Bu protokol, lenfositler T hücrelerini hastalıklı hastalardan çalışmalar, moleküler defekt ve immünolojik defekt için izole etme yeteneğini sağlar. Bu yöntem, canlı hücreleri, RNA, DNA ve proteinin saflaştırılması için hastalık anormallikleri olan hücreleri bu hastalardan izole etmemizi sağlar ve patogenezde önemli olan yol anormalliklerini anlamak için moleküler defektleri karakterize etmemizi sağlar. Bu yöntem, normal durumlarda kan hücrelerini ve ayrıca bağışıklık anormallikleri olan hastalıklardan kan hücrelerini incelemek için daha da fraksiyone edilebilen periferik kanın izolasyonu için değerlidir.
Bu prosedürü gösteren, laboratuvarımdan tıp öğrencisi araştırma görevlisi olan Alanna olacak. Antikoagülan içeren beş adet 10 mililitrelik tüpte periferik bir kan örneği elde ettikten sonra, 10 ila 15 mililitre kanı, konu numarasıyla etiketlenmiş 50 mililitrelik ayırma tüplerine aktarın ve numuneleri en az iki kat, ancak HBSS ile tüp başına en fazla 35 mililitreye seyreltin. Kanın altını tüp başına yaklaşık 13 mililitre yoğunluk ortamı ile dikkatlice ve yavaşça yerleştirin ve kabarcıkları önlemek için pipet neredeyse boşken pipetlemeyi durdurun.
Kan ve yoğunluk orta katmanlarının karışmasını önlemek için pipeti yavaşça çıkarın ve doldurulmuş ayırma tüplerini katmanları rahatsız etmeden dikkatlice santrifüje aktarın. Hücreleri santrifüjleme ile ayırdıktan sonra, buffy katını dikkatlice ve yavaşça toplamadan önce, üst tabakayı içeren plazmanın son 10 mililitresi hariç hepsini çıkarın. Buffy kaplamayı iki ayırma tüpü arasındaki tek etiketli steril 50 mililitrelik bir tüpte toplayın ve PBMC'yi taze HBSS ile tüp başına toplam 50 mililitreye kadar en az iki kat seyreltin.
Tüm kabarık katlar toplandığında, hücreleri santrifüjleme ile pelet edin ve her tüpten mümkün olduğunca fazla süpernatant çıkarın. Peleti gevşetmek için tüp tabanına dokunun ve peletleri tüp başına orijinal 10 mililitre kan numunesi hacmi başına bir ila iki mililitre ACK lizis tamponunda yeniden askıya alın. Tam olarak beş dakika sonra, her tüpteki lizisi eşit veya daha büyük bir HBSS hacmiyle durdurun ve her bir hacmi 50 mililitreye ayarlayın.
Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı atın, hücreleri aynı donörden toplayın ve başka bir santrifüjleme için taze HBSS ile 50 mililitreye kadar hacim getirin. Daha sonra hücreleri saymak için 10 mililitre 37 santigrat derece RP 10F ortamında yeniden askıya alın. CD4 + CD45RO + T hücresi saflaştırması için, hücreleri aşağı doğru döndürün ve PBMC'yi, seçim tampon konsantrasyonunun mililitresi başına yedinci hücrelere beş kez 10 ila 10 oranında seyreltin.
Hücreleri beş mililitrelik yuvarlak tabanlı polistiren tüpe aktarın ve nazik karıştırma ile bir mililitre numune başına 50 mikrolitre antikor kokteyli ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakika sonra, nazik karıştırma ile tüpe bir mililitre numune başına 50 mikrolitre manyetik parçacık eklemeden önce 30 saniye boyunca yüksek hızda vorteks manyetik parçacıkları. Taze seçim tamponu ve nazik karıştırma ile hacmi 2,5 mililitreye getirin ve tüpü 2,5 dakika boyunca bir mıknatıs üzerine yerleştirin.
