Name: isolation and characterization of microvesicles from peripheral blood
Uploaded: 2017-01-06T11:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood at JoVE.com

The authors acknowledge Meike Schaffrinski for excellent technical assistance. We would like to thank the following people for their help in the collection of peripheral blood samples (all from University Medical Center G&#246;ttingen): Henrietta Vida (Dept. of Transfusion Medicine), Kia Homayounfar, Lena-Christin Conradi (Dept. of General, Visceral and Pediatric Surgery), Leila Siam, Bawarjan Schatlo (Dept. of Neurosurgery), Hendrik A. Wolff, Martin Canis (Dept. of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery) as well as all employees of the interdisciplinary short-term oncology. We acknowledge Dirk Wenzel (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, G&#246;ttingen) for his help with the electron microscopy of MVs. 
The study was funded by the German Ministry of Education and Research (BMBF) project MetastaSys (grant no. 0316173) as well as the German Cancer Aid (grant no. 109615).

İnsan deneklerle dahil olmak üzere tüm deneyler yerel etik kurul (onay no. 3/2/14) tarafından onaylanmıştır. Hastaların seçimi için tür, yaş, cinsiyet, mevcut tedavi rejimleri ve bu nedenle kandaki OG bileşim etkilemek olabilir ve daha pek çok çeşitli faktörler toplama 22,23 örnek önceden dikkate alınması gerektiği not edilmelidir. Plazma örneklerinin hazırlanması 1. <ol><li> EDTA (1.6 mg / ml kan) içeren bir vacutainer kan toplama tüpüne 21-gauge kelebek iğne ile donör başına kan 2 tüpleri - 1 çizin. verimli kan antikoagülan garanti tüp (ler) birkaç kez ters emin olun. Not: - 15 ml daha sonra akış sitometrisi ve Western Blot analizi için kan önerilen hacmi 5&#39;tir. OG bozulmasını ve kaybını önlemek için, kan örnekleri 30 dakika kan kesildikten sonra &lt;ele alınmalıdır. </li><li> 1.200 x g&#39;de 15 dakika süre ile numuneler santrifüj ile plazma numunelerinin hazırlanmasıOda sıcaklığında (RT). </li><li> kan hücreleri (= alt tabaka) geri kalan plazma (= üst tabaka) ayrılmasını yardımcı olmak için bir valf filtre uygulanır. </li><li> 15 ml tüp içine plazma aktarın. </li><li> 1,500 x g&#39;de 15 dakika boyunca santrifüj, RT daha büyük hücre yıkıntıları pelet haline geri kalan trombositleri çıkarmak için. </li><li> 15 ml tüp içine süpernatant aktarın ve doğrudan -20 ° C&#39;de 6 aya kadar OG yalıtım veya mağaza örnekleri devam edin. NOT: Sunulan protokol, aynı zamanda, hücre kültür süpernatanlarından MVs (ve EXOS) izole etmek için kullanılabilir. 24 için% 80 birleşme - - bunun için, 60 hücrelerinin kültive vezikül tükenmiş FCS ile takviyeli kültür ortamında 48 saat, ve daha sonra supernatant toplamak. 750 x g&#39;de 5 dakika 4 ° C&#39;de santrifüj kalıntı kayan hücreleri tüketir büyük hücre yıkıntıları pelet haline getirildi 1500 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca tekrar yeni bir 15 ml tüp ve santrifüj içine süpernatant doldurun. Bu yüzer madde daha sonra MVs izolasyonu için kullanılabilmektedir2.16 - Adım 2.1 açıklandığı gibi. </li></ol> MVS 2. izolasyonu <ol><li> uygun bir santrifüj tüpü içinde plazma örneği aktarın. Gerekirse, santrifüj işlemi sırasında ince duvarlı borular çöküşü numunenin seyreltilmesi ve önlemek amacıyla PBS ile tüp doldurun. </li><li> 14.000 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de 35 dakika boyunca santrifüje. </li><li> Durusu süpernatant, tüpler ters döndü ve bir kağıt havlu üzerine koymak tutun. Kalan tüm yüzer havlu batırılmış ve bu şekilde örnek çıkarılana kadar 5 dakika - 3 bekleyin. </li><li> 1000 uL PBS MV pelletini, bir masa üstü santrifüjü içinde 14,000 x g&#39;de 4 ° C&#39;de 35 dakika boyunca 1.5 ml tüp ve santrifüj aktarın. </li><li> Süpernatant aspire. </li><li> pelet boyutuna bağlı olarak, 500 ul PBS - 50 MV pelletini. Seçenek olarak ise, RIPA tamponu içinde, örneğin, doğrudan lize MVs, (150 mM NaCI /% 0.1 SDS /% 0.5 Na-deoksikolat /% 1 Triton X-100/50 mM Tris, pH 7.2)daha sonra Western blot analizi için. -20 ° C&#39;de saklayın MVs. Onlar birkaç ay boyunca stabil kalır, ancak tekrarlanan donma-çözülme-döngüleri önlemek olacaktır. </li><li> İsteğe bağlı MV verim değerlendirmek ve daha sonraki deneyler için MVs dozlanması amacıyla bir protein tahlili ile OG protein konsantrasyonu (örneğin, Bradford ve Lowry metodu) belirler. </li><li> Ek Exos Plazma örneklerinden izole edilecekse, 110,000 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de, 2 saat için bir ultra-santrifuj tüpü ve santrifüj içine adım 2.3 süpernatant süzün. Aşama 2.3&#39;te tarif edildiği gibi süpernatant tortusundan ayırma, 1000 uL PBS Exo pelet tekrar süspansiyon ve küçük (1.5 mL) ultrasantrifügasyon tüplere aktarın. <ol><li> 75 uL PBS veya RIPA tamponu - 50 110.000 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de, aspirat süpernatan ve tekrar süspansiyon Ekzo pelet, 2 saat süre ile ultra santrifüj. </li></ol></li></ol> Akış Sitometrisi ile MVS 3. Karakterizasyonu <ol><li> Aktarım 15 uL PBS +% 1 vezikül tüketilmiş sığır fetüs serumu (Fbir akış sitometrisi tüp CS). Not: Vezikül tükenmiş FCS, daha önce, 24 tarif edilen şekilde 0.2 um&#39;lik bir filtre boyunca süpernatan 110,000 x g&#39;de 18 saat FCS (56 ° C&#39;de 30 dakika) ısı ile inaktive edilmiş santrifüj ve süzme yolu ile hazırlanır. </li><li> PBS içinde MVs (3 ug de geçerlidir düşük verim durumunda) 5 ug ekleyin. </li><li> OG yüzeyindeki spesifik olmayan bağlama merkezlerini bloke edebilir ve böylece arka plan boyama azaltmak için, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Protein-faiz karşı floresan etiketli antikor ekleyin. düşük bir sinyal-gürültü oranı optimal konsantrasyonunu belirlemek ve garanti etmek amacıyla kullanılmadan önce Boyama için kullanılan antikor miktarının titre edilir. Ayrıca negatif kontrol olarak lekesiz MVS ile bir tüp ve (antikor 1 ug kullanılması durumunda, örneğin, aynı zamanda izotop kontrol An 1 mikrogram kullanımı aynı konsantrasyonda eşleşen izotip kontrol antikoru ile boyandı MVS bir tüp dahil emin oluntibody) arka plan boyama ölçmek için. Not: Bu farklı fluorochromes bağlanmış bir çok antikor eklenerek sitometri renkli akış gerçekleştirmek de mümkündür. </li><li> karanlıkta, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 250 uL PBS ilave edin ve bir akış sitometrisi kullanılarak numunenin ölçüm devam edin. <ol><li> halinde numuneleri hemen ölçülemez ki 4 ° C&#39;de örnekleri ve mağaza düzeltmek için 150 uL PBS ve 50 uL% 4 paraformaldehit (PFA) ekleyin. UYARI: PFA zehirlidir. eldiven ve uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın. </li></ol></li><li> mümkün olan en düşük değere akış sitometresi eşiğini azaltın ve logaritmik ölçekte yan dağılım (SSC) arsa karşı ileri dağılım (FSC) kullanılarak OG nüfus arayın. OG nüfus Kapısı ve buna karşılık gelen bir histogram floresan sinyali değerlendirir. </li></ol> Western Blot tarafından MVS 4. Karakterizasyonu <ol><li> doğrudan MV peletUygun bir liziz tamponu (örneğin, RIPA tamponu). <ol><li> Uygun bir liziz tamponu (örneğin, RIPA tamponu) içinde 1: MV pelet daha önce PBS içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş edilmiş durumda, en az 1 seyreltin. </li></ol></li><li> Lowry testi ile OG numunenin protein konsantrasyonu, örneğin, belirleme. </li><li> 22.5 ul RIPA tamponunda MVS 20 ug - 10 hazırlayın. Daha sonra 95 ° C de 5 dakika boyunca 7.5 mL 4 x Laemmli yükleme tamponu ve ısıtılır. </li><li> bir poliakrilamit jeli üzerinde Numuneleri ve standart protokollere göre immunoblotting gerçekleştirin. </li><li> zarı üzerine proteinleri aktarıldıktan sonra, standart protokollere göre, bir yükleme kontrolü olarak bir Ponceau boyama yapar. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle TBST içinde destain membran. </li><li> TBST içinde% 5 BSA, oda sıcaklığında en fazla 1 saat 30 dakika boyunca blok membran. </li><li> gece boyunca ya da oda sıcaklığında 2 saat boyunca 4 ° C &#39;de primer antikor ile membran inkübe edin. </li><li> TBST&#39;dir 3 x 5 dakika ile membran yıkayın.</li><li> 1 bir seyreltme HRP ile birleştirilmiş ikincil antikor ile membran inkübe: 10,000,% 5 BSA. Not: Yüksek plan sinyalleri durumunda yerine BSA süt tozu kullanımı. </li><li> TBST 3x 5 dakika ile membran yıkayın. </li><li> Bir ECL algılama reaktifi ile membran geliştirmek ve chemilüminesan film ya da bir kemilüminesans görüntüleme sistemi sinyalleri algılar. Not: EXOS gelen MVs ayırt etmek için, tubulin benzeri proteinler kullanılabilir 4-aktinin veya mitofilin esas MVs 16,25 mevcut olması gereken. EXOS için markerler olarak kullanılan en tetraspanin antikorları (örneğin, CD9, CD81), indirgeyici koşullar altında çalışmaz ve bu nedenle 70 ° C &#39;de 10 dakika süre ile ısıtıldı, ardından indirgeyici olmayan yükleme tamponunda hazırlanmalıdır dikkat ediniz. </li></ol>

