Biz ses donanımları için eleştirel okuma / görüntüleme Matyáš Fendrych ve Stephan STADLBAUER teşekkür ederiz. OpenSPIM katkılarından dolayı IST Avusturya&#39;da Miba Makine Shop teşekkürler. Bu sonuçlara önde gelen araştırma REA hibe anlaşması n ° [291734] ve Avrupa Araştırma Konseyi (ERC projesi-2011 kapsamında Avrupa Birliği&#39;nin Yedinci Çerçeve Programı (FP7 / 2007-2013) İnsanlar Programı (Marie Curie Eylemleri) fon aldı -StG-20101109-PSDP).

Görüntüleme 1. Arabidopsis Kültürleme önce <ol><li> 2.15 g, MS-ortamı, 10 g sakroz, 0.97 g MES (2- (N-morfolino) etansülfonik asit) ve 1 L GKD 2 O (iki kez damıtılmış su eklenmesi ile yarım MS ortamı (yarı-kuvvetli Murashige ve Skoog ortamı) hazırlanması ) 1 L&#39;lik bir şişeye. KOH kullanılarak 5.8&#39;e pH ayarlayın. </li><li> ½ MS ortamına 15 g / l jellan zamkı ekleyin ve 121 ° C&#39;de 20 dakika süreyle otoklav. </li><li> yaklaşık 2 mm bir kalınlığı olan bir jel tabakası oluşturmak için köşeli Petri kapları (245 x 245 x 25 mm) içine sıcak ortam, 30 ml dökün. Yemekler orta katılaşmaya izin oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. </li><li> 1 ml steril H2O cam pipet ya da 1000 uL bir pipet ucu kullanılarak tohumları kaldırmak ve jelin yüzey üzerine ekmek ihtiva eden 1.5 ml reaksiyon tüpüne sterilize Arabidopsis tohumlar konulur. tohumları ayrı ayrı yaklaşık 10 mm yerleştirin. bant ile plaka mühür. </li><li> 4 ° C&#39;de 24 saat boyunca inkübe levhasını° C (tabakalaşma). </li><li> 6 gün boyunca ışık 120-140 umol / m / s miktarı ile 16/8 h gündüz / gece döngüsünde 22 ° C&#39;de, örneğin büyüme inkübatör plaka, geliştirin. 10 güne kadar eski bitkiler kullanılabilir. </li></ol> 2. Bitki Numune Hazırlama Yöntemi Not: numune tutucu 3D basılı veya elden Şekil 2C tasvir boyutları kullanarak bir makine atölyesinde yapılabilir ya. 3D model dosyası ek malzemenin (Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl) sağlanır. Malzeme listesinde 3D baskı siparişi için bağlantıya göz atın. <ol><li> 5 g 50 ml yarım MS ortamı içeren 50 ml şişe içine agaroz düşük eriyen ve 121 ° C&#39;de 20 dakika süreyle otoklav ekleyin. </li><li> 1.5 ml&#39;lik tepkime tüpleri içinde% 1 düşük erimeli agaroz bir çözüm kısım. 4 ° C&#39;de saklayın (en az iki ay için kullanılabilir). </li><li> 80 ° C&#39;de 1 %% düşük erime agaroz bir kısım eritin ve için soğumasını bekleyin33 ° C. </li><li> bir ultrason ünitesi örnek tutucu temizleyin. % 70 etanol ile numune tutucu sterilize ve steril su ile yıkayın. </li><li> Bir neşter kullanılarak bitki etrafında jel kesti. </li><li> Düz spatula ile blok kaldırın ve ikinci spatula ile numune tutucu üzerinde dikkatle kaydırın. </li><li> Bir 100 uL pipet kullanılarak (33 ° C&#39;de),% 1 agaroz ile örneği üzerindeki jel Tutkal. </li><li> 10 mcL pipet kullanarak% 1 agaroz jel üzerinde bir bitki Tutkal. Yaprakları jel ile kaplı olmadığını doğrulamak için bir stereo mikroskop kullanın. ilgi bölgeye doğrudan jeli yerleştirmeyin. </li><li> kurumasını bitki önlemek için, kesintisiz çalışır. Mümkün 1.000 mcL pipetlemeyin ucu içine numune tutucu yerleştirin. bir