1. Hücre Ayrılma <ol><li> Gösterilir protokolü ana hatlarını bir akış şeması Şekil 1 &#39;dir. Bu protokol boyunca kullanılan özel reaktiflerin katalog numaraları için Tablo 1&#39;e bakınız. Bir PBS banyosunda retina incelemek. Diseksiyonu sırasında, retinanın ayrışma engelleyebilir ile onları tutmak yana vitreus ve lens kaldırmak için en iyisidir. Bu retina pigment epiteli (RPE) tümünü kaldırmak için ve bazı durumlarda tamamen kaldırmak mümkün olmayabilir her zaman kritik önemli değildir. Bununla birlikte, tek bir hücre fotoreseptörlerin profil deneyler için, RPE kaldırılması gerekir. RPE kaldırmak için başarısızlık RPE ifade genlere sahip çubuk hücre profilleri kirlenmesine yol açabilir. Bu durum muhtemelen fotoreseptörlerin ve RPE arasındaki bağlantının kaynaklanmaktadır. Çözünme için, bütün yetişkin mürin retina 20 ihtiva eden bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içinde 10 dakika süreyle 37 ° C&#39;de inkübe edilirul aktifleştirilmiş papain, 5 mM EDTA içinde 20 ul 25 mM sistein ve 360 ​​ul Hank&#39;in dengeli tuz Çözelti (HBSS) 10 mM HEPES ile desteklenmiş. Filtreli pipet uçları potansiyel kontaminasyonu en aza indirmek için protokol boyunca tüm adımlar için kullanılır. Papain konsantrasyonu ve inkübasyon süresi, yaş ve doku doğasına göre değişir. Örneğin, doğum sonrası gün 0 (P0) izole retina gelişmekte ayırmak üzere, 10 ul aktifleştirilmiş papain, 5 mM EDTA içinde 10 ul 25 mM sistein, ve 10 mM HEPES ile desteklenmiş 380 ul Hank&#39;in dengeli tuz Çözelti (HBSS) içinde retinanın inkübe 37 ° C&#39;de 10 dakika boyunca Farklı türlerden retina da biraz farklı koşullar gerektirir. Tavuk retina gelişiminin en aşamalarında fare retina daha incedir. 10 ul aktifleştirilmiş papain, 5 mM EDTA içinde 10 ul 25 mM sistein ve 37 de 5 dakika için 10 mM HEPES ile desteklenmiş 380 ul Hank&#39;in dengeli tuz Çözelti (HBSS) ° C kullanılarak t ayırmak için yeterlidirHese retina. </li><li> Yavaşça herhangi bir yerleşmiş hücreleri çıkarmak için tüp dokunun, sonra P1000 pipet ile nazikçe 10-20 kez çiğnemek. 37 ek bir 10 dakika inkübe ° C dokusunun büyük kümeleri 10-20 kat inat ve sonra tekrar çiğnemek durumunda. </li><li> Dnaz i (10 U / ml) 5 ul ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir. Bir P1000 pipet ile hafifçe öğütmek. Kez tam sayısı ampirik olarak tespit edilmesi gerekmektedir, ancak genellikle 10-20 arasında kalan olacaktır. </li><li> 3 dakika 3000 rpm&#39;de bir masa üstü santrifüj santrifüjleyin altındaki sıvı 100-200 ul bırakarak süpernatantı ve pelet çıkarmak için tüp dokunun. HBSS 1 ml ekleyin ve nazik triturasyonun ile pelletini. Tüp dokunarak basitçe retina hücrelerinin çoğu lyse ile pelet resuspending burada kritik önem taşır. Bu yetişkin sıçan retinası ile özellikle doğrudur. </li><li> 3 dakika 3000 rpm&#39;de santrifüj dikkatlice içeren PBS 450 ul yılında süpernatan ve Pastör pipetiyle kaldırmakING% 0.1 BSA. Gelecekteki reaksiyonları inhibe edebilir ayrışma ile lizlendi hücreleri ve herhangi bir ürünlerden mRNA&#39;lar mevcudiyetinde en aza indirmek için mümkün olduğunca süpernatan kaldırmak için önemlidir. </li></ol> 2. Tek Hücreli Hasat <ol><li> % 0,1 BSA ile desteklenmiş PBS 5 ml içeren iki 6 cm tabaklar hazırlayın. Levha ayrışmış bir çanak üzerine hücreleri ve hücreler, en az 5 dakika boyunca yerleşmek izin verir. Kullanılan hücre yoğunluğu profilli olan tek bir hücre yapısı üzerine büyük ölçüde değişir. Örneğin, bir floresan işaretleyici böyle bir GFP ile etiketlenmiş çok nadir hücreleri için, tüm ayrıştırıldı retina tek bir 6 cm tabağına kaplanır. Biraz daha bol olan hücreler için, daha az hücre başlangıçta daha kolay ilk mikropipet ile bir (veya birine çok yakın) hücresini yapmak kaplanıyor. </li><li> Tersine çevrilmiş bir mikroskop ayrışmış hücrelerinin plakası yerleştirin. Biz Olympus&#39;un IMT-2 modeli kullanın. Bir fi için çizilmiştir mikropipetler