Name: indirect immunofluorescence on frozen sections of mouse mammary gland
Uploaded: 2015-12-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland at JoVE.com

Yazarlar, hayvan bakımı ve tesisler için (INRA, UMR1198, Jouy-en-Josas) ve IERP biriminin personel (UE 0907, INRA, Jouy-en-Josas) INRA MIMA2 görüntüleme çekirdek tesisine minnettarız. Biz de çok kullanışlı Antikorların bize sağlamak için IH Mather, MC Neville ve S. Tooze teşekkür etmek istiyorum.

CD1 fareleri INRA (UE0907 IERP, Jouy-en-Josas, Fransa) yetiştirilmiş. Hayvan bakımı tüm etik yönleri Fransa Tarım Bakanlığı tarafından belirlenen ilgili kurallar ve lisans gereklerine uyulması. Kullanılan prosedürler (Comethea Jouy-en-Josas / AgroParisTech gelen anlaşma 12/097) yerel etik kurul tarafından onaylanmıştır. 1. Meme Bezi Numune Hazırlama <ol><li> Fare meme bezi diseksiyon <ol><li> Servikal dislokasyon ile laktasyonun 10. günde fareler Euthanize ve karın yukarı bakacak şekilde aşağı hayvan pin. </li><li> Etanol ile ventral bölgeyi ıslatın ve bir kağıt havlu ile kurulayın. </li><li> Forseps kullanarak, iki arka bacaklarının arasına karın cildi yukarı çekin ve keskin bir makas ile yaklaşık 1 cm (sadece deri yoluyla) bir kesi yapmak. Bu ilk kesi başlayarak, daha sonra fare üzerinde boynuna cilt kadar kesmek için makas kullanın. Periton ve pi Cildi uzakta çekinn Bir kerede cilde bir tarafında aşağı o öğretti germe. </li><li> Karın ve çubukla deriden uzak iterek ve nihayet çekerek veya uzak periton onları keserek inguinal meme bezlerinin toplayın. Not: Bu adımda Carmine boyama tüm bezi 43 olan meme epitel görselleştirmek için gerçekleştirilebilir. Bu yaklaşım, çeşitli koşullarda (fizyolojik gelişim aşamaları, hastalıklar, in vivo tedavi) altında meme bezinin genel morfolojisi analiz etmek faydalı olabilir. </li><li> Karın kavşağında ve kasık bezlerinde 44 bulunan lenf düğümü çıkarın. </li></ol></li><li> Meme dokusu tespit <ol><li> Mümkün olduğu kadar süt uzaklaştırmak için (PBS) çözeltisi, pH 7.4 bir fosfat tamponlu tuzlu su içinde bu parçaları yıkayın hemen bir neşter ile 3 mm 3 parça halinde meme doku kesip. </li><li> Hızlı bir kağıda parçaları kurulayınhavlu ve buz üzerinde 10 ila 15 dakika süreyle% 4 paraformaldehid (PFA, HCHO,% 32 formaldehit çözeltisi, DİKKAT) içeren soğuk PBS çözeltisi koyun. Not: Bu IIF36 ve / veya in situ hibridizasyon 45 meme dokusu dilimleri üzerinde bir sonraki analiz izin vermek için yeterli zamandır. Aldehid sabitleyiciler doku parçaları oldukça yavaş nüfuz Ancak, (~ saatte 1-3 mm), bu zaman doku numunesinin optimal fiksasyonu sağlamak için uzatılabilir. Alternatif olarak, bir fiksatif solüsyonu (bu çalışmada ayrıntılı olmayan) bir anestezi hayvan perfüze in vivo doku düzeltin. </li></ol></li><li> Sukroz infüzyon <ol><li> Hızlı bir şekilde soğuk PBS meme parçalarını yıkayın ve hafifçe çalkalanarak altında 4 ° C de 16 saat 48 için% 40 sükroz (D-sakaroz, C12H22O11, Bay 342.3 g / mol) ihtiva eden soğuk bir PBS çözeltisi sokmaktan. </li></ol></li><li> Doku gömme Not: Bu adımda, meme parçaları küçük parçaları (2-3 mm 3 yapmak için yeniden kesilebilir) Ya da şeklini ayarlamak için. <ol><li> Düzgün plastik kalıp etiket ve oda sıcaklığında muhafaza Ekim bileşiği ile kalıp hacminin 3 doldurun. Kalıp başına meme dokusunun bir parçası (2-3 mm 3) yerleştirin ve OCT bileşiği ile örtün. </li><li> (Alüminyum veya metal bir elek kullanılarak bir tabaka üzerine), sıvı azot yüzeyinde kalıpları yerleştirin ve ürün dondurularak izin verir. Not: sıvı azot içinde kalıp batırılması önce katı ve beyaz olmak zorundadır. </li></ol></li><li> Doku kesitleri yapılana kadar -80 ° C&#39;de donmuş örnekleri saklayın. </li></ol> 2. Donmuş doku Kesit Not: esas olarak bir dondurucu içinde bir mikrotom olan bir kriyostat, donmuş doku bölümleri yapmak için gereklidir. Daha düşük bir sıcaklıkta, genellikle örneğin saf meme bezi gibi hayvansal yağ veya lipid bakımından zengin dokular için gereklidir. <ol><li> ° C -26 kadar kriyostat sıcaklığını ayarlayın ve stabilitenin sahip kadar bekleyinlized. Tüm kesit işlem boyunca -26 ° C &#39;de dondurulmuş doku bloğu koruyun. Kesinlikle işlem sırasında herhangi bir zamanda doku çözündükten kaçının. </li><li> En az 10 dakika süreyle kriyostat yerleştirerek ° C -26 kadar jilet kesme desteği, anti-roll cihaz ve fırça soğutun. Ayrıca bölümler yapılmış gibi cam slaytlar saklamak edebilmek için kriyostat içinde bir slayt kutusu yerleştirin. </li><li> Düzgün RT&#39;de onları doku bölümleri toplamak ve korumak için kullanılacak cam slaytlar etiket; Aksi takdirde doku bölümleri kendilerine bağlı olmayacaktır. Kriyostat içinde kalıp örneği çıkarın. Not: Kullanımı pozitif yüklü cam slaytlar büyük ölçüde nedeniyle yüksek elektrostatik çekim taze donmuş doku bölümleri yapışmasını tercih edecektir. </li><li> (Oda sıcaklığında tutulan) Ekim bileşiği ile metal doku diskin yüzeyini kaplayan ve bunun üzerine donmuş örneği itin. Islak kriyostat içinde monte yerleştirin ve co izinEn az 15 dakika boyunca ol elde edilir. </li><li> Kriyostat disk yuvasına ıslak montaj yerleştirin. Mümkünse, yeni keskin bıçak kullanın ya da en azından her bir örnek bu yana bazı dokular olacak hızla sıkıcı onu kesmek için kullanılan bıçak üzerinde alanını değiştirmek, 5-6 um kesim kalınlığı ayarlayın ve. </li><li> Dilimler eşit ve doğru oluşana kadar montaj orta kesim yaparak jilet üzerinde anti-roll cihazının konumunu ayarlayın. İdeal olarak, anti-roll cihazı yaklaşık 1 mm jilet üzerinde adım olacaktır. </li><li> Ayarların doğru olduğunu bir kez sürekli bir üniforma hareket tekerleği çevirerek doku bölümleri gerçekleştirin. Sıcaklık ideal sürece, bir doku kesiti, doğası gereği, bükmek için çalışacağız. <ol><li> Kapmak ve cam slayt istediğiniz gibi yerleştirmek için sahneye genelinde bölümü manevra için bir fırça kullanın. Dondurulmuş doku bloğu ve / veya jilet üzerinde muhtemelen mevcut kalıntıları temizlemek için bir fırça kullanın. </li></ol></li><li> Çekkullanıcı doğru doku kesiti ve kriyostat sahneye bastırarak kaçının. O sahnede doku dilim ve böylece cam slayt ile onu kurtarmak için yetersizlik yapışması neden olabilir kriyostat sahneye doku kısmını bastırarak kaçının. </li><li> Bölümünde yukarıda tutarak ve doku bölüme dokunmak için aşağı olta balıkçılığı yoluyla, bir cam slayt yüzeyinde onları toplayıp doku kesitlerine teker teker alın. Not: Doku kesitleri hızla nedeniyle statik cazibe sıcak cama yapışır. Birkaç doku kesitleri aynı slaytta yerleştirilir, bunları üst üste ve uzay onları yeterince ayrı bir hidrofobik daire içine alın edebilmek için dikkatli olmak (bölüm 3.1.1 bakın.). </li></ol> 3. Dolaylı İmmünofloresan <ol><li> Bölümleri yerlerinin <ol><li> Slayt monte doku etrafında bir hidrofobik daire çizmek için hidrofobik bir bariyer kalem kullanın. RT&#39;de yaklaşık 1 dakika boyunca daire kurumasını bekleyin. T etrafında bir çizgi çizinSorun ince siyah kalıcı bir kalem ile bölümleri yanı sıra, fakat üzerinde doku kesitleri olan birine zıt cam slayt tarafı. Not: Bu çevre su itici ve aseton ve alkol çözünmeyen. Bu nedenle, IHC prosedüründe kullanılan sulu çözeltiler karşı bir bariyer sağlar ve gereken reaktifler hacmini azaltmaktadır. </li><li> Oda sıcaklığında bir kaç dakika için ~ bir damla PBS 250 ul kaplayarak doku bölümleri rehidrate. ~ 10 ila 15 dakika süreyle PBS içinde yeni hazırlanmış bir% 3 PFA çözeltisi 250 ul kaplayarak doku bölümleri sabitleyin. Not: İsteğe bağlı olarak, bu durumda, bir aldehid söndürme çözeltisi kullanmak (50 mM amonyum klorid (NH4CI, Bay PBS içinde 53,5 g / mol) ve 0.1 M glisin (C2, H 5, NO 2, Bay 75,07 g / mol), PBS içinde ) sabitleme reaksiyonu durdurmak için. Basit ve bol miktarda PBS Yıkama reaksiyona girmemiş olan aldehit çıkanlması ve genel olarak yeterlidir. </li></ol></li><li> Antijen alma (isteğe bağlı) <br/&gt; Not: En antijenler, antijen alımı (AR) olmadan tespit edilebilir iken bu adımı yapılırsa, diğerleri sadece görülecektir. Bazı durumlarda, aynı zamanda, AR gözlenen sinyal değeri kılınmaktadır. <ol><li> Beher AR çözeltisi (100 mM Tris (Cı 4H 11 NO 3, Bay 121.14),% 5 üre (NH2 CONH2, Mr 60,06) pH 9.6) yerleştirin. AR