kap olarak pipet ucu kullanın ve bitki bulunduğu numune tutucu bir ucuna dikkatlice kaydırın. </li><li> Bir pipet kutusunda numune tutucu koymak ve gerekirse daha fazla bitki hazırlamak. Bitkiler doğrultularda olabilirtly görüntülü veya büyüme inkübatör geri koymak. </li></ol> 3. Mikroskop kurma NOT: LED aydınlatma sistemi özel olarak oluşturulmuş lamba olduğunu. LED-ring oluşturmak için gerekli teknik detaylar Şekil 3 ve malzeme listesinde bulunabilir. Yönetim Kurulu tasarımı için ek malzeme dosyası (Supplemental_File _-_ LED_Ring_Board.brd) bakın. <ol><li> Vida veya tutkal (örneğin çift taraflı bant) OpenSPIM x / y / z / θ aşamalı kolunun alt tarafında LED halka. </li><li> ayarlanabilir bir güç kaynağı (0-30 V, maksimum 2 A) LED halka bağlayın. </li><li> İstenilen ışık yoğunluğu gerilim ayarlayın (Arabidopsis, 120-140 mmol / m 2 / s Şekil 3D için). </li><li> % 70 etanol ile Örnek odacığının sterilize ve steril su ile yıkayın. </li><li> benzin ve lens temizleme dokusu ile objektif lens temizleyin. % 70 etanol ile objektif lens sterilize edin. </li><li> perfusi bağlayıntek yönlü bir düzenlemesi örnek odasına borular üzerinde. Bir sonraki peristaltik perfüzyon pompa taze ½ MS orta ve başka boş şişeyi içeren 1 L şişe koyun. bir perfüzyon tüpü kullanılarak örnek odasının alt girişi ile orta şişeyi bağlayın. Başka bir perfüzyon tüp kullanılarak kullanılan orta çöp boş şişe numune odasının üst çıkışını bağlayın. </li><li> 1 ml / dk akış hızını ayarlamak. Not: Örnek odası Overspill olup için, akışından daha yüksek bir çıkış olması önemlidir. Her iki pompalama hızını arttırmak ya da çıkış için daha geniş bir iç çapa sahip bir tüp kullanın. </li><li> % 70 etanol ile yıkayın ve su yüzeyinden örnek bölmesine yerleştirmeden önce kurumaya bırakın, 3 mm&#39;lik küçük kareler halinde siyah plastik folyoyu kesin. </li><li> numune tutucu gelen pipet ucu çıkarın ve örnek odasındaki numune tutucu takın. yeni üretilen numune tutucu sahne koluna uymuyorsa, bir ince kum kullanmakKağıt daha ince yapmak veya çok ince olması durumunda bir O-ring (∅ 6 mm) kullanın. </li><li> kapakları oluşturmak için, iki adet 50 x 25 mm parçalar halinde siyah alüminyum folyo kesti. her bir parçanın bir tarafta orta kesim 5 mm yapın. Bir üçgen girinti (Şekil 1D) oluşturmak için katlayın. Numune tutucu bakan üçgen çentikler ile örnek odasının üstünde kapakları koyarak iki kapaklı numune odasına kapatın. Bitki yaprakları kapak gölgede olmadığından emin olun ve ışıklandırma sistemi ışık alır. </li><li> görüş alanında yükselen bir yanal kök yerleştirmek için X / Y / Z ve rotasyon sahne kullanarak ilgi bölgeyi bulun. </li><li> Kayıttan önce, sistem en az 15 dakika boyunca dengeye gelmesi sağlar. </li><li> Kur görüntü elde etme. <ol><li> 3 um z aralığı (650 um) ile birlikte 217 bir görüntü yığını ayarlamak ve 17 saatlik bir toplam süre 15 dakika için görüntüleme aralıklarla geçen süreyi ayarlayın. NOT: A ayrıntılı belgelerOpenSPIM yazılım bulunabilir nasıl işletmek (http://openspim.org/Acquisition#Acquiring_a_Stack). </li></ol></li><li> Kayda başla. </li></ol>

