ 30 - 50 &amp; mgr; l) mit dem Zebrabärbling auf einem Glasboden - 35-mm - Schale. Führen Sie diese unter einem Präpariermikroskop und mit einem Pinsel vorsichtig auf die Zebrabärbling auf ihre bevorzugten Orientierung auszurichten. Warten Sie 10 bis 15 Minuten, bis die Agarose eingestellt ist, und fügen Sie ~ 2 ml Tricaine Lösung in die Schale (F).ank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54983/54983fig2.jpg" /> Abbildung 2: Darstellung von Neuronen und Mikroglia im Rückenmark eines 3-dpf Zebrabärbling. Visualisierung von Mikroglia und Neuronen im Rückenmark eines 3 Tage alten transgenen Zebrafisch exprimieren (A) GFP-positive Neurone (islet1: GFP) und (B) mCherry-positive Mikroglia (MPEG1: GAL4, UAS: mCherry). (C) Composite - Bild des Neurons und Mikroglia - Kanal zusammen mit dem Hellfeldbild. Die schematische Einlage in (C) zeigt die Orientierung des Fisch und umreißt den Bereich präsentiert. Maßstabsbalken = 30 &amp; mgr; m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54983/54983fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54983/54983fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Figur 3: Die Schritte in dem Verfahren der UV - Laser - Ablation (wie in dem Protokoll ausgeführt, Schritt 3). Schritte, das FRAP Softwaremodul in der konfokalen Software (Leica Application Suite) zu steuern. (A) Starten des FRAP - Modul als Werkzeug UV - Laser - Ablation durchzuführen. (B) , um die z-Ebene für die Ablation und andere FRAP Einstellungen wie Format, Geschwindigkeit Einrichten und Mittelung, die die Verweilzeit des Lasers wird bestimmen. (C) Die Steuerung der Laserintensität und der &quot;Zoom in&quot; Option Bleicheffizienz zu maximieren. (D) Auswahl einer oder mehreren Regionen von Interesse (ROI) , das abgetragen werden soll. (E) Einstellen der Zeitverlauf der Bleiche bestimmt die Bleichzyklen und die Gesamtlaser Verweilzeit bei den ROIs. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54983/54983fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken sie</a><html> e eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54983/54983fig4.jpg" /> Abbildung 4: Anterograde Degeneration einer UV-ablatiert Neurons. Zeitraffer-Bildgebung des Neurodegeneration eines UV-abgetragenen spinalen Neuron. (AF) UV-Bestrahlung eines einzelnen spinalen Neuronen (met: GAL4 UAS: EGFP; A; circle) führte im Soma des Neurons Schrumpfen und Aufrunden der Zeit (AC), gefolgt von axonalen Fragmentierung (CF; Pfeilspitzen) . Die axonale Degeneration begann im Soma (Ort der Ablation) und fortgeschritten anterograde Richtung des distalen Endes des Axons , bis schließlich die Fluoreszenz im Soma verschwunden und die gesamte axon zeigte &quot;blebbing&quot; (DF). Maßstabsbalken = 20 um. Die 3D-gerenderten Zeitraffer-Film dieser Ablation wird in Video 1 gezeigt.es / ftp_upload / 54983 / 54983fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54983/54983fig5.jpg" /> Abbildung 5: Bestätigung der Wirkung der Einzelzellen - UV - Bestrahlung eine Photokonvertierbare Fluorophor (Kaede) in einem Motor Neuron verwendet. Validierung der Einzelzellen-UV-Bestrahlung durch die Aktivierung des Photokonvertierbare Fluorophor Kaede in einem Neuron. (AD) UV - Bestrahlung von Neuronen mit Kaede markiert. (A) Photokonversion eines einzelnen Neurons (Kreis) mit einer Laserleistung von 30% für 10 s führte zu fotovoltaischen von Kaede (von grün bis rot) in nur die gezielte individuelle Neuron (B). Beachten Sie, dass das umgewandelte Zelle für mehrere Stunden überlebte und zeigte keine sichtbaren Anzeichen für eine Verschlechterung, wie blebbing oder Aufrundung. Ablation eines einzelnen Neurons (C<html> ; Kreis) mit einer höheren Laserleistung (95% für 10 s) resultierte in unmittelbaren Verschwinden des Neurons (D) und nachfolgender Photokonversion von Kaede in einer kleinen Anzahl von umgebenden Neuronen innerhalb eines Radius von ungefähr 20 um. Maßstabsbalken = 20 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54983/54983fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54983/54983fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/54983/54983vid1.jpg" /> Video 1: 3D - Oberflächendarstellung (Imaris) des UV - abgetragenen Neuron in 4 dargestellt ist . Die Zeitraffer-Video des Neurons in 4 dargestellt ist Oberfläche eine Visualisierungs-Software gerendert (Imaris, Bitplane). Sie weist auf den Schrumpfungsprozess des abgetragenen soma, gefolgt von axonalen Fragmentierungs anterograd zum distalen Ende der Zelle.euron_ablation-3D_rendered.mov &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Abbildung 1: Optional Agarose Guss für die Langzeit - Bildgebung. Um zu vermeiden, Bewegung des Fisches und der Agarose während einer Langzeiterfassung vorbereiten ein Donut geformt Kreis von Agarose entlang der Kanten in der Mitte des Glasboden-35-mm-Schale (A). Lassen Sie die Agarose-Set für ~ 10 min und übertragen Fisch in den inneren Kreis mit einem Tropfen Agarose (B). Versuchen Sie, die Menge an Agarose für die Einbettung zu minimieren (bürsten überschüssige Agarose nach außen, nachdem der Fisch Orientieren). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54983/Supplementary_Figure_1.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54983/Supplementary_Figure_1.jpg" target="_blank">diese Datei herunterzuladen.</a>

