Biz bu yazının eleştirel okuma için jinekoloji onkoloji grubu üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi, Avustralya Araştırma Konseyi ve Kanser Enstitüsü NSW (PST) fon tarafından desteklenmektedir. MK Newcastle Lisansüstü Araştırma Bursu Üniversitesi bir alıcı.

Hayvan bakım ve deneysel prosedürler Yeni Güney Galler Hayvan Araştırmaları Yasası, Yeni Güney Galler Hayvan Araştırmaları Yönetmeliği ve bakımı için Avustralya kodu ve Newcastle Üniversitesi Hayvan Bakım ve Etik Kurul kurallarına uygun olarak yapılmış ve teyit edilmiştir bilimsel amaçlarla hayvanların kullanımı. Fareler üzerinde yapılan tüm işlemler Newcastle Üniversitesi Hayvan Bakım ve Etik Komitesi tarafından kabul edildi. 1. Zaman Çiftleşme <ol><li> Çifti 6-8 haftalık erkek ve gündüz döngüsünün sonuna hemen önce dişi fareler. </li><li> Vajinal fişler varlığı sabah erken (veya 8.00 önceki AM), her gün için dişileri kontrol edin. fişin Gün 0.5 DPC olarak kabul edilir. </li><li> (Erkek olmadan) yeni bir kafes içine vajinal fişi ile kadın aktarın ve fiş tarihini etiket. </li></ol> Fare Embriyonik Gonadal Ridges 2. izolasyonu <ol><li> Fare embryo yalıtmakAşağıda tarif edildiği gibi 15.5 DPC hamile kadınlarda IC gonadal sırtlar bir kaç değişiklik ile, 9&#39;da tarif edildiği gibi. </li><li> Hamile kadın öğleden sonra gebeliğin ertesi gün içine girmek için kabul edilir zaman olarak öğleden önce diseksiyonu yürütmek. </li><li> servikal dislokasyon kullanarak 15.5 DPC hamile kadın Kurban (ya da kurumsal Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmış protokole göre). </li><li> Emici kağıt mendil sırtını fare tutmak ve% 70 etanol ile karın ventral tarafında püskürtün. </li><li> göğüs kafesi sonuna kadar ürogenital açıklık uzanan, forseps ile alt karın cildi (ventral tarafı) kaldırın ve cerrahi makas kullanarak lateral kesi yapmak. karın ortaya çıkarmak için hayvan başına doğru cilt çekin. </li><li> periton boşluğuna maruz cerrahi makas ile karın kaslarını kesin. sadece rahim ağzı üzerinde forseps ile gebe rahim tut ve bir kesim yapmak. Şimdi t tutarak rahim kaldırıno mesane ve periton ekten rahim ayırmak için uterotubal kavşaklarda kesim tarafından takip rahim geniş ligament kesti. </li><li> buz soğukluğunda HBSS (Hank dengeli tuz çözeltisi) ihtiva eden bir 50 ml tüp içine rahim aktarın. Aşırı kan çıkarmak için buz gibi soğuk HBSS ile nazikçe gebe uterusu yıkayın. </li><li> buz HBSS içeren bir Petri kabındaki rahim tutmak ve buz üzerinde tutmak. rahim duvarına kesin ve embriyoların çıkar. buz üzerinde HBSS ile yeni bir Petri kabındaki embriyoların tutun. </li><li> Temiz, steril kağıt mendil alın ve yeni bir Petri kabı üzerine koydu. Kağıt mendil% 70 etanol püskürtün. Yan tarafında, bu kağıt mendil embriyo edin ve Şekil 1 &#39;de noktalı çizgi ile gösterilen bir yönde, steril bir bıçak kullanarak alt karın kesti. </li><li> vertebra sütun iğneleyerek steril sünger kaide üzerinde embriyo sabitleyin. </li><li> Diseksiyon stereomicroscope altında yerleştirin ve dikkatlice ventral orta hat boyunca kesilir. karaciğer ve bağırsakları çıkarın. Fare ürogenital sistem (böbrek, üreter, testis, WD ve vas deferens) artık görünür olmalıdır. </li><li> testis ve WD kesip, ve buz üzerinde, HBSS ile yeni bir Petri kabı tutun. WD ve testis çıkarmak, üretra onun eki yakın vas deferens kesip gubernakulum gelen WD alt kısmının eki kesti. </li><li> Aynı grubun embriyolar (Bu deneysel plan uyarınca değişebilir) dan testisler ve WDS Havuz. </li></ol> Embriyonik Gonadal Ridges 3. Kültür (Şekil 2) <ol><li> % 10 FBS (Fetal Sığır Serumu),% 1 penisilin / streptomisin ve% 1 L-glutamin ile DMEM / F12 ilave embriyonik gonadal sırtlar kültürlenmesi için hazırlarlar. Bir su banyosu içinde 37 ° C&#39;ye kadar ortam ısıtın. </li><li> 24-iyi hücre kültür plakası kaynağı başına ortam 300 uL ekleyin. </li><li> taze Petri plaka almak ve üzerinde steril HBSS küçük bir damla koyun. (0,8 bir polikarbonat parça rölyef membran koymak81; onun parlayan yüzeyi HBSS bakan ile HBSS bu damla