<ol>
	<li>Grossmann, G., Guo, W. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RootChip:+an+integrated+microfluidic+chip+for+plant+science.">The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science.</a> Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).</li><li>Busch, W., Moore, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+and+computational+platform+for+high-throughput+live+imaging+of+gene+expression.">A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression.</a> Nat Methods. 9 (11), 1101-1106 (2012).</li><li>Calder, G., Hindle, C., Chan, J., Shaw, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+imaging+chamber+for+viewing+living+plant+cells+and+tissues+at+high+resolution+for+extended+periods.">An optical imaging chamber for viewing living plant cells and tissues at high resolution for extended periods.</a> Plant Methods. 11 (1), 22 (2015).</li><li>Dixit, R., Cyr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+damage+and+reactive+oxygen+species+production+induced+by+fluorescence+microscopy:+effect+on+mitosis+and+guidelines+for+non-invasive+fluorescence+microscopy.">Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy.</a> Plant J. 36 (2), 280-290 (2003).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Sectioning+Deep+Inside+Live+Embryos+by+Selective+Plane+Illumination+Microscopy.">Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+Zebrafish+Early+Embryonic+Development+by+Scanned+Light+Sheet+Microscopy.">Reconstruction of Zebrafish Early Embryonic Development by Scanned Light Sheet Microscopy.</a> Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).</li><li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-contrast+imaging+of+animal+development+with+scanned+light+sheet-based+structured-illumination+microscopy.">high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy.</a> Nat Methods. 7 (8), 637-642 (2010).</li><li>H&#246;ckendorf, B., Thumberger, T., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+of+Embryogenesis:+A+Perspective+for+Light+Sheet+Microscopy.">Quantitative Analysis of Embryogenesis: A Perspective for Light Sheet Microscopy.</a> Dev Cell. 23 (6), 1111-1120 (2012).</li><li>Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+quantitative+biology.">Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology.</a> Nat Methods. 12 (1), 23-26 (2015).</li><li>Maizel, A., Von Wangenheim, D., Federici, F., Haseloff, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+live+imaging+of+plant+growth+in+near+physiological+bright+conditions+using+light+sheet+fluorescence+microscopy.">High-resolution live imaging of plant growth in near physiological bright conditions using light sheet fluorescence microscopy.</a> Plant J. 68 (2), 377-385 (2011).</li><li>Sena, G., Frentz, Z., Birnbaum, K. D., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+Cellular+Dynamics+in+Growing+Arabidopsis+Roots+with+Light+Sheet+Microscopy.">Quantitation of Cellular Dynamics in Growing Arabidopsis Roots with Light Sheet Microscopy.</a> PLoS ONE. 6 (6), e21303 (2011).</li><li>Costa, A., Candeo, A., Fieramonti, L., Valentini, G., Bassi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Dynamics+in+Root+Cells+of+Arabidopsis+thaliana+Visualized+with+Selective+Plane+Illumination+Microscopy.">Calcium Dynamics in Root Cells of Arabidopsis thaliana Visualized with Selective Plane Illumination Microscopy.</a> PLoS ONE. 8 (10), (2013).</li><li>&#352;amajov&#225;, O., Tak&#225;&#269;, T., von Wangenheim, D., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+methods+and+techniques+to+study+endocytosis+in+plants.">Update on methods and techniques to study endocytosis in plants.</a> Endocytosis in Plants. , 1-36 (2012).</li><li>Rosquete, M. R., Von Wangenheim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+auxin+transport+mechanism+restricts+positive+orthogravitropism+in+lateral+roots.">An auxin transport mechanism restricts positive orthogravitropism in lateral roots.</a> Curr Biol. 23 (9), 817-822 (2013).</li><li>Lucas, M., Kenobi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+root+morphogenesis+is+dependent+on+the+mechanical+properties+of+the+overlaying+tissues.">Lateral root morphogenesis is dependent on the mechanical properties of the overlaying tissues.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (13), 5229-5234 (2013).</li><li>Vermeer, J., von Wangenheim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Spatial+Accommodation+by+Neighboring+Cells+Is+Required+for+Organ+Initiation+in+Arabidopsis.">A Spatial Accommodation by Neighboring Cells Is Required for Organ Initiation in Arabidopsis.