Bu protokol, çoğu kan ve katı dokudan doğru hücre dışı vezikülleri izole etmek ve toplamak, özellikle kaynaklarını ve protein içeriklerini analiz etmek için uygun bir yol sağlar, bu da daha fazla fonksiyonel deneye yardımcı olur. Yüksek verim ve düşük kontaminasyonun yanı sıra, bu protokolün temel avantajı, fizyolojik ve patolojik çalışmalar için yararlı olan EV'lerin yüzey antijenlerinin ve protein yüklerinin analizidir. Bir akış sitometresi ile hücre dışı veziküllerin ebeveyn hücrelerinin yüzey belirteçlerinin tespiti yoluyla enflamatuar hastalıklar ve osteoporoz gibi hastalıkların kanserlerinin teşhisini kolaylaştırır.
Doku hücre dışı vezikül miktarı aşağıdaki deneyler için kritik öneme sahiptir. Hücre dışı vezikül konsantrasyonunun yüksek olmadığından emin olun. Seyreltmeyi gerçekleştirmek için sabırlı olun.
Başlamak için, maksiller kemiği oftalmik cımbız ve makasla izole ederek maksiller kemik örneklerini hazırlayın ve cımbızla yumuşak dokulardan kurtulmak için PBS ile yıkayın. Daha sonra maksiller kemiği 1.5 mililitrelik santrifüj tüplerine koyun ve kemiği makasla çapı bir milimetre olan küçük parçalara bölün. Dokuyu örtmek için belirli miktarda Liberaz ekleyin ve 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin.
Daha sonra, numuneyi 800 G'de dört santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantı bir pipetle dikkatlice yeni ve temiz bir 1,5 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın. Büyük hücre kalıntılarını ve kalan trombositleri çıkarmak için hazırlanan plazma ve kemik örneklerini 2.500 G ve dört santigrat derecede 15 dakika boyunca santrifüj ettikten sonra, süpernatantları yeni ve temiz 1.5 mililitrelik santrifüj tüplerine dikkatlice aktarın ve dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 16.800 G'de santrifüj. Daha sonra, süpernatantı atın ve her tüpteki peletleri bir mililitre PBS ile yeniden askıya alın.
Daha önce gösterildiği gibi süpernatantı santrifüj ettikten ve attıktan sonra, yine, her tüpteki peletleri 50 mikrolitre PBS ile yeniden askıya alın ve bu numuneleri 24 saatten daha az bir süre boyunca dört santigrat derecede saklayın veya tercihen analizler için hemen kullanın. Numuneleri 500 mikrolitre PBS ile yeniden askıya alın ve 50 mikrolitreyi, A tüpü olarak etiketlenmiş boş bir kontrol olarak yeni ve temiz bir 1,5 mililitre santrifüj tüpüne ve 50 mikrolitreyi, B tüpü olarak etiketlenmiş FITC için basit bir boyama tüpü olarak başka bir temiz 1,5 mililitre santrifüj tüpüne aktarın. Birincil tüpü 16.800 G'de 30 dakika santrifüj ettikten ve süpernatanı attıktan sonra, peletleri 200 mikrolitre PBS ile yeniden askıya alın.
Her 50 mikrolitrelik numuneyi, tüp C olarak etiketlenmiş PE için basit boyama tüpleri, tüp D olarak etiketlenmiş yüzey işaretleyici boyama ve tüp E olarak etiketlenmiş ikincil antikor kontrolleri için dört adet 1,5 mililitrelik santrifüj tüpüne bölün.Osteoklast ilişkili reseptör ve kemik hücre dışı vezikül örneklerinin birincil antikorunu ve ayrıca CD-18 antikoru ve plazma hücre dışı vezikül örneklerini B tüpüne ve tüp D'ye ayrı ayrı ekleyin, dört santigrat derecede bir saat boyunca inkübasyon. Tüpleri santrifüj edin ve daha önce gösterildiği gibi süpernatantı atın ve peletleri 500 mikrolitre PBS ile yeniden askıya alın. Yine, ekstra birincil antikorları çıkarmak için 16, 800 G ve dört santigrat derecede 30 dakika boyunca santrifüj.
Süpernatantı attıktan sonra peletleri 50 mikrolitre PBS ile yeniden askıya alın, ardından tüpte sırasıyla FITC konjuge ikincil antikorlar ekleyerek E.Tüm tüpleri karanlıkta dört santigrat derecede bir saat boyunca inkübe edin. Bir damla 0.2, 0.5 ve bir mikrometre boyutunda boncuk süspansiyonunu sırasıyla bir mililitre PBS'ye seyreltin. Daha sonra, hücre dışı veziküller için seçilen kapıdan emin olmak için her bir boncuk boyutunu çalıştırın ve uygun bir ileri saçılma kullanarak boncukları ve hücre dışı vezikül popülasyonunu aramak için akış sitometresinin eşiğini ayarlayın.
