The authors thank Masaki Yoda and Elise Lamar for critical reading of the manuscript, Kazumasa Takenouchi for help with histology, Mari Fujiwara for help with microscopy and Makoto Morikawa for help in photographing human and mouse auditory ossicles.

Bu çalışmada yapılan tüm hayvan prosedürleri Keio Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan (IACUC - onay numarası: 09221) ve araştırma hayvanların kullanımı için Keio Üniversitesi&#39;nde Hayvan Deneyleri üzerinde Kurumsal Yönergeleri izleyin. İnsan örnekler Anatomi, Keio Üniversitesi Tıp Fakültesi Anabilim bağışlanan bir kadavradan izole edilmiştir ve kurumsal düzenlemelere uygun olarak kullanılmıştır. İşitsel Bulla ve Kapsül 1. İzolasyonu <ol><li> Solunum havalandırma min fazla bitene kadar izofluran veya sevofluran batırılmış kağıt havlu üzerinde bir platform içeren bir kavanoza fareler Euthanize ve sonra servikal dislokasyon gerçekleştirin. batırılmış kağıt havlu ile farelerin doğrudan temas önlemek için dikkatli olun. </li><li> boyun sırt tarafında küçük bir enine bir kesi yapmak ve kafasına doğru ayrı cilt çekin ve iki elinizi kullanarak kuyruk altında yatan boyun mu maruzSistemik lupus dokusu. </li><li> 14 cm keskin cerrahi makas kullanarak Servikal bölgede fareler başını kesmek. </li><li> tamamen burnuna doğru soyma cilt. burnu ve kesici diş ile birlikte tüm cilt kesti. </li><li> ağzına makas yerleştirin ve her iki tarafta masseter kasları kesti. </li><li> dikkatle çene açın ve birlikte dil ve alt çene çıkarın. </li><li> Midsagital düzlemde (Şekil 1A, B) boyunca ikiye keskin bir makas, split kafatası ve kafa tabanı kullanma. </li><li> forseps kullanarak, serebral ve serebellar hemisferlerin ve beyin sapı çıkarın. işitsel bül ve kapsül beyincik ve beyin sapı lateral yer almaktadır. İşitsel bül işitsel kapsül (Şekil 1C, D) daha fazla yanal olarak olduğuna dikkat edin. </li><li> Çevreleyen kafatası kemiği (Şekil 1E) ile bül ve kapsül parçalara ayır. </li><li> Oda sıcaklığında fosfat tamponlu tuz (PBS), pH 7.4 ihtiva eden bir çanak için numune aktarın. </li><li> Ubinoküler diseksiyon mikroskobu nder, bül ve kapsül (Şekil 1F) etrafında gevşetilmiş sınır kesmek için çevredeki kemikleri ve makas ayrı çekmek için forseps kullanabilir. kaldırıldı çevreleyen kemikler basioccipital (ventral sınır), exoccipital (ventro-posterior sınır), supraoccipital (arka kenar), interparietal, paryetal (dorsal sınır), skuamöz (dorso-anterior sınır), alisphenoid (anterior sınır) ve basisphenoid vardır (antero-ventral sınır) kemikleri. Östaki tüpünün 41 timpanik açılmasını destekler styliform süreci (Sp), temporal kemik stiloid farklı olduğunu unutmayın. </li></ol> Malleus, örs ve stapes: işitme kemiklerine 2. izolasyonu <ol><li> çekiç kemiği <ol><li> Kulak zarı görülebilecek şekilde küçük bir makas ve forseps hem kullanarak, (Şekil 2A, B sulkus tympanicus dış kulak yolu yanal parçası kaldırmak). </li><li> Ventral (noktalı) ve posterior (#) duvarları (Şekil 2C) malleal processus brevis (yuvarlak apofizlidir, Tartışma), hem de yakın kulak zarı ve kulak kemiğinin bir kısmını çıkarın. Malleus ve tensör timpani kas şimdi (Şekil 2B, E) açık olmalıdır. </li><li> Malleus ile stapes tabanı (Şekil 2F) kaldırın ve bir 27 G iğne (Şekil 2G) eğimli kenarı tensör timpani kas kesti. diğer memelilerde görüldüğü gibi malleal manubrium sıkıca timpanik membrana takılan unutmayın. </li><li> kırılgan manubrium, dikkatlice kulak zarına ayırın. Üç işitsel kemikçik ortaya çıkarmak için timpanik kemik çıkarın. </li><li> Kemikçik eklem (Şekil 2H) de inkus gelen malleus ile stapes tabanı yerinden. </li><li> goniale anterior süreci çatlatma ile malleus ile stapes tabanı izole edin. </li></ol></li><li> Incus ve Stapes <ol><li> t yalıtmakKısa crus (Şekil 3A) inkus posterior ligament keserek o incus. </li><li> 27 G iğne (Şekil 3B, C) kesik kenarı stapes yakın stapes arter keserek stapes izole edin. Gerekirse, iğne ile stapes kas sürecinde stapes kasının tendonu kesti. </li><li> stapesin obturator foramen içine dikiş iğnesine (veya işaretleme pimi) takın ve stapes yukarı kaldırın. Stapes uzaklaştırıldıktan sonra, oval pencere açıklığı açıkça görülebilir (Şekil 3D) olmalıdır. </li></ol></li></ol> İşitsel Bulla ve Kapsül 3. gömülmesi <ol><li> Parafine gömme için hazırlık <ol><li> Bölüm 1 &#39;de tarif edildiği gibi bül ve kapsül izole edin. </li><li> Makasla rahatsız bül (styliform işlemi) ön ucu kesilir, 4 ° C&#39;de PBS içinde% 4 paraformaldehid (PFA) bül ve kapsül batırmakC ve fiksatif bül içine girmesine izin verir. Hava bulla hapsolur ise, bir iğne ve şırınga ile çıkarın. Bir tüp rotator 4 ° CO / N de fiksatif bül ve kapsül bırakın. Dikkat: PFA toksik ve dikkatle ele alınmalıdır. </li><li> Bir kez PBS ile yıkayın. </li><li> % 10 etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu dihidrat 4 ° C&#39;de bir hafta kirecini bül ve kapsül (EDTA 2Na), 2 ml bir tüp içinde 100 mM Tris baz, pH 7.0. Her gün tampon değiştirin. </li><li> Bir kez PBS ile yıkayın. Numuneler 4 ° C&#39;de su içinde% 70 etanol içinde saklanır. İsteğe bağlı olarak, kademeli alkol serisi (% 30,% 50, su içinde% 70) ile,% 70 etanol aktarın. </li><li> Doku işlemcide (4x 40 ° C&#39;de her biri 1 saat), ksilen içinde açık bir etanol çözeltileri kademeli bir seri örnekleri (% 70, 2 x% 95, 3 x% 100 her biri 1 H), kurutma, ile numune sızmaya erimiş parafin mumu 42. İsteğe bağlı olarak, ticari doku clearin ile yerine ksileng çözelti (örneğin, Histo-Temizle). </li><li> işlemci örnekleri boşaltın ve onların kasetleri çıkarın. </li><li> Bir doku gömme konsol sisteminde, bir yerde erimiş parafin mumu ile dolu kalıplar içine numune. (Bölüm 4) gömme geçin. </li></ol></li><li> (Kawamoto film