</a> Science. 343 (6167), 178-183 (2014).</li><li>Von Wangenheim, D., Daum, G., Lohmann, J. U., Stelzer, E. H. K., Maizel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Arabidopsis+Development.">Live Imaging of Arabidopsis Development.</a> Arabidopsis Protocols. 1062, 539-550 (2014).</li><li>Berson, T., von Wangenheim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-Golgi+network+localized+small+GTPase+RabA1d+is+involved+in+cell+plate+formation+and+oscillatory+root+hair+growth.">Trans-Golgi network localized small GTPase RabA1d is involved in cell plate formation and oscillatory root hair growth.</a> BMC Plant Biol. 14 (1), 252 (2014).</li><li>Langhans, M., Meckel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+detection+and+tracking+in+plants.">Single-molecule detection and tracking in plants.</a> Protoplasma. 251 (2), 277-291 (2014).</li><li>Novak, D., Kucharova, A., Ovecka, M., Komis, G., Samaj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+nuclear+localization+and+quantification+of+GFP-tagged+EB1c+in+Arabidopsis+root+using+light-sheet+microscopy.">Developmental nuclear localization and quantification of GFP-tagged EB1c in Arabidopsis root using light-sheet microscopy.</a> Front Plant Sci. 6, (2015).</li><li>Von Wangenheim, D., Fangerau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rules+and+Self-Organizing+Properties+of+Post-embryonic+Plant+Organ+Cell+Division+Patterns.">Rules and Self-Organizing Properties of Post-embryonic Plant Organ Cell Division Patterns.</a> Curr Biol. 26 (4), 439-449 (2016).</li><li>Berthet, B., Maizel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+microscopy+and+live+imaging+of+plants.">Light sheet microscopy and live imaging of plants.</a> J Microsc. , (2016).</li><li>Pitrone, P. G., Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OpenSPIM:+an+open-access+light-sheet+microscopy+platform.">OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform.</a> Nat Methods. 10 (7), 598-599 (2013).</li><li>de Luis Balaguer, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-sample+Arabidopsis+Growth+and+Imaging+Chamber+(MAGIC)+for+long+term+imaging+in+the+ZEISS+Lightsheet+Z.1.">Multi-sample Arabidopsis Growth and Imaging Chamber (MAGIC) for long term imaging in the ZEISS Lightsheet Z.1.</a> Dev Biol. 419 (1), (2016).</li><li>Ove&#269;ka, M., Va&#353;kebov&#225;, L., Komis, G., Luptov&#269;iak, I., Smertenko, A., &#352;amaj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+plants+for+developmental+and+cellular+imaging+by+light-sheet+microscopy.">Preparation of plants for developmental and cellular imaging by light-sheet microscopy.</a> Nat Protoc. 10 (8), 1234-1247 (2015).</li><li>Yokawa, K., Kagenishi, T., Kawano, T., Mancuso, S., Balu&#353;ka, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illumination+of+Arabidopsis+roots+induces+immediate+burst+of+ROS+production.">Illumination of Arabidopsis roots induces immediate burst of ROS production.</a> Plant Signal Behav. 6 (10), 1460-1464 (2011).</li><li>Silva-Navas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D-Root:+a+system+for+cultivating+plants+with+the+roots+in+darkness+or+under+different+light+conditions.">D-Root: a system for cultivating plants with the roots in darkness or under different light conditions.</a> Plant J. 84 (1), 244-255 (2015).</li><li>Aoyama, T., Chua, N. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glucocorticoid-mediated+transcriptional+induction+system+in+transgenic+plants.">A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants.</a> Plant J. 11 (3), 605-612 (1997).</li><li>Brand, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+and+reliable+two-component+system+for+tissue-specific+gene+induction+in+Arabidopsis.">A versatile and reliable two-component system for tissue-specific gene induction in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 141 (4), 1194-1204 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Işık Sac Flüoresan Mikroskobu düşük fototoksisite ve fizyolojik durumda örnek tutarken yüksek uzamsal-zamansal çözünürlüğe sahip büyük bir hacmi yakalamak için kullanılabilecek ultra hızlı alım hızı, birleştirmek için büyük bir avantaja sahiptir. Işık levha mikroskobu çözünürlüğü konfokal mikroskop 9 ile karşılaştırıldığında edilebilir. Ancak, ışık saçılması ve emme bireysel uyarma ve emisyon yol boyunca meydana gelir ve genel görüntü kalitesi yüzeyine göre opak dokuların içinde önemli ölçüde daha düşük olabilir. Bu komplikasyonu aşmak için bir dikey eksen boyunca örnek döndürmek ve farklı yönlere aynı hacmi gözleyin imkanı kullanabilirsiniz. Ama bu, örneğin yan kökler daha fazla bilgi almadan düşük görüntü kalitesiyle sonuçlanacaktır arkasından kök ve görüntüleme bir tarafta ortaya, her zaman avantajlı değildir. Bununla birlikte, dönme esas SAMP konumlandırmak için kullanılabilmektediren iyi şekilde le. objektifler klasik yatay düzenlemesi örnek montaj yeni yollar sağlar. Bitkiler, bir dikey konumdan yarar. Montaj yöntemi &quot;ifadesi, jel yüzeyi üzerindeki&quot;, burada sunulan bir jel 24,25 iç kök gömme kütlesi olarak diğer montaj yöntemlerine göre birçok avantajı vardır. 