Name: development of an economical dna delivery system by "acufection" and its application to skin research
Uploaded: 2017-04-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research at JoVE.com

Bu çalışma Bilim ve Teknoloji Bakanlığı&#39;ndan hibe ile desteklenen (EN 103-2633-B-002-002; 104-2320-B-002-048). Biz Dr teşekkür ederim. el yazması okumak için Betty Wu-Hsieh ve Hawaii Üniversitesi&#39;nde Stanford Üniversitesi ve Dr Peter Hoffmann NTU&#39;da Chien-Kuo Lee Leigh Zerboni, Tarım Biyoteknoloji teknik yardım için NTU&#39;da Yun Chien ve Dr Wen-Chi Wei teknik tavsiye için Sinica Akademisi Araştırma Merkezi.

8&#39;de Dişi fareler - 12 haftalıkken bu çalışma için kullanıldı. C57 / BL6 sokak türü (WT) ve eksik IL-15 (IL-15&#39;te - / -) fareler sırasıyla Ulusal Laboratuvarı Hayvan Merkezi (NLAC), Tayvan ve Taconic Farm, satın alınmıştır. IL15 +/- heterozigot çaprazlamasından ikinci kuşak: 3 oranında IL eksikliği-15-(IL15 - / -) ve IL-15-baskın (IL15 +/- ve IL15 + / +), 1 gösterdi. IL15 genotipi - / - fareleri, PCR analizi ile teyit edilmiştir. Fareler Laboratuar Hayvanları Merkezi (LAK), Ulusal Tayvan Üniversitesi Tıp (NTU) Üniversite de Spesifik Patojen (SPF) tesis içinde tutulmuştur. anestetik madde ve yöntemlerin dahil olmak üzere tüm hayvan prosedürleri Halk Sağlığı Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) (Hayvan Protokolü 20130225 Onaylanmasının Yeminli) Ulusal Tayvan Üniversitesi Tıp Koleji ve Koleji tarafından onaylanan hayvan protokolüne uygun olarak gerçekleştirildi. &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 1. Akupunktur iğneleri hazırlanması Not: akupunktur iğneleri bir sap ve bir iğne ucu (Şekil 1A) oluşan tıbbi cihazlardır. akupunktur iğne çapları 0.35 mm (28 g) 0.2 mm (36 g) arasında değişmektedir. Biz deriyi delmeden sırasında olası aşırı hücre hasarı önlemek için iğnenin en ince noktası seçin. 13 mm (0.5 inç), 25 mm (1.0), 40 mm (1.5 inç) ve uzunluğu 50 mm (2.0) dahil olmak üzere 0.2-mm iğne 4 farklı uzunlukları vardır. 13 mm uzunluğunda 10 iğne bir demet, C57BL / 6 fare deri üzerinde iğne salınım sırasında en iyi rahat bir kavrama sağladı. yöntem daha büyük hayvan derisine uygulanır ya da daha büyük bir eliyle araştırmacılar tarafından gerçekleştirilirse parametreler değiştirilebilir. <ol><li> Steril olmayan pirojenik paketinden akupunktur iğneleri çıkarın. steril bir örtü üzerine iğne yerleştirin. </li><li> i 10 iğneler birbirine bağlamak için yapıştırıcı etiketleme bandı kullanınna demeti (Şekil 1B). Not: 10 iğneler geometrik bir silindir şekli oluşturmak üzere düzenlenmiştir. kolaylık sağlamak için, yapışkan bant uygulamadan önce düzenleme stabilize etmek için, parafin bir film parçası kullanılır. Bütün iğne noktaları aynı düzlemde olduğundan emin olun. yerine, tek bir iğne, bir paket kullanılarak iğne ve deri arasındaki temas alanını arttırarak maksimum DNA infüzyon kolaylaştırır. </li></ol> 2. Büyük miktarda hazırlanması ve endotoksin içermeyen plazmid DNA <ol><li> plazmid DNA&#39;sı ile kimyasal olarak kompetan bakteriyel hücreleri dönüştürmek. </li><li> Seçip LB ortamı antibiyotik içeren 3 mL tek bir bakteriyel koloni inoküle ve gece boyunca bir çalkalayıcı içinde 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> C antibiyotikler ile LB ortamında 100 250 mL ve 37 ° C&#39;de gece boyunca çalkalama: 1 ile bakteri kültürü seyreltilerek kültürünü Scale </li><li> yüksek qualit kullanılarak DNA&#39;nın büyük miktarda hazırlanmasıy, imalatçının talimatlarına uygun endotoksin serbest plazmid hazırlama kiti. Not: Acufection protokol, yüksek saflık ve plazmid DNA&#39;nın büyük bir miktarda kullanmak gerekir. yüksek kalitede kullanımı olup, endotoksin serbest ve kolon saflaştırılmış plazmid DNA önerilir. </li><li> Steril su içinde DNA elute. acufection için hazır olana kadar -20 ° C&#39;de küçük parçalar halinde saklayın DNA arasında değişir. NOT: Tutarlı plazmid DNA ifadesini sağlamak için DNA&#39;nın tekrarlanan donma-ve-çözülme kaçının. </li><li> acufection için steril PBS içinde 1 mg / mL ila plazmid DNA seyreltin. </li></ol> Acufection 3. Prosedürü Not: DNA optimal miktarı ve hedef deri yüzeyi alanı farklı genler için farklı ve daha fazla optimize edilmesi gerekebilir. iğneleyici gücü ve sayısı deri kalınlığına bağlı olarak değişebilir da derinin boynuzsu tabaka gevşetmek için. Bu şartlar dikkatli bir şekilde acufected gene transcri ekspresyon seviyesini değerlendirmek sonra tespit edilmelidirQRT-PCR ile pn. <ol><li> fareler tartılır ve peritoneal enjeksiyonu ile tribromoetanol (g vücut ağırlığı başına 400 ug) yönetmek. NOT: 2,2,2-tribromoetanol yaygın farelerde kullanılan bir enjekte edilebilir anestezik maddedir. Çözelti 2-metil-2-butanol% 2.5 ihtiva eden damıtılmış su (200 mL) içinde bir farmasötik olmayan kalite 2,2,2-tribromoetanol (2.5 g) çözülmesiyle yapılmaktadır. </li><li> anestezi altında kuruluğunu önlemek için gözleri veteriner oftalmolojik merhem kullanın. Not: - 2 dakika anestetik etki 1 indüklenebilir olacaktır. Ameliyattan önce anestezi yeterli derinliğinin sağlanması için ayak tutam refleksini kontrol edin. </li><li> dorsal yan deriyi Tıraş ve saç gövdesine keratin proteinleri çözmek için tüy dökücü krem ​​uygulayın. NOT: saç kaldırmak için tüy dökücü krem ​​kullanımı deriye DNA&#39;nın infüzyon kolaylaştıracaktır. </li><li> tüy dökücü krem ​​temizlemek