m). </li><li> Kullanarak temiz forseps (yukarı bakacak şekilde, kendi pürüzlü yüzey üzerine) membran üzerinde iki WDS ve gonadlar koymak ve steril mendil / emici kağıt kullanarak HBSS maksimum miktarını çıkarın. Emici kağıt ile doku dokunmayın; Aksi takdirde, bu dokuya zarar verecektir. </li><li> WDS ne gonadlar ne birbirlerine dokunmadan emin olun. Aksi takdirde, bunlar sonraki kuluçka sırasında birlikte sopa olacak. </li><li> Hava orta arayüzü 300 uL kültür ortamı ve kültürü bunları ihtiva eden 24 oyuklu bir plakanın her bir kuyucuğu içinde doku ile membran aktarın. Wigner bir kistik büyüme membranlar sonuçları üzerinde çok fazla kültür ortamı. </li><li> % 5 CO2 varlığında 37 ° C inkübatör inkübe plakası. </li><li> Her gün kültür ortamı değiştirin. pipet ile orta değiştirmek için, iyi ilk gelen orta kaldırmak ve daha sonra önceden ısıtılmış taze ortam 300 mcL ekleyin. Not:WD morfojenezi farklı sinyal yollarının etkisinin araştırılması için, gerekli konsantrasyonlarda kimyasal aktivatörler ve / veya inhibitörler, kültür ortamına ilave edilebilir. </li><li> Kültür 3 gün boyunca dokular. 3 gün içinde, 15.5 DPC embriyo toplanan kıvrıldığı WDS çok dolambaçlı tüpleri (Şekil 3B) dönüşüyor. Wnt inhibitörü IWR1 eklenmesi kıvrılma WD (Şekil 3C) inhibisyonu ile sonuçlanır. </li><li> hasat için bu dokular buz gibi soğuk PBS ile bir Petri kabı alır. Petri plaka içine kültürlü gonad ve WD membran aktarın. Membran PBS üstünde yüzer. PBS içinde lavabo ve gonad ve WD çıkarmak membran basın. </li><li> 4 ° C&#39;de ya da oda sıcaklığında 1 saat süreyle% 4&#39;lük paraformaldehit (PFA) O / N ile dokuları düzeltildi. Gerekirse, tespitten önce Wigner aydınlık alan görüntüleri çekmek. </li></ol> 4. Tüm Dağı İmmünofloresan <ol><li> Yıkama sabit dokular PBS-T (PBS +% 1 ile 3 kezOda sıcaklığında, yavaş sallama, 10 dakika her biri, Triton X-100). </li><li> Yavaş sallanan (~ 30 rpm) ile, 4 ° C&#39;de, etanol (% 25,% 50,% 75 ve% 100), 10 dakika her biri bir kademeli dizi doku kurutmak. Bu adımda, dokular% 75 etanol içinde 4 ° C&#39;de saklanabilir. <ol><li> , Etanol değiştirmek 2 dakika süreyle rahatsız dokuları tutmak ve izin vermek için dokular yerleşmek. Mümkün olduğu kadar supernatant çıkar ve daha sonra etanol bir üst konsantrasyonu ekleyin. dokulara zarar görmemesi için, pipet ucu herhangi bir aşamada dokuları temas etmemelidir. </li></ol></li><li> dehidratasyon sonra yavaş çalkalanarak, 4 ° C&#39;de, etanol (100,% 75,% 50 ve% 25%), 10 dakika, her bir kademeli dizi doku rehidrate. </li><li> yumuşak sallanan (~ 30 rpm) ile, oda sıcaklığında PBS-T (PBS +% 0.1 Triton X-100), 4 kere, 20 dakika her biri ile dokuların yıkayın. </li><li> Blokaj tamponu ile oda sıcaklığında 1 saat için dokular bloğun (PBS +% 1 BSA +% 0.2 yağsız kuru süt tozu +% 0.3 Triton X-100). </li><li> afteR bloke edici (blokaj tamponu içinde seyreltilmiş) birincil antikor çözeltisine dokuları transferi ve yumuşak sallanan (~ 30 rpm) ile 4 ° C &#39;de O / N inkübe edin. Kullanılan birincil antikorlar seyreltileri malzemeler Tablo l&#39;de tarif edilmektedir. </li><li> Sonraki gün, bir hafif sallanan (~ 30 rpm) ile, oda sıcaklığında PBS-MT (PBS +% 2 yağsız kuru süt tozu +% 0.5 Tween-20), 4x, 30 dakika her biri ile dokuların yıkayın. </li><li> hafifçe çalkalanarak, bloke edici tampon içinde 250 (Bu adım, bireysel antikorlar için optimizasyon ihtiyacı) ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe Bu yıkama aşamasından sonra, 1 &#39;deki bir seyreltmede ikincil antikor ilave edin. </li><li> Şimdi itibaren ikincil antikorlar ışığa duyarlı fluorophores etiketli olarak ışığa maruz kalmasını önlemek için alüminyum folyo ile kaplı dokuların tutmak. </li><li> dokular hafifçe çalkalanarak, PBS-T (PBS +% 0.1 Tween-20), 30 dakika her biri ile 3 kez yıkanır. </li><li> lekeli dokuları montajı için slaytlar hazırlayın. <ol><li> Bunun için, cam kapak fişleri kestive bir elmas kalem kullanarak ince şeritler halinde iki şerit çivi emaye kullanarak cam slayt diğeri üzerinde bir sopa. Bu iki sınırları arasında iki sınırları ve yeri dokuları yapın. </li><li> DAPI içeren montaj orta ekleyin ve bir kapak kayma koymak. slayt bunu düzeltmek için kapak kayma köşelerinde tırnak emaye uygulayın. Not: Dokular artık görüntüleme için hazır. -20 ° C&#39;de bu slaytları saklayın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+morphogenesis+of+the+Wolffian/epididymal+duct,+more+twists+and+turns.">Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns.</a> Dev Biol. 325, 6-14 (2009).</li><li>Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+normal+and+abnormal+development+of+the+Wolffian/epididymal+duct+by+using+transgenic+mice.">Understanding normal and abnormal development of the Wolffian/epididymal duct by using transgenic mice.</a> Asian J Androl. 17, 1-7 (2015).</li><li>Carroll, T. J., Park, J. S., Hayashi, S., Majumdar, A., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt9b+plays+a+central+role+in+the+regulation+of+mesenchymal+to+epithelial+transitions+underlying+organogenesis+of+the+mammalian+urogenital+system.">Wnt9b plays a central role in the regulation of mesenchymal to epithelial transitions underlying organogenesis of the mammalian urogenital system.</a> Dev Cell. 9, 283-292 (2005).</li><li>Kumar, M., Syed, S. M., Taketo, M. M., Tanwar, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+Wnt/&#946;catenin+signalling+is+essential+for+epididymal+coiling.">Epithelial Wnt/&#946;catenin signalling is essential for epididymal coiling.</a> Dev Biol. 412, 234-249 (2016).</li><li>Murashima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+roles+of+androgen+signaling+in+Wolffian+duct+stabilization+and+epididymal+cell+differentiation.">Essential roles of androgen signaling in Wolffian duct stabilization and epididymal cell differentiation.</a> Endocrinology. 152, 1640-1651 (2011).</li><li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+limitations+of+genetically+modified+mouse+models+in+drug+discovery+and+development.">Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development.</a> Curr Drug Metab. 9, 419-438 (2008).</li><li>Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+In+Vitro+Culture:+What+Have+We+Learned+about+Early+Kidney+Development?.">Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development?.</a> Stem Cells Int. 959807, 1-16 (2015).</li><li>Hirashima, T., Adachi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedures+for+the+Quantification+of+Whole-Tissue+Immunofluorescence+Images+Obtained+at+Single-Cell+Resolution+during+Murine+Tubular+Organ+Development.">Procedures for the Quantification of Whole-Tissue Immunofluorescence Images Obtained at Single-Cell Resolution during Murine Tubular Organ Development.</a> PLoS One. 10, 0135343 (2015).</li><li>Chan, W. Y., Blomberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+Development:+Methods+and+Protocols.">Germline Development: Methods and Protocols.</a> Methods Mol Biol. 825, (2012).</li><li>Karner, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tankyrase+Is+Necessary+for+Canonical+Wnt+Signaling+During+Kidney+Development.">Tankyrase Is Necessary for Canonical Wnt Signaling During Kidney Development.</a> Dev Dyn. 239, 2014-2023 (2010).</li><li>Traykova-Brauch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+versatile+system+for+acute+and+chronic+modulation+of+renal+tubular+function+in+transgenic+mice.">An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice.</a> Nat Med. 14, 979-984 (2008).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Organ kültürü sistemi, geleneksel hücre kültürü sistemi üzerinde birçok avantajı vardır. Bu sistem, farklı hücre tipleri arasında, orijinal yapısal ilişkiler ve etkileşimler korur. Bu in vivo sistemlerde taklit ve niş faktörü yoktur hücre kültürü çalışmalarında daha doğru bilgi verir. organ kültürü sistemlerinin kullanılması da bütün hayvan kullanımına kıyasla avantajlara sahiptir. Bunlar bütün hayvan, kolay bakım ve organ kültürü sisteminin bakım, vs Ayrı...