kullanmaBirlikte bir aspiratör borusu ile ne ucu (iç çapı 0,5 mm, dış çapı 1.04 mm) (Şekil 2) ve tek bir hücresini. Hücreleri kolayca bu tabağına onlara yakın yerleştirilir mikropipet girin. Bu aspiratör borusu inverted mikroskop (bizim inverted mikroskop ile kullanmak aspiratör tüpleri 38,1 cm uzunluğunda) ile ilişkili sahneye ne çok uzun ne de mesafe çok kısa olduğu önemlidir. Tüp çok uzun ise, hücreler toplama tüp içine mikropipet etkin bir şekilde sürülen olabilir. Biz eski IMT-2 modeli inverted mikroskop kullanmak başlıca nedeni elimizden aspiratör montajı tüpleri için sahneye ideal mesafe vardır bulundu olmasıdır. Mikropipet girdikten sonra, hücrenin (veya hücre) ve tek bir hücre gen ekspresyon profili için hasat emin olmak için ikinci bir plaka (yıkama levha) üzerine atılır. İkinci tabağa ya yeni bir mikropipet ile yabancı hücreleri çıkarmak için sık sık gerekli olabilirveya tek bir hücre mikropipet girer sağlamak için farklı bir konuma ilgi hücre hareket eder. </li><li> Bireysel hücre tamamen komşu hücreler izole edildiğinde, bölümü 2,2 olarak ilgi hücre aspire için yeni bir mikropipet kullanımı ve daha sonra 4.5 ul hücre parçalama tampon içeren 0.2 ml PCR tüp içine doğrudan çıkarmak. Hücre tüpe mikropipet ucu kapalı kırmamaya dikkat ederek, tüp yüzüne atılır. Örnekler lizis tamponunda hücre batırmayın bir tezgah üstü mikrosantrifüj kısaca bükülmüş olabilir. Bu iplik genellikle tek bir hücre izolasyonu boyunca buz üzerinde tutulması, her 5 hücre sonra ve sonra tekrar lizis tamponu içinde tek bir hücre içeren collection.Tubes sonunda yapılır. En iyi sonuçlar için, tek hücreler iki saatlik bir pencere post-ayrışma içinde toplanır. Bu süre geçtikten sonra ek süre gözlemler bu yana, bu ters transkripsiyon adımla devam etmek en iyisied RNA bozulma şansını artırmak için. </li></ol> 3. Ters Transkripsiyon <ol><li> Kısaca, tüm tek hücrelerin hücre lizis tamponu batırılır sağlamak için, bir tezgah üstü minicentrifuge in örnekleri dönerler. Hücre parçalanmasını teşvik etmek, 90 saniye boyunca 70 ° C&#39;de inkübe örnek. bir termalcycler içinde. Hemen geri buz tüpü yerleştirin. </li><li> 2 dakika süreyle buz üzerinde tüpler bırakın. Tüm reaktif eklemeler için, kirliliği önlemek için filtre ucu pipet uçları kullanın. Ters transkripsiyon gerçekleştirmek için, 0,33 ul Superscript III (200 U / ml), 0.05 ul RNaz önleyici (40 U / ml), ve 0.07 ul T4 geni 32 proteini ekleyin. 50 at 50 ° C, bir dakika içinde thermocycler için reaksiyon karışımının inkübe. Buz üzerinde 15 dk ve mekan için 70 ° C enziminin inaktive. </li><li> Ücretsiz astar kaldırmak için, 0.1 ul eksonükleaz Buffer (10X), 0.8 ul dH 2 0 (moleküler biyoloji grade), ve 0.1 ul eksonükleaz ekleyin I (20 U / ml). Içinde 30 dakika süreyle 37 ° C&#39;de inkübebir termalcycler. 25 dakika boyunca 80 ° C&#39;de kuluçkaya reaksiyon ve ardından buz üzerine tüp yerleştirerek enzim inaktive. </li></ol> 4. PCR tailing ve Tek Hücreli <ol><li> Atık reaksiyon karışımının 6 ul ekleyin ve 10 dakika süre ile 20 dakika, 70 ° C&#39;de 37 ° C&#39;de inkübe edilir numune için bir thermocycler kullanımı, ve 4 ° C de tutmak </li><li> PCR reaksiyon karışımına kuyruklu Örnek 10 ul ekleyin ve aşağıdaki koşulları kullanılarak ikinci bir iplikçik sentezi ve PCR amplifikasyonu gerçekleştirmek: <ol><li> 2 dakika süreyle 95 ° C </li><li> 5 dakika süreyle 37 ° C </li><li> 16 dakika süre ile 72 ° C </li><li> 40 sn için 93 ° C </li><li> 1 dakika süreyle 67 ° C </li><li> Döngü başına 6 sec ekleyerek 6 dakika süreyle 72 ° C, </li><li> 4 34 kez adıma git </li><li> 10 dakika süre ile 72 ° C </li><li> 4 Bekletme ° C </li></ol></li></ol> 5.. Affymetrix Chips için Etiketleme <ol><li> CDNA etiket 10-20 ug (amplifiye cDNA sonucu konsantrasyonunutek bir hücreden işlemleri genelde Affymetrix mikrodizinlerinde sağlam bir hibridizasyon elde etmek için) 1 mcg / ml Resimler ~ edilir. İlk olarak, bir parçası 80 ul içerisinde 8 ul 1X Bir phor-tüm tamponu ile seyreltilmiş ve 1 ul (1X içinde 1:10 Bir phor-tüm tamponu) DNaseI için tek hücre cDNA 10-20 ul ilave edilerek cDNA reaksiyon. 