yöntemiyle) dondurulmuş blokların gömme için hazırlık 43 <ol><li> Bölüm 1 &#39;de tarif edildiği gibi bül ve kapsül izole edin. </li><li> makası ile bül (styliform işlemi) ön ucu kesilir, 4 ° C &#39;de (antijenikliği korumak için% 2 ya da% 1 PFA yerine PBS içinde% 4) sabitleştirici bül ve kapsül bırakın. Hava bulla kaldıysa, bir iğne ve şırınga kullanılarak çıkarın. Bir tüp rotator 4 ° CO / N de fiksatif bül ve kapsül bırakın. </li><li> PBS hızla bül ve kapsül yıkayın ve hemen 4 ° C&#39;de sıvı cryo-gömme bileşik batırın. </li><li> Önemli: hava kabarcıklarını çıkarın eğer ortada herhangi birve bir iğne ile, ve forseps ile gömme bileşiğin eklenmesi ile aspirasyon yoluyla dış kulak. (Bölüm 4) gömme geçin. </li></ol></li></ol> 4. Numune Oryantasyon ve katıştırma Not: Bütün bül ve kapsül arzu edilen bölümleri kesmek için gömme boyunca belirli bir yönde düzenlenmiş olması gerekir. aşağıda belirtilen prosedürler bölümüne, çeşitli yönlerde malleus ile stapes tabanı kullanılmaktadır. <ol><li> Malleusun Boyuna (Parasagital) kesit <ol><li> Sıcak parafin (veya cryo gömme bileşik) aşağı bül veya dış kulak yolu lateral tarafını koyun. Malleusun boyun ve enine lamina gömme çanak (- C Şekil 4A) yatay altına paralel olacak şekilde yönlendirmeyi ayarlayın. Timpanik membran fare kafasının (Şekil 4A&#39;da dikey yaklaşık 30 ° &#39;lik bir açı ile eğimli dikkat edin; Şekil 59 Kampen <sup&gt; 44). </li></ol></li><li> Malleusun Yatay kesit <ol><li> Sıcak parafin (veya cryo gömme bileşik) yatay dorsal tepe yerleştirin. Malleusun boyun ve enine lamina gömme kabı (- F Şekil 4D) tabanına dik olacak şekilde bül ve kapsülün yönünü ayarlar. </li></ol></li><li> Manubrium ve kulak zarı 5 frontal kesit (kesitler) <ol><li> Bu gömme tabağın tabanına dik olacak şekilde sıcak bir parafin (veya kriyo-gömme bileşim) &#39;de malleal manubrium yerleştirin. </li></ol></li><li> Bir doku gömme konsol sistemi üzerinde parafin sertleşmesine uygun sıcaklıklara blok soğumasını (alternatif, kuru buz / hekzan banyosunda cryo gömme bileşik kullanın). </li><li> Süreç doku blok ve rutin prosedürler kullanılarak kesilmiş bölümleri. hematoksilen ve eozin (H &amp; # ile örneğin, leke parafin kesitleri38 E), safranin O (kıkırdak için) veya osteoklastlar için tartarata dirençli asit fosfataz (TRAP) aktivitesi () 3 veya imünohistokimya ile. Undekalsifiye cryosections kemik fluorochromes 14 kullanılarak etiketleme, kalsiyum alizarin kırmızısı boyama ve immünofloresans 42 için uygundur. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada, doğum sonrası farelerde işitsel bül ve kapsül izole etmek için kullanışlı bir yöntem mevcut. P12 önce, dokular kırılgan ve izolasyonu sırasında zarar görebilir. P12 sonra, işitsel bül ve kapsül kolay çevre dokulardan izole edilebilir. kesit önce kafa bül Kesme pek çok avantajı vardır. İlk olarak, doğum sonrası kavitasyon ve işitsel bül büyüme en aktif itibaren P6 meydana gelir ve P14 50 tarafından tamamlandı. kulak zarı ve koklear duvar arasındaki mezenkimal doku kavitasyon sürecinde hava ile değiştirilir. orta kulak boşluğunda bileşke hava fiksasyon, yumuşatma ve gömme sırasında doku ve sıvılar arasındaki teması engelleyebilir. Ön uç (styliform sürecini) keserek yerine unisolated bül bunu yapmak çalışarak izole işitsel bül havayı çıkarmak için daha kolaydır. İkinci olarak, malleus (ve kulak zarı) yönünü dikey değilKafada. Bu, belirli bir yönde izole işitsel bül ve kapsül gömerek istenilen düzlemde malleus ile stapes tabanı bölümünde bu nedenle kolaydır. izole sonra, işitsel bül ve kapsüller çeşitli analizler için de yararlıdır. Örneğin, yüksek çözünürlüklü X-ışını mikro-BT gibi malleus 14 osteojenik kılcal damarlar gibi kemik mikro morfoloji ortaya çıkarabilir. Stereofluorescence diseksiyon mikroskobu, orta veya iç kulak 33 floresan proteinleri ifade muhabiri fareler değerlendirmede yapıları görselleştirmek için güçlü bir araçtır. Buna ek olarak, in vivo veya ex vivo olarak floresans etiketleme yöntemleri ve bütün montaj immünofloresan algılama çeşitli üstlenilebilir. Işık levha floresan mikroskobu da üç boyutlu analiz 51 için yararlıdır. Burada açıklanmamış olmasına rağmen, çeşitli anatomik yapıları, periferal sinirler, kan damarları gibi işitsel bül ve kapsül ile bağlantılı veOrta kulaktaki kulak zarı da bu protokolü kullanarak değerlendirilebilir. O parafin kesit mineralizasyon analizini izin vermez, bu nedenle gömmeden önce kemik dokularının dekalsifikasyon gerektirir ve unutmayın. Buna karşılık, dondurulmuş kesitler hazırlamak için kullanılan Kawamoto filmi yöntemi 43 yumuşatma gerçekleştirilir, örneğin Alizarin boyama gibi in vivo kemik etiketleme teknikleri ya da özel boyama kullanılarak mineralizasyon çalışmalar için uygun olan edilebilir. Kriyo-ayırma koşulları, fare yaşına göre göre optimize edilmelidir. Örneğin, kriyostat odası içinde bir daha soğuk ısı bölümlerine hasarı en aza indirmek için daha büyük bir fare numuneler için tavsiye edilir. Fare, malleusun önde gelen yarı küresel çıkıntı için doğru terim &quot;orbicular apophysis&quot; dir. Bununla birlikte, &quot;prosesus brevis&quot; çok fazla th yuvarlak apofize belirtmek için kullanılmaktadırÖzellikle fare gelişimsel biyologlar 16,20,22-25 arasında bir iki yıl. &quot;Prosessus brevis&quot; aslen orbicular apofizlidir farklı yanal süreç (processus lateralis), atıfta bulundu. İnsanlarda, hafif konik bir çıkıntı benzeyen bir yanal işlemi (şekil 6B, dış görünüşü görülmektedir) manubrium uzanan kulak zarı bağlanma genel hat oluşturur. Farelerde, yan işlemi, umbo 48 karşı ucunda manubrium bir tahmindir. Kulak zarının pars flaccida malleusun yanal süreç üzerindedir. Yuvarlak apofizi insan malleusun belirgin değildir.