1) kök sistemi sıvı ortam ile doğrudan temas halindedir. örnek odası sürekli taze ortam sağlayan bir perfüzyon sistemine bağlanır. Aynı zamanda, hızlı bir şekilde, farklı ortam veya ilaç uygulamak için örnek odasının tüm hacmi değiştirmek için kullanılabilir. Onlar laboratuvarlarda büyümek için kullanılan olarak 2) Önceki hazırlık bitkilerin büyüdüğü örnek. Bitkiler flöresanlı bir mikroskop altında seçilebilir ve sadece arzu edilen bitkiler elde edilmesi gerekir. 3) bitki basılmadan numune tutucu Petri kabı aktarılır. Böylece bitki ayrıca, büyüme incubato üzerinde büyüyen aynı jel üzerinde gelişebilirR ve mekanik gerilim minimuma indirilir. 4) numune görünümü engelsiz ve numune ve algılama hedefi arasındaki boşluk sadece orta ve kırılma indeksleri farklı olan başka malzemeler ile doldurulur çünkü optik sapmaları en aza indirilir. Uzun süreli görüntüleme gerçekleştirmek için, bitki aydınlatma sistemi bitkinin fotosentezik aktivitesi sağlamak için gereklidir. Laboratuarların çoğunda bitkileri, şeffaf bir jeli üzerinde büyümeye kökleri ışığa maruz yani. Bu çevrelerine farklı tepkiler neden olur ve bunların biyokimya ve geliştirme 26,27 değişikliğe sebep olabilir. Kök sistemi üzerindeki ışık miktarını azaltmak amacıyla, siyah plastik folyo, su yüzeyini yanı sıra siyah alüminyum folyodan yapılmış kapak örneği odasını kapalı kapak kullanıldı. bitki ulaşabilir ışık kapağının ortasındaki delikten bırakır. Bu kurulumda, arka plan ışığı bir artış, suggestin gözlenmiştirKırmızı ve mavi LED&#39;ler gelen kaçak ışık miktarı önemli ölçüde GFP filtresi ve gölgeleme yaklaşımları azalmıştır g. Bu kamera arka plan gürültüsünü artırmadan görüntü alımı sırasında açık ışığı tutarak izin verdi. numune tutucu 3D baskı için tasarlanmıştır. Ancak, seçim malzemesi isimli önemli gibi çeşitli plastik yönündeydi test edildi% 100 stabil, Oluşan bir sürüklenme içinde örnek. Bu nedenle, bunun yerine reçine kullanılabilir veya bir polietilen (PEP) çubuk öğütülmesiyle numune tutucu oluşturmak için tavsiye edilir. çift ​​taraflı aydınlatma sistemi ile hafif levha mikroskobu kurulumu kullanırken numune tutucusu dönme açısına bağlı ışık yaprak biriyle etkileyebilir. plakadan bitki sıvı çekme sırasında mekanik stresi azaltmak için, spatula düz açı kullanılır. bitki hızla kurumasına ve ilk defa tecrübe hava akımı olabilir. wo, herhangi bir hava taslağı (hızlı hareketler, air-condition akışı) önlemek için deneyinMümkün rk kesintisiz ve 1000 mcL pipetlemeyin ucu içine örnek yuvasını kaydırın. mikroskop İçinde, sıvı bütün bitki daldırma ve kuru yaprakları tutmak için çok önemlidir. teknik yanal kök oluşumunun erken aşamalarında görüntüleme için idealdir. olgun kök uçları uzun vadeli görüntüleme yaparken bir Arabidopsis kökleri görüş alanının dışında hızla 100-300 mm / h ile büyümek olduğunu akılda tutmak gerekir. Çok kullanışlı bir gelecekte uygulama süresi uzun süreler boyunca aşağıdaki kök ucu büyümesini sağlayacak bir otomatik izleme algoritması, olabilir. satın alma işlemi sırasında bu tür ışık ve ortamın besin kompozisyonu olarak çevresel koşulları kontrol etme yeteneği bitkiler değişimlere uyum nasıl araştırıyor sağlar. Kök 28 uyarılabilir deksametazon veya β-Estr kullanılarak, örneğin, kimyasal olarak gen ekspresyonu aktive etmek için ilaç uygulamak için kullanılabilecek sıvı bir ortam ile doğrudan temas halinde olanuyanlabilir sistem 29 adiol. Bununla birlikte, bir ilaç yıkamak için numune odasının tüm hacmi değiştirmek için zaman alır. Kurulum ortam değişikliği hızlandırmak için numune odasının hacminin en aza düşürülmesiyle iyileştirilebilir. Bununla birlikte, bu teknik büyük bir potansiyele sahiptir. montaj prosedürü, standart yetiştirme koşulları ve ışık sayfalık mikroskobu kullanılarak yumuşak görüntü elde kombinasyonu fizyolojik düzeyde yüksek çözünürlüklü bitki gelişiminin uzun vadeli çalışmalar sağlar. Bu bitki gelişiminin temel mekanizmaları keşfetmek için araştırmacıların yardımcı olacaktır.