çözeltisinin hacmi tamamen cam tutucu yerleştirilmiş cam slaytlar karşılamak için yeterli olmalıdır. </li><li> Bir termometre ile takip edilerek 95 ° C&#39;ye kadar AR çözeltisi önceden ısıtmak ve daha sonra uygun bir raf üzerinde cam slaytlar yer sıcak tamponu içinde raf immerge kapak buharlaşma sınırlayacak ve 95 ° C de 10 dakika inkübe etmek. </li><li> Su banyosu beher çıkarın ve tampon maddesi içinde 10 dakika daha cam slaytlar bırakın. </li></ol></li><li> Immunodeteksiyon <ol><li> PBS (~ 250 ul / bölüm) ile doku bölümleri durulayın ve bir çözüm ile onları doyurmak% 3 sığır serum albümini (BSA, ~ 250 ul / bölümü) oda sıcaklığında en az 30 dakika boyunca PBS içinde. </li><li> PBS her doku bölümündeki% 2 BSA içeren seyreltilmiş primer antikor 30-50 ul koyun. Not: Bu birim tamamen doku bölümü kapsayan bir damla oluşturmak için yeterlidir. </li><li> Birincil antikor olmayan bir negatif kontrol gerçekleştirmek için, bir doku bölümü üzerinde tek başına seyreltici, (PBS içinde% 2 BSA) ile aynı hacmi yerleştirin. <ol><li> Sistematik olarak, her IHC deneyde, bu negatif kontrol içerir ve (sekonder antikor ve / veya doku bir oto-floresan için spesifik-olmayan etiketleme) deneyi arka tahmin etmek için kullanılan her bir ikincil antikor için gerçekleştirin. Pozitif veya negatif kontrollerin diğer tipleri de (tartışmaya bakınız) etiketleme özgünlüğünü sağlamak için gerçekleştirilebilir. </li></ol></li><li> 4 ° C&#39;de / nemlendirilmiş bir kutu O&#39;da N cam slaytlar yerleştirin. Not: Kullanılan Birincil antikorlar fare monoklonal anti-sitokeratin vardı8 (CK8, 1:50 seyreltme), fare monoklonal 14 (CK14, 1:50 seyreltme), anti-sitokeratin, tavşan poliklonal anti-fare kasein (# 7781, 1:50 seyrelti, cömertçe MC Neville, Colorado Sağlık Üniversitesi tarafından sağlanan Bilimleri Merkezi, CO, USA), tavşan poliklonal anti-BTN1 (1: cömertçe IH Mather, Hayvan ve Kuş Bilimleri Bölümü, University of Maryland, College Park, MD, ABD), tavşan poliklonal anti-Stx6 (tarafından sağlanan 300 seyreltme, cömertçe S. Tooze, Cancer Research, İngiltere, Londra Araştırma Enstitüsü, Londra, UK) ve tavşan poliklonal anti-VAMP4 (1:50 seyreltme) tarafından sağlanan 1:50 seyrelti,. </li><li> İyice oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS ile en az dört kez doku bölümleri yıkayın. </li><li> PBS,% 2 BSA içeren tüm doku kesitlerinde Bu çözeltinin 30-50 ul koyun ve 1.5 saat boyunca inkübe: Uygun ikincil antikoru (300 seyreltme rodamin-konjuge keçi anti-tavşan IgG (H + L), 1) seyreltin oda sıcaklığında karıştırıldı. <ol><li> Fluorochromes ışığa duyarlı moleküller olduğundan, yokOnların analize kadar ışığa doku bölümleri maruz bırakmaktadır. Hücre zarları, düşük etiketleme engelleyebilir yeşil bir otomatik floresan üretmek eğilimindedir beri doku kesitlerinde IIF, kırmızı flüorofora bağlı ikincil antikorlar lehine. Ayrıca, kırmızı bir florofor-bağlı ikincil antikor seçiminde nötral lipidlerin (aşağıya bakınız) eşlik eden etiketleme sağlar. </li></ol></li><li> İyice oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS ile en az dört kez doku bölümleri yıkayın. </li></ol></li><li> Post-fiksasyon (isteğe bağlı) <ol><li> Bazı deneyler için, antijen / antikor iskeleleri stabilize etmek için oda sıcaklığında 10 dakika süreyle PBS içinde seyreltilmiş 2% PFA için örneklerin inkübe edilmesi ile sonradan tespit gerçekleştirin. Bununla birlikte, bu adım birçok durumda gerek kalmaz. </li></ol></li><li> Nötr lipidler ve DNA counterstaining <ol><li> BODIPY 493 3 ug / ml ihtiva eden bir PBS çözeltisinden 30-50 ul doku bölümleri inkübe edilerek clds ve MFG&#39;ler, renk nötr lipidler görselleştirmek içinOda sıcaklığında 10 dakika süreyle / 503. Hızla PBS ile iki kez doku bölümleri yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca DAPI (4-6-diamidino-2-fenilindol, 5 mg / ml stok çözeltisi) 3 uM ihtiva eden bir PBS çözeltisinden 30-50 ul nükleer DNA Counterstain. Gözlem için slaytlar monte etmeden önce PBS ile iki kez doku bölümleri yıkayın. </li></ol></li><li> Bölüm montaj <ol><li> PBS çıkarın ve her doku bölümünde montaj orta bir damla yerleştirin. </li><li> Hava kabarcıklarını önlemek, slayt karşı bir açıyla kapak kayma bir tarafını yerleştirin sıvı damla dış kenarı ile temas ve sonra yavaşça kapağı indirin. Sıvı bir kaç dakika için cam slayt ve kapak slip arasında yayılır ve daha sonra bir kağıt havlu ile orta montaj fazlasının ayrılması için izin verir. </li><li> Gözlem kadar ışığa maruz kaldıkları önlemek için 4 ° C&#39;de oje ve mağaza doku bölümleri ile cam slayt kapak kayma mühür. </li></ol></li></ol>4. Floresan Gözlem ve Image Acquisition Not: görüntü alma yazılımı tarafından kontrol edilen bir kamera İHK sonuçlarını gözlemlemek için gerekli donatılmış bir floresan mikroskop. <ol><li> Görüntüleri elde etmeden önce, etiketleme yoğunluğunu kontrol etmek ve negatif kontroller bakarak deneyin arka değerlendirir. Tek tek her floresan etiket (renk kanalı) fotoğraflarını edinin. </li><li> Her renk kanalı için aynı koşullar (pozlama ve genel ayarlar) karşılık gelen kontrol de dahil olmak üzere, tüm resimleri edinin. </li><li> Geleneksel mikroskopi <ol><li> 63 (yağ daldırma, NA 1.3) hedefleri ve DP50 görüntüleme kamerasını × 20 × standart floresein izotiyosiyanat için filtreler (FITC, yeşil), rodamin (kırmızı) ve DAPI (mavi) emisyonları ile donatılmış bir mikroskop ile Epifloresans mikroskopi gerçekleştirin. </li></ol></li><li> Mikroskopisi </li><li> Bir MICROS ile konfokal mikroskopi gerçekleştirin63 (yağ daldırma, NA 1.4) hedefleri ve lazer 488- ve 568 nm dalga boylarında uyarım × × 20 kullanılarak, ZEN yazılımı ile donatılmış başa çıkabilmek. </li></ol> 5. Görüntü Tedavisi Not: Tüm görüntü sonrası tedaviler ImageJ özgür yazılım (http://imagej.nih.gov/ij/) kullanılarak yapılmaktadır. <ol><li> Görüntüyü üst üste (birleştirme) <ol><li> (Dosya / Aç) kombine olacak her kanalda edinilen görüntüleri açın. 8-bit gri tonlamalı görüntüleri ile çalışan varsa, arama tablosunu (Resim / Arama Tabloları) kullanarak her kanala yapay renk bağlıyor. </li><li> Her kanala bir renk atfetmek ardından (Görüntü / Renkli / Kanallar Birleştirme) &quot;Kanal Birleştirme&quot; komutunu kullanarak ve gri tonlama veya renkli görüntülerden kompozit resmi oluşturun. </li><li> (Dosya / Aç) kombine olacak her kanalda edinilen yığınları açılması ve &amp; kanallarını Birleştirme &quot;komutunu kullanarak görüntü aynı şekilde superimposition yığınlarının gerçekleştirin# 8221; Her kanala bir renk atfetmek (Görüntü / Renkli / Kanalları Birleştirme). Bir görüntü dizisi gibi kompozit yığını Kaydet veya bir film olarak (bölüm 5.4). </li></ol></li><li> Görüntü yığını Z projeksiyon <ol><li> Görüntü düzlemi (z ekseni) dik eksen boyunca onları yansıtarak bir görüntü yığınının tüm resimlerin iki boyutlu bir görünüm sağlamak için Z projeksiyon işlevini (Resim / Stack / Zproject Max Yoğunluğu) kullanın. &quot;Maksimum Yoğunluk&quot; seçeneği her piksel yığınının tüm görüntüleri üzerinde maksimum değeri içeren bir görüntü oluşturur. Bu, belirli bir kanala veya birkaç kanal üst üste sonra tüm görüntü yığınını gözlenen tüm lekelenme görselleştirme sağlayan tek bir görüntü oluşturur. </li></ol></li><li> Görüntü yığını 3D projeksiyon <ol><li> Bir düzlem üzerine dönen hacim projeksiyonları bir dizi oluşturmak için 3D projeksiyon komutunu (Resim / Stack / 3D projesi, parlak Noktası, y-ekseni) kullanın. Su görsel renderediniz varsa ve iç yapıları hem projeksiyon yöntemi (en yakın nokta, burada kullanılan parlak nokta () veya ortalama değeri) bağlıdır ve görselleştirme parametreleri seçildi. Animasyonlu dizinin Her kare, farklı bir görüş açısı çıkıntı sonucudur. </li><li> Üç ortogonal eksen (y-ekseni burada seçildi) her etrafında oluşturulan 3D görüntüyü döndürmek. Tek bir resim veya bir film olarak üretilen dizisi kaydedin. </li></ol></li><li> Film dönüşüm Görüntü yığını <ol><li> Görüntü yığını (Dosya / Aç) açın ve şu komutu &quot;AVI&quot; (Dosya / Kaydet / AVI) kullanarak AVI formatında bir film olarak kaydedebilirsiniz. </li></ol></li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını var olduğunu beyan ederiz.