37 de 13 dakika süre ile, bir thermocycler içinde inkübe ° C. 100 ° C ve buz üzerinde bir yerde 15 dakika süreyle DNase I inaktive. </li><li> 20 ul 5X TdT tamponu, 2.5 ul Biotin N6-ddATP (Enzo Biosciences), ve 1 ul TdT (TdT tamponu içinde seyreltilir 01:08) eklenir. </li><li> 65 dk sonra 5 ° C&#39;de, 37 ° C&#39;de 90 dakika süreyle inkübe -20 ° C&#39;de saklayın veya Affymetrix mikroarray hemen melezler. Hibridizasyon standart Affymetrix protokolleri kullanılarak gerçekleştirilir. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar CDNA örneğin cDNA, 10 ul&#39;lik kalitesini belirlemek üzere% 1 agaroz jel üzerine yüklendi. CDNA ağırlıklı (500-2000 bp) boyut aralığı tarafından değerlendirilecektircDNA yayma ve şiddeti (Şekil 1 ve Şekil 3a). Şekil 1 içinde tasvir jel, her şeridinde retina hücrelerinden bir cDNA yayma E16.5 izole gösterir. Sadece ortamı aspire edilmiş ve iğne içine PCR tüp içine tevdi edildiğinde şeritleri arasında ortaya çıkan leke göstermiştir. Bu şerit soluk bir smear tamamen yoksun şey değildir ama gen-spesifik PCR primerleri onlardan genlerin yükseltmek için kullanıldıkları zaman, bunların hiçbir sonuç görünmüyor. Buna ek olarak, cDNA yayma yoğunluğu (Şekil 1 ve Şekil 3a karşılaştırın) biraz farklılık gösterebilir. Şerit b, c, d ve e daha az güçlü iken Şekil 3a şeritli bir, f, g, h ve sağlam cDNA smear içerir. Gen özgü PCR tek bir hücreden cDNA kalitesinin ikinci bir ekran olarak kullanılır. Şekil 3 içinde cDNAlann flüoresan retina ganglion hücrelerinden izole edildi ve bu teste edildid retina ganglion hücre işaretleyicileri Brn3b ve Pax6 için PCR primerleri kullanarak. Bu deneyde, cDNA 1 ul 30 döngü süresince PCR tabi tutuldu. Gerçek zamanlı kantitatif PCR tercih testi olurdu, ama pahalı olabilir ve sadece cDNA kalitesini değerlendirmek için gerekli değildir yapabilirsiniz. Tek hücrelerin Tüm 8 Pax6 (Şekil 3b) için 8 dışarı Brn3b ve 6 testi pozitif çıktı. Hatta cDNA Brn3b ve Pax6 için üretilen bantlar daha az güçlü idi smear. Bu PCR sonuçlara rağmen, bu tür şerit b, c, d ve e gibi cDNA smear Affymetrix dizileri sağlam hibridizasyonları vermeyen ve genellikle kaçınılır bizim deneyim. Fotoseptör işaretleyici için geni CRX özgü PCR tek hücre cDNAlann (Şekil 3b) kirlenme seviyelerini belirlemek için kullanılmıştır. Bu hücreler bu nedenle, retinanın çoğunluğu (~% 70) oluşturan ve çünkü fotoreseptör işaretleyici seçildi, meydana herhangi bir hücre parçalanması büyük olasılıkla çubuk photore içerecektirreseptör. CRX mevcut soluk bir miktarı bile PCR 30 devir sonunda bu cDNA hazırlıklar sadece vardı. Son olarak, bu PCR bazlı ekranı cDNAlann bir tam mikroarray onlara tabi önce elde edilmiştir, belirli bir hücre tipinde hangi alt belirlemek için başlaması için kullanılabilir. Bu durum, bu işlemde en pahalı adım olarak, profilli edilir hücreleri öncelik yardımcı olabilir. Örneğin, gen Tachykinin1 (Şekil 3b) varlığı için bunları eleme tarafından retina ganglion hücrelerinin alt tanımlamışlardır. Küçük PCR tabanlı ekranından, özellikle tek hücreler seçilir ve onların DNA&#39;larının bir Affymetrix mikroarray için melezi. Mikroarray verileri karşılaştırılır ve desenleri standart kümeleme algoritmaları kullanarak tespit edilebilir. Şekil 4, bu gibi Heatmaps, grafiksel verileri temsil oluşturulur. Şekil tek hücre profil verileriyle ilgili iki ana sonucu vardır4. Tek hücre protokolü gerçekleştirildikten sonra İlk olarak, belirli bir hücre tipleri ifade genler de hücre tiplerinde in hemen hemen sadece bulunur. Bir hücre türü işaretleyici gen bipolar hücreleri ikinci hücre tipinde, bu ifadenin kolaylıkla in situ ya ile teyit edilir, daha düşük seviyede bir miktar &quot;çubuk&quot; genleri