Name: procedure and key optimization strategies for an automated capillary electrophoretic-based immunoassay method
Uploaded: 2017-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method at JoVE.com

Yazarlar Keith Tarpley bize EPA kayıt ve öğretim video düzenleme Office geliştirme, araştırma ve geliştirme-araştırma üçgen Parkı (ORD-RTP) grafik ve medya ekibinin teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca Deborah Pritchett ProteinSimple üzerinden bizim veri. duruma getirilmesi ile ilgili yararlı konuşmaları için teşekkür etmek istiyorum JM Guynn bilim ve eğitim araştırma/katılım programı ABD Çevre Koruma Kurumu, Oak Ridge Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.

Not: tüm reaktifler ve örnekleri üretici göre hazır sağlamak &#39; s protokolü, ana hatlar aşağı. Lütfen uygun bireysel koruma araçları nitril eldiven, önlük, kapalı parmaklı ayakkabılar ve koruyucu gözlük içerir Bu yordam sırasında giymek. Bir tablo belirli malzemeler, reaktifler ve gerekli ekipman ayrı olarak sağlanır. Örnekleri toplam protein konsantrasyonu-var belirlenen Bradford tahlil 11 gibi kullanılan, lysate arabellek ile uyumlu olan kurulan yöntemleri kullanılmadan önce.
 1. örnekleri ve Kimyasalları olarak üretici tarafından sağlanan standart paketinde hazırlanması <ol><li>dithiothreitol (DTT) 400 mM çalışma çözüm hazırlamak için açık tüp içeren 40 µL deiyonize su ekleyin Stok üretici tarafından sağlanan. Kabarcıklar çözümü çözüm yavaş ve yumuşak pipetting ile karıştırılarak tanıtımı önlemek önemlidir.</li>
	<li>Ekle 20 µL 10 X örnek arabellek ve floresan 5 X içeren pembe tüp için hazırlanan 400 mM DTT çözümün 20 µL master mix (Tablo reçetesi görmek). 
	Not: Master Mix (MM) bir folyo kapak ile üretici tarafından mühürlenmiş durumda ve pipet ucu tarafından deldi. DTT pipet sıçramasına önlemek için yavaş yavaş pipetting tarafından Mix.</li>
	<li>Sonra 16 µL deiyonize su ekleyin, 10 X örnek arabellek ve 2 µL hazırlanan 400 mM DTT çözüm için üretici tarafından sağlanan beyaz biotinylated merdiven tüp, 2 µL sağlanan. Karışımı yavaşça ve denaturing için bir 0.6 mL tüp içine transfer.</li>
	<li>Hazırlama 0.1 x tarafından sağlanan 10 su ile çözüm 1: 100 X sulandrarak örnek arabellek. Yeterli 0.1 x tüm örneklerini sulandırmak için örnek arabellek hazırlayın.</li>
	<li>Son istenen toplam protein konsantrasyonu bağlı olacak bir örnek eklenir 0.1 x örnek arabellek miktarını hesaplamak. Mix 1 Bölüm 5 floresan MM x 4 parça ile istenen son protein konsantrasyonu elde etmek için örnek seyreltilmiş.
	<ol><li>Hesaplama birimleri aşağıdaki gibi: (i) Cilt 5 x floresan MM (istenilen son protein konsantrasyonu) = / 5; (ii) protein stok hacmi (istenilen son protein konsantrasyonu x Toplam hacim gerekli) = / Protein hisse senedi toplama; (iii) birim 0.1 x örnek arabellek Toplam hacim - 5 MM birim x - Protein stok hacmi =.</li>
	</ol></li></ol> 2. Denatürasyon örnekleri ve merdiven <ol><li>hazırlanan yer örnekleri ve biotinylated merdiven 5 dk. girdap tüpler kuluçka, hemen sonra bir 95 ° C ısı bloğundaki yürütmek bir spin için ~ 5 s bir masa üstü santrifüj ve buz üzerinde yer 
	Not: Bazı proteinler, protein toplama önlemek ve göç kılcal matrisindeki geliştirmek için nazik denaturing koşulları (örneğin, 70 o C 10 dk) gerektirebilir. Eğer ağır yüksek moleküler ağırlık vasıl bulaşması (örneğin video bakınız) bu seçeneği düşünün.</li>
</ol> 3. Antikorların hazırlanması <ol>optimizasyonu ile saptanan <li>(Temsilcisi sonuçları ve video bakınız), birincil antikor (örneğin, 1:50, 1: 100) istenen dilution(s) sağlanan antikor hazırlamak Dilüent 2. 
	Not: Antikorlar genellikle daha yüksek konsantrasyonları immunoassay kılcal tabanlı geleneksel Batı kurutma için kullanılır. Sağlanan ikincil antikor seyreltme kullanıma hazırdır.</li>
</ol> 4. Luminol-S ve peroksit hazırlanması <ol><li>luminol-S ve peroksit 1:1 karışımı hazırlayın.</li>
	<li>Girdap karışımı ve buz üzerinde depolamak için 
	Not: Bu karışımı taze deneysel her tahlil için hazırlanır önemlidir. 250ul toplam karışımı tam bir tabak çalıştırmak için gerekli.</li>
</ol> 5. Tahlil plaka hazırlanması <ol><li> şekil 1 ' de gösterildiği gibi yük örnekleri ve yukarıda tahlil plaka hazırlanan Kimyasalları. Her satır için aşağıda ayrıntılı talimatlara bakın. Plaka kapak reaktif eklemeler arasında değiştirilir kuyulardan buharlaşma en aza indirmek için emin olun.</li>
	<li>İyi A1 içine A, damlalıklı 5 µL Biotinylated merdivenin satırda. İçin kalan satır, damlalıklı hazırlanan örnekleri (5 her µL) kuyu A2-A25. 
	Not: Kartuş ilk kılcal bu standart çalıştırmak için optimize edildiğinden bu A1 de her zaman merdiveni, içerir zorunludur.</li>
	<li>Satır B, antikor Dilüent 2 damlalıklı 10 µL her kuyuya (B1-B25).</li>
	<li>İyi C1 içine C, damlalıklı 10 µL antikor Dilüent 2 satırda. Kalan satır C kuyuları, birincil antikor (kuyu C2-C25) damlalıklı 10 µL.</li>
	<li>Satır D, damlalıklı 10 µL Streptavidin-HRP, iyi D1 içine. Kalan satırda D kuyuları, ikincil antikor (kuyu D2-D25) damlalıklı 10 µL.</li>
	<li>E, damlalıklı 10 µL her kuyuya (E1-E25) taze hazırlanmış luminol-peroksit karışımı satırdaki.</li>
	<li>Son olarak, Ekle yuvası başına 500 µL yıkama arabellek her top 3 satır arabellek Wells. 
	Not: Kabarcık oluşumu hafifçe pipetting ve kabarcıklar yükleme kılcal ile müdahale ve çalıştırabilirsiniz ucundan son hacim kovmak değil en aza indirmek önemlidir.</li>
	Bir kez tüm wells yüklü, <li>~ 1000 x g kabarcıklar kaldırmak ve kuyu dibinde sıvı olduğundan emin olmak için oda sıcaklığında 5 min için plaka santrifüj kapasitesi. Bir küçük pipet ucu veya temiz iğne ile herhangi bir görünür baloncuklar pop (örneğin, 25 göstergesi steril &#34; rep üst &#34; iğne).</li>
</ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig1.jpg" /> Resim 1 . Tahlil plaka için pipetting şablon. Renk kodlamasını uygun reaktifler ve tahlil plakasına eklendi örnekleri (24 toplam) temsil eder. Biotinylated merdiven örnekleri kuyulardan A2 A25 kadar hazırlanan iyi A1 (turuncu), Ekle (açık mavi), antikor Dilüent 2 kuyu B1-B25 ve C1 ' (açık yeşil), kuyu C2 C25 (mavi), streptavidin-HRP iyi D1 için kadar birincil antikor (koyu pembe), ikincil antikor D2 D25 kadar Kuyu yapımı (koyu yeşil) ve kuyu E1 E25 (mor) kadar luminol-peroksit karışımı. Yıkama arabellek daha büyük orta plaka ilk üç sıra eklendi wells (koyu mavi). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig1large.jpg" target="_blank"> Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
 6. kılcal immunoassay enstrüman başlayan <ol><li>araç ve eşlik eden bilgisayarın açık olduğundan emin olun. Hiçbir ısınma zamanı gereklidir.</li>
	<li>Bilgisayar araçları yazılımını açın. Önce seçin &#34; tahlil &#34; pencerenin sağ sekmesini ve &#34; yeni tahlil &#34; altında &#34; Dosya menüsü &#34; solda. Boyut, boyut aralığı (örneğin, 12-230 kDa) ve kartuş seçin özel tahlil için kullanılan türü (örneğin, 25 kılcal). 
	Not: Bir de giriş Mayıs tahlil parametrelerini, protein konsantrasyonu, antikor türü ve seyreltme, eğer dahil olmak üzere istenen ama bunlar tahlil başlatmak için gerekli değil.</li>
