This work of AA, SZ, WF, J-C.G, and LM was supported by the NICHD Intramural Program. The work of MV was supported by the Russian Federation Government grant #14.B25.31.0016.

Manyetik Nanopartiküller 1. Birleştirme (MNPS) <ol><li> Ticari bağlantı prosedürü ve antikorlar (Abs) ile çift MNPS için reaktif (tipik olarak 1 mg) kullanın. Karboksilik asit, reaktif gruplar ile demir oksit nanopartiküllerinin kullanılır. <ol><li> antikorlar bir hacimde daha yüksek 0.5 ml ise, bir 100K konsantratörü kullanarak konsantre. 3-5 dakika boyunca 2.000 xg&#39;de Spin. </li></ol></li><li> İşlem sonunda, ani soğutma tamponu, 10 ul ilave edildikten sonra, 12 mm x 75 mm tüp MNPS transferi ve 3 ml yıkama / saklama tamponu ilave edin. Manyetik separatörün merkezi delik tüp yerleştirilir ve 4 ° C&#39;de bir gece bekletin. </li><li> MNPS tüm tüpün yanına toplanan ve daha sonra dikkatlice sıvı dışarı pipetlemeyin emin olun. Taze yıkama / depolama tamponu 3 ml ekleyin ve arka mıknatıs yerleştirmek. </li><li> Birkaç saat sonra, MNPS tüpün yanına toplanır kontrol ve sıvıyı pipetleyin. yıkama / depolama tamponu 2 ml kullanınMNPS tekrar süspansiyon ve 4 ° C&#39;de depolayın. </li><li> (Bölüm 2&#39;de tarif edildiği gibi yakalama için bir fare monoklonal antikor kullanılması durumunda, örneğin, keçi anti-fare) ABS ilgili bir floresan Fab antikoru fragmanı ile etiketleme ile MNPS bağlanır olduğunu ve bir akış sitometresi üzerinde çalışır. </li></ol> MNPS için Coupled 2. Etiketleme Antikorlar <ol><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde Yakalanan Ab&#39;nin izotip spesifik MNPS bölgesinin (koşul başına) 60 ul (3.9 x 10 ila 12 parçacıklar) ve (200 ug / ml, ticari çözelti) 5 ul etiketli Fab fragmanları, birleştirin. </li><li> Sürekli karıştırma ile, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) enkübe edilir. </li><li> 5 dakika boyunca 1500 x g&#39;de bir mikrosantrfuj fosfat tamponlu tuz (PBS) ve bir dönüş 300 ul bir 100 K konsantratör Ön ıslatma sergilemez. </li><li> 100K sütun üzerinde etiketli kompleksleri arındırın. 200 ul PBS ile yıkayın, 5 dakika boyunca 1500 x g&#39;de bir mikrosantrfuj adım 2.2 karışımı spin ve kurtarmakİlk hacmi. </li></ol> Etiketli Ab-MNP Kompleksleri 3. İlgi parçacıklar (Virüsler veya AGH) Yakalama <ol><li> HIV (60 ul) veya EV hazırlanması (100 ul) ile önceden etiketlenmiş MNPS 60 ul (3.9 x 10 ila 12 parçacıklar) inkübe edin. <ol><li> çeşitli yöntemler kullanarak EV hazırlıklarını hazırlayın. Burada, sakaroz geçişlerini üzerinde AGH arındırmak exosome yağış reaktifler kullanılarak trombosit fakir plazmadan bunları toplamak veya plazma doğrudan izole 8. NOT: Optimal oranları her bir deney için tespit edilmesi gerekmektedir ve hazırlık virüs / EV konsantrasyonuna bağlıdır. MNP-Ab kısmı ~ fazla 10 6 virüs / EV fraksiyonunun konsantrasyonu karşılaştırılmalıdır. </li></ol></li><li> virüs, nazik karıştırma ile, 37 ° C&#39;de 40 dakika veya EVS, 4 ° C &#39;de 1 saat inkübe edin. </li><li> Fc yavaşça girdap bağlanmasını bloke oda sıcaklığında 3-5 dakika inkübe% 2.5 fare IgG / insan IgG ekleyin. </li><li>Her algılama Abs üreticisi tavsiye veya titre konsantrasyonları ekleyin ve oda sıcaklığında ek 20 dakika kuluçkaya yatmaktadır. </li></ol> Sınırsız Antikorlar gelen MNP-yakalanan viryonlar (veya AGH) Manyetik sütunlar kullanma 4. Ayırma <ol><li> bir ayırıcı mıknatıs yerleştirerek kullanım için manyetik ayırma kolonu hazırlayın. </li><li> Yıkama tamponu (2 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA),% 0.5 sığır serum albümini, PBS içinde (BSA)) 500 ul ile kolon ön ıslatma sergilemez. yıkama tamponu sütuna akmasına izin verin. </li><li> sütuna MNP-virüs / MNP-EV kompleksleri ekleyin ve tüm sıvı akmasına izin verin. Bütün hacmi geçmesine izin kolona yıkama tamponu 500 ul ekle. </li><li> Yıkama tamponu 2 kez daha tekrarlayın yıkama. </li><li> muhafaza MNP-virüs / MNP-EV komplekslerinin toplanması için x 75 mm tüp 12 mm mıknatıs ve yerden sütun çıkarın. Sütun 3 dakika mıknatıs kapalı tüp içinde bekletin. PBS 200 ul ekleyin ve izinBoncuklar PBS başka bir 200 ul ekleyin, yerçekimi tarafından aşağı akış ve elüsyon sonra 200 ul% 4 paraformaldehid ile düzeltmek. NOT: Paraformaldehyde bir şüpheli kanserojen ve havalandırılmış kaputu ele alınmalı ve eldiven giyilmelidir. </li><li> Tek virionlar ölçmek için / AGH Yüksek Verimli Sampler (HTS) ya da hemen öncesinde edinimi sayım boncuk sitometri iyi karıştırılmış akışını eklemek üzerinde hacimsel ayarları kullanın. </li></ol> MNPS yakalanan Virüsler 5. Analiz / a Akış Sitometre ile AGH <ol><li> 30 dakika boyunca flowsitometri Isınma. </li><li> Run kalite kontrol boncuk. </li><li> MNPS veya etiketli virüs / AGH birinin floresan Set eşik. arka plan &quot;gürültü&quot; azaltmak için eşik PBS süzülmüş 0.22 mikron kullanın. Olayları süzülmüş PBS hayır verir nerede düzeyinde PMT gerilimi ayarlayarak eşiğini ayarlamak, ya da çok az. </li><li> Düşük Run örnekler. (Arkasında seri olarak yerleştirilen kılıf sıvısı için ek 0.04 mikron inline filtresi kullanınStandart 0.2 mikron kılıf filtresi daha fazla) yanlış olayları ortadan kaldırmak için. </li></ol> Yakalama Etkinliğinin Değerlendirilmesi 6. <ol><li> 3.1, 3.2 anlatıldığı gibi floresan etiketli AGH veya MNP-Abs ile HIV yakalayın. (AGH bir zar boya ile veya kargo yoluyla ya da etiketli olabilir 15; HIV geni ile kodlanmış boya 16 ile, ya etiketlenmiş ya da bir zar boya 12, 17) sahip olabilir. </li><li> (4.1-4.2) &#39;de tarif edildiği gibi manyetik ayırma kolonu hazırlayın. </li><li> sütuna MNP-virüs / MNP-EV kompleksleri ekleyin ve tüm sıvı (fraksiyon akmaya) akmasına izin verin. tüp içinde fraksiyon akışı toplamak. </li><li> (4.4-4.5) &#39;de tarif edildiği gibi kolon üzerinde tutulan fraksiyon ile devam edin. </li><li> sonraki ayırma (4,1-4,5) ile 6.3 fraksiyon üzerinden akış tekrarlayın yakalama prosedürü. </li><li> İlk ca korudu kesirler analizBu sitometresinde onları çalıştırarak pture ve ikinci yakalama AGH veya HIV floresan etiketi üzerinde tetikleme ayarlanır. etkinliğini değerlendirmek için, her iki fraksiyonda olayların sayısını karşılaştırın. </li></ol> Belirli görevler için Protokol 7. Adaptasyon Not: yukarıda tarif edildiği gibi bir protokol DENV analizi için, HIV ve EVs analizi uygulanabilir olsa da, aşağıdaki modifikasyonlar dahil edilmelidir: <ol><li> Oda sıcaklığında 30 dakika süre ile karanlıkta 1 uM DII sahip virionlar inkübe edin. İnkübasyondan sonra herhangi bir fren ile, 4 ° C&#39;de 1.5 saat boyunca 240,000 x g hızında yoğunluk gradyan ortam içinde santrifüjleme (% 10,% 20,% 25 ve% 35) ile boyanan virüs temizler. % 20 ve% 25 yoğunluk gradyanı orta tabakaları 14 arasında fraksiyonu toplayın. </li><li> DII oda sıcaklığında 20 dakika süre ile% 2.5 fare IgG mevcudiyetinde tespit Ab&#39;nin İmalatçı tarafından tavsiye edilen veya titre konsantrasyonlarda DENV 1 x 10 7 (60 ul) etiketli inkübe edin. </li><li> inkubasyonyumuşak bir karıştırma ile, 37 ° C&#39;de 40 dakika boyunca önceden etiketlenmiş, 60 ul (3.9 x 10 ila 12 parçacıklar) MNP yakalama antikor kompleksleri ile karışım yedi. </li><li> Yukarıda açıklanan ve akış sitometresinde analiz gibi manyetik sütun üzerinde bağlanmamış Abs ayrı bileşke kompleksleri. </li></ol>