Erkek üreme sistemi öncelikle testis oluşur, germ hücre gelişimi ve farklılaşmasında ve sperm olgunlaşması, ulaşım ve depolama için gerekli olan karmaşık bir duktal sistemi için site. Epididimis vas deferens ile testis ve germ hücrelerinin 1 post-testiküler gelişim ve olgunlaşma ağırlıklı olarak yer bağlayan bir boru şeklinde bir organdır. Çok sarmal yetişkin fare epididimis basit ve düz habercisi tüp, Wolf kanalı (WD) 1 gelişir. Sperm dişi germ hücrelerinin 2 dölleme kapasitesini elde etmek için epididimin karmaşık ve kangal yapısı esastır. erkek doğurganlık için böyle önemli bir organı şekline geliştirir ve alır ne kadar iyi anlaşılamamıştır. Çeşitli sinyal yolları gibi Wnt 3,4 ve yol 5 sinyal androjen olarak WD gelişiminde rol gösterilmiştir. Bizim son çalışmalar bal ihtiyacını kurmuşturanced Wnt doğum öncesi gelişim 4 sırasında WD sarma için sinyalizasyon. Ancak, ileri çalışmalar epididimal epitel içinde ve interstisyel hücreler ile doğum sonrası epididimal sarma, hücresel farklılaşma ve hücre-hücre iletişimi yer alan mekanizmaları anlamak için gereklidir. Genetiği değiştirilmiş fare modelleri, çeşitli organ sistemlerinin 6 gelişimini ve hastalığın altında yatan moleküler mekanizmaların tanımlanması / onaylama için güçlü bir araç olduğu kanıtlanmıştır. geniş kullanılmasına rağmen, tahmin gen fonksiyonu açısından hedeflenen fare mutantlar öngörülemeyen fenotip ve bazı modellerde boş mutantlar hiçbir fenotip, genetik ve çevresel faktörlerin etkisiyle, emek yoğun ve dahil olmak üzere genetiği değiştirilmiş fare modelleri önemli kısıtlamalar vardır zaman alıcı fare modellerinin geliştirilmesi süreci. Bu nedenle, sadece genetik olarak modi gelen bulguların önemi yorumlanmasığı fare modelleri, her zaman 6 kolay değildir. Bu kısıtlamalar, bize kontrol kültür koşulları gerçek zamanlı olarak birden fazla sinyalleme yolunu değiştirmek için esneklik sağlar nitro organ kültür sisteminde kullanılarak aşılabilir. Organ kültürü sistemi bütün organların 7 fizyolojisini ve patolojisi ile ilgili vesile oluyor. Böylelikle organın şekil, yapı ve işlev 8 daha iyi anlaşılmasını sağlayan in vivo koşullarında varolduğu Dahası, florofor etiketli antikor ile boyandı Bütün organların görüntüleme, üç boyutlu bir bağlamda ilgi işaretleri görsel olanak sağlamaktadır. Burada, örneğin WDS ile boru şekilli organ morfojenezi ilgili çeşitli sorulara cevap uygulanabilir fare embriyonik gonadal sırtlar izolasyonu, in vitro kültürü ve WDS&#39;nin bütün montaj immünofloresan görüntüleme yöntemleri tarif etmişlerdir. Bu protokol, biz15.5 gün izole fare embriyonik ürogenital sırtlar coitum (DPC) hamile baraj sonrası ve bir epitel hücre markeri (sitokeratin 8, CK8), bir hücre çoğalması markeri (fosfo-Histon 3, PH3) ve aktif için immün ardından 3 gün boyunca onları kültüre βcatenin.