	<li>Turuncu panelinin üstüne düğmeye basarak kapıyı cihazda.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde onun paketinden kapiller kartuşu çıkarın. Cam kılcal kendilerini dokunmadan, kartuş, kartuş tutucusuna koyun. Mavi ve turuncu değiştirmek iç ışık gözlemleyerek kartuş oturma doğrulayın.</li>
	<li>Plaka sıkıca kenarda tutun ve buharlaşma mühür plaka alt bölümünden dikkatle akasındaki. Bu ayrılık matris wells bir sm ile görülen herhangi bir baloncuklar popBütün damlalıklı ipucu veya temiz iğne (örneğin, 25 göstergesi steril &#34; rep üst &#34; iğne).</li>
	<li>Tahlil plaka yer tam olarak oturduğundan, sağlanması plaka tutucu üzerinde ve enstrüman kapıyı kapat.</li>
	<li>Tıklama &#34; başlangıç &#34; yazılımında butonunu. 
	Not: Başlat düğmesi görünüyorsa araç ile bağlantı kesildi. Araç üst sol menüden seçin, ardından bağlayın. Bir pop-up araç seri numarası ile görünmelidir; Bu seçin ve sonra Bağlan'ı tıklatın. Başlat düğmesini şimdi görünmelidir.</li>
	Çalışma tamamlandıktan sonra <li>plaka atmak. Kartuşu ve elden çıkarma, pop baloncuklar için kullanılan herhangi bir iğne ile birlikte "Sharps" kapsayıcısı yer. Güç aracı düzenli olarak kullanılıyorsa, bağlantı sorunlarını önlemek için bırakın (örneğin, en az haftalık).</li>
</ol> 7. Deneme analiz <ol><li>analiz daha önce aşağıdaki kalite kontrolleri yapılmaktadır emin olun.
	<ol><li>Seçerek doğrula floresan standartları &#34; göstermek standartları &#34; simgesi. Standartlara doğru olarak tanımlanan onay &#34; grafiği &#34; sekme. Onlar doğru değilse, gidin &#34; tek görünüm &#34; simgesi, doğru tepe üzerinde sağ tıklayın ve seçin &#34; kuvvet standart &#34;, ya da yanlış tepe üzerinde sağ tıklayın ve seçin &#34; standart değil &#34;. Her yeni kılcal için bu denetimi yap.</li>
		Yanında tıkırtı üstünde <li>Doğrula biotinylated merdiven &#34; örnekleri &#34; ve &#34; tek görünüm &#34; simgeler. Merdiveni deney sekmesinde seçin. Bir tepe yanlış teşhis, doğru içinde tıkırtı üstünde &#34; grafik görünümü &#34; ve seçin &#34; Kaldır tepe &#34;. 
		Not: Örneğin, 12, 40, 66, 116, 180 ve 230 kDa boyutlandırma doruklarına 12-230 kDa teçhizat için kullanılan biotinylated merdiven göstermelidir. Eğer bu adım gerçekleştirilmez, örnek doruklarına boyutlandırma yanlış hesaplanır, sahte sonuç.</li>
		<li>Görünümü ve örnek doruklarına analiz. Molekül ağırlığı, pik alanı, pik yüksekliği ve sinyal-gürültü (S/N), deneysel hesaplamalar için gerektiği gibi de dahil olmak üzere zirveleri tablosundan veri türetmek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bradley, H. L., Sabnis, H., Pritchett, D., Bunting, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hematopoietic stem cell protocols. 1185, (2014).</li><li>Guo, L., Eldridge, S., Furniss, M., Mussio, J., Davis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+(hiPSC-CMs)+to+Monitor+Compound+Effects+on+Cardiac+Myocyte+Signaling+Pathways.">Use of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes (hiPSC-CMs) to Monitor Compound Effects on Cardiac Myocyte Signaling Pathways.</a> Curr Protoc Chem Biol. 7 (3), 141-185 (2015).</li><li>Chen, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantitation+of+endogenous+proteins+with+precision+and+accuracy+using+a+capillary+Western+system.">Absolute quantitation of endogenous proteins with precision and accuracy using a capillary Western system.</a> Anal Biochem. 442 (1), 97-103 (2013).</li><li>Chen, J. Q., Wakefield, L. M., Goldstein, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+nano-immunoassays:+advancing+quantitative+proteomics+analysis,+biomarker+assessment,+and+molecular+diagnostics.">Capillary nano-immunoassays: advancing quantitative proteomics analysis, biomarker assessment, and molecular diagnostics.</a> J Transl Med. 13, 182 (2015).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Application+of+a+Novel+Nanovolume+Capillary+Electrophoresis-+Based+Protein+Analysis+System+in+Personalized+&amp;+Translational+Medicine+Research.">The Application of a Novel Nanovolume Capillary Electrophoresis- Based Protein Analysis System in Personalized &amp; Translational Medicine Research.</a> J Bioanal Biomed. S3 (004), (2013).</li><li>ProteinSimple Western. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Size Assay Development Guide, Revision 1. , (2014).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies.">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> J Vis Exp. (93), (2014).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western++blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li><li>Silva, J. M., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fastest+Western+in+town:+a+contemporary+twist+on+the+classic+Western+blot+analysis.">The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis.</a> J Vis Exp. (84), e51149 (2014).</li><li>Thorn, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin+pathways:+pharmacodynamics+and+adverse+effects.">Doxorubicin pathways: pharmacodynamics and adverse effects.</a> Pharmacogenet Genomics. 21 (7), 440-446 (2011).</li><li>Ernst, O., Zor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linearization+of+the+bradford+protein+assay.">Linearization of the bradford protein assay.</a> J Vis Exp. (38), (2010).</li><li>Taira, N., Yoshida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+of+p53+tumor+suppressor:+determinants+of+its+functional+targets.">Post-translational modifications of p53 tumor suppressor: determinants of its functional targets.</a> Histol Histopathol. 27 (4), 437-443 (2012).</li><li>Thompson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+p53+on+key+serines+is+dispensable+for+transcriptional+activation+and+apoptosis.">Phosphorylation of p53 on key serines is dispensable for transcriptional activation and apoptosis.</a> J Biol Chem. 279 (51), 53015-53022 (2004).</li><li>Currier, J. M., Cheng, W. Y., Menendez, D., Conolly, R., Chorley, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+Gene+Biomarker+at+the+Tipping+Point+of+Adaptive+and+Adverse+Responses+in+Human+Bronchial+Epithelial+Cells.">Developing a Gene Biomarker at the Tipping Point of Adaptive and Adverse Responses in Human Bronchial Epithelial Cells.</a> PLoS One. 11 (5), e0155875 (2016).</li><li>Moser, A. C., Hage, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis-based+immunoassays:+principles+and+quantitative+applications.">Capillary electrophoresis-based immunoassays: principles and quantitative applications.</a> Electrophoresis. 29 (16), 3279-3295 (2008).</li><li>Shintani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Capillary Electrophoresis Applications. , (1997).</li><li>. Wes reagents and consumables :: ProteinSimple Available from: <a target="_blank" href="https://www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html">https://www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html</a> (2017)</li></ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin. Bu makale Ulusal Sağlık ve çevre etkileri araştırma laboratuvarı tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmış yayın için. İçerik bize EPA görüşlerini yansıtmayabilir ne de ticari adlar veya ticari ürünler söz ciro veya kullanım için tavsiye teşkil etmez.