Orta kulak üç işitsel kemikçikleri, yani malleus, incus ve stapes, kulak iç kulak zarının ya da koklea 1,2 ses iletir bir memeli özgü işitsel zinciri oluştururlar. İşitme fonksiyonu İşitsel Beyin Sapı Yanıtı (ABR) 3-6 ve Laser Doppler Vibrometry (LDV) 7 kullanılarak izlenebilir kulak zarı arkasında malleusun titreşim eşikleri ölçerek farelerde değerlendirilebilir. ABR, LDV ve otoakustik emisyon (DPOAE) ölçümleri birleştirerek, iletim tipi işitme kaybı sensorinöral bozukluğu 8 ayırt edilebilir. Kulak koşulları hayvan modelleri her yaştan hastaların refahı için işitme ve kulak sağlığı önemi göz önüne alındığında, ihtiyaç vardır. Örneğin, orta kulak iltihabı, insan bebekler ve çocuklarda ve şiddetli, akut otitis media görülen son derece yaygın bir kulak enfeksiyonu ve komplikasyonları Condi oluşabiliryon uygun antimikrobik 9 ile tedavi edilmez. Otitis media Fare modelleri patogenezini anlamak ve tedaviler 10,11 geliştirilmesinde faydalı olabilir. (Malleusun goniale kısmı hariç) endokondral kemikleşme 12,13 oluşturduğu Murin kemikçikleri, kemik metabolizması ve morfolojilerinden çalışmaya son derece alakalı. Birincisi, kendi küçük boyutlu X-ray veya floresan mikroskobu 14 kullanılarak sağlam bir periost ile kemiklerin yüksek çözünürlüklü analiz sağlar. İkincisi, bu tür kemik hücreleri 15 arasında aşırı veya yetersiz kemik erimesinin, veya bozulmuş etkileşimleri gibi anormal kemik metabolizması, kayıp 3,4,7 işitme potansiyel katılımcı olarak analiz edilebilir. Üçüncü olarak, anormal kemik parçası morfogenez gibi Hoxa2 16-19 Msx1 20-22 Prrx1 23 Goosecoid yoksun hayvanlarda gibi çeşitli gen eksikliği olan farelerde, bildirilir(GSC) 24,25, Bapx1 13 Tshz1 26 dusp6 (Mkp3) 27, Noggin (Nog), 28, FGFR1 29 farelerde tiroid hormon reseptörleri (thrA, Thrb) 5 Bcl2 30 ve diğerleri 1,31 ya da aşırı eksprese Hoxa2 32. Son olarak, kendi küçük boyutuna rağmen, yapıları kaslar 33 ve eklem 34,35 olarak Kemikcikler ile ilişkili erişilebilir. Fare kemikçikleri insan kemiklerinin daha küçük, ama fare orta kulak insan muadili bir minyatür sürümü değil dikkat çekicidir. İnsanlarda, oluşum safhasındaki stapedial arter gebelik sırasında kaybolur, oysa Örneğin farelerde, üzengi halkası geçer stapedial arter, yaşam 36 boyunca devam eder. Buna ek olarak, fare malleusun morfolojisi th farklıdıre insan kemik (Şekil 6). İnsanlarda, temporal kemik trabeküler kemiğin oluşan mastoid hava hücreleri bül 37 yerine kemikçik evler ise farelerde, işitsel (timpanik) bül, hava dolu orta kulak boşluğu kapatmaktadır. Her iki türde de işitsel kapsül (otik kapsül, kemik labirent) koklea ve iç kulak yarı dairesel kanallar kapsar. Orta kulak Karşılaştırmalı ve evrimsel biyoloji yoğun 38-40 gözden geçirilmiştir. İlk Aşağıda verilen protokol sırasıyla, öncelikle orta kulak ve iç kulak oluşan işitme bül ve kapsül, teşrih açıklamaktadır. Bu protokol aynı zamanda işitsel bül gelen malleus, incus ve stapes izole etmek için nasıl gösterir. Son olarak, işitsel kemiklerin doku kesit için hazırlık gömmek için işitsel bül ve kapsül yönlendirmek için nasıl gösterir.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Tools/Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paper towel</td><td>Daio Paper Corporation</td><td>703347</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Glass Jar</td><td>Various</td><td></td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>14 cm surgical scissors</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>91400-14</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Extra fine scissors-straight</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>14084-08</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Fine Forceps Angled 45&lt;b&gt;&amp;deg;&lt;/b&gt;</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>11063-07</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td>for routine dissection</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ18</td><td>for movies&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Injection needle 27 G</td><td>TERUMO</td><td>NN-2719S</td><td></td></tr><tr><td>Syringe (1 mL)</td><td>TERUMO</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Marking Pin</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube rotator RT-50</td><td>TAITEC</td><td>0000165-000</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050S</td><td>http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/</td></tr><tr><td>TC-65 Tungsten blade</td><td>Leica</td><td>14021626379</td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Stainless containers</td><td>Leica</td><td></td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Cryofilm type IIC</td><td>Leica</td><td></td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Silane coated slide (New Silane II)</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>511617</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>Matsunami</td><td></td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Tissue processor</td><td>Sakura Finetek</td><td>VIP-5</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Tissue Embedding Console System</td><td>Sakura Finetek</td><td>Tissue-Tek TEC 5&amp;nbsp;</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Sliding microtome for paraffin</td><td>Yamato Kohki Industrial</td><td>REM-710</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Path Blade+pro for hard tissue</td><td>Matsunami</td><td>PB3503C</td><td>for paraffin section</td></tr><tr><td>Micro-CT</td><td>RIGAKU</td><td>R_mCT2</td><td>http://www.rigaku.com/en</td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>KEYENCE</td><td>BZ-9000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Maruishi pharmaceutical Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>wako</td><td>191-01665</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>wako</td><td>285-14</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 12H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>wako</td><td>196-02835</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>wako</td><td>287-21</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA, EM Grade)</td><td>TAAB</td><td>P001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-2Na</td><td>wako</td><td>15111-45</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Super Cryoembedding Medium</td><td>Leica</td><td></td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Dry Ice</td><td>Various</td><td></td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Hexane</td><td>wako</td><td>080-03423</td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Super Cryomouting Medium type R2</td><td>Leica</td><td></td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Sakura Finetek</td><td>781001A0107</td><td></td></tr><tr><td>Histo-Clear</td><td>NDS</td><td>HS-200</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>DOJINDO</td><td>340-00433</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin&amp;nbsp;</td><td>wako</td><td>131-09665</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>wako</td><td>051-06515</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection of the auditory bulla in postnatal mice: isolation of the middle ear bones and histological analysis