için su ile ıslatılmış pamuk topları kullanın. NOT: tüy dökücü krem ​​suda çözünür. krem wil tamamen çıkarılmasıL, bir yağlı yüzey önlenmesi ve daha iyi bir sonuç elde iğneleyici. </li><li> Deri yüzeyi dezenfekte etmek için% 70 etanol ile ıslatılmış steril bir pamuk bez kullanın. </li><li> Mark önceden ölçülmüş şablon ile tüy dökücü krem ​​uygulanmış deri üzerinde hedef alanı (1 cm x 1 cm) olabilir. NOT: Hedef sitesini İşaretleme yukarı ve aşağı tanımlanmış alanı içinde iğne demetini uygulamak için yardımcı olacaktır. Bu deneme için-deney varyasyonu en aza indirmek için belirli bir yüzey alanına DNA aynı miktarda verilmesini sağlamak için önemlidir. </li><li> belirgin deri üzerine plazmid DNA (10 ug) &#39;in bir 10 uL damla yerleştirin. Not: acufection için DNA miktarı farklı genler ve sentezleme vektörünün tipine göre değişir. kullanılan DNA miktarı dikkatlice ilgi deneyini yürütmekte önce titre edilmelidir. 10 uL, küçük bir sıvı madde damlası olup, batıcı ise yuvarlanma olmayan traş ve tüy dökücü krem ​​uygulanmış Cilt üzerinde oturur. Fareler ile karşılaştırmak için 10 uL boş vektör DNA ile tedavi edilen farelerin, bir kontrol grubu olarak dahilÇalışma genle cufected. </li><li> Akupunktur iğne demeti (Şekil 1B) tutun ve 100 kat ya da deri ortadan PBS DNA nem kadar bir yukarı-ve-aşağı hareketle işaretlenmiş yüzey delin. NOT: Cilt yüzeyinin bazı kızarıklık oluşabilir. kanamaya derin kesikler yapmaktan kaçının. PBS içinde DNA nem (10 uL) deri üzerinde kaybolur, deri yüzeyinde hareketleri iğneleyici yukarı ve aşağı sayısı işlevsel belirlenir. o acufection-teslim genlerden en tutarlı sonuçlar vermiştir, çünkü Biz 30 s 100 kez verdi. Mevcut ise, iğneler kadar 6 hedef deri dürtmelerin (1 cm x 1 cm) ile yeniden kullanılabilir. acufection arasında,% 70 etanol ve PBS içinde iğneler durulayın. bunlar, mat ya da çapraz kontaminasyonu engellemek için farklı plazmid DNA olduğunda yeni iğne ile değiştirin. </li><li> Uyanıncaya kadar vücut ısısını korumak için bir ısıtma pedi üzerine acufected fareler yerleştirin. </li><li> onlar varken onların kafesine fareler dönünçıktı yeterli bilinç. Not: un acufected farelerin kafes ayrı kafes içinde acufected fareler tutulur (kafes başına en az 5 hayvan). </li><li> yerine su şişesi koyun ve IVC (tek tek havalandırılan bir kafes) rafına kafesi döndürür. </li></ol> 4. Ameliyat sonrası bakım <ol><li> İşlem sonrası ilk 48 saat için, yakın bir davranış değişiklikleri (huzursuzluk, ajitasyon ya da yeme bozukluğu) ya da anormal görünüş (kaba saç ceket veya kambur duruş) dahil olmak üzere herhangi bir rahatsızlık için fareler izler. </li></ol> IL-15ΔE7-acufected Cilt 5. İmikimod (IMQ) Tedavi Not: acufected geninin transkripsiyonel ifadesi ve protein üretimi ilgilenilen plazmid Transfeksiyondan 3 gün sonra uyarıcıların farklı tipleri ile tedavi edilebilir olan acufected 3. gün farelere saptanabilir. Biz IMQ krema ile IL-15ΔE7-acufected fare cildi tedavi ederek burada gösterilmektedir. IMQ bir imidazokinolin amin onaylanmış fya da dış genital ve perinatal siğiller 13 muamele edilmesi. Topikal IMQ tedavisi pul pul deri epidermal proliferasyonu ve dermal nötrofil infiltrasyon 12, 14, 15 tezahürü ile farelerde insan sedef gibi cilt bozukluklarının neden olduğu gösterilmiştir. Not: Plazmit vektörü C-ucuna (pEF-IL-de, bir IL-2 sinyal peptidi ve bir FLAG etiketi ile çevrili uzama faktör-1 alfa düzenlenmesinde (PEF) altında, tam uzunlukta fare IL-15 cDNA, içerdiği Bamford ve arkadaşlarının tarif edildiği gibi inşa edilmiştir 15, 5859 baz çifti). 16. Plazmid kalıntılarında ilk 16 amino asidini silmek için bir IL-15, şablon olarak 33 kullanılır - KİT IL-15ΔE7 (pEF-IL-15ΔE7, 5,811 baz çifti), IL-15 geninin ekson 7 48 (sentezi üstüste binme uzantısı) PCR yöntemi 17 ile. Başarıyla vardı Bakteri kolonileriIL-15ΔE7 ile transforme sınır enzimi sindirimi ile doğrulanmıştır ve DNA dizilimi 12, 18 ile takip edildi. protokolün adım 2&#39;de tarif edildiği gibi, endotoksin içermeyen plazmid DNA&#39;nın büyük bir miktar elde edilmiştir. <ol><li> tribromoetanol (g vücut ağırlığı başına 400 ug) karın içinden enjeksiyonu ile acufected fareler anestezi ve anestezi altında kuruluk önlemek için göze veteriner oftalmolojik merhem uygulanır. operatif prosedürler başlamadan önce anestezi yeterli derinlikte temin etmek ayak tutam refleksini kontrol edin. Not: 2 cm x 2 cm deri IMQ tedavi olacağından, pIL-15ΔE7 plazmid DNA (doz başına 10 uL PBS içinde 10 ug) 2 doz 2, hedef merkezler üzerinde acufected (1 cm x 1 cm) ekstrakte edildi. </li><li> Mark deri (x 2 cm, 2 cm) acufected alanı kapsayan çevrelemektedir. </li><li> topikal işaretli yüzey alanı üzerinde IMQ kremi uygulamak için Q-uçlu aplikatör kullanın. Not: adım 5.1 yalnızca ilk dozu (60 mg / doz) için gerçekleştirilir.Bir sonraki ardışık doz olmayan anestezi edilmiş farelerin uygulanır. </li><li> yüksek çözünürlüklü kamera ile günlük IMQ ile tedavi edilen dorsal cilt değişiklikleri belgelemek. Not: Bir kişi başka kaydedilirken fare tutar. Hareketsiz resimler vurularak daha sonra düzenlenir. </li><li> IMQ tedavi gün sonra 4 ya da 7. günde servikal dislokasyon tribromoetanol aşırı dozda (g vücut ağırlığı başına 800 ug) enjekte fareler öldürülür. Cilt kesilmiş ve işlenir (- 4.5 4.1 Adımları). </li></ol> Fare Skin 6. Homojenat <ol><li> Kuyruğun tabanından yatay kesim yapmak için cerrahi bir