IHC esas olarak belirli bir epitop antikor etkileşimlerine bağlıdır doku bölgeleri, antijeni lokalize için nispeten basit ve kolay bir deney yöntemidir. Protokolleri sayıda IIF bir proteinin lokalize etmek için kullanılsa da, bu işlemler çekirdek hemen hemen her zaman aynıdır. Ancak, güçlü bir sonucu etkileyebilir ve bu nedenle her İHK çalışma için optimize edilmesi gereken bazı kritik yönleri vardır. Bu yaklaşımın en zor yanı, yani en iyi deneysel koşullarını belirlemektir., Ilgilenilen antijen için güçlü ve spesifik sinyali üreten olanlar. Deneysel tasarım ve optimizasyon için dikkate alınması gereken değişkenler: antijen (1) tipi (türler, ekspresyon düzeyleri, hücre içi konumu); (2) epitop tipi (sekansı, konformasyon, farazi post-translasyonel modifikasyonlar); (3) örnek hazırlama (parafin ya da donmuş bölümleri için gömme); (4) sabitleme mete (perfüzyon veya daldırma); (5) (formaldehit, alkol ya da aseton) kullanılan fıksaj maddesi; (6) kullanılan blokaj reajanı (normal serum, BSA veya yağsız süt); (7) AR adımı; (8) algılama yöntemi (doğrudan veya dolaylı); (8) (monoklonal ya da poliklonal) birincil antikor tipi; (9) sekonder antikor (türler ve etiket); (10) counterstains (çekirdek ve / veya diğer hücresel bölmesi etiketleme); ve (11), montaj ortamı (ayrıntılar için Tablo 1 &#39;e bakınız). Fiksasyon ve bloke adım, en azından böyle bir konsantrasyonu, pH, sıcaklık, inkübasyon süresi ve seyreltici gibi diğer faktörleri optimizasyon gerektirir. İlk önemli yönü yakından da sonuçlarının kalitesini etkiler tespit yöntemi ile bağlantılı olan doku örnekleri, hazırlanmasına ilişkindir. Örneğin, doku parçaları sabit olabilir ya da gömme önce değildir. Bu adım, parafine genel, yani seçilen gömme yöntemi, OCT bileşiği bağlı olabilir, Ki kendisi de bazen kullanılmaktadır birincil antikor bağlıdır. Doku sabitleme fıksatif çözeltisi ile, anestezi verilen hayvanın perfüze in vivo gerçekleştirilebilir. Bu yöntem, sağlam dokuları inceleyerek zaman antijenleri korumak için yararlıdır, ancak ilgi doku düzeltmek için yeterli olmayabilir. Bu durumda, küçük bir doku parçaları (kalın olmayan ve kalınlığa göre daha mm 10) sabitleştirici çözeltisine batırılmış edilebilir. Dondurulmuş doku, sıvı azot veya izopentan içinde doku daldırılmasıyla hazırlanabilir ve ek dondurma olabilir yüksek fosforilasyon gibi translasyon sonrası modifikasyonların saptanmasında için tavsiye edilir. Bununla birlikte, parafine gömülmüş doku farklı olarak, dondurma nedeniyle hücre içi morfolojisini değiştirebilir hücre içinde buz kristalleri oluşumu dokuların uzun süreli korunması için yeterli değildir. Bir kez kesildiğinde, dondurulmuş doku kesitleri 1 yıla kadar -80 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. Herhangi bir durumda, doku örneklerinin hazırlanması doku muhafaza arasında bir uzlaşmadır/ hücresel mimarisi ve epitop bütünlüğünü koruyarak. Bu dokuların kimyasal bileşimini değiştirir bu yana, (fiksasyon altında) eksik ve aşırı (overfixation) fiksasyon sakınmayı sabitleme koşulları optimize etmek için kritiktir. Gerçekten de, bazı antijenler underfixation proteolitik degradasyonu teşvik belirli bir sinyal azaltabilir. Öte yandan, overfixation epitopu maskeleme veya güçlü bir non-spesifik bir arka plan üreten belirli etiketleme değiştirebilir. Böylece, sabitleyici çözeltisi seçimine ek olarak, böyle bir inkübasyon süresi gibi diğer parametreler, sıcaklık ve pH doku fiksasyon etkileyecektir. PFA IHC için en yaygın olarak kullanılan sabitleyici olsa da, bu &quot;evrensel&quot; sabitleyici olarak kabul edilemez. PFA protein-protein, protein-nükleik asit, çapraz bağlantıları indükler ve bu nedenle de artefakt Recó önlenmesi daha sonra epitopu (overfixation) değiştirmek ve edebilirBirincil antikor tarafından gnition. Bununla birlikte, epitop daha AR teknikleri (aşağıya bakınız) ile ortaya çıkarılabilir olabilir. Sitoplazmaya membran bazı fosforile edilmiş proteinler translokasyon indüklediği gösterilmiştir gibi PFA aynı zamanda, belirli bir antijen tespiti için uygun olabilir. Bu gibi durumlarda, PFA, alkol gibi uygun alternatif fiksatif ile değiştirilmelidir. Dokularda su molekülleri değiştirerek doku fiksasyon izin verirse, PFA farklı olarak, örneğin, metanol ya da etanol gibi alkoller epitopları maskesi yok. Bu proteinlerin çökelmesine yol ve daha sonra bağlı konformasyonel değişikliklere antikor / epitop etkileşimi engelleyebilir. Bu yaygın alkoller nüfuz etmez ve bu nedenle PFA gibi doku morfolojisi korumaz düşünülmektedir. Aseton sabitlenmemiş, hızlı bir şekilde dondurulup doku kesitleriyle çalışırken yaygın olarak kullanılan diğer bir alternatif sabitleyici vardır. Bununla birlikte, aseton kuvvetli bir dehidratasyon maddesi ve doku proteinlerine geri döndürülemez çökelmesine neden olabilir. <p&gt; Bazı antijenler için AR ek bir adım sabitleyici yapı değişikliklerini oluşturmaktadır ya da (epitop maskeleme) epitopunun elektrostatik yük değiştirir özellikle eğer iyi bir sinyal elde etmek için gerekli olabilir. AR yöntemler epitop immunoreaktivitesini ve primer antikor ile onun sonraki etkileşimi geri bu süreçlerin tersine hedefliyoruz. AR yöntemleri temel olarak iki yaklaşım dayanır: bu epitop peptidleri maskesi bölen proteinaz K, tripsin ya da pepsin gibi enzimleri ile (1) proteaz kaynaklı epitop, yani; ve (2) ısı kaynaklı epitop alma, yani bir mikrodalga fırın, düdüklü tencereler, sebze vapurları, otoklav veya su banyoları ile. Bu ikinci yaklaşım, özellikle, zaman ısıya, tampon-ve pH duyarlı olduğunu ve optimal koşullar ampirik (bir örnek Protokolü bölümünde sağlanan) tespit edilmelidir. Alternatif olarak, antijen için bir antikorun afinitesinin arttırılabilirpH veya antikor seyreltici katyon konsantrasyonunun değiştirilmesi gereklidir. Permeabilizasyon aşaması bazen, özellikle çekirdek antijeni boyama, kalın bir doku bölümlerinde bir hücre içi epitopuna iyi bir sinyal elde etmek için gereklidir. Bu kullanılarak çeşitli yollardan elde edilebilir: (1) fiksatif gibi alkoller veya aseton; ya da (2) bu tür Triton, NP-40 (PBS içinde% 0.1-0.2, 10 dakika), digitonin, saponin ya da Tween 20 gibi deterjanlar PFA tespit sonrasında (10 dakika 30 için 0.2-0.5%). Bununla birlikte, deterjan seçimi tespit epitopuna hücresel konumuna bağlıdır. Gerçekten de, hücre zarının çözündürme gibi Triton-X100 gibi sert deterjanlar, nükleer epitop algılama için uygundur, ancak bazı zar proteinlerinin ekstraksiyonu sonucunda değişikliğe sinyal yol açabilir. Hafif deterjan (saponin ve Tween 20) kullanılması, sitoplazmik epitoplarının saptanması için daha uygundur. İkinci kritik bir adım olduğunu Blockinspesifik olmayan lekelemeye g. Hedef epitopa bir antikorun bağlanma moleküller arası kuvvetler (örneğin, hidrofobik ve iyonik etkileşimler, hidrojen bağı) ile yönetilmektedir. Bu nedenle, hedef antijenlere göre başka proteinlere olan primer ve / veya sekonder antikor etkileşimi spesifik olmayan lekelemeye neden olabilir. Bu ilgi protein görselleştirme (düşük sinyal / gürültü oranı) önler, yüksek floresan arka plan oluşturur. Reaktifler engelleme spesifik antikor / epitop etkileşimi bozmadan spesifik olmayan etkileşimleri azaltır. Genel bir prosedür, ısı ile inaktive edilmiş normal serum veya BSA ile doku bölümleri inkübe oluşur. Normal bir serum kullanılarak, bu ikincil antikor konak hayvanın bu veya alakasız bir türden aynı türden olması gerekir. Her durumda, seçilen bloke edici ayıracı, birincil ve ikincil antikorlar için seyrelticiler ilave edilmelidir. Bundan başka, örneğin Triton X-100, T gibi iyonik olmayan deterjanların kullanılmasıween 20 veya saponindir spesifik olmayan etkileşimleri azaltmaya yardımcı olur. Üçüncü ve belki de en önemli parametre birincil antikor seçimi ve optimizasyonu olduğunu. Tabii ki, en iyi seçim az çapraz reaktiviteli yüksek kaliteli bir antikordur. Monoklonal antikorlar, genellikle tek bir epitopu için yüksek bir çekim ve özelliğe sergileyen gibi, yüksek dizi benzerliği olan bir protein ailesi belirli bir elemanı ayırmak için en iyi araçlardır. Hedef epitop doğal oluşum durumunu kaybettiği takdirde, veya epitopa erişim diğer proteinler, post-translasyonel modifikasyonlar, sıcaklık, pH, tuz konsantrasyonu tespit ve etkileşim ile engellenir, ancak antikor / epitop etkileşimi elde edilebilir. Bu gibi durumlarda, poliklonal antikorlar, aynı proteinin birden fazla epitopları tanıyan daha fazla uygundur. Ayrıca, bunlar genellikle pH ve tuz konsantrasyonunun bir geniş bir aralıkta tek klonlu antikorlara göre daha stabildir.Için ampirik olarak tespit olması, kuluçkalama süresi, seyreltici ve sıcaklık, ön çalışmalar uygun inkübasyon koşulları, örneğin, çalışma seyreltisi (1,7-15 mg / ml: 5-25 mg / ml, poliklonal antikor, monoklonal antikor) tanımlanmalıdır Her primer antikor. Bu parametreler, düşük arka plan gürültüsü ile uygun bir sinyal