<ol>
	<li>Tremblay, M. J., Fortin, J. F., Cantin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acquisition+of+host-encoded+proteins+by+nascent+HIV-1.">The acquisition of host-encoded proteins by nascent HIV-1.</a> Immunol Today. 19 (8), 346-351 (1998).</li><li>Santos, S., Obukhov, Y., Nekhai, S., Bukrinsky, M., Iordanskiy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-producing+cells+determine+the+host+protein+profiles+of+HIV-1+virion+cores.">Virus-producing cells determine the host protein profiles of HIV-1 virion cores.</a> Retrovirology. 9, 65 (2012).</li><li>Wolf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nature+and+significance+of+platelet+products+in+human+plasma.">The nature and significance of platelet products in human plasma.</a> Br J Haematol. 13 (3), 269-288 (1967).</li><li>Piccin, A., Murphy, W. G., Smith, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microparticles:+pathophysiology+and+clinical+implications.">Circulating microparticles: pathophysiology and clinical implications.</a> Blood Rev. 21 (3), 157-171 (2007).</li><li>Bernal-Mizrachi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+levels+of+circulating+endothelial+microparticles+in+patients+with+acute+coronary+syndromes.">High levels of circulating endothelial microparticles in patients with acute coronary syndromes.</a> Am Heart J. 145 (6), 962-970 (2003).</li><li>Rozmyslowicz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-+and+megakaryocyte-derived+microparticles+transfer+CXCR4+receptor+to+CXCR4-null+cells+and+make+them+susceptible+to+infection+by+X4-HIV.">Platelet- and megakaryocyte-derived microparticles transfer CXCR4 receptor to CXCR4-null cells and make them susceptible to infection by X4-HIV.</a> Aids. 17 (1), 33-42 (2003).</li><li>Bhattarai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GB+virus+C+particles+inhibit+T+cell+activation+via+envelope+E2+protein-mediated+inhibition+of+TCR+signaling.">GB virus C particles inhibit T cell activation via envelope E2 protein-mediated inhibition of TCR signaling.</a> J Immunol. 190 (12), 6351-6359 (2013).</li><li>Arakelyan, A., Ivanova, O., Vasilieva, E., Grivel, J. C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+composition+of+single+nano-sized+extracellular+blood+vesicles.">Antigenic composition of single nano-sized extracellular blood vesicles.</a> Nanomedicine. 11 (3), 489-498 (2015).</li><li>Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Margolis, L., Grivel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+flow+virometry+for+the+analysis+of+individual+virions.">Nanoparticle-based flow virometry for the analysis of individual virions.</a> J Clin Invest. 123 (9), 3716-3727 (2013).</li><li>Yang, H., Liang, W., He, N., Deng, Y., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemiluminescent+labels+released+from+long+spacer+arm-functionalized+magnetic+particles:+a+novel+strategy+for+ultrasensitive+and+highly+selective+detection+of+pathogen+infections.">Chemiluminescent labels released from long spacer arm-functionalized magnetic particles: a novel strategy for ultrasensitive and highly selective detection of pathogen infections.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 7 (1), 774-781 (2015).</li><li>Tang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+and+rapid+detection+of+Pseudomonas+aeruginosa+based+on+magnetic+enrichment+and+magnetic+separation.">Highly sensitive and rapid detection of Pseudomonas aeruginosa based on magnetic enrichment and magnetic separation.</a> Theranostics. 3 (2), 85-92 (2013).</li><li>Borlido, L., Azevedo, A. M., Roque, A. C., Aires-Barros, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+separations+in+biotechnology.">Magnetic separations in biotechnology.</a> Biotechnol Adv. 31 (8), 1374-1385 (2013).</li><li>Xi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+HBsAg-Specific+DNA+Aptamers+Based+on+Carboxylated+Magnetic+Nanoparticles+and+Their+Application+in+the+Rapid+and+Simple+Detection+of+Hepatitis+B+Virus+Infection.">Selection of HBsAg-Specific DNA Aptamers Based on Carboxylated Magnetic Nanoparticles and Their Application in the Rapid and Simple Detection of Hepatitis B Virus Infection.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 7 (21), 11215-11223 (2015).</li><li>Zicari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+maturation+of+individual+Dengue+virions+with+flow+virometry.">Evaluation of the maturation of individual Dengue virions with flow virometry.</a> Virology. 488, 20-27 (2016).</li><li>Lai, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+tracking+of+tumour+extracellular+vesicle+delivery+and+RNA+translation+using+multiplexed+reporters.">Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters.</a> Nat Commun. 6, 7029 (2015).</li><li>McDonald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+intracellular+behavior+of+HIV+in+living+cells.">Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells.</a> J Cell Biol. 159 (3), 441-452 (2002).</li><li>Morcock, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+retroviral+infectivity+by+N-ethylmaleimide+with+preservation+of+functional+envelope+glycoproteins.">Elimination of retroviral infectivity by N-ethylmaleimide with preservation of functional envelope glycoproteins.</a> J Virol. 79 (3), 1533-1542 (2005).</li><li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical Flow Cytometry. , 101-223 (2005).</li></ol>