ifade böyle bir gözlem olarak ikinci bir hücre tipinde, de bulunan çoğu durumda hibridizasyon veya antikor boyama. İkincisi, daha çeşitli amacrine ve ganglion hücre profilleri içerisinde, gen ekspresyonu heterojenliği hemen belli olmaktadır. Nr4a2 ve Scube2 farklı amacrine hücrelerinde eksprese heterojen genin iki örneği ise Pou4f1, sadece, gelişmekte ganglion hücrelerinin yaklaşık 1/4 ile ifade edilir. Birkaç yüz genler gelişmekte ganglion hücrelerinin belirteçleri olarak da 2,4 amacrine farklı hücre popülasyonlarının belirteçler olarak tespit ve teyit edilmiş Aslında, İlgi haritası gösterilen genlerin sadece küçük bir örnek vardır. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig1.jpg" /> Şekil 1.. Tek hücre profilleme yönteminin akış şeması. İlk retina izole ve papain kullanarak tek tek hücrelerin içine ayrışmış bulunmaktadır. İkincisi, tek hücre çekti cam iğne ile hasat ve PCR tüpleri yatırılır. Hücreler parçalanır ve cDNA PCR ardından ters transkripsiyon kullanılarak amplifiye edilir. Sonuçta elde edilen cDNA bu kalitesi gösterildiği gibi bir agaroz jeli üzerine tespit edilir. Ilk şeride DNA merdiveni sonra, şerit medya denetimleri amplifikasyon ürünleri ile alternatif tek hücre (kırmızı parantez ile gösterilir) cDNA smear göstermektedir. Bu kalite (kırmızı parantez) lekeleri Affymetrix mikroarrayler için melezi. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig2.jpg" /> Şekil 2. Iğneler ve aspiratör boru montaj resimleri. Tek hücre içindeki kılcal eylem kullanılarak izole edilmiştircam mikropipet (iç çapı 0,5 mm, dış çapı 1.04 mm) çekti ve aspiratör içine şişirme basıncı ile aktarılır. Bu aspiratör borusu hem uzun hem de kolay işlemek için yeterli ve güvenilir tek tek hücrelerin yerine kadar kısa olması önemlidir. Bir iğne içine çekti kapiler tüpün bir yakın görünümünü B. gösterilir <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig3.jpg" /> Şekil 3. Tek hücre cDNA smear ve gen spesifik PCR Temsilcisi örneği. Amplifikasyon sonra cDNA tek hücre kalitesini belirlemek için, her bir hücre örneği 10 ul negatif kontrol (A) ile birlikte% 1 agaroz jelde yürütülmüştür. Bir smear 500-2000 bp arasında görünmelidir. Spesifik genler için ek PCR tabanlı tarama tanımlamak / izole edilmiş hücre tipi ve örnek kontaminasyon mevcut miktarı (B) onaylamak için yardımcı olabilir. Retina ganglion hücrelerinin spesifik primerler Brn3b markersve Pax6 bu hücreler (Sıralar 1 ve 2) kimliğini teyit etmek için test edildi. Hazırlanmasında fotoseptör kirlenme miktarını belirlemek için, işaretleyici fotoseptör CRX için spesifik primerlerin (sıra 3) kullanılmıştır. Ganglion hücrelerinin alt kümeleri ayrıca Tachykinin1 (Satır 4) gibi belirteçlerin taranması ile tespit edilebilir. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig4.jpg" /> Şekil 4. Işaretleyici gen ifadesi tek bir hücre. 22 ayrı tek hücrelerin içinde ifade seçilen genleri için mikroarray sonuçlar İlgi haritası biçimde gösterilmektedir. Mikroarray sinyallerinden şiddetleri kırmızı renk yoğunluğu ile karşılık ölçeklenir edilmiştir. Siyah mikroarray sinyal yokluğunda gösterir. Diğer yetişkin hücrelerin retina izole edildi sırasında gösterilen retina ganglion hücrelerinin (RGC) öncüleri, embriyonik zaman noktalarında izole edilmiştir.

<ol>
	<li>Tietjen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptional+analysis+of+neuronal+progenitors.">Single-cell transcriptional analysis of neuronal progenitors.</a> Neuron. 38, 161-175 (2003).</li><li>Trimarchi, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+heterogeneity+of+developing+retinal+ganglion+and+amacrine+cells+revealed+through+single+cell+gene+expression+profiling.">Molecular heterogeneity of developing retinal ganglion and amacrine cells revealed through single cell gene expression profiling.</a> J. Comp. Neurol. 502, 1047-1065 (2007).