<table><tbody><tr><td>24-well plates</td><td>Corning, USA</td><td>3524</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>GE Healthcare Life Sciences, USA</td><td>SH30031.02</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)</td><td>Sigma, USA</td><td>D8437</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Interpath,&amp;nbsp; Australia</td><td>SH30034.02</td><td>10% FBS used in culture medium</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>GE Healthcare Life Sciences, USA</td><td>SH30034.01</td><td>1% concentration used</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco, USA</td><td>15070-063</td><td>1% concentration used</td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch&amp;nbsp;</td><td>Whatman, USA</td><td>110409</td><td>Membrane (0.8 &amp;micro;m)</td></tr><tr><td>IWR1</td><td>Sigma, USA</td><td>10161-5mg</td><td>100 &amp;micro;M concentration used</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences, USA</td><td>15710</td><td>16% stock, 4% in PBS for use. TOXIC - wear gloves and cannot&lt;br/&gt; be disposed of in the sink</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>214-20L PL</td><td>Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water.</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>2509-500ml</td><td>Very viscous, careful while dispensing</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma, USA</td><td>T8787-50ml</td><td>Very viscous, careful while dispensing</td></tr><tr><td>Di-Sodium Hydrogen Phosphate</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>621-500mg</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Sodium Di-hydrogen Phosphate</td><td>Ajax Finechem, USA</td><td>4745-500g</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>465-500g</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Cytokeratin8/Troma I</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB)</td><td>TROMA-I</td><td>1:250 in blocking buffer</td></tr><tr><td>active &amp;beta;catenin&amp;nbsp;</td><td>Cell Signalling Technology,&amp;nbsp; USA</td><td>D13A1</td><td>1:200 in blocking buffer</td></tr><tr><td>phospho-Histone 3</td><td>Millipore, MA, USA</td><td>06-570</td><td>1:200 in blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa488 Goat anti-rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearchLabs,&amp;nbsp; USA</td><td>111-545-047</td><td>1:250 in blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa594 Goat anti-Rat IgG</td><td>Jackson ImmunoResearchLabs,&amp;nbsp; USA</td><td>112-585-072</td><td>1:250 in blocking buffer</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>242-500ml</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>n-Propyl galate</td><td>Sigma, USA</td><td>2370</td><td>-</td></tr><tr><td>2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI)</td><td>Sigma, USA</td><td>D9564-10mg</td><td>Use to stain nucleic acids (DNA)</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>2225-500ml</td><td>Solvent</td></tr><tr><td>Cover Slips (24 x 50 mm)</td><td>Lomb Scientific</td><td>CS24501GP</td><td>-</td></tr></tbody></table>