makas kullanın. arka bacağın tabanının iki taraflı devam ve ön ayakları tabanına yan boyunca dikey olarak kesim devam etmektedir. </li><li> Dikkatle ön posterior yatan dokusundan derisini yüzeceğim. dorsal derisini kesmek için makas kullanın. Steril bir Petri tabağına cilt yerleştirin. </li><li> Hedefi kesilmesi için bir neşter kullanınderi ve hemen sıvı nitrojen içinde dondurulur. Not: Deney-için-deney varyasyonu en aza indirmek için, her bir fare için sabit olan aynı olmayan acufected cilt boyutu (1 cm x 1 cm) veya IMQ tedaviden (2 cm x 2 cm). </li><li> kolları ve havan eli ile önceden soğutulmuş bir 2 bölmeli harç merkezinde donmuş deri dokusu yerleştirin. doku toz haline getirmek için harç üzerinde bir kurşun çekiç kullanın. </li><li> Hızla RNA ekstraksiyonu için ya da protein lizatı elde etmek için 50 ul PBS ve 1x proteaz inhibitörü kokteyli içeren bir tüp hücre liziz reaktifi 500 uL içeren yeni bir tüpe toz doku yerleştirin. </li></ol> Cilt, Bölüm 7. H &amp; E ve immünohistokimyasal boyanması <ol><li> bir kaset içinde cilt dokusu ve gece boyunca% 4 paraformaldehid içinde bırakın. </li><li> bizim durumumuzda LAC, NTU&#39;da Patoloji Laboratuvarı tarafından gerçekleştirildi yerleştir ve bölüm doku. Not: Bölüm 5 um kalınlığında kesilir. Talep doku sectipozitif yüklü slaytlar üzerine ons. </li><li> 15 dakika boyunca 65 ° C&#39;de slaytlar ısıtın. </li><li> Bir boyama rafa slaytları yerleştirin. iki kez 100,% 95,% 80,% 75,% 60 ve% rehidrasyon için% 50 etanol (her biri 5 dakika) ardışık daldırma izledi 5 dakika için ksilen yerine içeren tank karşılık gelen raf bırakın. boyama öncesi 3 dakika musluk suyunda slaytlar bırakın. </li><li> hematoksilen eozin boyama gerçekleştirin. Not: &#39;H &amp; E boyama LAC, NTU&#39;da Patoloji Laboratuarına talep üzerine uygulandı. </li><li> immünohistokimyasal boyama için, spesifik olmayan arka plan boyaması azaltmak için 5 dakika boyunca oda sıcaklığında blok çözeltisi ile bölüm bloke eder. Not: blok çözeltisi, ticari olarak immüno-lekeleme teknikleri ile geliştirilmiştir. Hiç bir hayvan serumu bu üründe yer almaktadır. </li><li> blok çözeltisi çalkalamak için PBS içinde slayt batırın. </li><li> 1:10 PBS içinde blok çözeltisi ile seyreltilir ve% 2 fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS) (seyreltici çözeltisi) ekleyin. </li><li&gt; Pipet uygun şekilde seyreltilmiş birincil antikor bölümü üzerine ve oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edilir. Not: Antikorların seyreltici çözeltisi içinde seyreltilir. Bu boyama için antikor konsantrasyonları 1 en iyi duruma getirilmiştir: 800 ve 1: 200 Ki67 (klon SolA15) ve Ly6G (klon 1A8) için, sırası ile. Bu konsantrasyonlar, arka plan boyaması olmadan farklı leke gösterdikleri bulunmuştur. <ol><li> Aynı çözelti ikincil antikor, spesifik olmayan bağlanmanın kontrol edilmesi için ilk antikoru ihmal ile aynı vadede bir seri bölüm leke. </li></ol></li><li> Yıkama 5 dakika her biri için TBS içinde üç kez artı% 0.1 Tween-20 (TBST çözelti) kayar. yıkar arasında değiştirme çözüm. </li><li> her bölüme etiketli polimerlerin bir damla pipet ve 40 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Not: etiketli polimer, ticari olarak bir Fab&#39; fragmanı indirgenir peroksidaz ve sekonder antikor amino asit polimerleri birleştirilerek hazırlanır. Reaktif için kullanıma hazırdırFare doku kesitlerinin immünohistokimyasal boyanması. </li><li> Yıkama 5 dakika her biri için TBST üç kez kayar. yıkar arasında değiştirme çözüm. </li><li> Pipet 3,3&#39;-diaminobenzindine doku bölümü üzerine tetrahidroklorür (DAB) çözeltisi ve kahverengi bir çökelti, parlak alan mikroskopisiyle görülene kadar oda sıcaklığında beklemeye bırakılır. Not: DAB peroksidaz varlığında çökelmesi için süre yaklaşık 30 dakikadır. </li><li> peroksidaz aktivitesini durdurmak için suda bırakın slaytlar. nükleer boyanma için metil yeşil çözeltide Dip slaytlar. Yıkama 5 dakika her biri için PBS içinde üç kez kayar. </li><li> Kalıcı montaj ortamına (bölüm başına 8 uL) ile kaplanır lekeli bölümü üzerine bir lamel yerleştirin. </li></ol> 8. Fotoğraf ve Analiz Lekeli doku kesitinin <ol><li> parlak saha, mikroskop altında, H &amp; E ile boyanmış ve IHC doku bölümleri görselleştirmek. mikroskop bağlı şarj birleştiğinde cihaz (CCD) kamera ile resimler çekin. quantitative analiz, görüntüleme yazılımı kullanılabilir <ol><li> Bir 20X amacı ile bir scanscope kullanarak bütün lekeli bölümleri tara. </li><li> Epidermisin bir 1-mm kesimi içinde epidermal kalınlığı ölçülür ve segment içinde Kİ67-immüno-reaktif hücrelerin sayısı. NOT: Kantitatif analiz mikroskopi otomasyonu ve görüntü analiz yazılımı kullanılarak yapılır. Epidermal kalınlığı taban tabakası ve epidermisin en dış tabakası arasındaki mesafe ile tanımlanır. </li><li> Hemen topikal IMQ ile tedavi edilen derinin altında deri alanına (230 x 270 um 2 dikdörtgen) içinde Ly6G-immüno-reaktif hücrelerin sayısı. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Effendy, I., Loffler, H., Maibach, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+cytokines+in+murine+cutaneous+irritant+responses.">Epidermal cytokines in murine cutaneous irritant responses.</a> Journal of applied toxicology : JAT. 20, 335-341 (2000).</li><li>Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+immune+sentinels+in+health+and+disease.">Skin immune sentinels in health and disease.