</li><li>Trimarchi, J. M., Cho, S. H., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+expressed+preferentially+in+the+developing+peripheral+margin+of+the+optic+cup.">Identification of genes expressed preferentially in the developing peripheral margin of the optic cup.</a> Dev. Dyn. 238, 2327-2327 (2009).</li><li>Cherry, T. J., Trimarchi, J. M., Stadler, M. B., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+diversification+of+retinal+amacrine+interneurons+at+single+cell+resolution.">Development and diversification of retinal amacrine interneurons at single cell resolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9495-9500 (2009).</li><li>Roesch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptome+of+retinal+Muller+glial+cells.">The transcriptome of retinal Muller glial cells.</a> J. Comp. Neurol. 509, 225-238 (2008).</li><li>Ramos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+diversity+in+transcriptional+profiles+of+single+hematopoietic+stem+cells.">Evidence for diversity in transcriptional profiles of single hematopoietic stem cells.</a> PLoS Genet. 2, e159 (2006).</li><li>Chiang, M. K., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcript+analysis+of+pancreas+development.">Single-cell transcript analysis of pancreas development.</a> Dev. Cell. 4, 383-393 (2003).</li><li>Trimarchi, J. M., Stadler, M. B., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+retinal+progenitor+cells+display+extensive+heterogeneity+of+gene+expression.">Individual retinal progenitor cells display extensive heterogeneity of gene expression.</a> PLoS ONE. 3, e1588 (2008).</li><li>Nelson, S. B., Sugino, K., Hempel, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+problem+of+neuronal+cell+types:+a+physiological+genomics+approach.">The problem of neuronal cell types: a physiological genomics approach.</a> Trends Neurosci. 29, 339-345 (2006).</li><li>Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+diversity:+too+many+cell+types+for+comfort.">Neuronal diversity: too many cell types for comfort.</a> Curr. Biol. 8, R708-R710 (1998).</li><li>Cepko, C. L., Austin, C. P., Yang, X., Alexiades, M., Ezzeddine, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+determination+in+the+vertebrate+retina.">Cell fate determination in the vertebrate retina.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 589-595 (1996).</li><li>Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+molecular+markers+of+bipolar+cells+in+the+murine+retina.">Identification of molecular markers of bipolar cells in the murine retina.</a> J. Comp. Neurol. 507, 1795-1810 (2008).</li><li>Chang, H. H., Hemberg, M., Barahona, M., Ingber, D. E., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+noise+controls+lineage+choice+in+mammalian+progenitor+cells.">Transcriptome-wide noise controls lineage choice in mammalian progenitor cells.</a> Nature. 453, 544-547 (2008).</li><li>Levsky, J. M., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+and+the+myth+of+the+average+cell.">Gene expression and the myth of the average cell.</a> Trends Cell Biol. 13, 4-6 (2003).</li><li>Livesey, F. J., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+neural+cell-fate+determination:+lessons+from+the+retina.">Vertebrate neural cell-fate determination: lessons from the retina.</a> Nat. Rev. Neurosci. 2, 109-118 (2001).</li><li>Masland, R. H., Raviola, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confronting+complexity:+strategies+for+understanding+the+microcircuitry+of+the+retina.">Confronting complexity: strategies for understanding the microcircuitry of the retina.</a> Annu. Rev. Neurosci. 23, 249-284 (2000).</li><li>Blackshaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+mouse+retinal+development.">Genomic analysis of mouse retinal development.</a> PLoS Biol. 2, e247 (2004).