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Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

Targeted manipulations to cause directed stress or death in individual cells have been relatively difficult to accomplish. Here, a single-cell-resolution ablation approach to selectively stress and kill individual cells in cell culture and living animals is described based on a standard confocal UV laser.

Das Auslösen Zellstress und Tod unter Verwendung von herkömmlichen UV-Laser konfokale Mikroskopie

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...

triggering-cell-stress-death-using-conventional-uv-laser-confocal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.4K Aufrufe.  Macquarie University. Targeted manipulations to cause directed stress or death in individual cells have been relatively difficult to accomplish. Here, a single-cell-resolution ablation approach to selectively stress and kill individual cells in cell culture and living animals is described based on a standard confocal UV laser.

Serie: Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The vesicles are then retrieved from the plasma membrane (endocytosis) and grouped together with the general pool of vesicles within the nerve terminal, until they undergo a new exo- and endocytosis cycle (vesicle recycling). These processes have been studied using a variety of techniques such as electron microscopy, electrophysiology recordings, amperometry and capacitance measurements. Importantly, during the last two decades a number of fluorescently labeled markers emerged, allowing optical techniques to track vesicles in their recycling dynamics. One of the most commonly used markers is the styryl or FM dye 1; structurally, all FM dyes contain a hydrophilic head and a lipophilic tail connected through an aromatic ring and one or more double bonds (Fig. 1B). A classical FM dye experiment to label a pool of vesicles consists in bathing the preparation (Fig. 1Ai) with the dye during the stimulation of the nerve (electrically or with high K+). This induces vesicle recycling and the subsequent loading of the dye into recently endocytosed vesicles (Fig. 1Ai-iii). After loading the vesicles with dye, a second round of stimulation in a dye-free bath would trigger the FM release through exocytosis (Fig. 1Aiv-v), process that can be followed by monitoring the fluorescence intensity decrease (destaining).

Although FM dyes have contributed greatly to the field of vesicle recycling, it is not possible to determine the exact localization or morphology of individual vesicles by using conventional fluorescence microscopy. For that reason, we explain here how FM dyes can also be used as endocytic markers using electron microscopy, through photoconversion. The photoconversion technique exploits the property of fluorescent dyes to generate reactive oxygen species under intense illumination. Fluorescently labeled preparations are submerged in a solution containing diaminobenzidine (DAB) and illuminated. Reactive species generated by the dye molecules oxidize the DAB, which forms a stable, insoluble precipitate that has a dark appearance and can be easily distinguished in electron microscopy 2,3. As DAB is only oxidized in the immediate vicinity of fluorescent molecules (as the reactive oxygen species are short-lived), the technique ensures that only fluorescently labeled structures are going to contain the electron-dense precipitate. The technique thus allows the study of the exact location and morphology of actively recycling organelles.