</a> Nature reviews. 9, 679-691 (2009).</li><li>Liu, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topical+application+of+HIV+DNA+vaccine+with+cytokine-expression+plasmids+induces+strong+antigen-specific+immune+responses.">Topical application of HIV DNA vaccine with cytokine-expression plasmids induces strong antigen-specific immune responses.</a> Vaccine. 20, 42-48 (2001).</li><li>Lu, B., Federoff, H. J., Wang, Y., Goldsmith, L. A., Scott, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topical+application+of+viral+vectors+for+epidermal+gene+transfer.">Topical application of viral vectors for epidermal gene transfer.</a> J Invest Dermatol. 108, 803-808 (1997).</li><li>Partidos, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivering+vaccines+into+the+skin+without+needles+and+syringes.">Delivering vaccines into the skin without needles and syringes.</a> Expert Rev Vaccines. 2, 753-761 (2003).</li><li>Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+DNA+through+the+skin.">Immunization with DNA through the skin.</a> Methods. 31, 232-242 (2003).</li><li>Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+gene+transfer+to+mammalian+somatic+cells+by+particle+bombardment.">In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9568-9572 (1990).</li><li>Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+immunization+is+a+simple+method+for+eliciting+an+immune+response.">Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response.</a> Nature. 356, 152-154 (1992).</li><li>Haynes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-mediated+DNA+vaccine+delivery+to+the+skin.">Particle-mediated DNA vaccine delivery to the skin.</a> Expert Opin Biol Ther. 4, 889-900 (2004).</li><li>Tuomela, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodistribution+and+general+safety+of+a+naked+DNA+plasmid,+GTU-MultiHIV,+in+a+rat,+using+a+quantitative+PCR+method.">Biodistribution and general safety of a naked DNA plasmid, GTU-MultiHIV, in a rat, using a quantitative PCR method.</a> Vaccine. 23, 890-896 (2005).</li><li>Eriksson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+transfer+to+skin+and+wound+by+microseeding.">In vivo gene transfer to skin and wound by microseeding.</a> J Surg Res. 78, 85-91 (1998).</li><li>Lee, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternatively+spliced+IL-15+isoform+modulates+abrasion-induced+keratinocyte+activation.">An alternatively spliced IL-15 isoform modulates abrasion-induced keratinocyte activation.</a> J Invest Dermatol. 135, 1329-1337 (2015).</li><li>Rudy, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imiquimod+(Aldara):+modifying+the+immune+response.">Imiquimod (Aldara): modifying the immune response.</a> Dermatol Nurs. 14, 268-270 (2002).</li><li>van der Fits, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imiquimod-induced+psoriasis-like+skin+inflammation+in+mice+is+mediated+via+the+IL-23/IL-17+axis.">Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis.</a> J Immunol. 182, 5836-5845 (2009).</li><li>Sumida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+CXCR2+and+BLT1+facilitates+neutrophil+infiltration+and+resultant+keratinocyte+activation+in+a+murine+model+of+imiquimod-induced+psoriasis.">Interplay between CXCR2 and BLT1 facilitates neutrophil infiltration and resultant keratinocyte activation in a murine model of imiquimod-induced psoriasis.</a> J Immunol. 192, 4361-4369 (2014).</li><li>Bamford, R. N., DeFilippis, A. P., Azimi, N., Kurys, G., Waldmann, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+5'+untranslated+region,+signal+peptide,+and+the+coding+sequence+of+the+carboxyl+terminus+of+IL-15+participate+in+its+multifaceted+translational+control.">The 5' untranslated region, signal peptide, and the coding sequence of the carboxyl terminus of IL-15 participate in its multifaceted translational control.</a> J Immunol. 160, 4418-4426 (1998).</li><li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes:+gene+splicing+by+overlap+extension.">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77, 61-68 (1989).</li><li>Tan, X., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+IL-15+isoforms+generated+by+alternative+splicing+are+expressed+in+the+intestinal+epithelium.">Novel IL-15 isoforms generated by alternative splicing are expressed in the intestinal epithelium.</a> Genes Immun. 7, 407-416 (2006).</li><li>Basner-Tschakarjan, E., Mirmohammadsadegh, A., Baer, A., Hengge, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+trafficking+of+DNA+in+keratinocytes:+evidence+for+DNA-binding+proteins.">Uptake and trafficking of DNA in keratinocytes: evidence for DNA-binding proteins.</a> Gene Ther. 11, 765-774 (2004).</li><li>Fan, H., Lin, Q., Morrissey, G. R., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+via+hair+follicles+by+topical+application+of+naked+DNA+to+normal+skin.">Immunization via hair follicles by topical application of naked DNA to normal skin.</a> Nat Biotechnol. 17, 870-872 (1999).</li><li>Kennedy-Crispin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+keratinocytes'+response+to+injury+upregulates+CCL20+and+other+genes+linking+innate+and+adaptive+immunity.">Human keratinocytes' response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity.</a> J Invest Dermatol. 132, 105-113 (2012).</li></ol>