On yıllardır, oldu sürekli Kapiler elektroforetik tabanlı immunoassay yöntem geliştirme ilgi işleme azalmıştır düşük örnek ve reaktif harcamaları nedeniyle, zaman zaman geleneksel yöntemlere göre ve yüksek uyumluluk için yordam4,15otomatikleştirmek. Kılcal damarlar, elektroforetik, electrokinetic, polimer eleme ve proteinler (sırasıyla farklı özelliklerine göre ayır, isoelectric yöntemleri de dahil olmak üzere kullanılan proteinler ayrılması için farklı iletişim kuralları vardır Elektrostatik yükü, bölüm denge, özellikleri ayıran matris ve pH eleme)16. Burada, bir otomatik ayırma, eleme bir polimer kullanarak antikor tabanlı (veya immunoassay) Kapiler elektroforez yöntemi ve ticari olarak kabul edilen3açıklayın. Bu sistemin avantajları kolaylığı kullanım ve işlem, standart ve piyasada bulunan reaktifler ve daha az reaktif ve geleneksel protein deneyleri Batı leke gibi karşılaştırıldığında örnekleri gerektirir güvenilir, duyarlı ölçümler şunlardır, enzim bağlı immunoassay ve diğer formatları3,4,5. O bu teknoloji önceki Değerlendirmeler içinde değerlendirilebilir protein boyutu aralığı tarafından kullanılabilir ayırma matris4ancak son teklifleri için 440 kDa17 2 Aralık ölçülebilir genişlettik, sınırlı dikkat edilmiştir . Buna ek olarak, bazı lysate arabellekleri tahlil18ile uyumsuz olduğu bilinmektedir, bu nedenle kullanılan deneysel reaktifler yelpazesi önceden dikkate alınmalıdır.
Bir otomatik işlemi piyasada bulunan bileşenleri ile önemli bir avantajı standartlaştırılmış yöntemler ve Kimyasalları ile sonuç tutarlılığını var. Bu tahlil başarısızlık yordam içinde kritik adımlar otomatikleştirerek bozmasını önler. Ancak, bazı uygulamalar için Kapiler elektroforetik tabanlı immunoassay sorunları en aza indirmek için protokol sırasında yapıştırılır gerekir olduğunu unutmamak gerekir. İlk olarak, bu luminol-S/peroksit karışımı taze ve hemen önce yükleme plakası hazırlanır önemlidir. Oksitleyici Ajan, sonra tahlil belirli antikor tayini için tutarlı ölçümleri ile sonuçlanır eklendikten sonra tutarlı zamanlama içinde tutarlı ışıldama neden olur. Ayrıca, süresi bitmemiş reaktifler, hangi öncelikle oksitleyici Ajan potens etkiler kullanılır önemlidir. Ayrıca, örnekleri, antikorlar ve diğer Kimyasalları yükleme sırasını kesinlikle (bkz. şekil 1) takip edilmesi önemlidir. Yersiz pipetted herhangi bir reaktif tahlil başarısızlık ve boşa koşmak sonuçlanır.
Kritik adımları yanı sıra, birincil sorunları tekniği ile deneyimli genellikle optimizasyon ile aşılabilir. Nitekim, bu koşullar her modeli sistem/antikor birleşimi için özeldir ve bu nedenle ampirik olarak her yeni tahlil için tespit edilmelidir. Bu makalede, biz üç ortak en iyi duruma getirme yordamı üzerinde odaklanmak: çekim hızı, lysate titrasyon ve birincil antikor seyreltme. Ne zaman luminol substrat hızla, substrat tükenmesi sonuçlarına sinyal kaybı tükenmiştir değil bir çekim hızı analizini ölçülebilir sonuçlar oluşturma yeteneği bağlıdır. Lysate titrasyon farklı model sistemleri, hem de aynı protein hedef için bile farklı antikorlar ile farklı olabilir her tahlil doğrusal dinamik aralığını belirler. Antikor dilutions veya konsantrasyonları doyurarak yakınındaki seçilmiş ücretsiz antikor yetersizliğinden, ancak kullanılabilir protein hedef epitope farklı miktarda sadece sinyal değişiklikleri etkilenmeyecektir emin olun. Diğer konuları en iyi duruma getirme işlemi sırasında antikor kuluçka süresi ve istifleme/örnek yükleme süresi içerebilir. Çoğu durumda varsayılan ayarlar için araç en iyi çözünürlük ve hassasiyet dengesini sunuyoruz. Ancak, bazı durumlarda yanlış çözünürlükte veya duyarlılık bu parametreleri ayarlayarak geliştirilebilir.
Kapiler elektroforetik tabanlı immunoassay yöntemleri protein hızlı, verimli ve tekrarlanabilir ölçümler sağlar. Bu yöntemler öncelikle araştırma ve geliştirme ayarlarında kullanılan iken, bu teknolojilerin tutarlılık düzenleyici ve klinik uygulamaları potansiyel yarar vardır. Örneğin, duyarlı altgrupları çevre toxicants veya hasta kimlik hastalığın ilerlemesi ile protein biyolojik kan, idrar ve tükürük gibi erişilebilir matrisler ölçülen temel alabilir. Reaktif ve işlem maliyetleri bırak ve örnekleri ve aynı anda biçilen artar olabilir hedeflerin sayısı, biz büyük olasılıkla bu tür uygulamalar için kullanılan Kapiler elektroforetik tabanlı immunoassay yöntemleri göreceksiniz.