tek hücre organ farklılaşması ve büyüme sırasında nasıl davrandığını anlamak bitki gelişiminde önemli sorulardan biridir. İdeal olarak, gen ekspresyonu ve hücre içi protein lokalizasyonu gibi hücresel olaylar, doku daha geniş bir bağlamda ışığında görülebilir. Bu amaç, teknik zorluklar teşkil ve yüksek uzaysal ile tüm organ gözlem yanı sıra fotoğraf-toksisite etkilere neden olabilir zaman uzun süreli, aşırı zamansal çözünürlüğü gerektirir. bitkiler hızla çevresel değişimlere uyum beri, yetişme koşulları sıkı kontrol edilmelidir. bitkinin fizyolojik durumu ile müdahale etmeden uzun vadeli görüntüleme yapmak için, üç şey numune odasında, 1) büyüme koşulları sağlanmalıdır var, 2) istikrarlı uzun süre boyunca montaj örnek, ve 3) görüntüleme düşük ışık şiddetleri ile foto-hasar ve non-fizyolojik koşulları önlemek için. Fizyolojik büyüyen Conditimikroskop numune odasında ons uzun vadeli deneyler için çok önemlidir. 3 - konfokal mikroskoplar 1 görüntüleme büyüme odaları açıklayan mevcut protokoller vardır. Ancak, konfokal mikroskopi stres yanıtları neden olabilir bitki, yüksek ışık yoğunluğu tanıtır ve genellikle 4 büyümesini engeller. Buna ek olarak, en geleneksel mikroskoplar kendilerini yeniden yönlendirmek ve ağırlık vektörü doğru büyümeye deneyin beri bitkiler için optimal değildir numune, sadece yatay konumlandırma izin verir. 9 - Son on yılda, ışık sayfalık mikroskobu birkaç gün 5 varan süreler için hücresel çözünürlükte büyük örneklerin gelişimini yakalamak için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Işık sayfalık mikroskobu dikey numune konumlandırma izin verir ve giderek kök gelişimi 10 okuyan bitki araştırmalarında kullanılan - Son zamanlarda Berthe tarafından gözden 21,t Maizel 22. Söz konusu çalışmaların 10,13 birçoğu - 18,21 optimize edilmiş ve örnek özel bir şekilde kullanan Ernst HK Stelzer laboratuarında gerçekleştirilmiştir bir jel 17 yüzeyindeki kök büyüyen karakterize montaj. Bu çalışmalarda, ısmarlama bir mikroskop burada bitki alt tutulur kullanılmıştır. Buna karşılık, genel olarak mevcut ışık sayfalık mikroskopları çoğunluğu üst örnek tutun. Bu nedenle, bu örnekte görülen yöntem hali hazırda uygulanamaz. Burada sunulan yöntem OpenSPIM 23, uygulanması ve Seçici Düzlem Aydınlatma Mikroskobu (SPIM) artırılması için açık erişim platformu için geçerli köklü üzerinde yüzeye montaj yöntemi için bir protokol sağlar. Bu protokolün genel amacı OpenSPIM ışık sayfalık mikroskop Arabidopsis kökleri uzun vadeli görüntüleme sağlamaktır. Bu s dik bir bitkinin yetiştirilmesi gerçekleştirilirbir sıvı ortam içinde kökleri ile bir jel, sert bir yaprak havada kalmaya devam ederler. Bitkinin fotosentezik aktivitesi sağlamak için, ısmarlama bir aydınlatma sistemi yaprakları, kökleri etkilememektedir (Şekil 1) yanar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Agarose, low melting</td>
			<td >VWR</td>
			<td >AFFY3282125GM</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Black aluminum foil</td>
			<td >Thorlabs</td>
			<td >BKF12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Black plastic foil</td>
			<td >Carl Roth</td>
			<td >HT83.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LED blue (453 nm)</td>
			<td >OSRAM</td>
			<td >LD&#160;CN5M-1R1S-35-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LED red (625 nm)</td>
			<td >OSRAM</td>
			<td >LR T66F-ABBB-1-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LED board - PCB design software</td>
			<td >Cadsoft Eagle</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MES monohydrate</td>
			<td >Duchefa</td>
			<td >M1503.0100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropore Surgical Tape</td>
			<td >3M</td>
			<td >1530-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Murashige &#38; Skoog Medium (MS-Medium)</td>
			<td >Duchefa</td>
			<td >M0221</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phytagel&#160;</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >P8169</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sample holder 3D print</td>
			<td>i.materialise</td>
			<td ><a href="https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1">https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Square petri dishes (245x245x25 mm)</td>
			<td >VWR</td>
			<td >734-2179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sucrose</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >84097-1KG</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light sheet fluorescence microscopy of plant roots growing on the surface of a gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