FM dyes have been of invaluable help in the understanding of synaptic dynamics. FMs are normally followed under the fluorescent microscope during different stimulation conditions. However, photoconversion of FM dyes combined with electron microscopy allows the visualization of distinct synaptic vesicle pools, among other ultrastructure components, in synaptic boutons.

Studium synaptischer Vesikel Pools mit Photokonversion Styrylfarbstoffe

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Forschung

Neurowissenschaften

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Funktionelle Bildgebung mit Ultraschall-Blut-Hirnschranke Störung und Mangan-MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualisierung und genetische Manipulation von Dendriten und Dornen in der Maus Hirnrinde und im Hippocampus mit<em&gt; In utero</em&gt; Die Elektroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Micron-Skala Resolution Optical Tomography von Entire Gehirn der Maus mit der konfokalen Mikroskopie Licht Blatt

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Sex Stratified Neuronal Cultures to Study Ischemic Cell Death Pathways

Sex differences in neuronal susceptibility to ischemic injury and neurodegenerative disease have long been observed, but the signaling mechanisms responsible for those differences remain unclear. Primary disassociated embryonic neuronal culture provides a simplified experimental model with which to investigate the neuronal cell signaling involved in cell death as a result of ischemia or disease; however, most neuronal cultures used in research today are mixed sex. Researchers can and do test the effects of sex steroid treatment in mixed sex neuronal cultures in models of neuronal injury and disease, but accumulating evidence suggests that the female brain responds to androgens, estrogens, and progesterone differently than the male brain. Furthermore, neonate male and female rodents respond differently to ischemic injury, with males experiencing greater injury following cerebral ischemia than females. Thus, mixed sex neuronal cultures might obscure and confound the experimental results; important information might be missed. For this reason, the Herson Lab at the University of Colorado School of Medicine routinely prepares sex-stratified primary disassociated embryonic neuronal cultures from both hippocampus and cortex. Embryos are sexed before harvesting of brain tissue and male and female tissue are disassociated separately, plated separately, and maintained separately. Using this method, the Herson Lab has demonstrated a male-specific role for the ion channel TRPM2 in ischemic cell death. In this manuscript, we share and discuss our protocol for sexing embryonic mice and preparing sex-stratified hippocampal primary disassociated neuron cultures. This method can be adapted to prepare sex-stratified cortical cultures and the method for embryo sexing can be used in conjunction with other protocols for any study in which sex is thought to be an important determinant of outcome.

Primary disassociated embryonic hippocampal neuronal cultures are useful for investigating the signaling mechanisms involved in neuron death. Sexing the embryos before the isolation and dissociation of the hippocampus allows the preparation of separate male and female cultures, which enables the researcher to identify and investigate sex-specific cell signaling.

Sex differences in neuronal susceptibility to ischemic injury and neurodegenerative disease have long been observed, but the signaling mechanisms ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. Structural changes at the NMJ can result in neurotransmission failure, resulting in weakness, atrophy and even death of the muscle fiber. Many studies have investigated how genetic modifications or disease can alter the structure of the mouse NMJ. Unfortunately, it can be difficult to directly compare findings from these studies because they often employed different parameters and analytical methods. Three protocols are described here. The first uses maximum intensity projection confocal images to measure the area of acetylcholine receptor (AChR)-rich postsynaptic membrane domains at the endplate and the area of synaptic vesicle staining in the overlying presynaptic nerve terminal. The second protocol compares the relative intensities of immunostaining for synaptic proteins in the postsynaptic membrane. The third protocol uses Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to detect changes in the packing of postsynaptic AChRs at the endplate. The protocols have been developed and refined over a series of studies. Factors that influence the quality and consistency of results are discussed and normative data are provided for NMJs in healthy young adult mice.

The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.