<ol>
	<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Y&#225;&#241;ez-M&#243;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> J Extracell Vesicles. 4, (2015).</li><li>Guescini, M., Genedani, S., Stocchi, V., Agnati, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+and+Glioblastoma+cells+release+exosomes+carrying+mtDNA.">Astrocytes and Glioblastoma cells release exosomes carrying mtDNA.</a> J Neural Transm (Vienna). 117 (1), 1-4 (2010).</li><li>Balaj, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+microvesicles+contain+retrotransposon+elements+and+amplified+oncogene+sequences.">Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences.</a> Nat Commun. 2, 180 (2011).</li><li>Lee, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+ras-driven+cancer+cell+vesiculation+leads+to+emission+of+double-stranded+DNA+capable+of+interacting+with+target+cells.">Oncogenic ras-driven cancer cell vesiculation leads to emission of double-stranded DNA capable of interacting with target cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 451 (2), 295-301 (2014).</li><li>Chi, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumour+trail+left+in+blood.">The tumour trail left in blood.</a> Nature. 532 (7598), 269-271 (2016).</li><li>Pisitkun, T., Shen, R. -. F., Knepper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+proteomic+profiling+of+exosomes+in+human+urine.">Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (36), 13368-13373 (2004).</li><li>Harrington, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+and+biochemistry+of+nanostructures+provide+evidence+for+synthesis+and+signaling+functions+in+human+cerebrospinal+fluid.">The morphology and biochemistry of nanostructures provide evidence for synthesis and signaling functions in human cerebrospinal fluid.</a> Cerebrospinal Fluid Res. 6, 10 (2009).</li><li>Admyre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+with+Immune+Modulatory+Features+Are+Present+in+Human+Breast+Milk.">Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk.</a> J Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).</li><li>Caby, M. -. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal-like+vesicles+are+present+in+human+blood+plasma.">Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma.</a> Int Immunol. 17 (7), 879-887 (2005).</li><li>Nieuwland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+origin+and+procoagulant+properties+of+microparticles+in+meningococcal+sepsis.">Cellular origin and procoagulant properties of microparticles in meningococcal sepsis.</a> Blood. 95 (3), 930-935 (2000).</li><li>Mfonkeu, J. B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+Cell-Specific+Microparticles+Are+a+Biological+Marker+for+Cerebral+Dysfunctions+in+Human+Severe+Malaria.">Elevated Cell-Specific Microparticles Are a Biological Marker for Cerebral Dysfunctions in Human Severe Malaria.</a> PLoS One. 5 (10), e13415 (2010).</li><li>Parker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+inflammation+reduces+endothelial+microparticles+in+active+systemic+lupus+erythematosus.">Suppression of inflammation reduces endothelial microparticles in active systemic lupus erythematosus.</a> Ann Rheum Dis. 73 (6), 1144-1150 (2014).</li><li>Nozaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+value+of+endothelial+microparticles+in+patients+with+heart+failure.">Prognostic value of endothelial microparticles in patients with heart failure.</a> Eur J Heart Fail. 12 (11), 1223-1228 (2010).</li><li>Galindo-Hernandez, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+concentration+of+microvesicles+isolated+from+peripheral+blood+in+breast+cancer+patients.">Elevated concentration of microvesicles isolated from peripheral blood in breast cancer patients.</a> Arch Med Res. 44 (3), 208-214 (2013).</li><li>Menck, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-derived+microvesicles+mediate+human+breast+cancer+invasion+through+differentially+glycosylated+EMMPRIN.">Tumor-derived microvesicles mediate human breast cancer invasion through differentially glycosylated EMMPRIN.</a> J Mol Cell Biol. 7 (2), 143-153 (2015).</li><li>Moon, P. -. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Developmental+Endothelial+Locus-1+on+Circulating+Extracellular+Vesicles+as+a+Novel+Biomarker+for+Early+Breast+Cancer+Detection.">Identification of Developmental Endothelial Locus-1 on Circulating Extracellular Vesicles as a Novel Biomarker for Early Breast Cancer Detection.</a> Clin Cancer Res. 22 (7), 1757-1766 (2016).</li><li>Melo, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glypican-1+identifies+cancer+exosomes+and+detects+early+pancreatic+cancer.">Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer.</a> Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).</li><li>Kahlert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Double-stranded+Genomic+DNA+Spanning+All+Chromosomes+with+Mutated+KRAS+and+p53+DNA+in+the+Serum+Exosomes+of+Patients+with+Pancreatic+Cancer.">Identification of Double-stranded Genomic DNA Spanning All Chromosomes with Mutated KRAS and p53 DNA in the Serum Exosomes of Patients with Pancreatic Cancer.</a> J Biol Chem. 289 (7), 3869-3875 (2014).</li><li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+typing+of+circulating+microvesicles+allows+real-time+monitoring+of+glioblastoma+therapy.">Protein typing of circulating microvesicles allows real-time monitoring of glioblastoma therapy.</a> Nat Med. 18 (12), 1835-1840 (2012).</li><li>L&#228;sser, C., Eldh, M., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+RNA-Containing+Exosomes.">Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes.</a> J Vis Exp. (59), (2012).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> J Extracell Vesicles. 2, (2013).</li><li>Gustafson, C. M., Shepherd, A. J., Miller, V. M., Jayachandran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-+and+sex-specific+differences+in+blood-borne+microvesicles+from+apparently+healthy+humans.">Age- and sex-specific differences in blood-borne microvesicles from apparently healthy humans.</a> Biol Sex Differ. 6, (2015).</li><li>Shelke, G. V., L&#228;sser, C., Gho, Y. S., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+exosome+depletion+protocols+to+eliminate+functional+and+RNA-containing+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> J Extracell Vesicles. 3, (2014).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 113 (8), E968-E977 (2016).</li><li>Dignat-George, F., Boulanger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Many+Faces+of+Endothelial+Microparticles.">The Many Faces of Endothelial Microparticles.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (1), 27-33 (2011).</li><li>Esser, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Incorporation+of+CD45,+CD80+(B7-1),+CD86+(B7-2),+and+Major+Histocompatibility+Complex+Class+I+and+II+Molecules+into+Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+Virions+and+Microvesicles:+Implications+for+Viral+Pathogenesis+and+Immune+Regulation.">Differential Incorporation of CD45, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), and Major Histocompatibility Complex Class I and II Molecules into Human Immunodeficiency Virus Type 1 Virions and Microvesicles: Implications for Viral Pathogenesis and Immune Regulation.</a> J Virol. 75 (13), 6173-6182 (2001).</li><li>Canellini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+blood+cell+microparticles+and+blood+group+antigens:+an+analysis+by+flow+cytometry.">Red blood cell microparticles and blood group antigens: an analysis by flow cytometry.</a> Blood Transfus. 10 (2), s39-s45 (2012).</li><li>Scholz, T., Temmler, U., Krause, S., Heptinstall, S., L&#246;sche, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+tissue+factor+from+platelets+to+monocytes:+role+of+platelet-derived+microvesicles+and+CD62P.">Transfer of tissue factor from platelets to monocytes: role of platelet-derived microvesicles and CD62P.</a> Thromb Haemost. 88 (6), 1033-1038 (2002).</li><li>Berckmans, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-derived+microparticles+circulate+in+healthy+humans+and+support+low+grade+thrombin+generation.">Cell-derived microparticles circulate in healthy humans and support low grade thrombin generation.</a> Thromb Haemost. 85 (4), 639-646 (2001).</li><li>Rupp, A. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+EpCAM+expression+in+breast+cancer+derived+serum+exosomes:+role+of+proteolytic+cleavage.">Loss of EpCAM expression in breast cancer derived serum exosomes: role of proteolytic cleavage.</a> Gynecol Oncol. 122 (2), 437-446 (2011).</li><li>Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+signatures+of+tumor-derived+exosomes+as+diagnostic+biomarkers+of+ovarian+cancer.">MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer.</a> Gynecol Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> Kandaki EVs üzerinde son çalışmalar, EV kompozisyon ve sayımlar çeşitli hastalıkların nedeni sırasında değişiklik olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, bu AGH analizi ve ileri karakterizasyon daha fazla teşhis ve prognoz için hastalık biyobelirteçlerinin olarak potansiyel kullanımını değerlendirmek ya da tedavi yanıtları değerlendirmek için yüksek ilgi görmektedir. Burada mevcut protokol herhangi bir hücre organellerini içermeyen 600 nm çapında veziküllerin izolasyonu sağlar. Bu gözlemler MVS güncel bir tanımlama ile uyumlu ve apoptotik cisimlerin 2 varlığını dışlamak. genellikle Ekzo belirteç olarak kullanılan tetraspanins CD9 ve CD81 sadece biraz ifade edildi Western Blot kullanarak, izole edilmiş MVs tubulin yüksek ifade gösterdiği göstermek mümkün oldu. Bu MVs Exos farklı olduğunu teyit ve proteomik 25 tarafından son derinlemesine karakterizasyonu ve hem EV popülasyonlarının karşılaştırmak için uyuyor. Kan örneklerinin elde edilmesi sırasında içeriği &quot;&gt;, MV bozunmasını önlemek için, kısa sürede damar delinerek ve plazma hazırlama arasındaki zaman kalması açısından çok önemlidir. Ayrıca, kan örneklerinin uzun süreli depolama geliştirilmiş MV neden kan hücrelerinin aktivasyonuna yol açabilir sonuçta apoptotik cisimlerin salınımına neden apoptoz dökülme ve. OG izolasyonu için bir başka önemli husus nedenle, aşağı iplik sonra mümkün olduğunca süpernatant kadar çok kaldırmak için kritik öneme sahiptir. plazma proteinlerine veya daha küçük Exos MV hazırlıkları kirletmesini önlemek için topak, normal olarak görünür ve sıkı bir şekilde borunun duvara bağlı olduğu 14,000 x g&#39;de MVs., süpernatan kolay bir pipet ucu ile temizlenebilir. EXOS aksine yüksek hızlı ultra-santrifüj tarafından hazırlanması sırasında agregatlar oluşturması için eğilimi olan genellikle tekrar süspansiyon zor bu sorun MVs oluşmaz. Çalışmamız bu Possi olduğunu gösterirflow sitometri ile kanda bulunan OG subpopülasyonunun karakterize etmek için ble. En akış sitometrelerinde tespit limiti yaklaşık 200 olmasına rağmen - 300 nm, MVs tekrarlanabilir açıkça arka plan sinyallerinden kendi ayrım izin Aynı analiz parametreleri ve kapıları ile donör yanı sıra hücre kültürü örneklerinde ölçüldü. PBS akış sitometrisi (Şekil 3) sırasında yüksek bir arka plan neden olabilecek herhangi bir kirletici partiküller ihtiva etmez analizler için kullanılan ölçümlerinden önce kontrol edilmesi önemlidir. Bazı küçük MVs bir akış sitometri yaklaşımla ele olmayabilir rağmen, tüm büyük kan hücre popülasyonlarının (örneğin, trombositler, kırmızı kan hücreleri, lökositler, endotel hücreleri) MVS tespit edildi. 29 - Bizim analizlerde daha önce MVS 26 bulunmuştur farklı kan hücreleri için standart belirteçler kullanılır. Belirtilmelidir ki t akış sitometrisi ile mümkün olan en iyi sonuçları elde etmek içinO miktar ve antikor konsantrasyonu, söz konusu antijeni ifade eden bir MV numune üzerinde titre edilmelidir. Kanda spesifik MV alt popülasyonlar daha yüksek özgüllük ile tespit edilir ise, ilgili MVS iki farklı antijenlerin karşı çifte boyama gerçekleştirmek ve sonraki 23 analizleri için yalnızca tüm çift pozitif MVS dikkate almak mümkündür. Şu anda, sağlıklı bireylerin 23,30 kanında MV alt popülasyonlar standart bir dizi tanımlamak için çabalar vardır. Bu çalışmalar, daha önce trombosit türevli MVs gözlemlerimiz ile uyumlu olarak bir kan MVs büyük nüfus oluşturmaktadır göstermiştir. OG örnekleri karakterize etmek flow sitometri bir avantajı, bu yöntem zaten iyi günlük klinik teşhis biyomarkırların olarak MVs olası kullanımını sağlayacak birçok klinik merkezlerinde tanı amaçlı kurulmuş olmasıdır. çoğunlukla odak kandaki EVs önceki çalışmalarküçük Exos üzerinde ed, seçici istenen Exo hedef nüfusu 31,32 analiz özel sıralama prosedürleri ya güvenmek ya da analiz 18 öncesinde boncuk Latexe Exos birleştirilmesi ile zaman alıcı (2 gün) izolasyon süreci gerektirir. Kendi yayınlanmamış gözlemler tam kan hazırlıkları MVS akım sitometri analizi bile böyle böyle bir seçim süreçleri olmadan tümör kaynaklı MVS olarak MVS algılanmasını sağlar düşündürmektedir. Burada sunulan protokol standardı laboratuar ekipmanları ile periferik kan örneklerinden MVs hızlı izolasyonuna izin verir ve onların sonraki karakterizasyonu akım sitometri ve Western Blot kullanarak, birlikte ele alındığında. Bütün bu süreç hastalık biyobelirteçlerinin olarak MVs potansiyelini değerlendirmek için gerekli olan hastaların kanındaki OG profilleri gelecek çalışmalara kolaylaştıracaktır yaklaşık 2 saat içinde yapılabilir.