En Memelilerde, malleus, inkus ve stapes olmak üzere orta kulakta işitme kemikçikleri, en küçük kemiklerdir. Farelerde, bir kemik yapısı işitsel kapsül iç kulağı, yani koklea ve semisirküler kanallar kapsayan oysa işitsel bül, kemikçik evler çağırdı. Murin kemikçikler otolaringoloji alanındaki araştırmacılar büyük ilgi dolayısıyla işitme ve için gerekli olan, ancak onların metabolizma, gelişim ve evrim diğer alanlarda son derece alakalı. Değişmiş kemik metabolizması erişkin farelerde işitme fonksiyonu etkileyebilir ve çeşitli gen yoksun fareler in utero işitme kemiklerine morfogenezindeki değişiklikleri göstermek. fare işitsel kemikçikler küçük olmasına rağmen bir anatomik oryantasyon ve 3D yapısını anlar ise, kendi manipülasyon mümkündür. Burada, işitsel bül ve doğum sonrası farelerin kapsülü incelemek ve sonra bül kısmını kaldırarak bireysel kemikçik izole açıklanmıştır. Biz de tartışmak nasıl em içinfarklı yönlerde yatak bül ve kapsül malleusun, uzunlamasına yatay, ya da frontal kesitlerin hazırlanması için parafin veya dondurulmuş kesitler uygun üretmek için. Son olarak, biz fare ve insan işitme kemiklerine arasındaki anatomik farklılıklar numaralandırmak. Bu yöntemler işitsel kemiklerin, patolojik gelişim ve evrimsel açıdan ve farelerde orta kulağa analiz yararlı olacaktır.