organ culture and whole mount immunofluorescence staining of mouse wolffian ducts

Tubal morphogenesis erkek üreme sistemi dahil olmak üzere pek çok memeli organların gelişimi için temel bir gerekliliktir. epididimis, erkek üreme sisteminin ayrılmaz bir parçası, sperm depolama, olgunlaşması ve ulaşım sorumludur. yetişkin epididimis Wolf kanalı (WD) olarak bilinen basit ve düz embriyonik habercisi gelişir oldukça sarmal tüp. testiste sperm oosit döller edemiyoruz olarak epididimin uygun kıvrılma, erkek doğurganlık için esastır. Ancak, epididimal geliştirme ve sarma sorumlu mekanizma kısmen tüm organ kültürü ve görüntüleme yöntemlerinin eksikliği, belirsizliğini koruyor. Bu çalışmada, biz daha iyi diğer boru şeklindeki organları incelemek için uygulanabilir WD sarma ve geliştirme, sürecini görselleştirmek için bir in vitro kültür sistemi ve tüm montaj immünofloresan protokol açıklar.

gelişimi sırasında, WD basit ve düz tüp son derece karmaşık ve sarmal kanal dönüşür, burada önemli değişikliklere uğrar. Yukarıda tarif edilen yöntemler kullanılarak, WDS kültür koşulları benzer bir dönüşüm geçirmektedir. Burada 3 gün (Şekil 3) kültürlendi Wigner sonuçları göstermiştir. WD morfolojilerinden rol oynayan moleküler mekanizmaları incelemek için, kültür ortamı farklı sinyal yollarını hedef alan inhibitörleri ve aktivatörleri ile takviye edilebili...

Watch this Scientific Journal Video about Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts at JoVE.com

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Biz fare Wolf kanalı (WD) izolasyonu ve kültürü için bir yöntem mevcut. Biz de floresan levhası &#39;antikorlarla kültürlü / taze izole Wigner tüm montaj immün için detaylı bir prosedür ortaya koymaktadır. Birlikte, bu teknikler WD geliştirme, sarma ve farklılaşma çalışma sağlar.

Organ Kültür ve Fare Wolffian Kanallarının Tüm Dağı Immunoflorasan Boyama

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

organ-culture-whole-mount-immunofluorescence-staining-mouse-wolffian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.7K Görüntüleme.  University of Newcastle.  Biz fare Wolf kanalı (WD) izolasyonu ve kültürü için bir yöntem mevcut. Biz de floresan levhası 'antikorlarla kültürlü / taze izole Wigner tüm montaj immün için detaylı bir prosedür ortaya koymaktadır. Birlikte, bu teknikler WD geliştirme, sarma ve farklılaşma çalışma sağlar. 

Video: Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop within the uterus. A newly developed ex vivo upright droplet culture method provides an attractive alternative to studies performed in utero. The ex vivo droplet culture provides the ability to examine and manipulate cellular interactions and diverse signaling pathways through use of various blocking and activating compounds; additionally, the effects of various pharmacological reagents on the development of specific organs can be studied without unwanted side effects of systemic drug delivery in utero. As compared to other in vitro systems, the droplet culture not only allows for the ability to study three-dimensional morphogenesis and cell-cell interactions, which cannot be reproduced in mammalian cell lines, but also requires significantly less reagents than other ex vivo and in vitro protocols. This paper demonstrates proper mouse fetal organ dissection and upright droplet culture techniques, followed by whole organ immunofluorescence to demonstrate the effectiveness of the method. The ex vivo droplet culture method allows the formation of organ architecture comparable to what is observed in vivo and can be utilized to study otherwise difficult-to-study processes due to embryonic lethality in in vivo models. As a model application system, a small-molecule inhibitor will be utilized to probe the role of vascularization in testicular morphogenesis. This ex vivo droplet culture method is expandable to other fetal organ systems, such as lung and potentially others, although each organ must be extensively studied to determine any organ-specific modifications to the protocol. This organ culture system provides flexibility in experimentation with fetal organs, and results obtained using this technique will help researchers gain insights into fetal development.

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

The&#160;ex vivo&#160;upright droplet culture is an alternative to current&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo&#160;experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

Kullanımı<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tüm Fetal Organları Dik Damlacık Kültürleri Fare Organogenesis sırasında Gelişim Süreçleri Eğitim için

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Gelişim Biyolojisi

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate cancer (PCa). Understanding the anatomy and histology of the mouse prostate is important for the efficient use and proper characterization of such animal models. The mouse prostate has four distinct pairs of lobes, each with their own characteristics. This article demonstrates the proper method of dissection and identification of mouse prostate lobes for disease analysis. Post-dissection, the prostate cells can be further cultured in vitro for mechanistic understanding. Since mouse prostate primary cells tend to lose their normal characteristics when cultured in vitro, we outline here a method for isolating the cells and growing them as 3D spheroid cultures, which is effective for preserving the physiological characteristics of the cells. These 3D cultures can be used for analyzing cell morphology and behavior in near-physiological conditions, investigating altered levels and localizations of key proteins and pathways involved in the development and progression of a disease, and looking at responses to drug treatments.