Yazarlar ifşa etmek mali çıkarlarını hiçbir var.

acufected plazmid DNA &#39;nın ekspresyonunu sağlamak için en önemli nokta, eşit salınım ve derinin boynuzsu tabaka gevşetilmesidir. Cildi kesilmeden hafifçe iğneler iterken, kuvvet yüzeyini bastırmak için yeterince sert olmalıdır. 1 cm x 1 cm yüzey alanı 10 uL çözelti içinde DNA emilmesini kolaylaştırmak için, iğneler 30 s, yaklaşık 100 kez yukarı ve aşağı salınım hareketi. Bir cilt prick gerekiyor kuvveti belirlemek ve acufected genin en iyi ifadesi seviyesini elde etmek için gerekli o...

Cilt konak savunmasının ilk basamak olduğunu. Keratinositler (KCs), insanlarda ve farelerin derisinde başlıca hücre tipidir. Çevresel uyarılara (örneğin, güneş ışığı, oksijen, kimyasal ve patojenik invazyonu) yanıt olarak, KCs aktif ve IL-8, IL-6, IL-1a, IL-1 p, TNF-a gibi iltihap öncesi sitokinler ve kemokinlerin geniş bir yelpazeye üretirler α ve GM-CSF 1. Birlikte cilde bağışıklık hücrelerinin alınmasını tetikleyebilir. Ağır deri iltihabı sıklıkla akut ektopik kontakt dermatit, kronik bir T hücresi aracılı enflamasyonun (örneğin, alerjik kontak dermatit ve psoriasis) 2 dahil olmak üzere çok sayıda insan hastalıkları ile bağlantılıdır. KC aktivasyonunu inhibe ederek derideki inflamatuar öncesi yanıtları modüle deri iltihabı tedavi etmek için makul bir yaklaşımdır. Bu protokol geçici bağışıklık res incelemek amacıyla epidermiste bir sitokin gen ifade için yeni bir yaklaşım anlatılmaktadırderide böyle bir muameleye sonuçta ponse. epidermis cildin en yüzeysel tabakası oluşturur. Bu tür cildin daha derin katmanları girmesini nükleik asitler ve patojenler olarak dış maddeleri tutmak fiziksel bir engel olarak görev yapar. Çeşitli iğnesiz teknikler epidermal DNA transferi, 3, 4 için kurulmuştur. Solüsyon içindeki DNA veya katyonik lipozomlar veya adenovirüs vektörleri ile bağlantılı doğrudan bu stratum corneum&#39;un çıkarılması ya da reaktif tüylerini giderildikten ile muamele gibi teknikleri ile modifiye epidermise tatbik edilmiştir. Kornifiye epitel çıkarılması, DNA bağışıklık tepkilerini 5 indükleme keratinositler, Langerhans hücreleri ile epidermal bariyer ve etkileşim geçen kolaylaştırır. Bir geniş yüzey alanı, DNA transferi için mevcuttur ve bu yaklaşım iğneler dahil etmese de, ihtiyacı da dahil olmak dezavantajları vardırsıyrılmasıyla - (100 ug 10), cilt üzerinde sert tedavi ve DNA verme güçlendirici 6 olmayan bağışıklık kazandırılmış hayvanlarda bağışıklık tepkisini indüklemede tutarsız sonuçlar DNA&#39;nın büyük miktarlarda. Deriye Çıplak DNA mikropartikül aracılı hücre için bağışıklık tepkisi 7, 8 indüklemek için yüksek verimli ve tekrarlanabilir olduğu gösterilmiştir. Elde tutulan bir gen tabancası basınçlı helyum hava akışı 9 yardımıyla büyüklüğü 2 um çaplı plazmid DNA ile kaplanmış altın partikülleri ile cildin hedef sitesi bombardıman için kullanılmıştır. Plazmit DNA, muhtemelen deri KCsand dendritik hücreler (DC) tarafından alınır ve protein yerel olarak ifade edilir veya DC&#39;ler 10 ile lenf düğümleri taşınır. Gen tabancası sistemi basit ve sınırlı teknik deneyim, &quot;DNA bul, hazırlanması ve teslim için maliyet gerektirse deizin &quot;(yani altın tozlar, helyum gazı) ve gen tabancası için kendisi genel uygulamasını sınırlamıştır. deneyler farklı yerlerde yapılmaktadır Buna ek olarak, bir helyum gaz iletim sistemi için ihtiyaç gen tabancası taşıma kolaylığı sınırlar. mikro- tek bir enjeksiyon ve partikül bombardımanı 11&#39;den daha gen transferinin bir yüksek verim elde etmek için ortaya konmuştur. mikro-parçacık boncuk kullanılmadan deriye DNA verilmesi için bir dövme silah kullanan 11. Salınımlı Bu yaklaşımı kullanarak, tüm cilt üzerine mikroiğneler muhtemeldir şirketinden aynı anda birden fazla hücrelere DNA transferi, böylece, hücre zarını, kazıma ve. Bununla birlikte, 0.254 mm çapında iğne ile enjeksiyon çok sayıda ilişkili ağrı bir dezavantajdır. Burada in vivo DNA aktarımından için alternatif bir yaklaşım sunmaktadır. &quot;Acufection&quot; </strOng&gt; Burada açıklanan protokol Fare deride plazmid DNA teslim etmek için ekonomik ve etkili bir yol sağlar. Kısaca, on akupunktur iğneleri (uzunluk x 13 mm, çap olarak 0.2 mm) yapışkan bant ile bir paket içinde bağlanmıştır. ilgi konusu transgeni ihtiva eden plasmid DNA, 10 ug PBS 10 uL bir hacmi tıraş, tüy dökücü krem ​​ile muamele edilmiş yan deri üzerine yerleştirilmiştir. cilt yüzeyine (1 cm x 1 cm) salınmasına akupunktur iğne demeti kullanılarak, dik katmanında keratin gevşetilmiş ve yüzeye uygulanır plazmid DNA epidermise absorbe edildi. Cilt hasarı izlenir ve minimal olduğu bulunmuştur. acufected deride transfekte olmuş bir genin ekspresyonu, hem nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) ve ELISA ile doğrulandı. Deri iltihabı ile acufection teslim, IL-15ΔE7 immün modülatör etkileri IMQ ile muamele edilmiş fare modeli 12 ile gösterilmiştir. acufection kanıtlıyor olsa kolay ve daha az dema olmakin vivo olarak DNA nakli için bir yöntem nding, farklı genler ve cilt dikmek için kez, en uygun DNA miktarı da yeniden üretilebilir sonuçlar elde etmek için optimize edilmelidir.