Son yıllarda in vitro çalışmalar, birçok hücre dışı veziküller (EVS) arası iletişimde önemli bir rol oynadığını göstermiştir. Yaşayan hücreler sürekli boyut, içerik ve biyogenezine farklılık kesecikler döken. En iyi çalışılan AGH onlar multiveziküler organları intraluminal kesecikler olarak depolandığı endozomal sisteminden kaynaklanan eksozomlar vardır. Plazma zarı ile ikinci sigorta kez içeriyordu veziküller Eksozomlann olarak yayımlanan (Exos, çap 30-100 nm 1). Plazma zarı 2 doğrudan kapalı tomurcuk - Son yıllarda artan ilgisini topladı EV ikinci nüfus büyük microvesicles (1000 nm MVs, çapı 100) vardır. 5, ve komşu C transfer proteinlerin bir bolluk - veziküllerinin her iki tipi, örneğin, DNA, mRNA veya miRNA 3, bir lipid iki katmanının ile çevrilidir ve nükleik asitleri içerirlerarşın. Genel olarak veziküllerin protein bileşimi kökenli hücrenin durumunu yansıtırken, bazı proteinler seçici hedef ve AGH 1 zenginleştirilmiş gibi görünüyor. Bir önemli araştırma ilgi roman biyomarkırların olarak AGH kullanımına izin verebilir belirli EV imzaları belirlemek amacıyla anormal ve hastalıklı hücrelerden AGH karakterize etmektir. Özellikle tümörün kendisi kolayca erişilebilir olmadığı kanser, içinde, kanda tümör spesifik AGH hedefleyen sıvı biyopsi tedavi yanıtları izlenmesine olanak veya invaziv işlemler 6 gerek kalmadan primer tümör karakterize yardımcı olabilir. Gerçekten de EVS başarıyla idrar 7, CSF 8, anne sütü 9 ya da kan 10 de dahil olmak üzere, çeşitli vücut sıvılarından izole edilmiştir. Çeşitli çalışmalarda, farklı insan hastalıklarında EV sayılarında değişiklik ve kompozisyon belirledi. Örneğin, sepsis hastalarında ön pıhtılaştırma MVs sayısıdırönemli ölçüde sağlıklı bireylerin 11 oranla artmıştır. Ayrıca şiddetli serebral sıtma olan hastalarda kandaki toplam MVS bir artış görülebilir ve trombosit kaynaklı MVS sayıları koma derinliği ve trombositopeni 12 ile ilişkilidir. Diğer çalışmalar bu kardiyovasküler olaylar 13,14 daha yüksek bir olasılık ile ilişkilidir, sistemik lupus eritematozus veya kalp yetmezliği olan hastalarda ve ikincisi durumunda endotel kökenli veziküllerin yüksek sayıda rapor. Özellikle kanser, kandaki AGH halen tanısal ve prognostik değeri olan yeni biyomarkerların olarak tartışılmaktadır. Bu MUC1, EGFR veya FAK tümör-ilişkili proteinler eksprese MVs seviyeleri meme kanserli hastaların 15,16 kanında yükselmiş olarak görülmektedir. Ayrıca EXOS için son zamanlarda yapılan çalışmalar gibi glipikan-1 erken hastalık DE izin göğüs kanseri için pankreas kanseri veya del-1 için olduğu gibi, tümör spesifik antijenler taşıyan kan türevi EXOS göstermiştiryüksek özgüllük ve duyarlılık 17,18 ile koruması. Buna ek olarak, serum kaynaklı tümör Exos gibi Kras ve tedavi tahmini 19 için kullanımlarını göstermektedir p53 gibi mutasyonların saptanması için kullanılabilir DNA içerebilir. Son gelişmeler, belirli bir mikroakışkan çip ile glioblastoma hastaların kanında EXOS bu analiz tedavisi 20 izlenmesine olanak sağlar göstermiştir. Birlikte ele alındığında, bu bulgular veziküllerin hastalığa özgü alt popülasyonlar analizi tanı, prognoz yanı sıra tedavi seçenekleri ve başarı hakkında değerli bilgiler verir ima. Bununla birlikte, kan EXOS izolasyonu ve analizi, zaman alıcıdır, özel laboratuar ekipmanları gerektirir ve bu nedenle henüz rutin klinik teşhis için uygun değildir. Bunun aksine, MVs bu EXOS 18 için gerekli olan sitometri lateks boncuk çift bunları gerek kalmadan kolayca akış sitometrisi ile analiz edilebilir nedeniyle büyük bir boyuta, çok daha hızlı biçimde izole edilebilir ve21. Bu nedenle, burada kan örneklerinden MVs standartlaştırılmış izolasyonu ve akış sitometrisi ile OG altgrupları müteakip özellik tayini için kullanılabilecek bir protokol mevcut. Bu protokol, daha fazla çalışma ve günlük klinik teşhis için MVS kullanmak için gerekli olacak büyük hasta gruplarında OG profilleri derinliği karakterizasyonu sağlayacaktır.