Kapiler elektroforetik uzun boyutu veya şarj ayırma sistemleri kullanarak hücre lysates ifadede protein ölçmek ve geleneksel uzun çeşitli avantajlar sağlar. Örneğin, Batı leke için karşılaştırıldığında, kılcal tabanlı otomatik işlemleri jelleri, aktarım cihazları, gereksinimini ortadan kaldırır ve manuel yıkar. Buna ek olarak, mutlak gerekli protein yaklaşık 10 kat daha az, kılcal tabanlı sistemler nadir hücre tipleri veya sınırlı örnek1,2ile kullanmak için idealdir miktarıdır. Sonuçlar az 3 h otomatik sistemler kullanarak olarak elde edilen ve daha önce daha nicel ve geleneksel Batı daha tekrarlanabilir gösterilmiştir yordamlar3,4,5leke. Işlem boyutu tabanlı deneyleri için Sodyum Lauryl Sülfat (SDS), dithiothreitol (DTT), içeren örnekleri yükleme oluşur ve fluorescently molekül ağırlığı işaretleri istifleme ve ayırma matrisler içeren kapiller sütunlara etiketli. Kılcal damarlar için uygulanan gerilim büyüklüğüne göre örneklerinde proteinler ayırır ve UV ışığı kapiller duvarı için ayrılmış proteinlerin immobilizes. Kılcal sonra IMMUNO probed-hedef özgü birincil antikor ve horseradish peroksidaz ile (HRP)-konjüge ikincil antikor. Luminol ve peroksit bir ücret eşleşmiş cihaz (CCD) kamera tarafından ölçülen ve protein quantitate için analiz chemiluminescent ışık nesil katalizler.
Göreli kolaylık ve hız bir kılcal tabanlı otomatik elektroforetik immunoassay platformu rağmen tahlil koşulları protein konsantrasyonu, antikor seyreltme ve çekim hızı gibi duruma getirilmesi doğru tekrarlanabilir elde etmek için önemlidir sonuçlar. Genel olarak, bir tahlil bu sistemler için en iyi duruma getirmek için aşağıdaki yordamları yapılmalıdır:
1) bir ekran değerlendirmek ve antikorlar sinyal ve özgüllük protein hedef seçmek için yapılmalıdır. Varsa, saf protein veya hedef epitope özgüllük değerlendirmek için kullanılabilir; Ancak, toplam protein modeli sisteminden kaynaklı olası belirsiz sinyal değerlendirmek hala önemlidir.
2) sonra tahlil dinamik aralığını belirlenmesi gerekiyor. Örnek toplama iki katına gibi ideal bir sinyal (pik alanı kullanarak ölçülen) iki katına görülmektedir; Ancak, uygulamada, tahmin edilebilir bir şekilde (uygunörneğin, doğrusal) giriş için sinyal orantılı bir değişiklik protein miktar için yeterlidir. Ayrıca, bu iyileştirme protein konsantrasyonu yüksek sinyal ile ama hala deneysel model için doğrusal aralık içinde tanımlayabilirsiniz.
3) en iyi duruma getirme adım 2'de seçilen sabit protein konsantrasyonu kullanarak en uygun antikor konsantrasyonu belirlemek. Antikor konsantrasyonu artırır, sinyal o doygunluk yaylalar kadar artar. Bu doygunluk düzeyi yakınındaki bir antikor konsantrasyonu protein konsantrasyonu doğru ölçüm için gereklidir.
Protein konsantrasyonları, antikor dilutions ve pozlama süreleri bir kılcal tabanlı otomatik boyut tahlil6 için en iyi duruma getirmek için kullandığı işlem bütün hücre özleri BEAS-2B bir SV-40 dönüştürülmüş insan bronş izole kullanarak gösterilmiştir epitel hücre satırı. Hücre veya doku özleri protein izolasyon çok sayıda yayımlanan protokolleri7,8,9 kullanarak gerçekleştirilebilir ve burada yer almaz. En iyi duruma getirilmiş koşullar kullanarak bir deneme deneme sonuçlarını da için toplam bildirdi ve fosforile (serin 15, serin 20) p53 1,2, doksorubisin (hücre apoptosis10ikna bir ortak kemoterapötik Ajan) maruz kültürlerde 1.8, ve 2.4 µg/mL medya 4 hasat öncesinde s için. P53 en yüksek alanlarda yükleme denetimi olarak kullanılan ɑ-tübülin için normalleştirilmiş.