üretmek koşulları belirlemek için optimize edilmiş olması gerekir. Etiketleme özgüllüğü (yani., Oda sıcaklığında genel, 4 ° C) daha düşük sıcaklıklarda daha uzun kuluçka sürelerinde tarafından tercih edilmektedir. Doğrudan ya da dolaylı bulgulamanın yerine getirilmesi için seçimi genellikle antijen ekspresyonunun seviyesine bağlıdır. Örneğin, yüksek ölçüde sentezlenmiş bir epitop basit bağlı ikincil bir antikorun kullanılması ile mümkün olan spesifik olmayan arka plan kaçınarak ve böylece hızlı ve basit bir renkli boyama sağlayan bir florokrom-eşlenik primer antikor ile tespit edilebilir. Ancak, s may daha yüksek bir maliyetle düşük sinyal üretir IF doğrudan ve canometimes zor olabilir, işaretlenmiş antikor ticari olarak mevcut değildir. Üretilen sinyal, birincil antikor (büyütme) ile bağlı (birincil antikor konak türlerinden karşı üretilmiş) en az iki etiketli sekonder antikor etkileşimi daha yoğun olduğu Tersine, IIF düşük ifade epitopları belirlemek için daha duyarlıdır. Bundan başka, çeşitli floroforlar konjüge sekonder antikor geniş, nispeten ucuz, ticari olarak temin edilebilir, ve kalite kontrol edilir. Bununla birlikte, bu yaklaşım, çapraz reaktivite indükleyebilir ve böylece dikkatle birden etiketleme deneyler aynı türler ya da farklı izotiplerin üretilmeyen primer antikorlar tercih gerektirir. IIF bazen ilave bloke adımları gerektirir ve sistematik negatif kontrol (aşağı bakınız) içermelidir. Amplifikasyon daha mo başına bağlanan bir biyotin-konjuge sekonder antikor kullanılarak elde ve floresan avidin veya streptavidin (dört biotins etiketlenebilirlecule). Bununla birlikte, bu amplifikasyon yöntemi spesifik olmayan bağlanma önlemek için ek adımlar gerektirir ve endojen biyotin yüksek seviyelerinin mevcudiyetine bazı dokularda (karaciğer, böbrek, kalp, beyin, akciğer ve meme bezi laktasyondaki) boyama için adapte edilemez . Bununla birlikte, endojen biyotin, avidin numune ön kuluçka ve daha sonra primer antikor ile inkübe edilmeden önce, biotin ile bloke edilebilir. Daha kısa dalga boylu ışığı tarafından uyarıldığı zaman ışık yayarlar özelliği ile küçük kimyasal moleküller olan konjuge fluorochromes, seçimi, öncelikle mevcut mikroskop ekipman tipine bağlıdır. Doğru kullanıldığında fluorochromes spektral özellikleri arasındaki antikorlar ve çapraz arasında her iki çapraz reaktivite sınırlamak için tasarlanmış zaman immünofloresan tabanlı İHK çoklu hücresel hedeflere eş zamanlı görüntüleme sağlar. Son kritikİHK deneyleri ile ilgili nokta, lekelenme geçerliliğini desteklemek için deneysel eserler belirlemek için gerçekleştirilen ve sonuçların doğru yorumlanması için gereken pozitif ve negatif kontroller ile ilgilidir. Bazı doku sonuçlarının yanlış yorumlanmasına yol açabilir (otofloresansı olarak anılacaktır), yüksek floresan arka plan sergiler. Böylece, doku kesitleri IHC deney başlamadan önce her iki floresan ve parlak alan aydınlatma altında uyulması gerekmektedir. Birincil antikor atlar bir negatif kontrol sistemli ikincil antikor bağlanmasının potansiyel bir spesifik olmayan belirsiz olmayan önemsizdir ve yok olmasını sağlamak veya belirli boyama paternine daha çok benzemesine için her bir IHC deneyde dahil edilmesi gerekir. Aynı izotipin olmayan bir bağışıklık antikor ile değiştirerek bir monoklonal primer antikor ile çalışırken bir izotip kontrol gerçekleştirilebilir (örneğin, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgM) aynı konsantrasyonda. Bu kontrol es olurnumune ile antikorların etkileşimi nedeniyle olabilir, spesifik olmayan boyama, kurabilme becerisini. 4 ° C &#39;de: (1 mol oranı 10) O / N (1), bunun çözünebilir immünojen ile: kendi antijene karşı bir antikorun spesifik bağlanmasını göstermek için, bir emme kontrol primer antikor ön kuluçka iki şekilde elde edilebilir ; ve (2) hücrelerin veya ilgi epitopunu ifade ancak çalışılan dokudan farklı doku kesitleriyle (örneğin, 59 Şekil 4B &#39;ye bakınız). Her iki durumda da, birincil antikor sonucu azalması çok az veya hiç lekelenmeye neden olmalıdır. Kontrol, başka tür, alakasız bir primer antikor kullanılarak yapılabilir, yani., Ilgi konusu epitopu farklı bir hücresel lokalizasyonunu (sitoplazmik genel nükleer) sergileyen bir epitopa karşı yönlendirilen. Ilgisiz bir antikor da primer antikor olarak aynı izotip ve türden olmalıdır. IHC deneyleri için ilave kontroller Tiss örnekler kullanımını içerebilirÇevrede epitopunu (transgenik hayvanlar) ifade ya da (knock-out hayvan) bilinen ues. Bu yararlı bir referans sağlamak ve İHK prosedürü optimize etmek için yardımcı olabilir. IF teknikler ana sınırlama sadece, her iki prosedür, potansiyel olarak eserler indükleyici, sabit (ölü) tatbik edilir ve / veya hücrelerin geçirgen olmasıdır. Bu yaklaşımın diğer sınırlamalar numunelerin gözlem için mikroskop kullanımına bağlıdır. Epifloresans ve konfokal mikroskop optik çözünürlük sınırlı olduğu gibi İlk olarak, tespit protein konumu ya da eş-yere yorumlanır aşırı olmamalı. İkinci olarak, yani, ışıkla ağartma. ışığına maruz kaldığında zaman içinde floresan yoğunluğu solmasını da, fluorofor fotokimyasal yıkıma yol açan, floresans uyarıldığında numunede reaktif oksijen türlerinin üretimi üzerine inşa edilmiştir. Photobleaching azaltılabilir: a) korunmaktadır örnekleri tutmakOnların gözlem kadar IF deney ve depolama sırasında ışık; b) montaj orta bir antifade madde (reaktif oksijen türleri temizleyiciler) kullanılarak c) yoğunluğu ve / veya uyarma ışık süresini azaltarak; d) fluorophores konsantrasyonunun arttırılması veya yüksek kuantum verimi ile florokrom maddenin düşük bir konsantrasyonunu kullanmak; ve e) (örn. Alexa Fluors, Seta Fluors veya DyLightFluors) ışıkla ağartma karşı daha az eğilimlidirler sağlam fluorophores kullanılmıştır. Ve indirgenmiş piridin nükleotitlerin (NADH: emme, 340 nm, emisyon 460 nm), memeli hücrelerinde;: Üçüncü olarak, otofloresansı bağlı flavin koenzimler (emisyon 515 nm emilim, 450 nm FAD ve FMN) varlığında için sık sık. Ayrıca, numune düzeltmek için aldehidler, özellikle de glutaraldehid, kullanımı otofloresansı yüksek seviyeleriyle sonuçlanabilmektedir. Bu ve / veya probları ve m, optik filtreleri seçerek ve önceden antikor inkübasyon PBS içinde% 0.1 sodyum borohidrid ile örnekleri yıkanmasıyla en aza indirilebilirotofloresansı floresan sinyal göreli aximize. Dördüncü olarak, floresan örtüşme genellikle çok geniş bir bant genişliği, farklı asimetrik spektral profillerin yanı sıra çeşitli tepe emisyon dalga boyları ve sayısını gösterir ve bu durum nedeniyle florofor emisyon spektrum özelliklerinin esas olarak (aynı zamanda, boşaltma yoluyla, çapraz veya çapraz olarak adlandırılır) maksimum nokta bulunmamaktadır. Başka bir fluorofor birkaç flüoroforlar (renkli etiketleme) ile çalışan ve kanal (filtre) bir floroforun emisyonu ile karakterizedir zaman Floresan örtüşme meydana gelir. Genellikle, özellikle eş-lokalizasyonu veya kantitatif çalışmalardan durumunda sonuç IF yorumlanmasını da karmaşık olarak akmalarını eserler en aza indirilmelidir. Flüoroforlar emisyon dengeleme biraz IF prosedürü ile sadece gelişmiş olabilir gibi, kanama-through başta düzgün separ amacıyla optimize edilmiş floresan filtre setleri ve / veya photomultiplier dedektör kullanılarak görüntü elde zamanında azaltılabilirflorofor spektral profiller yedi. Belirli bir algılama kanalı her işaretin, tek tek fluorophores farklılaşma floresans emisyon sağlar Bu bağlamda, konfokal mikroskopi renkli görüntüleme çok uygundur. Ayrıca, konfokal mikroskopi etiketleme sıralı edinme (bir seferde sadece tek bir fluorofor) için ayrı ayrı tespit kanalları için kazanç, photomultiplier gerilimi veya lazer gücünü ayarlamak için izin verir. İdeal olarak, tek etiketli kontrolleri boşaltma-through ölçmek ve sonunda hesaplama kaldırmak için yapılmalıdır. Ikincil antikorlar olmadan bir kontrol (arka plan kontrol) sinyal kazancının limitlerini ayarlamak hazırlanan ve optimum görüntü elde etmek için her kanalın mahsup edilebilir. Ayrıca doğru görüntü arka planı (otofloresansı) post-satın alma işlemi için de kullanılabilir. Sonuç olarak, açıklanan yöntem kolay realizati için basit bir standart protokol sağlarMeme bezi bölümlerinde immün on. Bununla birlikte, bir IHC deney ana aşamaları, spesifik boyama görselleştirmek ve non-spesifik bir arka plan sinyalleri en aza indirmek için her bir antijen / antikor, çift için optimize edilmelidir. Tarif edilen yöntem de elde görüntülerden en sonrası tedavi için birkaç temel yöntem içerir. Floresans tabanlı immunodeteksiyon tanıya bir antijenin hücresel lokalizasyon gelen geniş bir uygulama yelpazesi ile güçlü bir yöntemdir. Bu yaklaşımlar yeni gelişmeler görüntüye yeni fluorophores, satın alma cihazları ve mikroskopi teknikleri gelecekteki gelişimi ile biyolojik yapıların ve süreçlerin önceden farkedilmemiş ayrıntıları elde edilecektir.