<table><tbody><tr><td>butterfly needle (21 gauge)</td><td>Hospira Deutschland GmbH</td><td>490P29201</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin Fraction V</td><td>Roth</td><td>8076.3</td><td>For 10x TBS weigh 24.2 g Tris base and 80 g NaCl, ad 1 L H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and adjust pH to 7.6</td></tr><tr><td colspan="4">For 1x TBS-T mix 100 mL 10x TBS with 900 mL H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and add 1 mL Tween-20</td></tr><tr><td>CD235a-PE</td><td>Beckman Coulter</td><td>A07792</td><td>use 5 &amp;micro;l for staining</td></tr><tr><td>CD45-FITC</td><td>Beckman Coulter</td><td>7782</td><td>use 5 &amp;micro;l for staining</td></tr><tr><td>CD62E-PE</td><td>Biolegend</td><td>336008</td><td>use 0.8 &amp;micro;g for staining</td></tr><tr><td>CD62P-PE</td><td>Biolegend</td><td>304905</td><td>use 0.1 &amp;micro;g for staining</td></tr><tr><td>CD81 antibody</td><td>Biolegend</td><td>349501</td><td>1:2,000 in 5% BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting</td></tr><tr><td>CD9 antibody</td><td>Immunotools</td><td>21270091</td><td>1:1,000 in 5% BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting</td></tr><tr><td>Chemiluminescence imager ImageQuant LAS-4000</td><td>Fujitsu Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DC protein assay kit II</td><td>Bio-Rad</td><td>5000112</td><td></td></tr><tr><td>ECL detection reagent</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>EDTA vacutainers for blood collection</td><td>Sarstedt</td><td>01.1605.001</td><td></td></tr><tr><td>FACSCanto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fetal calf serum (FCS)</td><td>Invitrogen</td><td>10091148</td><td>heat-inactivated (30 min, 56 &amp;deg;C)</td></tr><tr><td>filter 0.22 &amp;micro;m</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>HRP-coupled anti-mouse secondary antibody</td><td>santa cruz</td><td>sc-2005</td><td>use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T</td></tr><tr><td>HRP-coupled anti-rabbit secondary antibody</td><td>santa cruz</td><td>sc-2004</td><td>use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T</td></tr><tr><td>4x Laemmli loading buffer, Roti-Load 1</td><td>Roth</td><td>K929.1</td><td></td></tr><tr><td>microfuge SIGMA 1-15K</td><td>Sigma Laborzentrifugen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>milk powder (Blotting-Grade Blocker, nonfat dry milk)</td><td>BioRad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>multifuge 3 L-R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight LM10</td><td>NanoSight Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS, w/o Ca and Mg</td><td>Pan biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>perfusor syringe 50 mL</td><td>Braun</td><td>8728844F</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau-S staining solution</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A2935,0500</td><td></td></tr><tr><td>rotor Sw32.1 Ti for ultracentrifugation (6 x 17 mL)</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rotor TLA-120.2 for ultracentrifugation (10 x 1.5 mL)</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubes for flow cytometry (5 mL, round-bottom)</td><td>BD Biosciences</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>tubes for ultracentrifugation (15 mL)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344061</td><td></td></tr><tr><td>tubes for ultracentrifugation (11* 34 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>Tubulin antibody</td><td>Millipore</td><td>05-829</td><td>1:5,000 in 5%BSA in TBST</td></tr><tr><td>ultracentrifuge Optima L-80 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultracentrifuge TL-100</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>valve filter Seraplas V15</td><td>Sarstedt</td><td>53,428</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and characterization of microvesicles from peripheral blood