Kuluçkanın sonunda, mıknatısı alın ve zenginleştirilmiş hücre süspansiyonunu yeni bir steril tüpe boşaltmak için tüpü sürekli bir hareketle ters çevirin. Hücre geri kazanımını arttırmak için, mıknatıs üzerinde 2,5 dakikalık bir inkübasyon için hareketsiz boncukları rahatsız etmeden tüpe 2,5 mililitre seçim tamponu ekleyin ve yıkamayı toplama tüpüne ekleyin, ardından bir hemositometre kullanarak canlı hücrelerin sayısını sayın ve akış sitometrisi ile hücre saflığını onaylayın. Hücreleri aktive etmek için, CD4 + CD45RO + T hücrelerini, 37 santigrat derece RP 10F orta konsantrasyonda mililitre başına beş kez 10 ila altıncı hücrelere ayarlayın ve hücreleri uygun büyüklükte kültür kaplarına tohumlayın.
Hücreleri nemlendirilmiş 37 santigrat derece,% 5 karbondioksit inkübatöründe gece boyunca dinlendirin. Ertesi sabah, dinlenmiş hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti 37 santigrat derece RP 10F orta konsantrasyonda mililitre başına beş kez 10 ila altıncı hücrelerde yeniden askıya alın. Süspansiyonu, üç steril vidalı kapak tüpünün her birinde altıncı hücre alikotlarına beş ila 10 çarpı 10'a bölün ve PMA ile tüp ikideki hücreleri ve A23187 ile üçüncü tüpü uyarın ve nazik karıştırma.
Araç kontrolü olarak hizmet etmek üzere ilk tüpe eşit miktarda dimetil sülfoksit ekleyin ve tüpleri uygun aktivasyon süresi için inkübatöre gevşetilmiş kapaklarla yerleştirin. Kuluçkanın sonunda, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve hücre peletini rahatsız etmeden mümkün olduğunca fazla süpernatant atın. Daha sonra hücreleri ticari olarak temin edilebilen bir RNA izolasyon kiti tarafından yönlendirildiği şekilde lize edin ve RNA'yı üreticinin talimatına göre izole edin.
Bu negatif seçim protokolü ile elde edilen CD4 + CD45RO + T hücrelerinin canlılığı ve saflığı sürekli olarak yüksektir. SS PBMC'lerden lökoredüksiyon sistemi odacıklarından elde edilen CD4 + CD45RO + T hücrelerinin verimi, normal donör PBMC'lerden yaklaşık% 16 ile karşılaştırıldığında tipik olarak yaklaşık% 75'tir. SS bellek T hücreleri ve SS PBMC'ler, normal donör T hücrelerinden ve PBMC'lerden gelen hücrelere kıyasla sitokin ve diğer bağışıklık tepkisi genlerini kötü ifade eder.
Ek olarak, normal donör T hücrelerinde normalde eksprese edilmeyen birçok gen, hem istirahatte hem de stimülasyondan sonra SS T hücrelerinde yüksek oranda eksprese edilir. İyi steril teknik ve tutarlı bir rutin bu tekniğin başarısı için gerçekten önemlidir. Ficoll'u katmanlarken, hassas kontrollü otomatik bir pipet kullanmanız ve Ficoll'u yerleştirdiğiniz hıza gerçekten dikkat etmeniz de gerçekten önemlidir.
Bu yöntem kullanılarak izole edilen hücreler uygulanabilir olacak ve toksisite çalışmaları, sinyal iletim yolaklarının karakterizasyonu için moleküler biyokimyasal çalışmalar, akış sitometrisi ve gen ekspresyon çalışmaları için kullanılabilecektir. Yöntem, hücreleri hastalığı olan hastalardan izole etmek, enflamatuar hastalıklar için ve ayrıca doğrudan çalışmalar için kanserler gibi diğer hastalıklar için kullanılabilir. Bu hastalıklara örnek olarak sedef hastalığı ve atopik dermatit verilebilir.