Meme bezi asıl işlevi yenidoğanların beslemek için süt üretmek için bir atipik memeli exocrine organıdır. Meme dokusu gelişimi esas olarak doğum sonrası meydana gelir ve epitel çevreleyen dokudan işgal ettiği benzersiz bir süreç ile karakterize edilir. Bu doku eş zamanlı üreme durumu varyasyonların (Şekil 1), özellikle erişkin yaşamı boyunca, pek çok değişiklik (büyüme, farklılaşma ve regresyon) uğrar. Doku genel morfolojisine ek olarak, farklı hücre tiplerinin yanı sıra meme bezi içindeki düzenlemesinin oranlar önemli ölçüde gelişme 1-5 boyunca değişmez. Embriyonik yaşamı boyunca meme epitel embriyonik gün 10,5 (E10.5) (Şekil 1A yaklaşık orta hattın her iki tarafında ön ve arka bacak arasında ektoderm hafif bir kalınlaşma ve tabakalaşma tarafından tanımlanan meme süt çizgileri türeyen ).E11.5 üzerinde süt hattı simetrik tekrarlanabilir yerlerde meme süt hattı boyunca konumlandırılmış bireysel placodes, içine kırılır ve çevredeki mezenşimin yoğunlaşmaya başlar. Placodes dermis içine derin batmaya başlar ve meme mezenşimin meme tomurcuğu (E12.5-E14.5) etrafında konsantrik tabakalar halinde düzenler. E15.5 itibarıyla meme epitel, çoğalmaya ve yağ yastığı doğru meme mezenşimin aracılığıyla iter birincil filiz oluşturmak üzere uzatılması başlar. Birincil filiz nipel kılıf oluşumu ile işaretlenmiş cilde bir açıklığı olan bir içi boş lümen geliştirir. E18.5 üzerinde uzama kanal yağ yastığı haline geldi ve yağ yastığı kapsayan küçük bir arborized duktal sistemi içine dallı gelmiştir. Kalkınma esas tutuklandı ve ilkel meme bezi ergenliğe kadar morfogenetik sessiz kalır. Erkek embriyo, androjen reseptörlerinin aktivasyonu yok tomurcukları, dejenerasyonuna yol açarE15.5 tarafından. E18 itibariyle meme gelişimi ergenlik 6-9 kadar durur. Doğumda, meme bezi uzatır ve dalları yavaş yavaş (izometrik büyüme) bir ilkel duktal sistemi barındırıyor. Ergenlik başlangıcında, kanalların ucunda yer alan küre biçimli yapılar terminal uç tomurcukları (TEB), kapak hücrelerin bir dış tabaka ve bir hücre tabakalı iç kısım (vücut hücreleri) oluşturulmaktadır adlandırılır. Bu yapılar yüksek proliferatif ve hormonal uyaranlara yanıt olarak çevreleyen stromal doku sızmak. Duktal uzama TEB&#39;in sonuçlar içinde Silahların Yayılmasını Önleme, morfolojilerinden dallanma ile birleştiğinde. Bu süreç meme başı (Şekil 1B, ergenlik) kaynaklanan bir temel epitel arborized ağının kurulmasına yol açar. ~ 10-12 hafta doğumdan sonra, epitel bütün yağ yastığı işgal etmiştir, genişleme durur ve at TEB kaybolur. Duktal geliştirme sonra dinamik değişiklikleri, yani Successi uğraröstrus döngüsü 10 (Şekil 1B, yetişkin) göre olan epitel hücrelerin proliferasyonunu ve regresyonu ettik. Gebeliğin başlangıcından itibaren, meme dokusu emzirme hazırlanmak için önemli büyüme ve morfolojik değişikliklere uğrar. Meme epitel yoğun bir çok dallı tübülo-alveol ağa lider, çoğalmaya ve ayırt. Buna paralel, meme epitel hücreleri (MECler) polarize ve sentez ve süt ürünleri salgılar mümkün hale gelir. MECler kasılma myoepitelyal hücreleri ile çevrilidir ve bağ ve yağ dokuları, kan damarları ve sinir terminalleri (Şekil 1B, gebelik) oluşan bir stroma dahil edilmiştir sayıda alveol yapılar (acininin) içine düzenliyoruz. Ayrıca, MECS bazal yan bazal membran (hücre dışı matris) ile yakın temas içinde olduğunu ve bu iki varlık arasındaki etkileşimler sıkıca memenin hem morfogenezine ve salgı fonksiyonunu düzenlerry epitel 11-13. Tüm bu işlemler, en önemli hormones14 olan çeşitli çevre hareketlerine, parakrin faktörleri ve hücre dışı matrisin etkisine dayanır. Örneğin, progesteron, geniş yan dallanma prolaktin (PRL) ile kombinasyon halinde, 15 ve 16,17 alveologenesis indükler teşvik eder ve alveol farklılaşmasını korur. Steroidler ve PRL18, sitokinler ve gelişimi ile ilişkili sinyal yolları yanı sıra (Wnt sinyal yolları ve Notch) ayrıca meme soy bağlılığı ve geliştirme 19-21 katılmaktadırlar. Gebeliğin sonunda lümen MECler alveol lümeninde kolostrum olarak bilinen bir protein bakımından zengin süt üretmeye başlarlar. Ayrıca, progesteron epitel geçirgenliğine etki eder ve sıkı bağlantıları hala açık olduğundan, kolostrum maternal kan akışı bulunur. Doğumdan sonraki, mammary epiteli (Şekil 2, meme epitel) hemen hemen tüm meme bezi hacminin kadar sürer ve son derece organize edilmektedir. Süt üreten üniteler, yani alveollerin (Şekil 2, alveol), apikal plazma zarı lümen sınırlayan ile polarize meme epitelyum salgılama hücrelerinde (MESCs) bir tek tabaka ile oluşturulmuştur. Alveoller dış ortamın (Şekil 2, lob) süt drenaj kanallarına bağlı loblar şeklinde gruplandırılmış lobülleri kendilerini düzenlemek. Emzirme oluşur yani., MESCs öncelikle plasental hormonlar damla (özellikle progesteron) (Şekil 1B, laktasyon) tarafından tetiklenen süt bol miktarda, salgılamaya başlar. Süt protein genleri esas emzirme sırasında serbest bırakılacak hipofiz PRL yanıt olarak, gebelikten laktasyon 9,22,23 arasında değişen belirli bir zamansal zamanla aktif hale gelir. Buna paralel, MESCs hem ekstraselüler matriks arasındaki temaslar süt protein synt teşvikHücresel integrinler ve laminin 24,25 arasındaki etkileşimlerin aracılık ettiği ve MESCs 26,27 apoptoz bastırmak sinyallerin aracılığıyla nüklerde. Bu sinyal yolları belirli bir transkripsiyon aktivasyonu 29 faktörleri ile süt protein geni promoterlerinden 28 aktivasyonu ile sonuçlanır. Hücre-hücre kişileri de apikal kutupluluk kurulması ve süt ürünlerinin vektörel salgılanması da dahil olmak üzere farklılaşma bazı yönleri için önemlidir. Laktasyon ve MESCs başladıktan sonra hızla kapatmak sıkı bağlantılar ince yenidoğanlarda besin ihtiyaçlarına yanıt olarak kanda yanı sıra süt bileşenlerinin sentezi, taşınması ve salgılanması gelen moleküllerin alımını orchestrate. Emzirme sırasında, alveoller çevreleyen myoepitelyal hücrelerinin kasılması oksitosin yanıt olarak ortaya çıkar ve kanallar boyunca ve meme ucu içine süt fırlatma yol açar. Süt proteinleri içeren karmaşık bir sıvı (çoğunluklakazein), şekerler (özellikle laktoz) gibi immünoglobulinler A (IgA), büyüme faktörleri ve hormonlar gibi lipidler ve mineraller gibi biyolojik olarak aktif moleküller. Kazeinler, yani salgı yolu boyunca taşınan miseller, kazein, supramoleküler yapılarda monte sentezlenebilir ve daha sonra exocytosis tarafından yayımlanan, yani Mesc apikal plazma membranı ile kazein içeren salgı kabarcıklarına füzyonu (SVS) (Şekil 2). Hücre içi trafik membranöz bölmeleri arasındaki maddi borsalarında dayanır ve gerektirir Çözünür N-etilmaleimit Duyarlı Füzyon (NSF) Eklenti Protein (SNAP) Reseptör (SNARE) 30,31. SNARE proteinleri ailesi, hedef zarlarında lokalize veziküler vesikül membran içinde mevcut tuzak (v tuzak), ve hedef tuzak (t-tuzak) bölünmüştür. Bunların halkalaştırılmış halka etki ile sıkıştırma ile, v-ve t-tuzak oldukça dengeli bir dört sarmal demet kompleksi oluşturmak üzere birleşir, ifade inci gibie SNARE kompleksi. Bu kompleks giderek yakın 30,32 içine getirerek iki karşıt lipit bilayers füzyon teşvik etmektedir. Daha sonra, Snare kompleksleri NSF adenozin trifosfat tarafından ayrışmış ve onun adaptör protein SNAP ve Snare proteinler kökenli 33 kendi bölmesine geri geri dönüştürülür. İlginçtir ki, her SNARE protein ağırlıklı hücre içi füzyon olayları 34 özgüllük katkıda bulunabilir farklı hücre bölmeleri ve SNARE eşleştirme bulunur. Daha önceki çalışmalar, en azından Protein 23 (SNAP23) ve veziküllü Associated Membrane Protein 8 (VAMP8) ve syntaxins (STX) sinaptozomal-ilişkili olduğunu göstermektedir -7 ve -12 kasein Ekzositoz 35,36 bir rol oynayabilir. Bu proteinler aynı zamanda sütün lipid fraksiyon, örneğin, süt yağı globülleri (MFG&#39;ler) 37 ile bağlantılı olarak tespit edilmiştir. Mevcut olan model, sitoplazmik lipid damlacıkları (clds) nötr l birikimi ile oluşturulmaktadır öne sürülenipids (özellikle triaçilgliseroller ve sterol esterleri) ve endoplazmik retikulum (ER) zarında 38-41 iki broşürler arasında anne diyet türetilen kolesterol. Büyük clds MESC apikal plazma membran ile sarılmış olan, tomurcuklanarak bunlar MFG&#39;lerin olarak yayınlanırlar MESCs apikal tarafında (çapı 1-10 um) nakledilirken küçük CLD füzyonuyla, en azından kısmen oluşturulmaktadır 40-42. Yavrular sütten ve MESCs giderek geri puberte durumuna (Şekil 1B, involution) için meme dokusunun gerileme neden apoptoz ile ölmek sonra Emzirme sona erer. İmmünofloresan (IF) araştırma ve klinik teşhis hem de biyoloji neredeyse tüm yönleriyle kullanılan yaygın bir analitik laboratuvar yöntemidir. Teknikler doku kesitlerinde yapılabilir IF (immünohistokimya, İHK) veya hücre (immünsitokimya, ICC) örnekleri. Bu güçlü bir yaklaşım fluorescent- kullanımına dayanmaktadırÖzellikle bu şekilde floresan mikroskobu aracılığıyla doku dağılım gözönünde canlandırılmasına olanak tanıyan ilgilenilen antijene (doğrudan ya da dolaylı olarak) bağlanan etiketli antikorlar. Floresan sinyalleri çoğunlukla numunenin kalitesi ve konsantrasyonu antikorların ve doğru olarak kullanma bağlıdır. Basit bir indirekt immunfloresan (IIF) protokolü süt ürünleri (kazein ve MFG&#39;ler) ve süt ürünleri salgılanması yer alan proteinler tespit etmek için sunulan fare meme dokusu (Şekil 3) donmuş bölümlerinde (butirofilin (BTN1), proteinler trampet). Bu protokol, doku toplama görüntü tedavi sonrası, eleştirel ve isteğe bağlı adımların yanı sıra bazı teknik önerilere kadar, tam bir İHK bakış sağlarken aynı zamanda sunulmuş ve tartışılmıştır.