küçük endozomal türetilmiş Eksozomlann (Exos, çap &lt;100 nm) ve büyük plazma zarı kaynaklı microvesicles (MVs, çap&gt; 100 nm) dahil dışı veziküller (AGH) serbest bırakılması bütün canlı hücrelerde meydana temel hücresel bir süreçtir. Geldikleri hücre için ve in vitro çalışmalar belirli Bu veziküller taşıyıcı proteinler, lipidler ve nükleik asitler arası iletişimin arabulucu olarak önemlerini sermiştir. EVs başarıyla çeşitli vücut sıvılarından izole edilmiştir ve kan, özellikle EVs kanser veya bulaşıcı hastalıklar için biyolojik sözü olarak tespit edilmiştir. Kandaki MV alt popülasyonlarının çalışma imkan vermek üzere, periferik kan örneklerinden MVs standartlaştırılmış izolasyonu ve karakterizasyonu için bir protokol mevcut. MVs diferansiyel santrifüjleme ile EDTA antikoagüle Plazma örneklerinden topak haline getirildi ve tipik olarak 100 bir çapa sahip olan - 600 nm. Nedeniyle büyük bir boyuta, onlarKolayca flow sitometri, rutin klinik teşhis kullanılan ve en laboratuvarlarda mevcut olan bir teknikle incelenecektir. İzole MVs kalite kontrol testleri için birkaç örnek verilecektir ve kan farklı OG alt toplulukların ayrımı için kullanılabilen işaretleyiciler sunulacaktır.