The authors declare no conflict of interest.

Geleneksel akış sitometrelerinde bireysel düzeyde 18 fiziksel ve kimyasal özelliklerine göre hücrelerin analiz etmek için önemli bir araçtır kalır. akış temel ilkeleri sitometri gelişimi beri değişmiş değil: Lazer ışınına geçer ve ışık dağıtır hücre hücre bağlı floresan antikorlar tarafından yayılan floresan spektrumları kayıt tetikleyen bir olay oluşturur. Onlar en 18 ışık toplamak yok akış sitometresi hangi büyük açılar altında daha fazla ışık dağılım olarak 300 nm altında daha küçük parçacıkların bir Sitometre yan dağılım ile tespit edilemez. Burada anlatılan teknik, tanımlama ve floresan tetikleme geleneksel akış sitometrelerinde sayısız bireysel virüs ya da AGH birden antijenlerin analizi sağlar. protokolü içinde kritik adımlar MNPS antikorların bağlantı vardır. Bizim deneyler performan- edildiMed bir reaktif grup karboksilik asit ile 15 mil demir oksit nano-tanecikleri kullanılarak, daha önce tarif edildiği gibi 9. Üreticiye göre, her bir 15 mil MNP 20 antikorlarının fazla bağlanırlar; Biz yaklaşık 15 nm MNP başına 10 antikorları bağlarlar. Bu tahmin önce ve birleştirme sonrası antikor miktarı ve nanoparçacık karakterizasyonu ve boyutlandırma cihazlarla ölçülerek boncuk / mL sayısına dayanır. Prensip olarak, birleştirme partiküllerinin agregasyonunu neden olabilir ve istenmeyen olabilir. Bu toplama bizim protokol ile olmuyor kontrol etmek için, biz nanoparçacık karakterizasyonu ve boyutlandırma enstrümantasyon ile bu doğrulandı. Bu cihaz kaplama ve antikor katmanları ziyade sadece 15 nm çekirdek içeren parçacıklar için hidrodinamik çap ölçer. Biz birleştiğinde boncuk çoğunluğu tek bir zirvede yer aldığını (73 ± 7.3 nm altındaki tüm olayların% 90 ile 64.7 ± 4.2 nm zirveye demek) bulundu. Ab-MNP co karıştırmaSağ orantılı virionlar ya AGH mplexes MNPS EVs / virionlar daha yüksek birkaç emir konsantrasyonunda yani çok önemlidir. Bu tek EVs / virionlar analiz olduğundan emin olmak için önemlidir. Düşük debide sitometresinde çalıştırarak olayların tesadüfler kaçının. floresan üzerinde edinimi tetikleyebilir ve yakalanan kişilerin konsantrasyonunu ölçmek için hacimsel denetimlerini kullanmak için emin olun. Bununla birlikte, çapraz bağlama MNPS veya aynı nanopartikül iki veya daha fazla virion arasında bağlanarak EVs veya virionlar burada toplayabilir. Bunu kontrol etmek için, Şekil 4&#39;te tarif edildiği gibi toplama için bir test gerçekleştirilmelidir. Hatta tek tek yakalanan virionlar veya AGH aynı anda akış sitometresinin lazer ışınını girebilir. Bu iki farklı antijen için yanlış pozitif yaratacak. Bunu önlemek için, tarif edildiği gibi akış sitometrisi ayarlanmalıdır ve preparasyonlar seyreltilmelidir. Bir aynı kullanarak tesadüf oluyor olmadığını kontrol edebilirsinizBir önceki nokta açıklandığı gibi strateji. Ayrıca, rastlantı olmaması hazırlama seri dilüsyonları analiz etmek ve floresan lekeli antijenin ortalama florasan yoğunluğu tüm seyreltileri (Şekil 5) sabit kalırken olay sayısı dilüsyonu ile doğrusal olarak azalmaktadır ispatlanması belirlenebilir. Başka bir sorun çok az virüs / AGH yakalanabilir olmasıdır. Bunun nedeni virüsler / spesifik MNPS tarafından yakalanır hangi aracılığıyla antijenleri taşıyan AGH gerçek kıtlığı olabilir. Alternatif olarak, yakalama etkinliği çeşitli nedenlerden dolayı düşüktür (örneğin, MNPS, bu protokol için geliştirilen virionlar / AGH ile MNPS oranları sapma, vb antikorların verimsiz bağlantı). İkinci olasılığını önlemek için, yakalama etkinliği özellikle değerlendirilmelidir. Tipik haliyle, verimlilik, Şekil 6&#39;daki gibi yaklaşık% 90 olmalıdır. Farklı antikorlar nedeniyle engelleyebilirbirbirleriyle veya MNPS bağlı antikorlar ile sterik engelleme. Bunun üzerine serbest dalgalı Abs Daha sonraki ayrılığı Ab-MNP kompleksleri ilk floresan algılama Abs ile boyanmış olmalıdır Bölüm 7. Kısaca, virionlar veya AGH açıklanan ve daha sonra yakalanan bir ters yakalama protokolü (test edilmelidir olmadı kontrol etmek için manyetik sütunlar. Akış virometry virionlar ya EVs antijenik bileşimi analizi, mevcut yöntemlere göre önemli avantajlara sahiptir. Rutin biyokimyasal yöntemler hazırlıklarında belirli proteinlerin genel varlığına rapor, ancak virionlar veya EVs heterojenliği hiçbir bilgi sağlar. Bu büyük ticari olarak temin edilebilen parçacıkları üzerinde virionlar ya EVs Immunocapture içerir. Bu parçacıklar çapı birkaç mikron arasında tipik olarak ve her biri virionlar ya EVs yüzlerce ya da binlerce yakalayabilir. Bu nedenle, herhangi bir sonraki analiz ortalamalara virionlar / AGH özellikleribir parçacık tarafından yakalanan. Bunun aksine, akış virometry olayların en az% 90 tek bir virion, ya da tek bir EV temsil çapında ve tarif edilen protokol ile 10-15 nm MNPS kullanır. Ana sınırlama hazırlık virionlar veya EVs tüm nüfus analiz olmayabilir, ama sadece o yakalanır söyledi. Bu nedenle, virionlar ya EVs yakalanır, üzerinden antijen seçimi kritik hale gelir. Ayrıca farklı antijenlerin sayısı (çeşitli antijenlere karşı floresan antikorlar sayısı) sitometrisi farklı akış virionlar ya EVs küçük bir yüzey ile sınırlandırılmıştır. Son olarak, farklı antikorlar sterik nedeniyle küçük (hücrelere kıyasla) yüzeye tekrar birbirleri ile etkileşime girebilir. Mevcut protokolü de yakalanabilir nedeniyle, özel antikorlar mevcut olduğu sürece, herhangi bir virüs ya da herhangi bir kökenli EV analizi için adapte edilebilir. Bireysel virionlar izin üzerindeki antijenlere Analizis araştırmacılar, viral popülasyonların farklı fraksiyonları patogenezi ele. Ayrıca, plazma bireysel EVs tanımlanması mümkün özellikle hücrelere EVs izini ve normal veya patolojik bu hücrelerin koşulları ve içinde bulundukları organ hakkında rapor yapabilir.