<table><tbody><tr><td>Dissection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpel and adapted blades</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Towel paper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue sample preparation</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (pH7.4)</td><td>Sigma</td><td>P-3813</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA, 32% EM grade, 100 ml)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714-S</td><td>personnal protection equipment required WARNING: this product will expose you to Formaldehyde Gas, a chemical known to cause cancer</td></tr><tr><td>OCT compound/Tissue Tek</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose (D-saccharose)</td><td>VWR</td><td>27480.294</td><td></td></tr><tr><td>Plastic molds</td><td>Dominique Dutscher</td><td>39910</td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryostat/sample support</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>CM3050S</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades (SEC35)</td><td>Thermo Scientific</td><td>152200</td><td></td></tr><tr><td>Slide box</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass slides Superfrost/Superfrost Ultra Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>10143560W90/1014356190</td><td></td></tr><tr><td>Brushes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IHC</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>Super Pap Pen</td><td>Sigma</td><td>Z377821-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Permanent marker (black)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl in PBS</td><td>Sigma</td><td>A-0171</td><td></td></tr><tr><td>0.1 M glycine in PBS</td><td>VWR</td><td>24403.367</td><td></td></tr><tr><td>Antigen Retrieval solution: Tris 100 mM 5% urea pH9.6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heater (up to 100&amp;deg;C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield (anti-fading mounting medium) without DAPI/with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000/H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips 22x50mm (microscopy grade)</td><td>VWR</td><td>CORN2980-225</td><td></td></tr><tr><td>Nail polish</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primary antibodies</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>Rabbit anti-mouse caseins (#7781; 1:50 dilution)</td><td>generously gifted by M.C. Neville (University of Colorado Health Sciences&lt;br/&gt; Center, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-cytokeratin 8 (CK8, clone 1E8, 1:50 dilution)</td><td>Biolegend (Covance)</td><td>MMS-162P</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-cytokeratin 14 (CK14, cloneLL002, 1:50 dilution)</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-115-P0/P1</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-butyrophilin (1:300 dilution)</td><td>generously gifted by I.H. Mather (Department of Animal and Avian Sciences University of Maryland College Park, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-Stx6 (1:50 dilution)</td><td>generously gifted S. Tooze&lt;br/&gt; (Cancer Research UK, London Research Institute, London, UK)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-VAMP4 (1:50 dilution)</td><td>Abcam</td><td>ab3348</td><td></td></tr><tr><td>Secondary antibodies</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>Rhodamine-conjugated goat anti-rabbit IgG (H + L) (1:300 dilution)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>111-025-003</td><td></td></tr><tr><td>Counterstains</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>Bodipy 493/503</td><td>Life Technologies (Molecular Probes)</td><td>D-3922</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole)</td><td>Life Technologies (Molecular Probes)</td><td>D-1306</td><td></td></tr><tr><td>Observation/Image capture</td><td>&lt;span style=&quot;line-height: 20.8px;&quot;&gt;Company&lt;/span&gt;</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>conventional fluorescence microscope</td><td>Leica Leitz DMRB&lt;br/&gt; microscope</td><td></td><td>Standard filters for FITC, Rhodamine&lt;br/&gt; and DAPI emissions,&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; &amp;times;63 oil-immersion objective (NA 1.3), DP50 imaging camera (Olympus), Cell&amp;circ;F software (Olympus)</td></tr><tr><td>Laser Scanning Microscope (confocal microscopy)</td><td>Zeiss LSM&lt;br/&gt; 510 microscope</td><td></td><td>Plan-Apochromat &amp;times;63 oil-immersion objective (NA 1.4),&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; CLSM 510 software,&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; Confocal facilities, MIMA2 Platform, INRA Jouy-en-Josas, France, http://mima2.jouy.inra.fr/mima2)</td></tr><tr><td>Image treatment</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>ImageJ 1.49k software</td><td></td><td></td><td>Free software</td></tr></tbody></table>