tarif edilen protokol takip izole edilebilir MVs verimini ölçmek amacıyla, 10 donörlerin kan numunelerinden izole MVs miktarı hesaplanmıştır. Bir Lowry protein deneyinde değerlendirildi OG verim mL kan için 19.2 ug MVs (Tablo 1) &#39;in bir ortalama ug ila 30 kadar, 10 arasında değişmektedir. Nanoparçacık izleme analizi (NTA) ile tespit edilen partikül konsantrasyonu, 1.66 x 10 9&#39;dan ml plazma, numune başına 5.9 x 10 9 parçacıklar (Tablo 2), ortalama 2.36 x 10 ila 10 arasında değişmektedir. Transmisyon elektron mikroskobu ile MVs ileri karakterizasyonu bir lipit çift katmanı ile çevrili ve herhangi bir hücre organelleri (Şekil 1A) içermeyen bir çapı&gt; 100 nm olan veziküller nüfusu ortaya koymuştur. NTA izole MVs büyüklüğü 600 nm (Şekil 1 b) ve ortalama OG boyutuna kadar 100 arasında değişmektedir doğruladı 201 idimil (Şekil 1C). Western Blot tarafından tipik OG ve Exo belirteçleri için boyama izole MVs tubulin pozitif ve Exos tubulin negatif ve BS9 ve CD81 (Şekil 2) zenginleştirilmiş ise sadece, BS9 ve CD81 hafif bir ifade gösterdi olduğunu gösterdi. Akış sitometrisi (Şekil 3A) izole MVs analizi, normal olarak hücre kültür süpernatanlarından izole MVs için kullanılan ile aynı parametreler kullanılarak kapı olabilir tanımlanmış bir vezikül popülasyonu ortaya ve PBS ölçümü ile elde edilen arka plan sinyali açıkça farklıdır + % 1 MVs (Şekil 3B) ilavesi olmaksızın FCS veziküller tükenmiş. Kanda mevcut farklı OG popülasyonları analiz etmek için, MVs ör CD62P, trombosit türevli MVS, CD45 lökosit-türevi MVS, CD235a, farklı kan hücre popülasyonları için kurulan işaretleri ile boyandıKırmızı kan endotel hücre-türevli MVs (Şekil 4) MVs ve CD62E hücre kökenli. Bu nitelendirme MVs çoğunluğu tüm örneklerde trombositler tarafından döken gibiydi iken OG alt popülasyonlar yüzdesi araştırılmıştır donör kan örnekleri arasında farklılık göstermiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig1.jpg" /> Şekil 1: periferik kandan izole MVs boyutları dağılımı. A, izole edilmiş MVs transmisyon elektron mikroskobu ile görülür hale getirilirler. B, veziküllerin boyut dağılımına gösteren MVs temsili nanopartikül izleme analizi (NTA). C, 10 bağımsız hazırlıkları ortalama MV boyutu NTA (ortalama) ile ölçüldü. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig1large.jpg" target="_blank">Al görmek için buraya tıklayınız</a>Bu rakamın Arger sürümü. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig2.jpg" /> Şekil 2: Western Blot ile izole edilmiş MVs karakterizasyonu. İki vericilerden izole MVs ve EXOS Diferansiyel Protein ifadesi, western lekeleme ile görselleştirildi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55057/55057fig3.jpg" /> Şekil 3: Akış Sitometrisi ile MVS analizi. A, MVs ilk ilgili OG nüfus kapısına sidescatter (SSC) araziler karşı ileri (FSC) görsel edilir. Daha sonra, bu MVs ilgili antijen tarafından karakterize edilir<html> antijene karşı floresan etiketli antikorlar kullanılarak. B, iki donörlerin plazmadan izole MVS SSC araziler karşı Tipik FSC. Karşılaştırma olarak, sadece PBS +% 1 vezikül tükenmiş MVs olmayan FCS kullanarak hücre kültürü üstte yüzen hem de bir negatif kontrol izole A549 akciğer kanseri hücreleri, tümör hücresi türevli MVs için tipik bir arsa sağ tarafta gösterilmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55057/55057fig4.jpg" /> Şekil 4: Akış Sitometrisi ile İzole MVS karakterizasyonu. Üç vericiden MVs akış sitometrisi ile oluşturulan kan hücre belirteçleri (kırmızı) ekspresyonu için karakterize edilmiştir. İlgili izotip kontrolleri gri renkle gösterilir.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Örnek </td><td> MVs / ml kan [ug] </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 29.4 </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 10.3 </td></tr><tr><td> 3. </td><td> 15.2 </td></tr><tr><td> 4. </td><td> 31.1 </td></tr><tr><td> 5. </td><td> 18.8 </td></tr><tr><td> 6. </td><td> 22.7 </td></tr><tr><td> 7. </td><td> 19.1 </td></tr><tr><td> 8. </td><td> 18.7 </td></tr><tr><td> 9. </td><td> 15.0 </td></tr><tr><td> 10. </td><td> 11.9 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Periferik Kan Örneklerinden OG Protein Verimi. </strong&gt; Gösterilen 10 donörlerden alınan mL periferik kandan başına MVS miktarıdır. OG verimleri Lowry testi ile ölçülmüştür. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Örnek </td><td> MVs / ml plazma [partikül sayımı] </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 6.42E + 09 </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 2.36E + 10 </td></tr><tr><td> 3. </td><td> 1.88E + 09 </td></tr><tr><td> 4. </td><td> 6.51E + 09 </td></tr><tr><td> 5. </td><td> 3.48E + 09 </td></tr><tr><td> 6. </td><td> 4.57E + 09 </td></tr><tr><td> 7. </td><td> 2.09E + 09 </td></tr><tr><td> 8. </td><td> 1.66E + 09 </td></tr><tr><td> 9. </td><td> 2.54E + 09 </td></tr><tr><td> 10. </td><td> 6.20E + 09 </td></tr></tbody></table> Tablo 2: Periferik Kan Örneklerinden MV Parçacık Verim. </stRong&gt; MV 10 donörler ve partikül sayımları nanoparçacık izleme analizi ile belirlendi plazma örneklerinden izole edilmiştir. Üç bağımsız ölçümün ima edilen bir değerdir gösterilmiştir.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood at JoVE.com