Der neuromuskulären Synapse: Mess Synapse Größe, Fragmentierung und Veränderungen der synaptischen Protein Dichte Mit der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Ex-vivo-Bildgebung von Postnatale Kleinhirn-Körnerzellmigration mittels konfokaler Makros

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced tools currently used to study neurons, have only partly been taken on by oligodendrocyte researchers. Cell type-specific staining by viral transduction is a useful approach to study live organelle dynamics. This paper describes a protocol for visualizing oligodendrocyte mitochondria in organotypic brain slices by transduction with adeno-associated virus (AAV) carrying genes for mitochondrial targeted fluorescent proteins under the transcriptional control of the myelin basic protein promoter. It includes the protocol for making organotypic coronal mouse brain slices. A procedure for time-lapse imaging of mitochondria then follows. These methods can be transferred to other organelles and may be particularly useful for studying organelles in the myelin sheath. Finally, we describe a readily available technique for visualization of unstained myelin in living slices by Confocal Reflectance microscopy (CoRe). CoRe requires no extra equipment and can be useful to identify the myelin sheath during live imaging.

Myelinating oligodendrocytes promote rapid action potential propagation and neuronal survival. Described here is a protocol for oligodendrocyte-specific expression of fluorescent proteins in organotypic brain slices with subsequent time-lapse imaging. Further, a simple procedure for visualizing unstained myelin is presented.

Visualisierung und Live Imaging Oligodendrozyt Organellen in organotypischen Gehirnscheiben mit Adeno-assoziierten Virus und konfokale Mikroskopie

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the transmission of molecules from the nervous system to voluntary muscles, leading to contraction. They are affected in many human diseases, including inherited neuromuscular disorders such as Duchenne muscular dystrophy (DMD), congenital myasthenic syndromes (CMS), spinal muscular atrophy (SMA), and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Therefore, monitoring the morphology of neuromuscular junctions and their alterations in disease mouse models represents a valuable tool for pathological studies and preclinical assessment of therapeutic approaches. Here, methods for labeling and analyzing the three-dimensional (3D) morphology of the pre- and postsynaptic parts of motor endplates from murine teased muscle fibers are described. The procedures to prepare samples and measure NMJ volume, area, tortuosity and axon terminal morphology/occupancy by confocal imaging, and the distance between postsynaptic junctional folds and acetylcholine receptor (AChR) stripe width by super-resolution stimulated emission depletion (STED) microscopy are detailed. Alterations in these NMJ parameters are illustrated in mutant mice affected by SMA and CMS.

This protocol describes a method for morphometric analysis of neuromuscular junctions by combined confocal and STED microscopy that is used to quantify pathological changes in mouse models of SMA and ColQ-related CMS.

Charakterisierung neuromuskulärer Verbindungen bei Mäusen mittels kombinierter konfokaler und hochauflösender Mikroskopie

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the ...

Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a cascade of events leading to neurotransmitter release. Moreover, changes in presynaptic calcium levels mediate the activity of many intracellular proteins and play an important role in synaptic plasticity. Studying calcium signaling is also important for finding ways to treat neurodegenerative diseases. The neuromuscular junction is a suitable model for studying synaptic plasticity, as it has only one type of neurotransmitter. This article describes the method for loading a calcium-sensitive dye through the cut nerve bundle into the mice's motor nerve endings. This method allows the estimation of all parameters related to intracellular calcium changes, such as basal calcium level and calcium transient. Since the influx of calcium from the cell exterior into the nerve terminals and its binding/unbinding to the calcium-sensitive dye occur within the range of a few milliseconds, a speedy imaging system is required to record these events. Indeed, high-speed cameras are commonly used for the registration of fast calcium changes, but they have low image resolution parameters. The protocol presented here for recording calcium transient allows extremely good spatial-temporal resolution provided by confocal microscopy.

The protocol describes the method of loading a fluorescent calcium dye through the cut nerve into mouse motor nerve terminals. In addition, a unique method for recording fast calcium transients in the peripheral nerve endings using confocal microscopy is presented.

Registrierung von Kalziumtransienten in neuromuskulären Verbindungen von Mäusen mit hoher zeitlicher Auflösung mittels konfokaler Mikroskopie

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a ...