çok hücreli organizmalarda hücreler, belirli bir hücre için özel olarak mevcut ya da en azından hücre özel gruplarına ait olabilir birçok bireysel özelliklere sahiptir. onların çeşitli morfoloji ile kanıtlandığı gibi, hatta kültürlü klonlanmış hücreler bireysel özellikleri göstermektedir. Ayrıca, bir hücrenin bireysellik o salgılar ürünlerde yansımaktadır. viral enfeksiyon durumunda, viral partiküller onları üreten hücrelerden proteinlerin taşıyabilir. Örneğin, HIV için birçok konakçı hücre proteinleri viral zarf gömülür ve farklı hücreler tarafından üretilen virüs, bu karakteristik proteinleri, 1, 2 ya da &quot;hücre imza&quot; taşıyabilir. Hatta enfeksiyon olmadan, hücreler çevredeki medya, küçük hücre dışı veziküller (AGH) içine bırakın. Bu veziküller ve birçok durumda da yapının Biogenesis, virüsler, özellikle retrovirüsler bu benzerler. Son yıllarda netleştiBaşlangıçta &quot;trombosit toz&quot; 3 olarak kabul edildi AGH, hücre-hücre iletişim önemli bir fizyolojik sistem oluşturduğunun. Birlikte arası iletişim, yani hücre-hücre temas etkileşimlere ve serbest çözünür moleküllerin iki diğer sistemlerle EVS normal fizyoloji koordine etmek ve çeşitli patolojilerin viral enfeksiyonlar 6, 7 de dahil olmak üzere 4, 5 değiştirilir. serbest viral partiküller ve hücre dışı kesecikler hem oldukça çeşitli olmasına rağmen, onların bireysel özellikleri kaybolur hangi toplu analizi ile ağırlıklı olarak karakterize edilir. Farklı yüzey antijenleri göre hücreler fenotip akış sitometrisi benzer bir yöntem olup, ayrı ayrı, viral ve viral-benzeri partiküller karakterize etmek için gereklidir. Ne yazık ki, AGH veya küçük virionlar standart akış CYTO kullanılarak analiz edilemezmetry yöntemler onlar en sitometrelerinde tetiklenmesi için dayandığı ışık saçılım sinyali üretmek için çok küçük olduğu için. Bu sınırlamayı aşmak için, tetikleme floresans uygulanabilir. AGH veya virionlar floresan antikor ile boyandı eğer Ancak, çünkü onların benzer floresan ve karşılaştırılabilir boyutlarda serbest antikorlar ve onların agrega ayırt etmek zordur. Son zamanlarda, düzenli akış sitometre 8, 9 kullanarak bireysel küçük parçacıkların üzerindeki antijenlere karakterizasyonu sağlayan bir nanoteknoloji tabanlı yüksek verimlilik yöntem geliştirdi. Muhtelif uygulamalar 10, 11, 12, 13, diğer gruplar tarafından tarif edilmiş gibi, ilgi konusu Immunocapture partiküllerine MNPS kullanır; Ancak, bizim yeni teknik bireysel speci yakalanması için izin verirfic hedefleri serbest dalgalı antikorlar müdahalesi olmaksızın, ışık saçılması yerine tetikleme floresan kullanılarak flow sitometri ile bu yakalanan parçacıkların feno izledi. Bu yöntem geniş bir uygulama alanı vardır ve in vivo olarak hücreler tarafından üretilen herhangi bir vira- ve viral olmayan küçük bir parçacık antijenik bileşimi karakterize etmek için kullanılabilir ve in vitro olarak bir yüzey antijenine karşı spesifik floresan antikorlar durumu Resim. Biz zaten birkaç biyolojik sorunları incelemek için bu tekniği uyguladık. Özellikle, bireysel HIV-1 parçacıkların 9 konak hücre belirteçleri dağılımını değerlendirdi, biz onların yüzey proteinleri 14 analizine dayanan bireysel Dang virüsleri (DENV) olgunlaşmasını okudu ve sağlıklı gönüllüler ve hastalar kan dolaşımına salınır AGH araştırıldı akut koroner sendrom (AKS). benzer prensiplere göre, ancakYeni yöntemin uygulanması aşağıda açıklanmaktadır özel protokoller geliştirilmesini gerektirmiştir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="868">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Materials</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Carboxyl Magnetic Iron Oxide Nanoparticles Conjugation Kits</td>
			<td style="width:164px;">Ocean Nanotech</td>
			<td style="width:119px;">ICK-15-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane</td>
			<td style="width:164px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC810024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5mL Round Bottom PP Test Tube, without Cap</td>
			<td style="width:164px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">DEPC treated water</td>
			<td>Quality Biological&#160;</td>
			<td style="width:119px;">351-068-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SuperMAG-01 magnetic separator&#160;</td>
			<td style="width:164px;">Ocean Nanotech</td>
			<td style="width:119px;">SuperMAG-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Zenon R-Phycoerythrin Mouse IgG1&#160;Labeling Kit</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Z25055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanosep Centrifugal Devices with Omega Membrane 100k</td>
			<td style="width:164px;">Pall Corp</td>
			<td>OD100C34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">EDTA 0.5M</td>
			<td style="width:164px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin solution</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9576-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10010-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde, EM Grade, Purified</td>
			<td style="width:164px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">123count eBeads&#160;</td>
			<td style="width:164px;">eBioscience</td>
			<td>01-1234-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">CytoCount beads</td>
			<td style="width:164px;">Dako</td>
			<td>S2366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">AccuCheck count beads</td>
			<td style="width:164px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">PCB100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Cytometer Setup &#38; Tracking Beads Kit (CST)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>642412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Vybrant DiI Cell-Labeling Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>V22885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Equipment</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#181;MACS column&#160;</td>
			<td style="width:164px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">OctoMACS Separator magnet</td>
			<td style="width:164px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:164px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">none</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">NanoSight NS300</td>
			<td style="width:164px;">Malvern</td>
			<td style="width:119px;">none</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">BD LSRII flow cytometer</td>
			<td style="width:164px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">none</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:423px;">Software</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Flowjo software</td>
			<td>Flowjo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">BD FACSDiva software</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow virometry to analyze antigenic spectra of virions and extracellular vesicles

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of some of the EVs. Both virions and EVs carry proteins of the cells that generated them and are antigenically heterogeneous. In spite of their diversity, both viruses and EVs were characterized predominantly by bulk analysis. Here, we describe an original nanotechnology-based high throughput method that allows the characterization of antigens on individual small particles using regular flow cytometers. Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles (MNPs) coupled to antibodies recognizing one of the surface antigens. The captured virions or vesicles were incubated with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated on magnetic columns from unbound antibodies and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence. This method has wide applications and can be used to characterize the antigenic composition of any viral- and non-viral small particles generated by cells in vivo and in vitro. Here, we provide examples of the usage of this method to evaluate the distribution of host cell markers on individual HIV-1 particles, to study the maturation of individual Dengue virions (DENV), and to investigate extracellular vesicles released into the bloodstream.