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

Periferik kan Microvesicles izolasyonu ve özelliklerinin belirlenmesi

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

isolation-and-characterization-of-microvesicles-from-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Biology

23.0K Görüntüleme.  University Medical Center Göttingen. Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting. 

Video: Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released from many cell types and play a pivotal role in regulating cell-cell communication and a diverse range of biological processes. Many different methods for the characterization of EVs have been described. However, most of these methods have the disadvantage that the preparation and characterization of the samples are very time-consuming, or it is extremely difficult to analyze specific markers of interest due to their small size and due to the lack of discrete populations. While methods for analysis of EVs have been considerably improved over the last decade, there is still no standardized method for characterization of single EVs. Here, we demonstrate a semi-automated method for characterization of single EVs by fluorescence-based nanoparticle-tracking analysis. The protocol that is presented addresses the common problem of many researchers in this field and provides the complete workflow for rapid isolation of EVs and characterization with PKH67, a general cell membrane linker, as well as with specific surface markers such as CD63, CD9, vimentin, and lysosomal-associated membrane protein 1 (LAMP-1). The presented results show a high level of reproducibility, as confirmed by other methods, such as Western blotting. In the conducted experiments, we exclusively used EVs isolated from human serum samples, but this method is also suitable for plasma or other body fluids and can be adjusted for characterization of EVs from cell culture supernatants. Irrespective of the future progress of research on EV biology, the protocol that is presented here provides a rapid and reliable method for rapid characterization of single EVs with specific markers.

In this protocol, we describe the complete workflow for rapid isolation of extracellular vesicles from human whole blood and characterization of specific markers by fluorescence-based nanoparticle-tracking analysis. The presented results show a high level of reproducibility and can be adjusted to cell culture supernatants.

İnsan kanı nanopartikül izleme analizi ile tek hücre dışı veziküller floresans tabanlı hızlı karakterizasyonu

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Biyokimya

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides (MF) and S&#233;zary syndrome (SS) represent the most common subtypes. Despite a number of studies on characterizing gene expression, genetic alterations, and epigenetic abnormalities of CTCL, the molecular pathogenesis of MF/SS remains unclear. MF refers to the more common CTCL with a skin-predominance, and is usually limited to skin, whereas&#160;SS is an aggressive leukemic variant of CTCL with widespread skin involvement and is characterized by neoplastic distribution mainly involving blood, skin, and lymph node. Focusing on clinical practice, the identification of gene expression biomarkers has&#160;enormous potential to improve diagnosis and treatment of MF/SS. Indeed, recent transcriptomic studies have identified potential diagnostic biomarkers from differences in gene expression between normal and malignant T cells, which may improve our understanding of SS biology, and reveal potential therapeutic targets. This manuscript describes a detailed reproducible protocol for the isolation of peripheral blood mononuclear cells from fresh whole blood from patients diagnosed with SS, selection of CD4+ memory T cells (CD4+CD45RO+ T cells), chemical stimulation, and preparation of RNA suitable for transcriptomic profiling to discover novel prognostic molecular markers to gain additional insight in disease etiology. The stimulation using chemical agonist to activate nuclear regulation provides more specific assessment for pathways important in the dynamic transcription regulation and gene expression and eliminates confounding defects that may arise from upstream signaling defects arising from TCR antigen loss at the cell membrane. The data obtained from comparison of transcriptome of unstimulated to stimulated SS T cells unmasks functional regulatory gene expression defects not evident from analysis of quiescent unstimulated cells. Furthermore, the method outlined from this approach can be adapted for studying T cell gene expression defects in other T cell immune diseases.

We present a simple protocol for the isolation of peripheral blood mononuclear cells from whole blood obtained from patients diagnosed with S&#233;zary Syndrome, followed by selection of CD4+ T cells, their stimulation with phorbol12-myristate13-acetate and A23187 ionophore, and preparation of RNA for transcriptomic profiling.

Transkriptomik Profilleme için İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin ve CD4 + T hücrelerinin Sézary Sendromu Hastalarından İzole Edilmesi

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Kanser Araştırmaları

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain nucleic acid and protein cargo and are increasingly recognized as a means of intercellular communication utilized by both eukaryote and prokaryote cells. However, due to their small size, current protocols for isolation of EVs are often time consuming, cumbersome, and require large sample volumes and expensive equipment, such as an ultracentrifuge. To address these limitations, we developed a paper-based immunoaffinity platform for separating subgroups of EVs that is easy, efficient, and requires sample volumes as low as 10 &#956;l. Biological samples can be pipetted directly onto paper test zones that have been chemically modified with capture molecules that have high affinity to specific EV surface markers. We validate the assay by using scanning electron microscopy (SEM), paper-based enzyme-linked immunosorbent assays (P-ELISA), and transcriptome analysis. These paper-based devices will enable the study of EVs in the clinic and the research setting to help advance our understanding of EV functions in health and disease.

This protocol details a method to isolate extracellular vesicles (EVs), small membranous particles released from cells, from as little as 10 &#956;l serum samples. This approach circumvents the need for ultracentrifugation, requires only a few minutes of assay time, and enables the isolation of EVs from samples of limited volumes.

Ekstrasellüler Veziküller Yalıtım ve Karakterizasyonu için kağıt tabanlı cihazlar

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Biyomühendislik

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

HIV-1 pozitif Bireylerin Plazma eksozomlann izolasyonu

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

İzolasyon ve profil MicroRNA içeren İnsan Bile dan ekzozomlar

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Tıp

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) containing immunologically active molecules. Knowledge regarding the molecular mechanisms of vesicle biogenesis, the content of the vesicles, and their functions at the pathogen-host interface is very limited. Addressing these questions requires rigorous procedures for isolation, purification, and validation of EVs. Previously, vesicle production was found to be enhanced when M. tuberculosis was exposed to iron restriction, a condition encountered by Mtb in the host environment. Presented here is a complete and detailed protocol to isolate and purify EVs from iron-deficient mycobacteria. Quantitative and qualitative methods are applied to validate purified EVs.