<table><tbody><tr><td>Accu Handy Needle</td><td>Accu</td><td>36Gx0.5</td><td>Medical device</td></tr><tr><td>Nair&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; Lotion</td><td>Church &amp;amp; Dwight</td><td>N/A</td><td>Use to remove hair</td></tr><tr><td>Shandon Xyline substitute</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>6764506</td><td>Deparaffinization</td></tr><tr><td>Avertin (2,2,2-Tribromethanol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4,840-2</td><td>Anesthesia</td></tr><tr><td>2-methyl-2-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152463</td><td>Solvent for the dissolution of avertin</td></tr><tr><td>Difco&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; LB broth, Miller</td><td>BD</td><td>244620</td><td>Propagation and maintenance of &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; for molecular biology</td></tr><tr><td>Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit</td><td>eBioscience</td><td>88-7215</td><td>Measure IL-15 protein</td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly6G</td><td>BioLegend</td><td>127601</td><td>Antibody used for immunohistochemical stain</td></tr><tr><td>anti-mouse Ki-67</td><td>eBioscience</td><td>14-5698-80</td><td>Antibody used for immunohistochemical stain</td></tr><tr><td>Simple Stain Mouse MAXPO (Rat)</td><td>Nichirei Biosciences</td><td>414341F</td><td>Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain</td></tr><tr><td>DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>Peroxidse substrate for immunohistochemical stain</td></tr><tr><td>Ultra V block</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TA-060-UB</td><td>Reduce nonspecific background staining</td></tr><tr><td>Methyl green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8884</td><td>Nuclear staining</td></tr><tr><td>Vecta Mount&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;</td><td>Vector Laboratories</td><td>M-5000</td><td>Permanently preserving histochemical stains</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail tablets</td><td>Roche</td><td>04-693-116-001</td><td>Inhibit protease activity in cell lysate</td></tr><tr><td>Aldara cream</td><td>3M Parmaceuticals</td><td>N/A</td><td>5% imiquimod cream</td></tr><tr><td>Bessman Tissue Pulverizer</td><td>Spectrum Labs</td><td>189475</td><td>Use to pulverize skin tissue</td></tr><tr><td>ABI7900HT cycler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td>quantitative real-time PCR assay</td></tr><tr><td>Camcorder</td><td>Panasonic</td><td>HDC-SD60</td><td>Image documentation</td></tr><tr><td>Axio Scope.A1</td><td>ZEISS</td><td>N/A</td><td>Bright-field microscopy</td></tr></tbody></table>

development of an economical dna delivery system by "acufection" and its application to skin research

Deride bağışıklık yanıtının düzensizliği sayısız insan derisi bozuklukları ile ilişkilidir. deri dokusu, bağışıklık ile ilişkili genlerin doğrudan transferi insan hastalıklarının fare modellerinde deri inflamasyon, immün modülasyonunu araştırmak için ilginç bir yaklaşımdır. Burada fare deri çıplak DNA teslim ve transgen ifadesine yol açan düşük maliyetli bir protokol mevcut. Yöntem, aku delinmez aracılı DNA trans Fection belirten, &quot;acufection&quot; terimini almaktadır. acufection gerçekleştirmek için, fare deri önce fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde DNA ile aşılanmış ve daha sonra hücrelere DNA emme ve transfeksiyon kolaylaştırmak için akupunktur iğneleri bir paket ile hafifçe dürtülmüş. plazmid DNA muhtemelen keratinositler ve deride dentritik hücreler (DC&#39;ler) ile alınır ve protein içine eksprese edilir. Iğneler bizatihi Mekanik prick zarar veya keratinosit aktivasyonunu uyarmadı. İfadetransfekte olmuş genlerin 2 gün acufection aşağıdaki transkripsiyonel ve translasyonel her iki düzeyde de deride tespit edildi ve 7 güne kadar sürmüştür. Bu acufection yöntemin geliştirilmesi için birincil amacı, IL-15, daha önce tanımlanmamış izoformu araştırmaktır. inflamasyonunu indüklemek amacıyla, deride eksprese edilir ve daha sonra bir Toll benzeri reseptör 7 (TLR7) agonisti, imikimod (IMQ) ile muamele, bu yöntem, kısmen silinmiş ekson 7 (IL-15ΔE7) bir alternatif olarak eklenmiş, IL-15 izoformunun edildi kullanılması. Acufection teslim deri IL-15ΔE7 IMQ bağlı deri iltihabı, keratinositlerin çoğalmasını, epidermal kalınlığı ve nötrofil bastırılır. Kutanöz enflamasyon düzenleyici mekanizmaların tanımlanması artan ilgi ile, protokol burada tarif edilen in vivo olarak DNA nakli için gen tabancası sistemi ya da mikro-için uygun maliyetli bir ve çok yönlü bir alternatif sağlar. Bu potansiyel olarak bir yeni fonksiyonunun keşif izin verebilirderide veya kutanöz hastalıklar için yeni tedavi araştırmak için gen.

Bazı kızarıklık akupunktur iğne ile delmeden sonra ilk saat içinde belirgin iken, cilt 2 gün temizlenir ve 7 gün kadar olumsuz deri reaksiyonu (Şekil 2A) batıcı sonra gözlenmiştir. İğne iğneleyici görmemiş deri (Şekil 2B) ile karşılaştırıldığında, H &amp; E analizi ile epidermal orthokeratosis ve en az deri infiltrasyonu çok düşük seviyede indüklenmiş. Epidermal kalınlık (?...

Watch this Scientific Journal Video about Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research at JoVE.com

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Bu protokol Fare deride çıplak plazmid DNA eksprese etmek için uygun maliyetli bir alternatifidir. protokol genel amacı deri iltihabı, belirli bir genin işlevsel rolünü betimlemişlerdir cilt dokusuna immün ilişkili genleri sunmaktır.