<table><tbody><tr><td>Wes instrument</td><td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)</td><td>004-600</td><td></td></tr><tr><td>P53 DO-1 primary antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-126</td><td></td></tr><tr><td>phosphorylated p53 (ser 15) primary antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9286</td><td></td></tr><tr><td>phosphorylated p53 (ser 20) primary antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9287</td><td></td></tr><tr><td>alpha-tubulin primary antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3873</td><td>used as a loading control</td></tr><tr><td>Compass Software</td><td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)</td><td></td><td>provided with the Wes</td></tr><tr><td>12-230 kDa Master kit</td><td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)&amp;nbsp;</td><td>PS MK02 (since replaced by a new kit #)</td><td></td></tr><tr><td></td><td>www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html</td><td>INCLUDES PART NO:&lt;br/&gt; Wash Buffer (60 mL) 042-202&lt;br/&gt; 10X Sample Buffer (440 &amp;mu;L) 042-195&lt;br/&gt; Pre-Filled Microplates (8) PS-PP01&lt;br/&gt; Capillary Cartridges (8) PS-CC01&lt;br/&gt; Antibody Diluent II (20 mL) 042-203&lt;br/&gt; Luminol-S (1.5 mL) 042-233&lt;br/&gt; Peroxide (1.5 mL) 042-234&lt;br/&gt; Streptavidin-HRP (132 &amp;mu;L) 042-414&lt;br/&gt; Standard Pack (8): Biotinylated ladder, fluorescent 5X master mix, DTT, and empty 0.6 mL tube PS-ST01&lt;br/&gt; Anti-Rabbit Secondary Antibody 042-206&lt;br/&gt; or&lt;br/&gt; Anti-Mouse Secondary Antibody 042-205</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cell culture, treatment, and harvest&lt;/strong&gt; (using vendor recommended protocols; protocols not included in manuscript)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BEAS-2B cells</td><td>American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)</td><td>CRL-9609</td><td></td></tr><tr><td>keratinocyte growth medium, KGM Gold</td><td>Lonza Ltd (Basel, Switzerland)</td><td>192152</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>keratinocyte basal medium, KBM Gold</td><td>Lonza Ltd (Basel, Switzerland)</td><td>192151</td><td>serum free medium for chemical dosing</td></tr><tr><td>doxorubicin</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>D1515</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue Bradford Assays</td><td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td><td>23200</td><td>for protein quantification</td></tr><tr><td>Nuclear Extract kit</td><td>Active Motif (Carlsbad, CA)</td><td>D1515</td><td>used to prepare whole cell lysates</td></tr><tr><td></td><td></td><td>INCLUDES:</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Lysis Buffer AM1</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>1M dithiothreitol (DTT)</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>10X PBS&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Phosphatase Inhibitors</td><td></td></tr></tbody></table>

procedure and key optimization strategies for an automated capillary electrophoretic-based immunoassay method

Uzun kılcal tabanlı kullanmak yeni teknolojiler için geleneksel uzun kıyasla daha hızlı ve daha nicel protein değerlendirme söz veriyorum. Ancak, benzer şekilde diğer protein antikoru tabanlı deneyleri, protein konsantrasyonu, antikor seyreltme ve çekim hızı gibi kılcal tabanlı immunoassay parametrelerinin Optimizasyonu önemli bir anlamlı ve güvenilir nesil önkoşuldur veri. Ölçümleri sinyal değişiklikleri lysate konsantrasyon değişiklikleri doğrudan orantılı nerede tahlil doğrusal aralık içinde olmalıdır. Uygun lysate konsantrasyonları, antikor dilutions ve pozlama süreleri insan bronş epitel hücre hat, BEAS-2B, seçme işlemi burada gösterilmiştir. Tahlil doğrusallık tüm cep telefonu özü protein konsantrasyonları p53 ve α-tübülin antikorları ile bir dizi üzerinden gösterilir. Sinyal tükenmişlik örneği uzun pozlama süreleri ile en yüksek konsantrasyonlarda görülür ve doygunluk gösteren bir α-tübülin antikor seyreltme eğrisi gösterilir. Ayrıca, örnek deneysel sonuçlar en iyi duruma getirilmiş parametrelerini kullanarak doksorubisin tedavi hücreler için raporlanır.