HIV-1 viryonlarıyla hücresel antijenlere seçici yakalama &quot;Akış virometry&quot; ile bireysel viral parçacıkların hücresel antijenleri görselleştirmek için artık mümkün. Bir örnek olarak, HIV-1, LFA-1, HLA-DR tarafından taşınan iki hücre antijenleri üzerinde odaklanmıştır. Daha önce, bu iki antijen toplu 1 &#39;de analiz, HIV-1 preparasyonlarda tespit edilmiştir. Bu MNPS Env HIV proteini, VRC01 karşı antikorların birisi ile bağlanmış ve (periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC), üretilen HTV-1 LAI.04 veya HIV-1 SF162), bu MNPS HİV-1 virionlar ile çekilen hazırlanabilir. Buna ek olarak, 2G12, başka bir anti-Env antikoru ile bu virionlar ile boyanmıştır. Akış virometry LFA-1 ve HLA-DR varlığı ile ilgili HIV-1 virionlar yüksek heterojen göstermiştir. Ortalama 16.7 ±% 2.0 üzerinde (n = 6) ve 8.6 ± 0.3% (n = 3), LFA-1, HLA-DR taşınan HIV-1 LAI.04 virionlar,sırasıyla. 4.8 ± 0.6% (n = 3) Tüm virionların iki antijen için pozitifti. Diğer HIV-1 suşu, HIV-1 SF162, bu antijenler 20.0 ±% 4.4 mevcut (n = 6) ve 10.8 ± 1.3% (n = 6) sırası ile virionlar, ve, her iki antijen de 6.5 ± tarafından taşınır, oysa % 0.4 (Şekil 1). Hücresel protein dağılımı virüsü çoğaltılmış hücrelerine bağımlıdır. Enfekte PBMC tarafından üretilen gelen antijenik farklı virionlar üretilen Jurkat hücreleri, HIV-enfekte edilmiştir. Jurkat hücreleri tarafından üretilen HTV-1 LAI 0.4 virionları 1.6 ± 1.4% gerçekleştirilmiştir (n = 3) ve 1.6 ± 0.7% (n = 4), LFA-1, HLA-DR, sırasıyla. Jurkat hücrelerinde üretilen HTV-1 SF162 virionlar, bu parametreler (N = 4) 7.2 ± 2.5% (n = 3) ve 5.6 ± 2.7% idi. Bu nedenle, (en azından HLA-DR ve LFA-1) antijenik makyaj, HIV-1 LAI.04 iki farklı hücre tarafından üretilen farklı olduğutürleri (p &lt;0.02). Dang virüsü değerlendirilmesi uygulanan virometry Akış DENV matürasyon viryonları üzerindeki prM proteinin ifadesi ile ilişkilidir. Biz olgun virüsleri oluşturan BHK-1 üretilen DENV ne fraksiyonu ve LoVo hücreleri değerlendirmek için akış virometry uyguladı. Viryonlar bir lipidik boya DII ile boyandı. Bireysel yakalanan virionlar Analizi 48.2 ± 5.3% üzerinde PRM ortaya (n = 8) DENVs evi. Bunun aksine, 84.5 ± 3.4% (n = 4) DENV bölgesinin prM taşınan LoVo hücreleri gösterdi. Virionlar geri kalanı, sırasıyla 51.8 ± 5.3% (n = 8) ve 15.5 ± 3.4% (n = 4) idi prM negatif (Şekil 2). Bu nedenle, akış virometry olgunlaşmamış (veya kısmen olgun) DENV vırıonlardan tam olarak olgun tek tek DENV ayırt etmek için kullanılabilir. Ekstrasellüler veziküller sağlıklı kan dolaşımına salınırAkut koroner sendrom ile gönüllüler ve hastalar (AKS) ACS ve sağlıklı hastalarda farklı EV alt kümelerini araştırmak amacıyla, floresan CD31, CD41a, CD63 ya da karşı antikorlarla MNPS birleştirilmiş platelet zayıf plazma (PPP) gelen EVS ele. CD31-MNPS tarafından yakalanan EVs CD41a-MNPS tarafından yakalanan EVs CD31 ve CD63 için boyandı, CD41a ve CD63 için boyandı ve CD63-MNPS tarafından yakalanan EVs CD31 ve CD41a (Şekil 3) için boyandı. AKS hastalarında tespit antikorların bir ya da iki pozitif CD31-MNPS tarafından ve esir AGH miktarı 3359 [2328 idi; 5.472] EVs / 1.272 [714 ile karşılaştırıldığında ul; 2.157] EVs / sağlıklı gönüllülerde (p = 0.001) | il. Sağlıklı gönüllülerde ile karşılaştırıldığında AKS hastalarında CD63 tarafından yakalanan AGH tutarı 3541 [1318 idi; 5173] AGH / ul vs. 806 [488; 2112] AGH / ul (p = 0.007). 4752 [3238 vardı; sağlıklı gönüllülerin plazmasında bu sayı önemli ölçüde daha düşük iken 7,173] EVs /, CD41a-MNPS tarafından yakalanan ACS hastaların plazmasındaki 2.623 [1.927 ul; 4188] AGH / ul (p = 0,015). Genel olarak, elde ettiğimiz sonuçlar EV miktarları çoğunlukla AKS hastalarında artarken, artış büyüklüğü EVs farklı alt popülasyonlarda farklı olduğunu göstermektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55020/55020fig1.jpg" /> Şekil 1: Farklı hücre tipleri de replike HIV-1 virionlar hücresel antijenlere seçici olarak dahil edilmez. PBMC&#39;ler veya Jurkat hücreleri tarafından yayımlanan, HIV (HIV-1 veya HIV-LAI.04 1 SF162) viryonlar VRC01-MNPS çekilir ve ikinci anti-gp120 antikor 2G12 ve HLA-DR ve LFA-1&#39;e karşı özel antikorlar ile boyandı. boyama yöntemi, HLA-DR (beyaz çubuklar) ve LFA-1 (siyah BA akış analizi tabi tutulmuşturrs). Üç ila altı deneyler 9 ± SEM. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55020/55020fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55020/55020fig2.jpg" /> Şekil 2: DENV virionlar Olgunlaşma durumu. Üretilen DENV BHK-21 hücreleri (A, B) ya da LoVo hücrelerinin (C, D) &#39;de 2H2 antikorları (A, C) ya da prM proteini için boyanmış, yoğunluk gradyanlı bir ortam içinde Ultrasantrifüje edildikten sonra, lipidik boya DII ile etiketlenmiş edildi ve izotip kontrol IgG2a (B, D). Etiketli virionlar sonra 3H5-1-MNPS çekilir ve analizi 14 akış tabi tutuldu. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55020/55020fig2large.jpg" target="_blank">Bu daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız</a>rakam. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55020/55020fig3.jpg" /> Şekil 3: AKS hastalar ve sağlıklı kontrollerden AGH analizi. Plazma EVs CD31-MNPS, CD63-MNPS ya CD41a-MNPS çekilir ve CD31 ve CD41a karşı CD41a ve CD63 karşı sırasıyla CD31 ve CD63, karşı antikorlar ile boyandı. Algılama antikorların en azından biri ile boyanmış Yakalanan EVs, görsel ve akış analizi numaralanmıştır. Veriler ortanca ve çeyrekler arası aralık (IQR) ile nokta arsa olarak sundu. Yeşil sembolleri: Sağlıklı gönüllüler (kontrol), kahverengi sembolleri: AKS hastalar. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55020/55020fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55020/55020fig4.jpg" /> Şekil 4: erlendirmesiBireysel virionlar temsil akış olaylarının fraksiyonu üzerine. (A) HIV-1. Virionlar Süspansiyon iki bölüme ayrılır ve her iki mi (sol panel) ve DIO (orta panel) ile boyandı. Karıştırma işleminden sonra, iki farklı şekilde boyanmış virüsleri içerdi Süspansiyon, VRC01-MNPS çekilir ve virometry (sağ panel) akış tabi tutuldu. Agrega (çift renkli olaylar) toplam olayların% 10&#39;dan az oluşturmuştur. (B - D) DENV. 1: 2: DII lekeli viryonlann Süspansiyon seri 1 iki defa seyreltilmiştir 256 ve bir akış sitometresinde (B) üzerinde HTS ile elde. DII DENVs 2H2 antikorları (C) veya DII DENVs ile etiketlenmiş 3H5-1-MNPS (D) ele geçirildi. 1: 2: Hazırlık C ve D daha sonra seri olarak 1 ile iki kat seyreltilmiştir ve 256 HTS 14 ile elde. Virionlar orada her durumda bu yana bir araya görünmemektedirseyreltme faktörü ve olayların sayısı arasında doğrusal bir ilişki olduğunu. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55020/55020fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/55020/55020fig5.jpg" /> Şekil 5: akış sitometresi ile tek parçacıkların tespiti. 1: 2: DII lekeli DENV süspansiyonu seri 1 iki defa seyreltilmiştir 2.048 ve bir akış sitometresi üzerinde bir HTS kullanılarak elde. Seyreltme faktörü bir fonksiyonu olarak tespit edilen virüs (A) sayısı. (B) ortalama florasan yoğunluğu (MFI) DII DENV 14 etiketli. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55020/55020fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt = &quot;Şekil 6&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55020 / 55020fig6.jpg&quot; /&gt; Şekil 6: virionlar ve spesifik antikorlara bağlanmış MNPS çekilen hücre dışı veziküllerin fraksiyonunun değerlendirilmesi. Işaretli HIV-1 virionlar ya EVs MNPS spesifik antikorlara bağlı olan ve virometry akış işlemine tabi ile yakalandı. Manyetik sütun üzerinde ayrılmasından sonra, akış oranı (korunmaz) fraksiyonlar ilk aşamada cevapsız virionlar veya ilgi duyulan EVS varlığı için analiz edildi. (A) işaretli HIV-1 BaL viryonlar 2G12-MNPS (sol panel) ele geçirildi. Akış fraksiyonu yeniden yakalanıp virometry (sağ panel) akış tabi tutuldu. İlk çevrimde ilgi virionlar yaklaşık% 95 ele geçirildi. (B) olarak tanımlanan EVs, anti-CD81 MNPS çekilir ve manyetik sütun (sol panel) üzerinde izole edilmiştir. Flow-through fraksiyonu yeniden yakalanır ve (sağ panel) analiz edildi. İlk olarakilgi veziküllerin döngüsü yaklaşık% 99 8 ele geçirildi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55020/55020fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles at JoVE.com