</li><li>Livesey, F. J., Young, T. L., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+gene+expression+program+of+mammalian+neural+progenitor+cells.">An analysis of the gene expression program of mammalian neural progenitor cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1374-1379 (2004).</li><li>Chowers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+genes+preferentially+expressed+in+the+retina+using+a+custom+human+retina+cDNA+microarray.">Identification of novel genes preferentially expressed in the retina using a custom human retina cDNA microarray.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 3732-3741 (2003).</li><li>Clarke, G. C., Leavitt, R. A., Andrews, B. R., Hayden, D. F., Lumsden, M. R., J, C., McInnes, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one-hit+model+of+cell+death+in+inherited+neuronal+degenerations.">A one-hit model of cell death in inherited neuronal degenerations.</a> Nature. 406, 195-199 (2000).</li><li>McEvoy, J. F. -. O., Zhang, J., Nemeth, J., Brennan, K., Bradley, R., Krafcik, C., Rodriguez-Galindo, F., Wilson, C., Xiong, M., Lozano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexpression+of+normally+incompatible+developmental+pathways+in+retinoblastoma+genesis.">Coexpression of normally incompatible developmental pathways in retinoblastoma genesis.</a> Cancer Cell. 20, 260-275 (2011).</li><li>Gelder, R. N. V. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA.">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1663-1667 (1990).</li><li>Ginsberg, S. D., Che, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profile+analysis+within+the+human+hippocampus:+comparison+of+CA1+and+CA3+pyramidal+neurons.">Expression profile analysis within the human hippocampus: comparison of CA1 and CA3 pyramidal neurons.</a> J. Comp. Neurol. 487, 107-118 (2005).</li><li>Iscove, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Representation+is+faithfully+preserved+in+global+cDNA+amplified+exponentially+from+sub-picogram+quantities+of+mRNA.">Representation is faithfully preserved in global cDNA amplified exponentially from sub-picogram quantities of mRNA.</a> Nat. Biotechnol. 20, 940-943 (2002).</li><li>Subkhankulova, T., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+linear+and+exponential+amplification+techniques+for+expression+profiling+at+the+single-cell+level.">Comparative evaluation of linear and exponential amplification techniques for expression profiling at the single-cell level.</a> Genome Biol. 7, R18 (2006).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Çalışmaların sürekli genişleyen sayısı, gen ekspresyon 6,8 açısından daha homojen olduğu inanılan toplumlarda sağlam hücreden hücreye değişkenliği ortaya koymaktadır. En az bir örneği olarak, bu gen ifadesi &quot;gürültü&quot; önemli bir biyolojik fonksiyonları 13 oynamak için gösterilmiştir. Tek tek hücreler arasında gen ekspresyonu farklılıklar geleneksel bütün doku yöntemleri kullanarak gizlenmiş edilir. Bu deneyler temsilcisi 14 olmayabilir &quot...

Reaction mixtures:
Cell Lysis buffer
<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &mu;</td>
			<td>10X reaction buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.23 &mu;l</td>
			<td>10% NP-40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.23 &mu;l</td>
			<td>0.1M DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05 &mu;l</td>
			<td>RNase Inhibitor (40 U/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05 &mu;l</td>
			<td>SUPERase-In (20U/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.13 &mu;l</td>
			<td>Modified Oligo d(T) primer 
			(TATAGAATTCGCGGCCGCTCGCGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.09 &mu;l</td>
			<td>dNTPs (2.5 mM each)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.27 &mu;l</td>
			<td>dH20 (use molecular biology grade for all reaction mixtures)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tailing Reaction Mixture