Çekim hızı - Belirleme sinyali tükenmişlik
Luminol ve peroksit substrat çok hızlı bir şekilde boşaldığında sinyal tükenmişlik oluşabilir. Bu verileri farklı Kemiluminesan pozlama zaman tarafından belirlenebilir. Analiz yazılımı düzenleme - &#62; analiz - &#62; "resimler" için gidin. Pozlama aralığı 5 ila 480 s. Her poz verilerden benzer bir sinyal/saat katsayısı olmalıdır böylece sinyal/saat, y ekseni bir electropherogram içinde bildirir. Luminol tükenmiş olur bu katsayısının sırayla uzun pozlama ile p53-1 antikor (Şekil 2) ile görülen azalır. Substrat tükenmesi nedeniyle, bu tahlil ölçülebilir 0.2 µg/µL konsantrasyonu sadece 5-30 s Etkilenmeler kadar kabul edilebilir. Bu nedenle, bu örnekte 15 s p53 en uygun veri analizi pozlama zaman olmaya kararlıydım.
Lysate titrasyon - Doğrusal dinamik aralığı belirleme
Bu ölçümler her tahlil doğrusal dinamik aralığı içinde en yüksek bölgelere göre ölçülen sinyal değişiklikleri değişiklikleri örnekteki protein miktarı ile orantılı nerede alınması önemlidir. 15 s seçilmiş en uygun çekim hızı kullanarak önceki bölümde, tahlil doğrusallık p53 ve ɑ-tübülin için konsantrasyon (şekil 3) 15-fold bir dizi daha büyük üzerinde gösterilmiştir. Bizim deneyim, R2 değeri &#62; 0,9 bir doğrusal regresyon uygun olarak kabul edilir (tahlil mutlak bir nicel ölçüm ise) bilinen miktar veya örnek saf protein bir seyreltme aralığı için kabul edilebilir bilinmeyen hedef protein lysate (eğer tahlil göreli bir nicel ölçüm) olduğunu.
Antikor seyreltme duruma getirilmesi
Konsantrasyonları doyurarak antikorları kullanarak ölçülen herhangi bir sinyal değişiklikleri sadece protein miktarı değişikliklere bağlı olduğundan emin olun yardımcı olur. Gücümüzü, Bütün hücre (tahlil içine yüklenen 0.2 µg/µL toplam protein) ayıklar iki BEAS-2B hücre satır 1:25 - 1:800 (şekil 4) arasında değişen seri olarak seyreltilmiş ɑ-tübülin antikor konsantrasyonları ile probed. Chemiluminescent sinyal (burada, pik alanı olarak ölçülür) karşı antikor seyreltme çizildi. Doygunluk 1:50 gözlenen eğri göze çarpan bir plato başladığı seyreltme.
Deneysel deneme - BEAS-2B hücrelerdeki doksorubisin tedavi
En iyi duruma getirilmiş tahlil koşul kullanma, BEAS-2B hücre kültürü doksorubisin üç farklı konsantrasyonları ile tedavi edildi (1,2, 1.8 ve 2.4 µg/mL) için 4 h (5 rakam, Tablo 1). P53 translasyonel modifikasyonlar ile aktivasyonu hücre döngüsü tutuklama, yaşlanma ve Apoptozis12de dahil olmak üzere çeşitli hücresel yanıt aracılık eder. Özellikle, Apoptozis doksorubisin tedavi13den sonra sonuçlanan p53, transkripsiyon aktivasyonu için serin 15 fosforilasyon sanılıyor. Bu gösteride, ɑ-tübülin alanları kontrol kat sunulan en yüksek normalleştirilmiş. İlginçtir, 3.5 4-fold artışlara p53 fosforilasyon, serin serin 20 fosforile p53 düzeyini 15 ve logosuna 2 kat artış doksorubisin 4 h maruz kaldıktan sonra gözlendi. Bu sonuçlar p53 aktivasyonu olduğunu gösterir; Ancak, doz-yanıt seçilen konsantrasyonları görülür (tersine, test en düşük doz en yüksek yanıt elde edildi). Toplam p53 açık tedaviye yanıt bu modeli sistemde göstermek değil. Biz daha önce çinko tedavi BEAS-2B hücreleri14' te toplam p53 benzer koşullar altında yüksek düzeyde yokluğunda p53 fosforilasyon aktivasyonu gözlemledim.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig2v3.jpg"> 
Resim 2 . Sinyal tükenmişlik algılamak için pozlama görüntü karşılaştırma. Lane protein konsantrasyonları ile p53-1 antikor 1:500 seyreltme at probed BEAS-2B lysates için azalan göstermek görüntüler. Kemiluminesan sinyal katsayıları, tepe yükseklikleri enstrüman yazılım olarak rapor üst üste. Tepe yükseklikleri farklı olarak görsel grup yoğunluklarda otomatik olarak oluşturulan ve bantları ve bir panelden diğerine değil karşılaştırılabilir görüş yardım etmek için aracı tarafından ayarlanır. Kemiluminesan sinyal azalma kaybolmaya başlayan sinyali ile (split tepe) substrat tükenmesi gösteren iki uzun pozlama, pozlama süresi arttıkça unutmayın. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig2v3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig3v3.jpg"> 
Şekil 3 . Lysate titrasyon lane sayısı gösteriliyor. Lysate titrasyon lane gösterilen (A) BEAS-2B 1:500 p53-1 veya 1:50 ɑ-tübülin ile probed zaman lysate kez. En yüksek alan değerleri farklı olarak, görsel grup yoğunluklarda otomatik olarak oluşturulan ve bantları ve bir panelden diğerine değil karşılaştırılabilir görüş yardım etmek için aracı tarafından ayarlanır. Doğrusal regresyon çözümlemesi (B) deneyleri, 0.01 0.20 µg/µL ve 0,025-0,40 µg/µL, 0.999 ve 0.985, R2 değerleri ile sırasıyla test tüm aralığında doğrusal onaylar. Toplam protein konsantrasyonları doğrusal aralık ortasında potansiyel hedef protein değişim her iki yönde de (örneğin, α-tübülin için 0.2 µg/µL) karşılamak için seçilmiştir. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig3v3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig4.jpg"> 
Şekil 4 . İki ayrı BEAS-2B protein lysates olan ve olmayan temel normalleştirme için α-tübülin antikor seyreltme eğrileri. Kesin bir ulusTure doğrusallık üzerinden 1:50 (0.02) görülür seyreltme, doygunluk gösteren. 1:50 bu nedenle bu antikor için en uygun seyreltme olarak seçilmiştir. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig5.jpg"> 
Şekil 5. Toplam ve serin 4 h doksorubisin (DXN) tedavisinin etkisi fosforile p53 protein ifade BEAS-2B hücre. Tepe alanları α-tübülin için normalleştirilmiş ve denetim (CTL) kat çizilen. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/55911/55911tbl1.jpg"> 
Tablo 1. Toplam ve serin 4 h doksorubisin (DXN) tedavisinin etkisi fosforile p53 protein ifade BEAS-2B hücre. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911tbl1large.jpg" target="_blank">Bu tablo daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method at JoVE.com

Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

Hedef proteinler üzerinden toplam protein ürünleri ölçmek için bir ticari platformu kullanarak bir kılcal tabanlı immunoassay gösterilmiştir. Buna ek olarak, pozlama süresi, protein konsantrasyonu ve antikor seyreltme tahlil parametreleri bir hücre kültür modeli sistemi için optimize edilmiştir.