indirect immunofluorescence on frozen sections of mouse mammary gland

Dolaylı immünoflüoresans algılar ve bir dokuda ilgili proteinleri bulmak için kullanılır. Burada sunulan protokol proteinlerinin bağışıklık saptanması için bir tam ve basit bir yöntem olup, meme bezi laktasyondaki fare örnek olarak alınmıştır açıklanmaktadır. Özellikle fare meme bezi, doku fiksasyon ve dondurulmuş doku kesit diseksiyon ilgili doku örneklerinin hazırlanması için bir protokol, ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bir standart bir protokol isteğe bağlı antijen alma aşaması da dahil olmak üzere, dolaylı immünofloresan gerçekleştirmek için de sunulmaktadır. Etiketli doku kesitlerinin gözlem yanı sıra görüntü toplama ve post-tedavileri de belirtilmiştir. Bu prosedür, bir proteinin hücresel lokalizasyonu hayvan dokusunun koleksiyonundan tam bir bakış verir. Bu genel yöntem, diğer doku örnekleri uygulanabilir olsa da, çalışılan her doku / birincil antikor çift göre adapte edilmelidir.

Watch this Scientific Journal Video about Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland at JoVE.com

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Bu makalede açıklanan dolaylı immünfloresan protokol algılama ve fare meme bezinde proteinlerin yerelleştirme verir. Tam bir yöntem olup, meme bezi örnekleri hazırlamak için floresan mikroskobu ile görüntü, doku kesitlerinde immunhistokimya gerçekleştirmek için ve görüntüleri yeniden verilir.

Fare Meme Bezinin Dondurulmuş Bölümler Dolaylı İmmünofloresan

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

indirect-immunofluorescence-on-frozen-sections-of-mouse-mammary-gland

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

36.8K Görüntüleme.  INRA.  Bu makalede açıklanan dolaylı immünfloresan protokol algılama ve fare meme bezinde proteinlerin yerelleştirme verir. Tam bir yöntem olup, meme bezi örnekleri hazırlamak için floresan mikroskobu ile görüntü, doku kesitlerinde immunhistokimya gerçekleştirmek için ve görüntüleri yeniden verilir. 

Video: Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and genetic alterations. Mammary gland whole mounts are an inexpensive method to capture the progression of morphological changes that may arise after exposure. However, in later life, when abnormalities are more prone to develop, sole reliance on this one method may not always provide enough information to make a proper diagnosis of the abnormality. Historically, in chemical test guideline studies, a single mammary gland is removed at necropsy and prepared as a hematoxylin and eosin (H&#38;E)-stained section. The incorporation of contralateral mammary whole-mount collection and analysis decreases the likelihood of a false-negative assessment. Evaluation of the whole mount is limited by the presence of one or two entire mammary glands on a slide, and in some cases, the abnormalities observed in the whole mount are not uniformly represented in the H&#38;E section.&#160; The goal of this study was to develop a protocol for converting coverslipped mammary whole mounts to H&#38;E-stained sections so that lesions that would otherwise have been missed or that are difficult to diagnose can be identified. Here, we detail a method to produce a high-quality, paraffin-embedded H&#38;E section from a mammary gland that was initially prepared as a whole mount. In comparison to a tissue that was intentionally prepared for H&#38;E sectioning, the whole mount requires additional preparation for tissue removal and processing. However, this method is considered inexpensive, as it requires common lab reagents and little additional time. As a result, this method can provide invaluable information on how chemical and environmental exposures alter normal mammary development, as well as display changes that occur because of genetic modifications.

We developed a method to successfully remove, process, section, and stain, for histopathological evaluation, mammary tissue that had originally been fixed on slides as whole mounts. This method may promote the collection and evaluation of mammary gland whole mounts in reproductive and developmental test guideline studies.

Lezyon Tanımlaması için Meme Bandı Bütün Dağılımları

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

Kanser Araştırmaları

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

Floresan Antikorlar Fare Epidermis Parafin Bölüm İmmünohistokimya

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Biyoloji

Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands

Cell-cell interactions play a pivotal role in preserving tissue integrity and the barrier between the different compartments of the mammary gland. These interactions are provided by junctional proteins that form nexuses between adjacent cells. Junctional protein mislocalization and reduced physical associations with their binding partners can result in the loss of function and, consequently, to organ dysfunction. Thus, identifying protein localization and protein-protein interactions (PPIs) in normal and disease-related tissues is essential to finding new evidences and mechanisms leading to the progression of diseases or alterations in developmental status. This manuscript presents a two-step method to evaluate PPIs in murine mammary glands. In protocol section 1, a method to perform co-immunofluorescence (co-IF) using antibodies raised against the proteins of interest, followed by secondary antibodies labeled with fluorochromes, is described. Although co-IF allows for the demonstration of the proximity of the proteins, it does make it possible to study their physical interactions. Therefore, a detailed protocol for co-immunoprecipitation (co-IP) is provided in protocol section 2. This method is used to determine the physical interactions between proteins, without confirming whether these interactions are direct or indirect. In the last few years, co-IF and co-IP techniques have demonstrated that certain components of intercellular junctions co-localize and interact together, creating stage-dependent junctional nexuses that vary during mammary gland development.

Intercellular junctions are requisites for mammary gland stage-specific functions and development. This manuscript provides a detailed protocol for the study of protein-protein interactions (PPIs) and co-localization using murine mammary glands. These techniques allow for the investigation of the dynamics of the physical association between intercellular junctions at different developmental stages.