<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.18 &mu;l</td>
			<td>100 mM dATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 &mu;l</td>
			<td>10X reaction buffer(100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.62 &mu;l</td>
			<td>dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3 &mu;l</td>
			<td>TdT (400 U/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3 &mu;l</td>
			<td>RNase H (2 U/&mu;l)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
PCR Reaction Mixture
<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 &mu;l</td>
			<td>10x Ex-Taq HS Buffer with Mg2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &mu;l</td>
			<td>2.5 mM dNTPs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &mu;l</td>
			<td>Modified Oligo d(T) primer (10 &mu;g/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 &mu;l</td>
			<td>Ex-Taq HS Polymerase (5U/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>68.8 &mu;l</td>
			<td>dH2O</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
10X One-Phor All Buffer
<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M</td>
			<td>Potassium acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M</td>
			<td>Tris acetate (pH 7.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M</td>
			<td>Magnesium acetate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Solutions:
10X Phosphate buffered saline (1 liter)
80g NaCl 
2g KCl 
14.4 g Na2PO4 
2.4 g KH2PO4 
adjust to pH 7.4 with NaOH and bring the volume to 1 liter with water
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical needle puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 750</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary tubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0674</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assembly</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning filter tips (100-1000 &mu;l</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-265</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank's balanced salt solution (1X)</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>10-508F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer (1M)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>091688449</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04716728001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS03126</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript III</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>AM2682</td>
			<td>These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase-In</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>AM2694</td>
			<td>These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Oligo d(T) primer (gel purified)</td>
			<td>Oligos ETC</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>We have used primers purchased from many different companies and have seen the most reliable and reproducible results from Oligos ETC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 gene 32 protein</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0300L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0293S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TdT</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3 333 574</td>
			<td>As with other reagents, using a TdT enzyme from other companies gave more variable results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase H</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18021-014</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex-Taq HS Polymerase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR006A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin N6-ddATP</td>
			<td>Enzo Biosciences</td>
			<td>42809</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. Specific reagents and equipment.