Yordam ve anahtar optimizasyon stratejileri için bir otomatik Kapiler elektroforetik tabanlı Immunoassay yöntemi

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. ...

procedure-key-optimization-strategies-for-an-automated-capillary

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K Görüntüleme.  U.S. Environmental Protection Agency. Hedef proteinler üzerinden toplam protein ürünleri ölçmek için bir ticari platformu kullanarak bir kılcal tabanlı immunoassay gösterilmiştir. Buna ek olarak, pozlama süresi, protein konsantrasyonu ve antikor seyreltme tahlil parametreleri bir hücre kültür modeli sistemi için optimize edilmiştir.

Video: Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The biological activity of these proteins depends on their physicochemical properties. The use of high-performance techniques like chromatography and capillary electrophoresis has been described for the analysis of physicochemical heterogeneity of mAbs. Nowadays, capillary zone electrophoresis (CZE) technique constitutes one of the most resolutive and sensitive assays for the analysis of biomolecules. Besides, the electro-driven separation in CZE is governed by extensive properties of matter and offers the advantage of analyzing proteins close to their native state. However, the successful implementation of this technique for routine analysis depends on the skills of the analyst at the critical steps during sample and system preparation. The purpose of this tutorial is to detail the steps to succeed in the CZE analysis of mAbs. Further, this protocol can be used for the development and improvement of skills of the personnel involved in protein analytical chemistry laboratories.

Here, we present a comprehensive capillary zone electrophoresis protocol for the assessment of intrinsic physicochemical heterogeneity of monoclonal antibodies as a quality attribute.

Nötr Kılcal kullanılarak monoklonal antikor izoformlannın Kapiler Elektroforez Ayırma

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Biyokimya

A Simple Method for Automated Solid Phase Extraction of Water Samples for Immunological Analysis of Small Pollutants

A new method for solid phase extraction (SPE) of environmental water samples is proposed. The developed prototype is cost-efficient and user friendly, and enables to perform rapid, automated and simple SPE. The pre-concentrated solution is compatible with analysis by immunoassay, with a low organic solvent content. A method is described for the extraction and pre-concentration of natural hormone 17&#946;-estradiol in 100 ml water samples. Reverse phase SPE is performed with octadecyl-silica sorbent and elution is done with 200 &#181;l of methanol 50% v/v. Eluent is diluted by adding di-water to lower the amount of methanol. After preparing manually the SPE column, the overall procedure is performed automatically within 1 hr. At the end of the process, estradiol concentration is measured by using a commercial enzyme-linked immune-sorbent assay (ELISA). 100-fold pre-concentration is achieved and the methanol content in only 10% v/v. Full recoveries of the molecule are achieved with 1 ng/L spiked de-ionized and synthetic sea water samples.

A protocol for the extraction and pre-concentration of estradiol from water samples by using an automated and miniaturized system is presented.

Küçük Kirleticilerin İmmünolojik Analizi Su Örneklerinin Otomatik Katı Faz Ekstraksiyon Basit Bir Yöntem

A new method for solid phase extraction (SPE) of environmental water samples is proposed. The developed prototype is cost-efficient and user friendly, and ...

Çevre

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides an alternative strategy, capillary isoelectric focusing (cIEF), with many advantages compared to conventional immunoblotting. This is an antibody-based, automated, rapid, and quantitative method in which a complete western blotting procedure takes place inside an ultrathin capillary. This technique does not require a gel to transfer to a membrane, stripping of blots, or x-ray films, which are typically required for conventional immunoblotting. Here, proteins are separated according to their charge (isoelectric point; pI), using less than a microliter (400 nL) of total protein lysate. After electrophoresis, proteins are immobilized onto the capillary walls by ultraviolet light treatment, followed by primary and secondary (horseradish peroxidase (HRP) conjugated) antibody incubation, whose binding is detected through enhanced chemiluminescence (ECL), generating a light signal that can be captured and recorded by a charge-coupled device (CCD) camera. The digital image can be analyzed and quantified (peak area) using software. This high throughput procedure can handle 96 samples at a time; is highly sensitive, with protein detection in the picogram range; and produces highly reproducible results because of automation. All of these aspects are extremely valuable when the quantity of samples (e.g., tissue samples and biopsies) is a limiting factor. The technique has wider applications as well, including screening of drugs or antibodies, biomarker discovery, and diagnostic purposes.

Capillary isoelectric focusing is an antibody-based, ultrasensitive, high throughput technique, enabling detailed characterization of proteins and their isoforms from extremely small biological samples. The following describes a protocol for detection and quantification of specific proteins and their isoforms in an automated and robotized manner.

Proteinler ve onların izoformlarının kapiller Isoelectric odaklanarak yöntemi tarafından son derece hassas ve nicel tespiti

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO2 nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO2 NF mat; transfer-printing of TiO2 NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.

This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 &#181;L of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.

Tüm Blood adlı ultrasensitive Protein Algılama için Tam Otomatik Santrifüj mikroakışkan Cihazı

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

Biyomühendislik

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease and treatment. It has the potential to predict therapeutic efficacy and identify novel therapeutic targets. Whole blood staining utilizes unmanipulated blood, which minimizes artifacts that can occur during sample preparation. However, whole blood staining must also be done on freshly collected blood to ensure the integrity of the sample. Additionally, it is best to prepare antibody cocktails on the same day to avoid potential instability of tandem-dyes and prevent reagent interaction between brilliant violet dyes. Therefore, whole blood staining requires careful standardization to control for intra and inter-experimental variability.
Here, we report deployment of an automated liquid handler equipped with a two-dimensional (2D) barcode reader into a standard process of making antibody cocktails for flow cytometry. Antibodies were transferred into 2D barcoded tubes arranged in a 96 well format and their contents compiled in a database. The liquid handler could then locate the source antibody vials by referencing antibody names within the database. Our method eliminated tedious coordination for positioning of source antibody tubes. It provided versatility allowing the user to easily change any number of details in the antibody dispensing process such as specific antibody to use, volume, and destination by modifying the database without rewriting the scripting in the software method for each assay.
A proof of concept experiment achieved outstanding inter and intra- assay precision, demonstrated by replicate preparation of an 11-color, 17-antibody flow cytometry assay. These methodologies increased overall throughput for flow cytometry assays and facilitated daily preparation of the complex antibody cocktails required for the detailed phenotypic characterization of freshly collected anticoagulated peripheral blood.