&quot;Acufection&quot; ve Cilt Araştırmaları onun Uygulaması tarafından bir Ekonomik DNA Yerleştirme Sisteminin Geliştirilmesi

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

development-an-economical-dna-delivery-system-acufection-its

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.4K Görüntüleme.  National Taiwan University College of Medicine.  Bu protokol Fare deride çıplak plazmid DNA eksprese etmek için uygun maliyetli bir alternatifidir. protokol genel amacı deri iltihabı, belirli bir genin işlevsel rolünü betimlemişlerdir cilt dokusuna immün ilişkili genleri sunmaktır. 

Video: Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Dünya Tarım Pest Böcek Embriyo Mikroenjeksiyon yoluyla Nükleik Asitler teslim edilmesi,<em&gt; Ceratitis capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Genetik

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Güçsüz İnsan dermis kullanma Genetiği Değiştirilmiş Organotipik Cilt Kültürlerin Üretimi

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Gelişim Biyolojisi

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the engineered pDNA is administered to the vaccines, it is transcribed and translated into immunogen proteins that can elicit responses from the immune system. Many ways of delivering DNA vaccines have been investigated; however each delivery route has its own advantages and pitfalls. Skin tattooing is a novel technique that is safe, cost-effective, and convenient. In addition, the punctures inflicted by the needle could also serve as a potent adjuvant. Here, we a) demonstrate the intradermal delivery of plasmid DNA encoding enhanced green fluorescent protein (pCX-EGFP) in a mouse model using a tattooing device and b) confirm the effective expression of EGFP in the skin cells using confocal microscopy.

Skin tattooing is a potent and safe way to delivery DNA vaccine intradermally. Here, a DNA plasmid encoding EGFP is delivered by tattooing to the skin of a laboratory mouse, and the expression of EGFP in the skin cells is then inspected by confocal microscopy.

Cilt DNA Aşı Teslim İçin Yeni Bir Yaklaşım olarak Dövme

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Biyomühendislik

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often performed at low throughput, it is moreover time-consuming and error-prone, even more so when multiplexing several plasmids. We developed an easy, fast, and accurate method to perform cell transfection in a 384-well plate layout using acoustic droplet ejection (ADE) technology. The nanodispenser device used in this study&#160;is based on this technology and allows precise nanovolume delivery at high speed from a source well plate to a destination one. It can dispense and multiplex DNA and transfection reagent according to a predesigned spreadsheet. Here we present an optimal protocol to perform ADE-based high-throughput plasmid transfection which makes it possible to reach an efficiency of up to 90% and a nearly 100% cotransfection in cotransfection experiments. We extend initial work by proposing a user-friendly spreadsheet-based macro, able to manage up to four plasmids/wells from a library containing up to 1,536 different plasmids, and a tablet-based pipetting guide application. The macro designs the necessary template(s) of the source plate(s) and generates the ready-to-use files for the nanodispenser and tablet-based application. The four-steps transfection protocol involves i) a diluent dispense with a classical liquid handler, ii) plasmid distribution and multiplexing, iii) a transfection reagent dispense by the nanodispenser, and iv) cell plating on the prefilled wells. The described software-based control of ADE plasmid multiplexing and transfection allows even nonspecialists in the field to perform a reliable cell transfection in a fast and safe way. This method enables rapid identification of optimal settings for a given cell type and can be transposed to higher-scale and manual approaches. The protocol eases applications, such as human ORFeome protein (set of open reading frames [ORFs] in a genome) expression or CRISPR-Cas9-based gene function validation, in nonpooled screening strategies.

This protocol describes high-throughput plasmid transfection of mammalian cells in a 384-well plate using acoustic droplet ejection technology. The time-consuming, error-prone DNA dispensing and multiplexing, but also the transfection reagent dispensing, are software-driven and performed by a nanodispenser device. The cells are then seeded in these prefilled wells.

Akustik Nanodispensing teknolojisini kullanarak yüksek verim DNA Plasmid multiplexing ve transfeksiyon

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

Tasarım ve Yapay Ekstrasellüler Matrix İnşaatı (aECM) Proteinler gelen<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Cilt Doku Mühendisliği

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

Establishing a High Throughput Epidermal Spheroid Culture System to Model Keratinocyte Stem Cell Plasticity

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human cancers. As a lining tissue, the skin epithelium is often subject to injury and has evolutionarily adapted by acquiring the cellular plasticity necessary to repair damaged tissue. Over the years, several efforts have been made to study epithelial plasticity using in&#160;vitro and ex vivo cell-based models. However, these efforts have been limited in their capacity to recapitulate the various phases of epithelial cell plasticity. We describe here a protocol for generating 3D epidermal spheroids and epidermal spheroid-derived cells from primary neonatal human keratinocytes. This protocol outlines the capacity of epidermal spheroid cultures to functionally model distinct stages of keratinocyte generative plasticity and demonstrates that epidermal spheroid re-plating can enrich heterogenous normal human keratinocytes (NHKc) cultures for integrin&#945;6hi/EGFRlo keratinocyte subpopulations with enhanced stem-like characteristics. Our report describes the development and maintenance of a high throughput system for the study of skin keratinocyte plasticity and epidermal regeneration.

Here we describe a protocol for the systematic cultivation of epidermal spheroids in 3D suspension culture. This protocol has wide-ranging applications for use in a variety of epithelial tissue types and for the modeling of several human diseases and conditions.

Keratinosit Kök Hücre Plastisitesini Modellemek için Yüksek Verimli Epidermal Sferoid Kültür Sistemi Kurulması

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human ...

Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells

Efficient intracellular delivery of biomolecules is required for a broad range of biomedical research and cell-based therapeutic applications. Ultrasound-mediated sonoporation is an emerging technique for rapid intracellular delivery of biomolecules. Sonoporation occurs when cavitation of gas-filled microbubbles forms transient pores in nearby cell membranes, which enables rapid uptake of biomolecules from the surrounding fluid. Current techniques for in vitro sonoporation of cells in suspension are limited by slow throughput, variability in the ultrasound exposure conditions for each cell, and high cost. To address these limitations, a low-cost acoustofluidic device has been developed which integrates an ultrasound transducer in a PDMS-based fluidic device to induce consistent sonoporation of cells as they flow through the channels in combination with ultrasound contrast agents. The device is fabricated using standard photolithography techniques to produce the PDMS-based fluidic chip. An ultrasound piezo disk transducer is attached to the device and driven by a microcontroller. The assembly can be integrated inside a 3D-printed case for added protection. Cells and microbubbles are pushed through the device using a syringe pump or a peristaltic pump connected to PVC tubing. Enhanced delivery of biomolecules to human T cells and lung cancer cells is demonstrated with this acoustofluidic system. Compared to bulk treatment approaches, this acoustofluidic system increases throughput and reduces variability, which can improve cell processing methods for biomedical research applications and manufacturing of cell-based therapeutics.