single-cell profiling of developing and mature retinal neurons

Hücrelerin çok özel, ama son derece küçük popülasyonlarda çok dokuda önemli rol oynamaktadır. Son derece nadir hücre alt grupları için hücre türüne özgü marker ve gen ekspresyonu programlarının belirlenmesi standart bütün doku yaklaşımları kullanarak bir meydan okuma olmuştur. Bireysel hücre gen ifadesi profil toplam doku 1-7 sadece küçük bir yüzdesi ihtiva hücre tipleri için eşsiz erişim sağlar. Buna ek olarak, bu teknik geçici olarak dinamik bir gelişim geçişleri sırasında 8 hücreleri az sayıda cinsinden ifade edilmiştir gen ifadesi programları incelemek için kullanılabilir. Hücresel çeşitlilik Bu sorun nöronal bağlantıları 9 oldukça farklı hücreler arasında oluşabilir merkezi sinir sistemi (SSS) tekrar tekrar ortaya çıkar. Farklı hücre tipleri kesin sayısı tam olarak bilinmemektedir, ancak korteks i kadar 1000 farklı tipte olabileceği tahmin edilmektedirtself 10. Karmaşık sinirsel devrelerin fonksiyonu (ler) nadir görülen nöronal türleri ve bunların ifade genlerin bazı bağımlı olabilir. Yeni bir belirteç tanımlanması ve moleküler olarak farklı nöronların sınıflandırmak için yardımcı olarak, tek bir hücre yaklaşımı sinir sisteminde hücre tiplerinin analizi özellikle faydalıdır. Ayrıca nöronal progenitör gelişiminin erken aşamalarında Farklı olarak ifade genler ve gen yolları tespit ederek nöral gelişim mekanizmaları aydınlatmak için yardımcı olabilir. Önemli nöronal çeşitliliği ile basit, kolay erişilebilir dokusu gibi, gözdeki hücresel gelişim, nöronal farklılaşma ve nöronal çeşitlendirme süreçleri incelemek için mükemmel bir model sistemidir. Ancak, merkezi sinir sistemi diğer bölgelerinde olduğu gibi, bu hücresel çeşitlilik çubuk fotoreseptör ma makyaj özellikle göz önüne alındığında, belirli bir hücre kaderinin benimsemeye retina ataları sürücü genetik yollarının belirlenmesi için bir sorun olabilirtotal retina hücre popülasyonu 11 bununla birlikte, çoğunluk. Burada tek retina hücreleri (Şekil 1) ile ifade transkriptlerin belirlenmesi için bir yöntem sunulmaktadır. Tek-hücre profil tekniği retinanın 2,4,5,12 farklı hücresel popülasyonları içinde heterojenite Mevcut miktarının değerlendirilmesi için olanak sağlar. Buna ek olarak, bu yöntem hücre kaderinin retina progenitör hücrelerin alt 8 meydana karar alma süreçlerinde rol (ler) oynayabilir yeni aday genler bir dizi ortaya çıkarmıştır. Protokolü için bazı basit ayarlamalar ile, bu teknik birçok farklı doku ve hücre tipleri için kullanılabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons at JoVE.com

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Tek retina hücreleri ve bunların cDNAlann sonraki amplifikasyon izolasyonu için bir yöntem tarif edilmiştir. Tek hücreli transkriptomik bir dokusunda hücresel heterojenite mevcut derecesini ortaya koymaktadır ve nadir hücre popülasyonu için yeni belirteç genlerin ortaya çıkarır. Beraberindeki protokol birçok farklı hücre tiplerine uyacak şekilde ayarlanabilir.

Gelişen ve Olgun Retina Nöronlar Tek hücreli Profilleme

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

single-cell-profiling-of-developing-and-mature-retinal-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.0K Görüntüleme.  Iowa State University. Tek retina hücreleri ve bunların cDNAlann sonraki amplifikasyon izolasyonu için bir yöntem tarif edilmiştir. Tek hücreli transkriptomik bir dokusunda hücresel heterojenite mevcut derecesini ortaya koymaktadır ve nadir hücre popülasyonu için yeni belirteç genlerin ortaya çıkarır. Beraberindeki protokol birçok farklı hücre tiplerine uyacak şekilde ayarlanabilir.