Işık sayfalık mikroskobu (Şekil 1) ile kök sistemi izlerken Bu numune hazırlama yöntemi mikroskop numune haznesi içerisindeki bitki ekimi sağlar. Bitki, özel tasarlanmış örnek tutucu (Şekil 2) üzerine monte edilen jel (½% 1.5 jellan zamkı içeren MS ortamı) bir tabaka yüzeyi üzerinde büyür. numune tutucu 3D malzemesi olarak şeffaf bir reçine kullanılarak basılır olduğunu. Boyutları vurgulayan bir imal versiyonu Şekil 2C&#39;de gösterilmektedir. kökler sürekli perfüzyon sistemi ile yenilenir sıvı (½ MS ortamı) daldırılır. Yaprakları havada kalır ve sürekli / bitki (Şekil 1A, B ve Şekil 3A-C) üzerinde bir halka halinde düzenlenmiş mavi ve kırmızı LED&#39;ler gelen s 130 mol / m² ışık yoğunluğu ile aydınlatılmaktadır. LED halka bizim makine atölyemizde imal edilmektedir veBiz Şekil 3 ve malzeme listesinde LED-ring nasıl oluşturulacağı konusunda teknik ayrıntıları. Işık yoğunluğu sürekli 30-250 umol / m2 / s (Şekil 3B) arasında değişen ayarlanabilir. Kök sistemi, su yüzeyini kaplayan siyah plastik folyo küçük yaprak (Şekil 1) gölgeli. Algılama lens tarafından toplanır aydınlatma herhangi bir kaçak ışık GFP filtresi (Şekil 3E) tarafından filtre edilir. Bu ayar ile, büyüyen bir Arabidopsis yanal kökü bir zaman atlamalı bir 20X / 0.5 lensi (Şekil 4) kullanılarak 17 saat süreyle kaydedildi. yan kök birincil kökü derinlerde bulunduğu perisiklden hücre tabakası, aslına vardır. uzun süreli dönemler için, bir doku içinde daha derin bir görüntüleme yeteneklerini göstermek için, daha yüksek bir büyütme (40X / 0.75) bir yanal ro oluşumunu çekmek için kullanılanot Birinci aşama primordiumunun gelen kadar 38 saat (Şekil 5) bir süre içinde birincil kök dışarı çıkması. Veri kümesinin bir örnek teşkil eden bir 2D dilim Şekil l&#39;de gösterilmiştir. 5B. Bu kayıt hücresel çözünürlüğe sahip 3D (Şekil 5A) lateral kök oluşumu dinamiklerini takip etmemizi sağlar. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig1.jpg" /> Şekil 1: OpenSPIM örnek odasının içine koşulları Büyüyen. A) görüntüleme odasının Sketch. Bitki jel yüzeyi üzerindeki dik büyümektedir, (bakınız Şekil 2), özel bir dahili numune tutucu üzerine yerleştirildi. kökler sürekli perfüzyon sistemi ile değiştirilen bir sıvı ortam içinde büyümektedir. Bitki havada büyür ve kırmızı ve mavi LED (ayrıca bakınız Şekil 3) tarafından aydınlatılır bırakır. Kök sistemi zekâ gölgeli<html> Su yüzeyi kaplayan siyah plastik folyo h küçük levhalar. siyah alüminyum folyo iki parçadan oluşan bir kapak ayrıca su yüzeyinin altında ışık miktarını azaltır ve numune odasına nem tutar. Sağdaki büyütülmüş paneli likit ortamına daldırılmış jel bloğun yüzeyi üzerinde büyüyen bitki vurgular. agaroz bir damla jel üzerine kök bağlar. kesik kutu mikroskop tarafından gözlemlenen faiz bölgeyi gösterir. Kapaksız görüntüleme odasının (B) Fotoğraf). Sayılar (1) - (10) A ve B temsil etmektedir: (1): LED halka x / y / z / θ kademeli, (2): örnek tutucu (3): kapak (4): Arabidopsis thaliana (5): perfüzyon sistemi, (7): algılama objektif lens, (8): sıvı ortam, (9): örnek odası, (10): aydınlatma objektif lens siyah plastik folyo, (6) yaprak. C) kapak siyah alüminyum folyo iki parçadan oluşmaktadır.<html> target = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig2.jpg" /> Şekil 2: numune tutucu. A) 3 boyutlu modeli. 3D veri dosyası ek malzemenin sağlanır. Saydam akrilik plastikler (4) ve (5): Reçine (6): şeffaf bir reçine (3) - (1) farklı malzemeler kullanılarak 3D baskı B) fotoğrafı. C) numune tutucu Teknik çizim, rakamlar milimetre temsil etmektedir. Bir bitki ile üretilen numune tutucu D) Fotoğraf monte edilebilir. kesik alan mikroskopla görülebilir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <html> / 55044 / 55044fig3.jpg &quot;upload /&gt; Şekil 3: Bitki aydınlatma ayarı. Lambanın A) şematik diyagramı. LED&#39;lerin çiftleri yönlü yıldırım için ayrı ayrı açma / kapama açılabilir. LED: ışık yayan diyot, R: direnç, T: transistör, JP: pinhead. Baskılı devre kartı): B) aydınlatma lambası nihai tasarım bir PCB yazılımı (PCB kullanılarak çekildi. Biz ek malzemenin devre tasarımı dosyası sağlar. Yönetim Kurulu daha sonra üretilen ve bizim enstitünün MIBA makine dükkanında toplandı. LED halkasının C) Fotoğraf açık. Kırmızı ve mavi LED dört çift bir halka olarak düzenlenmiştir. D) voltaj aralığı 3,5 V ve 14,0 V Direnişleri arasında ayarlanabilir 30-250 umol / m arasında değişen ışık miktarını ulaşmak için kullanılan 2 / s (R1-8: 220 Ohm, R9-12: 1220 Ohm ). E) lamba, GFP ve YFP emisyon spektrumu.<html> tp: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55044/55044fig4.jpg" /> Şekil 4: Arabidopsis Zaman atlamalı kayıt thaliana yan kök. 5 gün eski fide bir membran işaretleyici (pUBQ10 :: YFP Pip1 4) ifade ve nükleer muhabir (pGATA23 :: nls-GUS-GFP) özel bir yanal kök içine geliştirmek hücrelerin perisiklden işaretleme. 217 görüntü (3 mikron z-boşluk) bir yığın 20X / 0.5 lens kullanarak 17 saat kayıt için her 15 dakikada yakalandı. A) 69 üzerinden dört kez noktaları maksimum yoğunluk projeksiyonu gösterilmiştir. B) bir zaman noktasında z-yığınının Altı 217 üzerinden tek dilim gösterilir. A ve B Ölçek çubukları 100 um temsil etmektedir.yük / 55044 / 55044fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/55044/55044fig5.jpg" /> Şekil 5: Arabidopsis Zaman atlamalı kayıt thaliana yan kök. 6 gün eski fide bir membran işaretleyici (pUBQ10 :: YFP Pip1 4) ifade ve nükleer muhabir (pGATA23 :: nls-GUS-GFP) özel bir yanal kök içine geliştirmek hücrelerin perisiklden işaretleme. 200 görüntü (1.5 mikron z-boşluk) bir yığın 40X / 0.75 lens kullanarak 38 saat kayıt için her 15 dakikada yakalandı. A) Dört zaman noktalarının 3D render, ızgara numaraları, ana kök merkez düzlemi boyunca um, B) Tek dilim temsil etmektedir. Ölçek çubuğu 50 uM temsil eder. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig5large.jpg" target="_blank">Lütfen</a>Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın. Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl. 3D model dosyası sağlanır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/Supplemental_File-3D_Sample_Holder.stl" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.</a> Company Dosya Halka Board.brd LED. devre tasarımı dosyası sağlanır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/Supplemental_File-LED_Ring_Board.brd" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel at JoVE.com