Genetically engineered mice are useful models for investigating prostate cancer mechanisms. Here we present a protocol to identify and dissect prostate lobes from a mouse urogenital system, differentiate them based on histology, and isolate and culture the primary prostate cells in vitro as spheroids for downstream analyses.

Kimlik, histolojik karakterizasyonu ve için fare Vitro 3D küresel kültür modelleri prostat lob diseksiyonu

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

Kanser Araştırmaları

Three-Dimensional Imaging of Organoids to Study Primary Ciliogenesis During ex vivo Organogenesis

Organoids are stem cell-derived three-dimensional structures that reproduce ex vivo the complex architecture and physiology of organs. Thus, organoids represent useful models to study the mechanisms that control stem cell self-renewal and differentiation in mammals, including primary ciliogenesis and ciliary signaling. Primary ciliogenesis is the dynamic process of assembling the primary cilium, a key cell signaling center that controls stem cell self-renewal and/or differentiation in various tissues. Here we present a comprehensive protocol for the immunofluorescence staining of cell lineage and primary cilia markers, in whole-mount mouse mammary organoids, for light sheet microscopy. We describe the microscopy imaging method and an image processing technique for the quantitative analysis of primary cilium assembly and length in organoids. This protocol enables a precise analysis of primary cilia in complex three-dimensional structures at the single cell level. This method is applicable for immunofluorescence staining and imaging of primary cilia and ciliary signaling in mammary organoids derived from normal and genetically modified stem cells, from healthy and pathological tissues, to study the biology of the primary cilium in health and disease.

<meta charset="utf8"></head><body>Ex vivo Organogenez Sırasında Primer Siliyogenezi İncelemek için Organoidlerin Üç Boyutlu Görüntülenmesi

Stem cell-derived organoids facilitate the analysis of molecular and cellular processes that regulate stem cell self-renewal and differentiation during organogenesis in mammalian tissues. Here we present a protocol for the analysis of the biology of the primary cilium in mouse mammary organoids.

Ex vivo Organogenez Sırasında Primer Siliyogenezi İncelemek için Organoidlerin Üç Boyutlu Görüntülenmesi

Organoids are stem cell-derived three-dimensional structures that reproduce ex vivo the complex architecture and physiology of organs. Thus, organoids ...

Genetik

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ovarian fitness is often assessed by visualizing and quantifying follicles and oocytes. Because the ovary is an opaque three-dimensional tissue, traditional approaches require laboriously slicing the tissue into numerous serial sections in order to visualize cells throughout the entire organ. Furthermore, because quantification by this method typically entails scoring only a subset of the sections separated by the approximate diameter of an oocyte, it is prone to inaccuracy. Here, a protocol is described that instead utilizes whole organ tissue clearing and immunofluorescence staining of mouse ovaries to visualize follicles and oocytes. Compared to more traditional approaches, this protocol is advantageous for visualizing cells within the ovary for numerous reasons: 1) the ovary remains intact throughout sample preparation and processing; 2) small ovaries, which are difficult to section, can be examined with ease; 3) cellular quantification is more readily and accurately achieved; and 4) the whole organ imaged.

Here, we present a protocol to quantify follicles in cultured ovaries of young mice without serial sectioning. Using whole organ immunofluorescence and tissue clearing, physical sectioning is replaced with optical sectioning. This method of sample preparation and visualization maintains organ integrity and facilitates automated quantification of specific cells.