Murin Makat Boğazlarında Gap, Sıkı ve Aderans Bağlantılarının Bileşenleri Arasındaki Protein-Protein Etkileşimlerinin ve Ortak Lokalizasyon Analizleri

Cell-cell interactions play a pivotal role in preserving tissue integrity and the barrier between the different compartments of the mammary gland. These ...

Gelişim Biyolojisi

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

Mouse mammary glands comprise ductal trees, which are lined by epithelial cells and have one opening at the tip of each nipple. The epithelial cells play a major role in mammary gland function and are the origin of most mammary tumors. Introducing genes of interest into mouse mammary epithelial cells is a critical step in evaluating gene function in epithelial cells and generating mouse mammary tumor models. This goal can be accomplished through the intraductal injection of a viral vector carrying the genes of interest into the mouse mammary ductal tree. The injected virus subsequently infects mammary epithelial cells, bringing in the genes of interest. The viral vector can be lentiviral, retroviral, adenoviral, or adenovirus-associated viral (AAV). This study demonstrates how a gene of interest is delivered into mammary epithelial cells through mouse mammary intraductal injection of a viral vector. A lentivirus carrying GFP is used to show stable expression of a delivered gene, and a retrovirus carrying Erbb2 (HER2/Neu) is used to demonstrate oncogene-induced atypical hyperplastic lesions and mammary tumors.

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

The present protocol describes intraductal injection of viral vectors via the teat to deliver genes of interest into the mammary epithelial cells.

İn Vivo Meme İntraduktal Enjeksiyon Yoluyla Fare Meme Epitel Hücrelerine Gen İletimi

Mouse mammary glands comprise ductal trees, which are lined by epithelial cells and have one opening at the tip of each nipple. The epithelial cells play ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has a broad spectrum of applications. Detection of antigens allows for characterization and identification of multiple cell types. Located above the kidneys and encapsulated by a layer of mesenchymal cells, the adrenal gland is an endocrine organ composed by two different tissues with different embryological origins, the mesonephric intermediate mesoderm-derived outer cortex and the neural crest-derived inner medulla. The adrenal cortex secretes steroids (i.e., mineralocorticoids, glucocorticoids, sex hormones), whereas the adrenal medulla produces catecholamines (i.e., adrenaline, noradrenaline). While conducting adrenal research, it is important to be able to distinguish unique cells with different functions. Here we provide a protocol developed in our laboratory that describes a series of sequential steps required for obtaining immunofluorescence staining to characterize the cell types of the adrenal gland. We focus first on the dissection of the mouse adrenal glands, the microscopic removal of periadrenal fat followed by the fixation, processing and paraffin embedding of the tissue. We then describe sectioning of the tissue blocks with a rotary microtome. Lastly, we detail a protocol for immunofluorescent staining of adrenal glands that we have developed to minimize both non-specific antibody binding and autofluorescence in order to achieve an optimal signal.

Here we present a method to isolate adrenal glands from mice, fix the tissues, section them, and perform immunofluorescence staining.

Yalıtım, fiksasyon ve fare böbreküstü bezlerinin ayirt görüntüleme

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections

Multispectral fluorescence imaging on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues enables the detection of multiple markers in a single tissue sample that can provide information about antigen coexpression and spatial distribution of the markers. However, a lack of suitable antibodies for formalin-fixed tissues may restrict the nature of markers that can be detected. In addition, the staining method is time-consuming. Here we describe a rapid method to perform multispectral fluorescence imaging on frozen tissues. The method includes the fluorophore combinations used, detailed steps for the staining of mouse and human frozen tissues, and the scanning, acquisition, and analysis procedures. For staining analysis, a commercially available semiautomated multispectral fluorescence imaging system is used. Through this method, up to six different markers were stained and detected in a single frozen tissue section. The machine learning analysis software can phenotype cells that can be used for quantitative analysis. The method described here for frozen tissues is useful for the detection of markers that cannot be detected in FFPE tissues or for which antibodies are not available for FFPE tissues.

We describe a rapid staining method to perform multispectral imaging on frozen tissues.

Dondurulmuş Doku Kesitlerinin Multispektral Floresan Görüntülemesi için Hızlı Bir Yöntem

Multispectral fluorescence imaging on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues enables the detection of multiple markers in a single tissue sample ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

Sağlam, Bütün fare meme dokuları yalıtım hücre dışı matriks ifade ve bezi Morfoloji analizi için

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Longitudinal Intravital Microscopy Using a Mammary Imaging Window with Replaceable Lid

The branched structure of the mammary gland is highly dynamic and undergoes several phases of growth and remodeling after birth. Intravital microscopy in combination with skin flap surgery or implantation of imaging windows has been used to study the dynamics of the healthy mammary gland at different developmental stages. Most mammary imaging technologies are limited to a time frame of hours to days, whereas the majority of mammary gland remodeling processes occur in time frames of days to weeks. To study mammary gland remodeling, methods that allow optical access to the tissue of interest for extended time frames are required. Here, an improved version of the titanium mammary imaging window with a replaceable lid (R.MIW) is described that allows high-resolution imaging of the mammary gland with a cellular resolution for up to several weeks. Importantly, the R.MIW provides tissue access over the entire duration of the intravital imaging experiment and could therefore be used for local tissue manipulation, labeling, drug administration, or image-guided microdissection. Taken together, the R.MIW enables high-resolution characterization of the cellular dynamics during mammary gland development, homeostasis, and disease.

This protocol describes a novel mammary imaging window with a replaceable lid (R.MIW). Intravital microscopy after implantation of the R.MIW allows for longitudinal and multi-day imaging of the healthy and diseased mammary gland with a cellular resolution during the different developmental stages.

Değiştirilebilir Kapaklı Meme Görüntüleme Penceresi Kullanarak Boyuna İntravital Mikroskopi

The branched structure of the mammary gland is highly dynamic and undergoes several phases of growth and remodeling after birth. Intravital microscopy in ...

Intravital Subcellular Microscopy of the Mammary Gland

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory mechanisms. During pregnancy, the gland expands from a primitive ductal tree embedded in a fat pad to a highly branched alveolar network primed for the formation and secretion of colostrum and milk. Post-partum, the gland supplies all the nutrients required for neonatal survival, including membrane-coated lipid droplets (LDs), proteins, carbohydrates, ions, and water. Various milk components, including lactose, casein micelles, and skim-milk proteins, are synthesized within the alveolar cells and secreted from vesicles by exocytosis at the apical surface. LDs are transported from sites of synthesis in the rough endoplasmic reticulum to the cell apex, coated with cellular membranes, and secreted by a unique apocrine mechanism. Other preformed constituents, including antibodies and hormones, are transported from the serosal side of the epithelium into milk by transcytosis. These processes are amenable to intravital microscopy because the mammary gland is a skin gland and, therefore, directly accessible to experimental manipulation. In this paper, a facile procedure is described to investigate the kinetics of LD secretion in situ, in real-time, in live anesthetized mice. Boron-dipyrromethene (BODIPY)665/676&#160;or monodansylpentane are used to label the neutral lipid fraction of transgenic mice, which either express soluble EGFP (enhanced green fluorescent protein) in the cytoplasm, or a membrane-targeted peptide fused to either EGFP or tdTomato. The membrane-tagged fusion proteins serve as markers of cell surfaces, and the lipid dyes resolve LDs &#8805; 0.7 &#181;m. Time-lapse images can be recorded by standard laser scanning confocal microscopy down to a depth of 15-25 &#181;m or by multiphoton microscopy for imaging deeper in the tissue. The mammary gland may be bathed with pharmacological agents or fluorescent dyes throughout the surgery, providing a platform for acute experimental manipulations as required.

<meta charset="utf8"></head><body>Meme bezinin intravital hücre altı mikroskobu

The present protocol describes a facile technique for the intravital imaging of the lactating mouse mammary gland by laser scanning confocal and multiphoton microscopy.

Meme bezinin intravital hücre altı mikroskobu

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory ...

Fare Meme Bezinin Dondurulmuş Bölümler Dolaylı İmmünofloresan

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Lezyon Tanımlaması için Meme Bandı Bütün Dağılımları

Floresan Antikorlar Fare Epidermis Parafin Bölüm İmmünohistokimya

Murin Makat Boğazlarında Gap, Sıkı ve Aderans Bağlantılarının Bileşenleri Arasındaki Protein-Protein Etkileşimlerinin ve Ortak Lokalizasyon Analizleri

İn Vivo Meme İntraduktal Enjeksiyon Yoluyla Fare Meme Epitel Hücrelerine Gen İletimi

Yalıtım, fiksasyon ve fare böbreküstü bezlerinin ayirt görüntüleme

Dondurulmuş Doku Kesitlerinin Multispektral Floresan Görüntülemesi için Hızlı Bir Yöntem

Sağlam, Bütün fare meme dokuları yalıtım hücre dışı matriks ifade ve bezi Morfoloji analizi için

Değiştirilebilir Kapaklı Meme Görüntüleme Penceresi Kullanarak Boyuna İntravital Mikroskopi

Meme bezinin intravital hücre altı mikroskobu

Meme bezinin intravital hücre altı mikroskobu