Bu protokol, fare işitsel bül gelen kemikçik izole etmek için bir yöntem sunar. İlk olarak, bül ve kapsül kafatası (Şekil 1) tek bir parça olarak kesilir. Parçalara bül sonra malleus ile stapes tabanı (Şekil 2) ve örs ve üzengi (Şekil 3) hazırlamak için kullanılır. Işitsel bül ve kapsülün Merkezi bül, dorsal sorguç, ön semisirküler kanal ve subarcuate fossa (Şekil 1F) ön ucunda styliform süreçtir. Microcomputed tomografi (BT) görüntüleme işitsel bül kemikçiklerdeki yanı sıra bu kemiklerin uzunlamasına ve yatay bir kesit (Şekil 4) için en uygun oryantasyon ortaya koymaktadır. malleusun uzunlamasına parafın kesit için, bül ve kapsül pa gömülü bir hafta boyunca 4 ° C&#39;de EDTA içinde dekalsifiye edildiŞekil 4 A&#39;da gösterilen yönde de raffin blok - C, 4 um kesitler ve daha sonra H &amp; E ile boyandı. Işitsel bül de kulak zarı bağlı malleus P14 (Şekil 5A) devam eden endokondral ossifikasyon saptandı. yeni kemik oluşumunu görselleştirmek için, kalsein (30 mg / g vücut ağırlığı), periton bir P20 fareye enjekte edildi ve bül ve kapsül P21, 24 saat sonra izole edilmiştir. Yumuşatma olmaksızın örnek dondurulup yerleştirilebilir ve Kawamoto 43 yöntemine göre bir yapışkan film kullanılarak 6 uM&#39;de cryosectioned edildi. DAPI ile nükleer boyama (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol) sonra bu bölüm flöresanlı bir mikroskop altında gözlemlendi. Kalsein sinyalleri (yeşil) Malleus (m) &#39;de, yeni kemik oluşumunu, bül ve kapsül (Şekil 5B) gösterdi. malleusun yatay kesit için, 5 haftalık bir fare izole işitsel bül için (yumuşatma olmadan donmuş gömülüoryantasyon Şekil 4D bkz - Kawamoto yöntemi kullanılarak 6 mikron olarak cryosectioned F) ve H &amp; E ile boyandı. Malleal Processus brevis (MPB) yatay kesit, aynı zamanda koklea (Şekil 5C) göstermektedir. Bir P31 fare izole sağ işitme kemiklerine bir medial görünüm fare malleusun tipik özelliklerini gösterir, yani &quot;kayma-martı kanat benzeri&quot; (ya da Farsça kılıç gibi 45) manubrium, önemli bir processus brevis (yuvarlak apofiz ,) (Şekil 6) Tartışma görebilir ve enine lamina. Ön işlem (prosesus anterior) goniale yaklaşık diseksiyon işlemi kırıldığı ve (ectotympanic) timpanik halkasından ayrılabilir dikkat etmek gerekir. incudostapedial eklem yerinden oysa bu temsili numune, malleus ve inkus arasında sağlam bir incudomalleolar eklemi sergiler. malleal içine tendon girmeler vestapedial kas işlemler tespit (Şekil 6A, yıldızlar) vardır. Şekil 6B, aynı büyütmede, fare ve insan işitme kemiklerine karşılaştırır. boyut dışındaki türlerden farklılıklar, aşağıdakileri içerir. malleal manubrium kanat benzeri farelerde ancak insanlarda kulüp gibi. anatomik ekseni (ya da dönme ekseni, malleusun inkus ve kısa bir süreç ön işleminde çizgi) ve manubrium arasındaki açı farelerde çok küçük ve hemen hemen dik olan karşıt iki hemen hemen paralel olan insanlarda 6,46-48 yılında. İnsan Kemikcikler olarak, vibrometric çalışmalar incudo-malleoler ortak işlevsel 49 sabit ziyade hareketli olduğunu ortaya koymaktadır. Fare Malleus insanlarda 47 belirgin olmayan bir geniş, ince ve düz enine lamina sergiler. Farelerde, prosesus ön zar kemik, yani goniale ve tympani üzere kaynaşırC halkasının, insanlarda prosesus ön kemik 41 küçük bir spicule düşürülür ise. Fare ve insan üzengi da farklıdır: farelerde, ön crus kavislidir ve arka crus daha düz ise, insanlarda olduğu, ön crus düz arka crus daha fazladır. Bu vücut büyüklüğüne malleus baş göreli kitlesel &quot;küçük&quot; kemiklerin 48 allometrik ilişkilerinde önemli değişkenlik gösteren, örneğin altın köstebek gibi türler büyütülür dikkati çekiyor. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig1.jpg" /> Şekil İşitsel Bulla ve Kapsül 1. Diseksiyon. Bir P31 fare kafatası (A) sağ ve sol yarısı ayrılmıştır. A, ön; P, arka; L, sol; R, doğru. (B) ikiye, derili başının sağ yarısında medial yüzeyi. Cx, serebral korteks; Cb, beyincik; İşletmeleri, brainstem. D, dorsal; V, ventral. Forseps ile beyin (C) Sökme. (D) sağ kafatasında işitsel kapsül medial görünümü. dorsal tepe (ok başları), orta kranial fossa (MCF) ve posterior fossa (pcf) arasında uzanan ve dorso-anterior ve işitsel kapsülün ventro-arka yüzeyleri ayırır. Ölçek çubuğu, 2 mm. (E), işitsel bül ve kapsül (medial görünüm) Yüksek büyütme. Co, koklea; VII, yüz siniri; VIII, sinir vestibülokohlear; AC, anterior (üstün) semisirküler kanal; serebellar paraflokkulusun evler sf, subarcuate fossa. Ölçek çubuğu, 1 mm. İzole işitsel bül ve kapsül (medial görünüm) (F) Mikrografik. Sp, styliform süreci. Ölçek çubuğu, 1 mm. (A - E), P31 fare. (F), P33 fare. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig2.jpg" /> Malleusun 2. Diseksiyon Şekil. (A) sağ işitsel bül ve kapsülün ventrolateral görünümü. sulkus tympanicus (ST, kesik ok) kulak zarı eki sitesidir. ST kemik yanal dış kulak parçası ve ST kemik medial orta kulak boşluğunun tabanını oluşturur. A, ön; P, arka; D, dorsal; V, ventral. Dış kulak yolu çıkarıldıktan sonra (B) Görünüm pars flaccida (Pf) ve tensa pars (Pt) dahil timpanik membran (TM) ortaya çıkarmak için. Timpanik kemik malleal prosesus brevis (MPB) yakınındaki (noktalı çizgiler ve #) parçaları (C) çıkarılması. m, malleus; mM malleal manubrium. kulak zarından görülen orta kulak boşluğunda, hava kabarcığı ok. (D) Exposed malleus. Malleus kafa gösterilir. Noktalıhat inkus eklem yüzeyini gösterir. Tensör timpani kasının (E) tendon (TT) malleusun bağlı. Malleus kaldırıldığında (F) tensör tympani çekilir. * Kas süreç. (G) tensör timpaninin iğne kullanılarak kesilir. Üç işitsel kemikçikler kulak zarı çıkarıldıktan sonra (H). incudo-malleoler eklem yerinden edilir. m, malleus; i incus; s, stapes; , Goniale (çekiç kemiği ve timpanik halka, TR kaynaştırılmış) gidin. Tüm ölçek barlar, 0.5 mm. (A, lH), P33 fare. (B - G), P31 fare. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55054/55054fig3.jpg" /> Şekil inkus ve stapes 3. Diseksiyon. (A) incus vemalleusun çıkarılmasından sonra üzengi. stapedial arterin (SA) üzengi (ler) geçer. Noktalı çizgi inkus eklem yüzeyini gösterir. kısa bacak inkus (i) (ICB, crus breve) posterior ligaman sabit unutmayın (gösterilmemiştir). Asterisk, stapes kas süreci. (B) inkus çıkarılmasından sonra Stapes. İğne ucu stapedial arter (SA) kesmek için kullanılır. Kan akış yönünü ok. Noktalı çizgi stapesin eklem yüzeyini gösterir. (C) stapedial arter üzengi kaldırılır. X stapes arter (SA) kesik ucunu gösterir. (D) oval pencere (Ah, fenestra ovalis veya fenestra Vestibül) stapes çıkarılmasından sonra görülebilir. Rw, yuvarlak pencere (fenestra rotunda veya fenestra cochleae). Ölçek çubukları, 0.5 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig3large.jpg" target="_blank">Bu daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız</a>rakam. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55054/55054fig4.jpg" /> (- C parasagital, A) ve Yatay (D - E) malleusun Kesit Boyuna için gömülmesi sırasında İşitsel bül ve Kapsül yönlendirme Şekil 4.. (A - C) malleusun boyun ve enine lamina çanak gömme tabanına paralel yerleştirilir. (A) Yandan görünüm: Mikro BT görüntüsünde (mavi yalancı) bül sağ malleusun katıştırma göstermek için. Malleus ve inkus yeşil yalancı edilir. Kesikli çizgi, istenilen kesme düzlemi. Düz çizgi, çanak gömme alt. m, malleus; ok uçları, sırt sorguç. M, medial; L, yan; D, dorsal; V, ventral. (B) Üstten görünüm: Mikro-BT görüntüsü. bül (styliform işlemi) ön ucu uzaklaştırılmıştır unutmayın. i incus. (C) Üstten görünüm: a çekilmiş mikroskobu (renk filtresi). AC, anterior (üstün) semisirküler kanal; Sf, subarcuate fossa; Sp, styliform süreci. A, ön; P, arka; D, dorsal; V, ventral. (D - F) malleusun processus brevis çanak gömme dibine dik yerleştirilir. (D) Yandan görünüm: Mikro-BT görüntüsünde sağ malleusun katıştırma göstermek için. Kesikli çizgi, istenilen kesme düzlemi. Düz çizgi, çanak gömme alt. (E) Üstten görünüm: Mikro-BT görüntüsü. mM malleal manubrium. (F) Üstten görünüm: (a renk filtresiyle çekilmiş) mikrografı. Ölçek çubukları, 1mM. Daha önce 7 açıklandığı gibi Mikro-BT görüntüleri, 5 um bir voksel çözünürlükte elde edildi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/55054/55054fig5.jpg" /> FŞEKIL 5. Histoloji. (A) H &amp; E boyama. P14 işitsel bül (noktalı çizgi), parafine gömülü sağ malleus (m) Boyuna (Parasagital) bölümü. TM, kulak zarı. (B) Calcein kemik etiketleme. P21 işitsel bül dondurulmuş, undekalsifiye sol malleus (m) Boyuna kesit. Counterstain, DAPI. (C) &#39;H &amp; E boyama. İşitsel bül ve kapsülün (5 haftalık fare) dondurulmuş, kalan undekalsifiye malleal Processus brevis (MPB) yatay kesit. Co, koklea. Ölçek çubukları, 1mM. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/55054/55054fig6.jpg" /> Şekil 6. işitme kemiklerine medial görünümü. (A), P sağ işitme kemiklerine31 fare. A, ön; P, arka; D, dorsal; V, ventral. Ölçek çubuğu, 1 mm. Malleus kafası (Caput mallei, capitulum mallei); Boyun (Collum mallei); lamina (enine lamina); mM (Ağız sapı mallei); siyah yıldız (malleusun kas süreci); MPA (prosessus anterior, prosessus gracilis); MPB (processus brevis); örs gövdesi (Corpus incudis); ICB (Crus breve, kısa crus, kısa bir süreç); ICL (Crus longum, uzun crus, uzun bir süreç); IPL (prosessus lenticularis, lentiküler işlem olup, Silviyan apofizi); stapes başı (Caput stapedis); beyaz yıldız (stapes kas süreci); ScA (Crus anterius, ön bacak); SCP (Crus posterius, arka bacak); Baz (Baz stapedis, kürek); Sof (obturator foramen, intercrural foramen). (B) 76 yaşındaki insan kadın sağ işitsel kemikçikler (Anatomi Anabilim Tıp, Keio Üniversitesi izniyle). insan Kemikcikler için kullanıldığı gibi P31 fare kemikçikleri (sağ alt) aynı büyütmede görüntülenmiş. CurvEd oklar anatomik ekseni ile manubrium (noktalı çizgiler) arasındaki açı gösterir. Ölçek çubuğu, 2 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis at JoVE.com