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

Bir Gel Yüzeyinde Büyüyen Bitki kökleri Işık Sac Flüoresan Mikroskopi

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

light-sheet-fluorescence-microscopy-plant-roots-growing-on-surface

Research

JoVE Journal

Biology

14.6K Görüntüleme.  Institute of Science and Technology Austria. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

Video: Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Biyoloji

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

Floresans-mikroskopi Tarama ve nesil Sekanslama: organel Bütünlüğü ile ilgilendim Genlerin belirlenmesi için Faydalı Araçlar

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

Konak Bitki uçucu için bir tarama aracı olarak Electroantennographic Biyoassay

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

Bitki damarları ve Üç Boyutlu Yapı ve Fonksiyon Visualize&#39;a Yüksek Çözünürlüklü Bilgisayarlı Tomografi Kullanımı

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is particularly suited for long-term time-lapse imaging over many hours up to several days. However, an appropriate sample mounting strategy is needed that offers both confinement and normal development of the sample. Multilayer mounting, a new embedding technique using low-concentration agarose in optically clear tubes, now overcomes this limitation and unleashes the full potential of light sheet microscopy for real-time developmental biology.

The development of zebrafish can be followed over days with light sheet microscopy when embryos are embedded in optically clear polymer tubes with low-concentration agarose.

Çok katmanlı Zebra balığı uzun vadeli Işık Sayfalık Mikroskopi için Montaj

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

Değişken açılı Epifloresans Mikroskopi ile Bitki Hücre Yüzey Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

Domates Tüylü Roots Üretimi ile yüksek verim CRISPR Vektör İnşaat ve DNA Değişiklikler Karakterizasyonu

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Floresan Mikroskopi ile Stromule Frekansı görselleştirme

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...