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles coupled to antibodies recognizing surface antigens. The captured virions or vesicles were labeled with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated in high magnetic field and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence.

Virionlar antijenik Spectra ve ekstrasellüler veziküllerin Analiz Virometry Akış

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

flow-virometry-to-analyze-antigenic-spectra-virions-extracellular

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.8K Görüntüleme.  Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health. Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles coupled to antibodies recognizing surface antigens. The captured virions or vesicles were labeled with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated in high magnetic field and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence.

Video: Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which are ubiquitous and the most numerous entities on our planet 4 and important in all environments 5, have yet to be revealed via similar approaches. Here we describe an approach for isolating and characterizing the genomes of single virions called 'Single Virus Genomics' (SVG). SVG utilizes flow cytometry to isolate individual viruses and whole genome amplification to obtain high molecular weight genomic DNA (gDNA) that can be used in subsequent sequencing reactions.

Single Virus Genomics (SVG) is a method to isolate and amplify the genomes of single virons. Viral suspensions of a mixed assemblage are sorted using flow cytometry onto a microscope slide with discrete wells containing agarose, thereby capturing the virion and reducing genome shearing during downstream processing. Whole genome amplification is achieved using multiple displacement amplification (MDA) resulting in genomic material that is suitable for sequencing.

&#39;Tek Virüs Genomik&#39; kullanarak Tek viryonlar İzolasyonu ve Genom Analizi

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

İnfiltratif Lenfositlerinin Analiz Olmayan enzimatik ayırmak Taze İnsan Dokusuna Basit ve Hızlı Protokolü

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes

Lymphocytes respond to a variety of stimuli by activating intracellular signaling pathways, which in turn leads to rapid cellular proliferation, migration and differentiation, and cytokine production. All of these events are tightly linked to the energy status of the cell, and therefore studying the energy-producing pathways may give clues about the overall functionality of these cells. The extracellular flux analyzer is a commonly used device for evaluating the performance of glycolysis and mitochondrial respiration in many cell types. This system has been used to study immune cells in a few published reports, yet a comprehensive protocol optimized particularly for lymphocytes is lacking. Lymphocytes are fragile cells that survive poorly in ex vivo conditions. Oftentimes lymphocyte subsets are rare, and working with low cell numbers is inevitable. Thus, an experimental strategy that addresses these difficulties is required. Here, we provide a protocol that allows for rapid isolation of viable lymphocytes from lymphoid tissues, and for the analysis of their metabolic states in the extracellular flux analyzer. Furthermore, we provide results of experiments in which the metabolic activities of several lymphocyte subtypes at different cell densities were compared. These observations suggest that our protocol can be used to achieve consistent, well-standardized results even at low cell concentrations, and thus it may have broad applications in future studies focusing on the characterization of metabolic events in immune cells.