Whole blood Immunophenotyping is indispensable for monitoring the human immune system. However, the number of reagents required and the instability of specific fluorochromes in premixed cocktails necessitates daily reagent preparation. Here we show that semi-automated preparation of staining antibody cocktail helps establish reliable immunophenotyping by minimizing variability in reagent dispensing.

İnsan Periferik Kan immünfenotipik Analizi Antikor Kokteyller Hazırlama A Yarı-otomatik Yaklaşım

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

<meta charset="utf8"></head><body>Tek Uçta Boncuk Dizisi (BIST) Kullanarak Otomatik Lektin Bazlı Glikan Profili Oluşturma

Rapid Glyco-Qualitative Assessment of Recombinant Proteins Using a Fully Automated System

Protein glycosylation, a critical post-translational modification, influences the stability, efficacy, and immunogenicity of recombinant proteins, including biopharmaceuticals. Glycan structures exhibit significant heterogeneity, varying with production cell types, culture conditions, and purification methods. Consequently, monitoring and evaluating the glycan structures of recombinant proteins is vital, particularly in biopharmaceutical production. The lectin microarray, a technique complementary to mass spectrometry, boasts high sensitivity and ease of use. However, it typically requires more than a day to yield results. To adapt it to non-glycoscience research or drug product process development, an automated, high-throughput alternative is needed. Therefore, the world's first fully automated lectin-based glycan profiling system was developed, utilizing the "bead array in a single tip (BIST)" technology concept. This system allows for the preparation and storage of lectin-immobilized beads in units of 1,000, with customizable parallel insertion orders for various purposes. This article presents a practical protocol for research involving "glyco-qualified" recombinant proteins. After testing their reactivity against 12 polyacrylamide-glycan conjugates, 15 lectins were selected to increase the system's versatility. In addition, the sample labeling process was optimized by switching from Cy3 to biotin, reducing the overall processing time by 30 min. For immediate data qualification, lectin-binding signals are displayed as a dotcode on the top monitor. The system's reliability was confirmed through day-to-day reproducibility tests, repeatability tests, and long-term storage tests, with a coefficient of variation of &lt;10%. This user-friendly and rapid glyco-analyzer has potential applications in the quality monitoring of endogenous glycoproteins for biomarker evaluation and validation. This method facilitates analysis for those new to glycoscience, thereby broadening its practical utility.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Tam Otomatik Bir Sistem Kullanarak Protein Glikozilasyon Araştırmalarını İlerletmek

A system for the automated and rapid analysis of glycans on proteins was previously developed. This article presents the protocol for "glyco-qualitative analysis," optimized for a broad spectrum of users, such as those engaged in analyzing glycan structures in biopharmaceuticals and other glycoconjugate materials.

Tam Otomatik Bir Sistem Kullanılarak Rekombinant Proteinlerin Hızlı Gliko-Kalitatif Değerlendirmesi

Protein glycosylation, a critical post-translational modification, influences the stability, efficacy, and immunogenicity of recombinant proteins, ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

Geliştirme ve doğrulama vericiyi bir tek molekül dijital enzim bağlı Immunosorbent Assay insan Interferon-α için dizi

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Electrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits the dielectric properties of thin insulator films to enhance the charge density and hence boost the electrowetting effect. The presence of charges results in an electrically induced spreading of the droplet which permits purposeful manipulation across a hydrophobic surface. Here, we demonstrate EWOD-based protocol for sample processing and detection of four categories of antigens, using an automated surface actuation platform, via two variations of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) methods. The ELISA is performed on magnetic beads with immobilized primary antibodies which can be selected to target a specific antigen. An antibody conjugated to HRP binds to the antigen and is mixed with H2O2/Luminol for quantification of the captured pathogens. Assay completion times of between 6 and 10 min were achieved, whilst minuscule volumes of reagents were utilized.

Electrowetting-based digital microfluidic is a technique that utilizes a voltage-driven change in the apparent contact angle of a microliter-volume droplet to facilitate its manipulation. Combining this with functionalized magnetic beads enables the integration of multiple laboratory unit operations for sample preparation and identification of pathogens using Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA).

Otomatik Enzimbağlantılı İmmünosorbent Assay için Elektrowetting tabanlı Dijital Mikroakışkanplatformu

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits ...

Yordam ve anahtar optimizasyon stratejileri için bir otomatik Kapiler elektroforetik tabanlı Immunoassay yöntemi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Nötr Kılcal kullanılarak monoklonal antikor izoformlannın Kapiler Elektroforez Ayırma

Küçük Kirleticilerin İmmünolojik Analizi Su Örneklerinin Otomatik Katı Faz Ekstraksiyon Basit Bir Yöntem

Proteinler ve onların izoformlarının kapiller Isoelectric odaklanarak yöntemi tarafından son derece hassas ve nicel tespiti

Tüm Blood adlı ultrasensitive Protein Algılama için Tam Otomatik Santrifüj mikroakışkan Cihazı

İnsan Periferik Kan immünfenotipik Analizi Antikor Kokteyller Hazırlama A Yarı-otomatik Yaklaşım

Tam Otomatik Bir Sistem Kullanılarak Rekombinant Proteinlerin Hızlı Gliko-Kalitatif Değerlendirmesi

Tam Otomatik Bir Sistem Kullanılarak Rekombinant Proteinlerin Hızlı Gliko-Kalitatif Değerlendirmesi

Tam Otomatik Bir Sistem Kullanılarak Rekombinant Proteinlerin Hızlı Gliko-Kalitatif Değerlendirmesi

Geliştirme ve doğrulama vericiyi bir tek molekül dijital enzim bağlı Immunosorbent Assay insan Interferon-α için dizi

Otomatik Enzimbağlantılı İmmünosorbent Assay için Elektrowetting tabanlı Dijital Mikroakışkanplatformu