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

Doğum sonrası Farelerde İşitsel Bulla diseksiyonu: Orta Kulak Kemikler ve histolojik analiz izolasyonu

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

dissection-auditory-bulla-postnatal-mice-isolation-middle-ear-bones

Research

JoVE Journal

Biology

29.9K Görüntüleme.  Keio University School of Medicine. We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis. 

Video: Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current regenerative medicine strategies have focused on transplanting stem cells or genetic manipulation of surrounding support cells in the inner ear to encourage replacement of damaged stem cells to correct hearing loss. Yet, the extracellular matrix (ECM) may play a vital role in inducing and maintaining function of hair cells, and has not been well investigated. Using the cochlear ECM as a scaffold to grow adult stem cells may provide unique insights into how the composition and architecture of the extracellular environment aids cells in sustaining hearing function. Here we present a method for isolating and decellularizing cochleae from mice to use as scaffolds accepting perfused adult stem cells. In the current protocol, cochleae are isolated from euthanized mice, decellularized, and decalcified. Afterward, human Wharton&#39;s jelly cells (hWJCs) that were isolated from the umbilical cord were carefully perfused into each cochlea. The cochleae were used as bioreactors, and cells were cultured for 30 days before undergoing processing for analysis. Decellularized cochleae retained identifiable extracellular structures, but did not reveal the presence of cells or noticeable fragments of DNA. Cells perfused into the cochlea invaded most of the interior and exterior of the cochlea and grew without incident over a duration of 30 days. Thus, the current method can be used to study how cochlear ECM affects cell development and behavior.

The goal of this protocol is to demonstrate an effective method to decellularize and decalcify mouse cochleae for utilization as scaffolds for tissue engineering applications.

Fare Cochleae iç kulak doku mühendisliği için Decellularizing için bir iletişim kuralı

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

Biyomühendislik

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Tüm Dağı Diseksiyon ve Yetişkin Fare Kohlea immünofloresan

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Nörobilim

The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.

Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.

Koklear Hücre Dejenerasyonu Inducing için hızlı ve Güvenilir Teknik: Ototoksik Ajan Teslimat için Fare Yuvarlak pencere Yaklaşımı

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research ...

Tıp

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest signaling pathways shown to be associated with ciliary function was the non-canonical Wnt signaling pathway, also referred to as planar cell polarity (PCP) signaling. One of the best places in which to study the effects of planar cell polarity (PCP) signaling during vertebrate development is the mammalian cochlea. PCP signaling disruption in the mouse cochlea disrupts cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, all of which are affected by cilia dysfunction. The goal of this protocol is to describe the analysis of PCP signaling in the developing mammalian cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy. Defects in convergence and extension are manifested as a shortening of the cochlear duct and/or changes in cellular patterning, which can be quantified following dissection from developing mouse mutants. Changes in stereociliary bundle orientation and kinocilia length or positioning can be observed and quantitated using either immunofluorescence or scanning electron microscopy (SEM). A deeper insight into the role of ciliary proteins in cellular signaling pathways and other biological phenomena is crucial for our understanding of cellular and developmental biology, as well as for the development of targeted treatment strategies.

Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.

Ciliopathy Fare Mutant Kohlea Planar-Hücre-Polarite fenotipleri Değerlendirilmesi

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

Cryosectioning and Immunostaining Mouse Inner Ear Tissue: From Embryonic to Adult Stages

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is to provide a straightforward and standardized method for inner ear tissue processing for researchers, possibly new to the field, interested in working with the mouse cochlea. Included here are protocols for dissection, fixation, embedding, cryosectioning, and immunostaining. Section immunostaining is one of the best methods for examining individual cells within the context of the entire cochlea.
Key steps include dissecting the inner ear away from the skull, fixing the tissue using 4% paraformaldehyde, embedding with Optimal Cutting Temperature compound, cryosectioning, and immunostaining with antibodies targeting specific proteins expressed by the cochlea.
Included in our methods are special considerations made for the cochlea given its 
shape and structure.&#160;Reasonably good focus and dissection skills are needed, as tissue damage can affect the quality of immunostaining and consistency among samples. However, with the procedures we outline, most users can be trained in a few weeks to make beautiful preparations. Overall, this protocol offers a valuable way to promote research to understand auditory development, function, and disease in mouse models.

This protocol, intended for novice users of mouse inner ear tissue, comprehensively details steps for processing mouse inner ears at different developmental stages for section immunostaining.

Fare İç Kulak Dokusunun Kriyoseksiyon ve İmmün Boyama: Embriyonik Aşamalardan Yetişkin Aşamalarına

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is ...