Mycobacterium tuberculosis shows increased production and release of extracellular vesicles in response to low iron conditions. This work details a protocol for generating low iron conditions and methods for the purification and characterization of mycobacterial extracellular vesicles released in response to iron deficiency.

Demir sınırlı Mycobacteria tarafından üretilen Ekstrasellüler Veziküllerin İzolasyon ve Karakterizasyonu

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...

Isolation of Splenic Microvesicles in a Murine Model of Intraperitoneal Bacterial Infection

Microvesicles (MVs) are submicron fragments released from the plasma membrane of activated cells that act as proinflammatory and procoagulant cellular effectors. In rats, spleen MVs (SMVs) are surrogate markers of pathophysiological conditions. Previous in vitro studies demonstrated that Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis), a major periodontal pathogen, enables&#160;the endothelial shedding and apoptosis while lipopolysaccharide (LPS) favors the shedding of splenocyte-derived microvesicles (SMVs). In vivo studies showed the feasibility of pharmacological control of SMV shedding. The present protocol establishes a standardized procedure for isolating splenic SMVs from the P. gingivalis acute murine infection model.&#160;P. gingivalis infection was induced in young C57BL/6 mice by intraperitoneal injection (three injections of 5 x 107 bacteria/week). After two weeks, the spleens were collected, weighed, and the splenocytes were counted. SMVs were isolated and quantified by protein, RNA, and prothrombinase assays. Cell viability was assessed by either propidium iodide or trypan blue exclusion dyes. Following splenocyte extraction, neutrophil counts were obtained by flow cytometry after 24 h of splenocyte culture. In P. gingivalis-injected mice, a 2.5-fold increase in spleen weight and a 2.3-fold rise in the splenocyte count were observed, while the neutrophils count was enhanced by 40-folds. The cell viability of splenocytes from P. gingivalis-injected mice ranged from 75%-96% and was decreased by 50% after 24 h of culture without any significant difference compared to unexposed controls. However, splenocytes from injected mice shed higher amounts of MVs by prothrombinase assay or protein measurements. The data demonstrate that the procoagulant SMVs are reliable tools to assess an early spleen response to intraperitoneal&#160;P. gingivalis infection.

<meta charset="utf8"></head><body>İntraperitoneal Bakteriyel Enfeksiyonun Murin Modelinde Splenik Mikroveziküllerin İzolasyonu

Microvesicles shed from the plasma membrane act as cellular effectors. Spleen microvesicles (SMVs) are surrogate markers of pathophysiological conditions. In rats and mice, SMV content and properties characterize aging or inflammation and are altered by cytoprotective treatments, making them a valuable yet abundant monitoring tool for preclinical research.

İntraperitoneal Bakteriyel Enfeksiyonun Murin Modelinde Splenik Mikroveziküllerin İzolasyonu

Microvesicles (MVs) are submicron fragments released from the plasma membrane of activated cells that act as proinflammatory and procoagulant cellular ...

Biyoloji

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important players in the maintenance of organismal homeostasis and the progression of a wide spectrum of diseases. While the current research focuses on the characterization of endogenous exosomes with the endosomal origin, microvesicles blebbing from the plasma membrane have gained increasing attention in health and sickness, which are featured by an abundance of surface molecules recapitulating the membrane signature of parent cells. Here, a reproducible procedure is presented based on differential centrifugation for extracting and characterizing EVs from the plasma and solid tissues, such as the bone. The protocol further describes subsequent profiling of surface antigens and protein cargos of EVs, which are thus traceable for their derivations and identified with components related to potential function. This method will be useful for correlative, functional, and mechanistic analysis of EVs in biological, physiological, and pathological studies.

The present protocol describes a method to extract extracellular vesicles from the peripheral blood and solid tissues with subsequent profiling of surface antigens and protein cargos.

Plazma ve Solid Dokulardan İzlenebilir ve İşlevselleştirilmiş Hücre Dışı Veziküllerin İzlenmesi ve Analizi

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological regulators of organismal homeostasis and important indicators of pathologies; in the meantime, their immense potential to establish accessible and controllable disease therapeutics is emerging. Mesenchymal stem cells (MSCs) can release large amounts of EVs in culture, which have shown promise to jumpstart effective tissue regeneration and facilitate extensive therapeutic applications with good scalability and reproducibility. There is a growing demand for simple and effective protocols for collecting and applying MSC-EVs. Here, a detailed protocol is provided based on differential centrifugation to isolate and characterize representative EVs from cultured human MSCs, exosomes, and microvesicles for further applications. The adaptability of this method is shown for a series of downstream approaches, such as labeling, local transplantation, and systemic injection. The implementation of this procedure will address the need for simple and reliable MSC-EVs collection and application in translational research.

The present protocol describes the differential centrifugation for isolating and characterizing representative EVs (exosomes and microvesicles) from cultured human MSCs. Further applications of these EVs are also explained in this article.

Kültürlenmiş İnsan Mezenkimal Kök Hücrelerinden Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Terapötik Uygulaması

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

Periferik kan Microvesicles izolasyonu ve özelliklerinin belirlenmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

İnsan kanı nanopartikül izleme analizi ile tek hücre dışı veziküller floresans tabanlı hızlı karakterizasyonu

Transkriptomik Profilleme için İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin ve CD4 + T hücrelerinin Sézary Sendromu Hastalarından İzole Edilmesi

Ekstrasellüler Veziküller Yalıtım ve Karakterizasyonu için kağıt tabanlı cihazlar

HIV-1 pozitif Bireylerin Plazma eksozomlann izolasyonu

İzolasyon ve profil MicroRNA içeren İnsan Bile dan ekzozomlar

Demir sınırlı Mycobacteria tarafından üretilen Ekstrasellüler Veziküllerin İzolasyon ve Karakterizasyonu

İntraperitoneal Bakteriyel Enfeksiyonun Murin Modelinde Splenik Mikroveziküllerin İzolasyonu

İntraperitoneal Bakteriyel Enfeksiyonun Murin Modelinde Splenik Mikroveziküllerin İzolasyonu

Plazma ve Solid Dokulardan İzlenebilir ve İşlevselleştirilmiş Hücre Dışı Veziküllerin İzlenmesi ve Analizi

Kültürlenmiş İnsan Mezenkimal Kök Hücrelerinden Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Terapötik Uygulaması