The study of metabolism is becoming increasingly relevant to immunological research. Here, we present an optimized method for measuring glycolysis and mitochondrial respiration in mouse splenocytes, and T and B lymphocytes.

Bir Optimize Protokol Lenfositlerindeki Glikoliz ve Mitokondriyal Solunum Analiz

Lymphocytes respond to a variety of stimuli by activating intracellular signaling pathways, which in turn leads to rapid cellular proliferation, migration ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain insight into an ongoing disease state.
Here, a simple and efficient method is described to perform BAL on murine lungs without the need of special tools or equipment. BAL fluid is isolated by inserting a catheter in the trachea of terminally anesthetized mice, through which a saline solution is instilled into the bronchioles. The instilled fluid is gently retracted to maximize BAL fluid retrieval and to minimize shearing forces. This technique allows the viability, function, and structure of cells within the airways and BAL fluid to be preserved.
Numerous techniques may be applied to gain further understanding of the disease state of the lung. Here, a commonly used technique for the identification and enumeration of different types of immune cells is described, where&#160;flow cytometry is combined with a select panel of fluorescently labeled cell surface-specific markers. The BAL procedure presented here can also be used to analyze infectious agents, fluid constituents, or inhaled particles within murine lungs.

The health status of the lung is reflected by the type and number of immune cells that are present in the bronchioles of the lung. We describe a bronchoalveolar lavage technique that allows the isolation and study of nonadherent cells and soluble factors from the lower respiratory tract of mice.

İnflamatuvar Hücre İnfiltrasyonunu İncelemek İçin Murin Akciğerlerin Bronkoalveoler Lavajı

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Aşırı Ezme ve İnsanın Saflaştırılması<em&gt; Cis</em&gt; -prenıltransferaz in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of heterogeneous vesicles, whose size range between 40 and 1,000 nm. Accumulated evidence indicated that EVs play important regulatory roles in pathogen-host interactions. A deep understanding of schistosome EVs should provide insights into the mechanisms underlying schistosome-host interactions, enabling development of novel strategies against schistosomiasis. Here, we aim to further study EVs functions in schistosomes by presenting a protocol for the isolation and characterization of EVs from adult Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVs were isolated from in vitro culture medium using centrifugation combined with a commercial exosome isolation kit. The isolated S. japonicum EVs (SjEVs) typically possess a diameter of 100 - 400 nm, and are characterized by transmission electronic microscopy and western blotting. The usage of PKH67 dye-labeled SjEVs has demonstrated that SjEVs are internalized by the recipient cells. Overall, our protocol provides an alternative method for isolating EVs from adult schistosomes; the isolated SjEVs may be suitable for functional analysis.

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Here, we present a protocol to describe extracellular vesicles (EVs) isolation in in vitro cultured medium from adult Schistosoma japonicum.

Yalıtım ve yetişkin Schistosoma japonicum üzerinden ekstraselüler veziküller karakterizasyonu

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for vaccination as well as understand how pathogenic antibody responses develop in allergies and autoimmune disease. Generating robust antigen-specific antibody responses is not always trivial. In mouse models, it often requires multiple rounds of immunizations with adjuvant that leads to a great deal of variability in the levels of induced antibodies. One example is in mouse models of peanut allergies where more robust and reproducible models that minimize mouse numbers and the use of adjuvant would be beneficial. Presented here is a highly reproducible mouse model of peanut allergy anaphylaxis. This new model relies on two key factors: (1) antigen-specific splenocytes are adoptively transferred from a peanut-sensitized mouse into a na&#239;ve recipient mouse, normalizing the number of antigen-specific memory B- and T-cells across a large number of mice; and (2) recipient mice are subsequently boosted with a strong multivalent immunogen in the form of liposomal nanoparticles displaying the major peanut allergen (Ara h 2). The major advantage of this model is its reproducibility, which ultimately lowers the number of animals used in each study, while minimizing the number of animals receiving multiple injections of adjuvant. The modular assembly of these immunogenic liposomes provides relatively facile adaptability to other allergic or autoimmune models that involve pathogenic antibodies.

Described is the preparation of antigenic liposomal nanoparticles and their use in stimulating B-cell activation in vitro and in vivo. Consistent and robust antibody responses led to the development of a new peanut allergy model. The protocol for generating antigenic liposomes can be extended to different antigens and immunization models.

Antijenik lipozomlar hastalığa özgü antikorların üretimi için

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during physiological and pathological states. The isolation of EVs continues to be a major challenge in this field, due to limitations intrinsic to each technique. The differential ultracentrifugation with density gradient centrifugation method is a commonly used approach and is considered to be the gold standard procedure for EV isolation. However, this procedure is time-consuming, labor-intensive, and generally results in low scalability, which may not be suitable for small-volume samples such as bronchoalveolar lavage fluid. We demonstrate that an ultrafiltration centrifugation isolation method is simple and time- and labor-efficient yet provides a high recovery yield and purity. We propose that this isolation method could be an alternative approach that is suitable for EV isolation, particularly for small-volume biological specimens.

Here, we describe two extracellular vesicle isolation protocols, ultrafiltration centrifugation and ultracentrifugation with density gradient centrifugation, to isolate extracellular vesicles from murine bronchoalveolar lavage fluid samples. The extracellular vesicles derived from murine bronchoalveolar lavage fluid by both methods are quantified and characterized.

Üzerinden Ultrafiltrasyon tekniği Santrifüjü kullanarak fare Bronchoalveolar lavaj sıvı ekstrasellüler veziküller yalıtım

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Nötrofil kütle sitometri analizi için tüm kemik Iliği hazırlanması-Lineage hücreler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...