Gelişim Biyolojisi

Cochlear Implant Surgery and Electrically-evoked Auditory Brainstem Response Recordings in C57BL/6 Mice

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of hearing. Improvement of the implant technology is needed if CI users are to perceive music and perform in more natural environments, such as hearing out a voice with competing talkers, reflections, and other sounds. Such improvement requires experimental animals to better understand the mechanisms of electric stimulation in the cochlea and its responses in the whole auditory system. The mouse is an increasingly attractive model due to the many genetic models available. However, the limited use of this species as a CI model is mainly due to the difficulty of implanting small electrode arrays. More details about the surgical procedure are therefore of great interest to expand the use of mice in CI research.
In this report, we describe in detail the protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in the C57BL/6 mouse strain. We demonstrate the functional efficacy of this procedure with electrically-evoked auditory brainstem response (eABR) and show examples of facial nerve stimulation. Finally, we also discuss the importance of including a deafening procedure when using a normally hearing animal. This mouse model provides a powerful opportunity to study genetic and neurobiological mechanisms that would be of relevance for CI users.

Animal models of cochlear implants can advance knowledge of the technological bases of treating permanent sensorineural hearing loss with electrical stimulation. This study presents a surgical protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in mice as well as the functional assessment with auditory brainstem response.

Koklear Implant ameliyatı ve elektriksel olarak uyarılmış işitsel beyin sapı yanıt kayıtları C57BL/6 farelerde

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of ...

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have indicated that hair cell synapses may be the initial targets in sensorineural hearing loss (SNHL). Such studies have proposed the concept of cochlear &#34;synaptopathy&#34;, which refers to alterations in ribbon synapse number, structure, or function that result in abnormal synaptic transmission between IHCs and SGNs. While cochlear synaptopathy is irreversible, it does not affect the hearing threshold. In noise-induced experimental models, restricted damage to IHC synapses in select frequency regions is employed to identify the environmental factors that specifically cause synaptopathy, as well as the physiological consequences of disturbing this inner ear circuit. Here, we present a protocol for analyzing cochlear synaptic morphology and function at a specific frequency region in adult mice. In this protocol, cochlear localization of specific frequency regions is performed using place-frequency maps in conjunction with cochleogram data, following which the morphological characteristics of ribbon synapses are evaluated via synaptic immunostaining. The functional status of ribbon synapses is then determined based on the amplitudes of auditory brainstem response (ABR) wave I. The present report demonstrates that this approach can be used to deepen our understanding of the pathogenesis and mechanisms of synaptic dysfunction in the cochlea, which may aid in the development of novel therapeutic interventions.

This manuscript describes an experimental protocol for evaluating the morphological characteristics and functional status of ribbon synapses in normal mice. The present model is also suitable for noise-induced and age-related cochlear synaptopathy-restricted models. The correlative results of previous mouse studies are also discussed.

Fare koklea belirli frekans bölgelerinde şerit synapses morfolojik ve fonksiyonel değerlendirilmesi

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

Yetişkin Farede Koklear Yüzey Hazırlama

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Dissection of the Endolymphatic Sac from Mice

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the human phenotypes. Although important progress has been done in the understanding of the development and function of the neurosensory epithelia of the cochlea and vestibula, limited knowledge is available regarding the development, cellular composition, molecular pathways and functional characteristics of the endolymphatic sac. This is, in large part, due to the difficulty of visualizing and microdissecting this tissue, which is an epithelium comprised of only one cell layer. The study presented here describes an approach to access and microdissect the endolymphatic sac from the wild-type mouse inner ear at different ages. The result of a similar dissection is shown in a pendrin-deficient mouse model of enlargement of the vestibular aqueduct. A transgenic mouse with a fluorescent endolymphatic sac is presented. This reporter mouse can be used to readily visualize the endolymphatic sac with limited dissection and determine its size. It can also be used as an educational tool to teach how to dissect the endolymphatic sac. These dissection procedures should facilitate further characterization of this understudied part of the inner ear.

<meta charset="utf8"></head><body>Farelerden Endolenfatik Kesenin Diseksiyonu

This study describes how to dissect the endolymphatic sac from the inner ear of the mouse at different ages. The result of a similar dissection is shown in an Slc26a4-null mouse model of enlargement of the endolymphatic sac. A transgenic mouse with a fluorescent reporter expressed in the endolymphatic sac is presented as a model to readily visualize the endolymphatic sac, and educational tool.

Farelerden Endolenfatik Kesenin Diseksiyonu

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the ...

Doğum sonrası Farelerde İşitsel Bulla diseksiyonu: Orta Kulak Kemikler ve histolojik analiz izolasyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Fare Cochleae iç kulak doku mühendisliği için Decellularizing için bir iletişim kuralı

Tüm Dağı Diseksiyon ve Yetişkin Fare Kohlea immünofloresan

Koklear Hücre Dejenerasyonu Inducing için hızlı ve Güvenilir Teknik: Ototoksik Ajan Teslimat için Fare Yuvarlak pencere Yaklaşımı

Ciliopathy Fare Mutant Kohlea Planar-Hücre-Polarite fenotipleri Değerlendirilmesi

Fare İç Kulak Dokusunun Kriyoseksiyon ve İmmün Boyama: Embriyonik Aşamalardan Yetişkin Aşamalarına

Koklear Implant ameliyatı ve elektriksel olarak uyarılmış işitsel beyin sapı yanıt kayıtları C57BL/6 farelerde

Fare koklea belirli frekans bölgelerinde şerit synapses morfolojik ve fonksiyonel değerlendirilmesi

Yetişkin Farede Koklear Yüzey Hazırlama

Farelerden Endolenfatik Kesenin Diseksiyonu

Farelerden Endolenfatik Kesenin Diseksiyonu