Terminal koşulunu 100.000 membran boyalı partikülün hesaplanması olarak ayarlayın ve numuneyi makalede açıklandığı gibi bir akış sitometresi ile analiz edin. Peletleri 50 mikrolitre RIPA-lizis tamponunda tekrar askıya alın ve buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. BCA protein testi ile 96 kuyucuklu mikroplakadaki tüm numunelerin protein konsantrasyonlarını ölçmek için, BSA'nın mililitresi başına iki miligramı% 0.9 normal salin ile mililitre başına 0.5 miligrama seyreltin.
Mililitre BSA başına 0.5 miligramda ve normal salinin% 0.9'unda, belirli hacimlerde çoğaltılmış üç kuyucuğa. Daha sonra numunelerin iki mikrolitresini bırakın ve ayrı ayrı çoğaltılmış üç kuyucuğa 18 mikrolitre normal salin ekleyin. BCA reaktifi A'yı B reaktifi ile karıştırarak bir çalışma çözeltisi hazırladıktan sonra, her bir oyuğa 200 mikrolitre çalışma çözeltisi ekleyin ve 30 saniye boyunca hafifçe çalkalayın.
Daha sonra 96 kuyucuklu mikroplakayı 37 santigrat derecede 20 ila 25 dakika boyunca inkübe edin ve spektrofotometre ile 596 nanometrede optik yoğunluğu ölçün. Ardından, verileri dışa aktarın, standart bir eğri çizin ve numunelerin protein konsantrasyonunu hesaplayın. Sonuçlara göre, numuneleri% 0.9 normal salin ve SDS-PAGE yükleme tamponunun konsantrasyonunun beş katı ile mikrolitre başına bir mikrograma seyreltin ve tüpleri filmle sıkıca kapatın ve 100 santigrat derecede beş dakika ısıtın.
Numuneleri protein merdivenine% dört ila% 20 HEPy'nin tris jelinin gradyan konsantrasyonuna yükleyin. Jeli, proteinler bir çizgi oluşturana kadar 80 voltta çalışan tamponda çalıştırın. Ardından, yükleme boyası jelin dibinde olana kadar bir saat boyunca 120 volta geçin.
Jeli, 200 miliamperde bir saat boyunca aktarmak için ıslak bir transfer sistemi kullanarak 20 saniye boyunca metil alkolde önceden inkübe edilmiş poliviniliden florür membranına aktarın. 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne 2,5 gram BSA ve 50 mililitre TBST ekleyerek %5 BSA bloke edici tampon hazırlayın. Bu tampondaki membranları oda sıcaklığında iki saat boyunca ajitasyonla bloke edin.
Membranları, TBST ile seyreltilmiş spesifik primer antikorlarla inkübe edin, gece boyunca dört santigrat derecede uygun konsantrasyona getirin. Membranları yıkama tamponunda dört kez yıkayın ve çalkalama ile oda sıcaklığında bir saat boyunca uygun ikincil antikorlarla inkübe edin. Membranları yıkama tamponunda dört kez yıkadıktan sonra, bir jel görüntüleme sistemindeki kemilüminesans kitini kullanarak membranları görüntüleyin.
İletim elektron mikroskobu ve nanopartikül izleme analizi, hücre dışı veziküllerin tipik morfolojik özelliklerinin 500 ila 300 nanometre arasında değişen bir çapa sahip yuvarlak ve fincan şeklinde olduğunu ortaya koymuştur. Akış sitometrisi analizi, hücre dışı veziküller üzerinde eksprese edilen spesifik membran belirteçlerinin yüzdelerini gösterir ve bu da ana hücrelerden kökenlerini ima eder. Western blot analizi, PGD ve PKM2'nin ekspresyonunu, protein içeriği ve plazma hücre dışı veziküllerin ve kemik hücre dışı veziküllerin bir temsilcisi olarak gösterir ve metabolik durumu gösterir.
Hücre dışı veziküllerde Golgin-84'ün negatif ekspresyonu, mitofilin, Alfa-aktinin-4, Flotillin-1, Kaveolin-1 ve Beta-aktin'in vezikül markeri CD9 ile birlikte varlığı ile tespit edilirken, CD81 ekspresyonu, plazma hücre dışı veziküllerinde APO-A-1 varlığı eksikliği ile düşük veya yoktur. Araştırmacılar, bu nedenle adım 2.2'nin doku örneklerinin hazırlanması ve sindiriminin yeterli bir şekilde yapılması gerektiğini akılda tutarak. Aksi takdirde, dokulardan çıkarılan hücre dışı veziküllerin sayısı sınırlıdır.
Hücre dışı veziküllerin floresan boyası etiketli belirteç, potansiyel fonksiyona bağlı fazı tedavi etmek için ağıza enjekte edilebilir.