Bütün Dağı ayirt ve kültürlü fare yumurtalıklarda folikül miktar

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed in order to create testicular organoids. Many of these methods rely upon extracellular matrix (ECM) to promote de novo tissue assembly, however, there are differences between methods in terms of biomimetic morphology and function of tissues. Moreover, there are few direct comparisons of published methods. Here, a direct comparison is made by studying differences in organoid generation protocols, with provided outcomes. Four archetypal generation methods: (1) 2D ECM-free, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM-free, and (4) 3D ECM culture are described. Three primary benchmarks were used to assess the testicular organoid generation. These are cellular self-assembly, inclusion of major cell types (Sertoli, Leydig, germ, and peritubular cells), and appropriately compartmentalized tissue architecture. Of the four environments tested, 2D ECM and 3D ECM-free cultures generated organoids with internal morphologies most similar to native testes, including the de novo compartmentalization of tubular versus interstitial cell types, the development of tubule-like-structures, and an established long-term endocrine function. All methods studied utilized unsorted, primary murine testicular cell suspensions and used commonly accessible culture resources. These testicular organoid generation techniques provide a highly accessible and reproducible toolkit for research initiatives into testicular organogenesis and physiology in vitro.

Here, four methods for generating testicular organoids from primary neonatal murine testicular cells are described i.e., extracellular matrix (ECM) and ECM-free 2D and 3D culture environments. These techniques have multiple research applications and are especially useful for studying testicular development and physiology in vitro.

Ekstra Hücresel Matris Tabanlı ve Ekstra Hücresel Matrissiz Murine Testiküler Organoidlerin Üretimi

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. Differentiation of germ cells takes place in the cytoplasmic pockets of somatic Sertoli cells that host 4 to 5 generations of germ cells simultaneously and coordinate and synchronize their development. Therefore, the composition of germ cell types within a cross-section is constant, and these cell associations are also known as stages (I&#8211;XII) of the seminiferous epithelial cycle. Importantly, stages can also be identified from intact seminiferous tubules based on their differential light absorption/scatter characteristics revealed by transillumination, and the fact that the stages follow each other along the tubule in a numerical order. This article describes a transillumination-assisted microdissection method for the isolation of seminiferous tubule segments representing specific stages of mouse seminiferous epithelial cycle. The light absorption pattern of seminiferous tubules is first inspected under a dissection microscope, and then tubule segments representing specific stages are cut and used for downstream applications. Here we describe immunostaining protocols for stage-specific squash preparations and for intact tubule segments. This method allows a researcher to focus on biological events taking place at specific phases of spermatogenesis, thus providing a unique tool for developmental, toxicological, and cytological studies of spermatogenesis and underlying molecular mechanisms.

This protocol describes transillumination-assisted microdissection of segments of adult mouse seminiferous tubules representing specific stages of seminiferous epithelial cycle, and cell types therein, and subsequent immunostaining of squash preparations and intact tubule segments.

Aşağı Akış İmmünasyon Analizleri için Fare Seminifer Epitel Döngüsünün Belirli Aşamalarının Transilluminasyon Destekli Diseksiyonu

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Tüm Dağı Diseksiyon ve Yetişkin Fare Kohlea immünofloresan

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Nörobilim

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Için Fare Fetal Tüm Bağırsak Kültür Sistemi<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sinyal facebook ve villus Kalkınma Üç boyutlu Canlı Görüntüleme Manipülasyon

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Biyoloji

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

Fare Meme Bezinin Dondurulmuş Bölümler Dolaylı İmmünofloresan

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

Organ Kültür ve Fare Wolffian Kanallarının Tüm Dağı Immunoflorasan Boyama

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Kullanımı

Kimlik, histolojik karakterizasyonu ve için fare Vitro 3D küresel kültür modelleri prostat lob diseksiyonu

Ex vivo Organogenez Sırasında Primer Siliyogenezi İncelemek için Organoidlerin Üç Boyutlu Görüntülenmesi

Ex vivo Organogenez Sırasında Primer Siliyogenezi İncelemek için Organoidlerin Üç Boyutlu Görüntülenmesi

Bütün Dağı ayirt ve kültürlü fare yumurtalıklarda folikül miktar

Ekstra Hücresel Matris Tabanlı ve Ekstra Hücresel Matrissiz Murine Testiküler Organoidlerin Üretimi

Aşağı Akış İmmünasyon Analizleri için Fare Seminifer Epitel Döngüsünün Belirli Aşamalarının Transilluminasyon Destekli Diseksiyonu

Tüm Dağı Diseksiyon ve Yetişkin Fare Kohlea immünofloresan

Için Fare Fetal Tüm Bağırsak Kültür Sistemi

Fare Meme Bezinin Dondurulmuş Bölümler Dolaylı İmmünofloresan