This protocol describes the assembly and operation of a low-cost acoustofluidic device for rapid molecular delivery to cells via sonoporation induced by ultrasound contrast agents.

Moleküler Bileşiklerin Hücrelere Daha İyi Teslimi İçin Akostofluidik Bir Cihazın Montajı ve çalışması

Efficient intracellular delivery of biomolecules is required for a broad range of biomedical research and cell-based therapeutic applications. ...

Absorbent Microbiopsy Sampling and RNA Extraction for Minimally Invasive, Simultaneous Blood and Skin Analysis

Conventional skin biopsy limits the clinical research that involves cosmetically sensitive areas or pediatric applications due to its invasiveness. Here, we describe the protocol for using&#160;an absorbent microneedle-based device, absorbent microbiopsy, for minimally invasive sampling of skin and blood mixture. Our goal is to help facilitate rapid progress in clinical research, the establishment of biomarkers for skin disease and reducing the risk for clinical research participants. In contrast to conventional skin biopsy techniques, the absorbent microbiopsy can be performed within seconds and does not require intensive training due to its simple design. In this report, we describe the use of absorbent microbiopsy, including loading and application, on a&#160;volunteer. Then, we show how to isolate RNA from the absorbed sample. Finally, we demonstrate the use of quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR) to quantify mRNA expression levels of both blood (CD3E and CD19) and skin (KRT14 and TYR). The methods that we describe utilize off the shelf kits and reagents. This protocol offers a minimally invasive approach for simultaneous sampling of skin and blood within the same absorbent microbiopsy matrix. We have found human ethics committees, clinicians and volunteers to be supportive of this approach to dermatological research.

In this article, we demonstrate how the absorbent microbiopsy technique is performed and how the sample can be used for RNA extraction for simple and simultaneous sampling of skin and blood in a minimally invasive manner.

Emici Microbiopsy örnekleme ve RNA çıkarma minimal invaziv, eşzamanlı kan ve cilt analizi için

Conventional skin biopsy limits the clinical research that involves cosmetically sensitive areas or pediatric applications due to its invasiveness. Here, ...

Tıp

Hücre Kültürlerinde Ham Vektör Üretimi ve Etkin DNA Dağıtımı

Transgene Expression in Cultured Cells Using Unpurified Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors

Recombinant adeno-associated viral vectors (rAAV) can achieve potent and durable transgene expression without integration in a broad range of tissue types, making them a popular choice for gene delivery in animal models and in clinical settings. In addition to therapeutic applications, rAAVs are a useful laboratory tool for delivering transgenes tailored to the researcher&#39;s experimental needs and scientific goals in cultured cells. Some examples include exogenous reporter genes, overexpression cassettes, RNA interference, and CRISPR-based tools, including those for genome-wide screens. rAAV transductions are less harmful to cells than electroporation or chemical transfection and do not require any special equipment or expensive reagents to produce. Crude lysates or conditioned media containing rAAVs can be added directly to cultured cells without further purification to transduce many cell types&#8212;an underappreciated feature of rAAVs. Here, we provide protocols for basic transgene cassette cloning and demonstrate how to produce and apply crude rAAV preparations to cultured cells. As proof of principle, we demonstrate the transduction of three cell types that have not yet been reported in rAAV applications: placental cells, myoblasts, and small intestinal organoids. We discuss appropriate uses for crude rAAV preparations, the limitations of rAAVs for gene delivery, and considerations for capsid choice. This protocol outlines a simple, low-cost, and effective method for researchers to achieve productive DNA delivery in cell culture using rAAV without the need for laborious titration and purification steps.

Yazar Gündemi: Hücre Kültürü Araştırmalarında Saflaştırılmamış Rekombinant AAV'lerin Potansiyelinin Ortaya Çıkarılması 

Recombinant adeno-associated virus (rAAV) is widely used for clinical and preclinical gene delivery. An underappreciated use for rAAVs is the robust transduction of cultured cells without the need for purification. For researchers new to rAAV, we provide a protocol for transgene cassette cloning, crude vector production, and cell culture transduction.

Saflaştırılmamış Rekombinant Adeno İlişkili Viral Vektörler Kullanılarak Kültürlenmiş Hücrelerde Transgen Ekspresyonu

Recombinant adeno-associated viral vectors (rAAV) can achieve potent and durable transgene expression without integration in a broad range of tissue ...

"Acufection" ve Cilt Araştırmaları onun Uygulaması tarafından bir Ekonomik DNA Yerleştirme Sisteminin Geliştirilmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Dünya Tarım Pest Böcek Embriyo Mikroenjeksiyon yoluyla Nükleik Asitler teslim edilmesi,

Güçsüz İnsan dermis kullanma Genetiği Değiştirilmiş Organotipik Cilt Kültürlerin Üretimi

Cilt DNA Aşı Teslim İçin Yeni Bir Yaklaşım olarak Dövme

Akustik Nanodispensing teknolojisini kullanarak yüksek verim DNA Plasmid multiplexing ve transfeksiyon

Tasarım ve Yapay Ekstrasellüler Matrix İnşaatı (aECM) Proteinler gelen

Keratinosit Kök Hücre Plastisitesini Modellemek için Yüksek Verimli Epidermal Sferoid Kültür Sistemi Kurulması

Moleküler Bileşiklerin Hücrelere Daha İyi Teslimi İçin Akostofluidik Bir Cihazın Montajı ve çalışması

Emici Microbiopsy örnekleme ve RNA çıkarma minimal invaziv, eşzamanlı kan ve cilt analizi için

Saflaştırılmamış Rekombinant Adeno İlişkili Viral Vektörler Kullanılarak Kültürlenmiş Hücrelerde Transgen Ekspresyonu

Saflaştırılmamış Rekombinant Adeno İlişkili Viral Vektörler Kullanılarak Kültürlenmiş Hücrelerde Transgen Ekspresyonu