1. Hücre Ayrılma <ol><li> Gösterilir protokolü ana hatlarını bir akış şeması Şekil 1 &#39;dir. Bu protokol boyunca kullanılan özel reaktiflerin katalog numaraları için Tablo 1&#39;e bakınız. Bir PBS banyosunda retina incelemek. Diseksiyonu sırasında, retinanın ayrışma engelleyebilir ile onları tutmak yana vitreus ve lens kaldırmak için en iyisidir. Bu retina pigment epiteli (RPE) tümünü kaldırmak için ve bazı durumlarda tamamen kaldırmak mümkün olmayabilir her zaman kritik önemli değildir. Bununla birlikte, tek bir hücre fotoreseptörlerin profil deneyler için, RPE kaldırılması gerekir. RPE kaldırmak için başarısızlık RPE ifade genlere sahip çubuk hücre profilleri kirlenmesine yol açabilir. Bu durum muhtemelen fotoreseptörlerin ve RPE arasındaki bağlantının kaynaklanmaktadır. Çözünme için, bütün yetişkin mürin retina 20 ihtiva eden bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içinde 10 dakika süreyle 37 ° C&#39;de inkübe edilirul aktifleştirilmiş papain, 5 mM EDTA içinde 20 ul 25 mM sistein ve 360 ​​ul Hank&#39;in dengeli tuz Çözelti (HBSS) 10 mM HEPES ile desteklenmiş. Filtreli pipet uçları potansiyel kontaminasyonu en aza indirmek için protokol boyunca tüm adımlar için kullanılır. Papain konsantrasyonu ve inkübasyon süresi, yaş ve doku doğasına göre değişir. Örneğin, doğum sonrası gün 0 (P0) izole retina gelişmekte ayırmak üzere, 10 ul aktifleştirilmiş papain, 5 mM EDTA içinde 10 ul 25 mM sistein, ve 10 mM HEPES ile desteklenmiş 380 ul Hank&#39;in dengeli tuz Çözelti (HBSS) içinde retinanın inkübe 37 ° C&#39;de 10 dakika boyunca Farklı türlerden retina da biraz farklı koşullar gerektirir. Tavuk retina gelişiminin en aşamalarında fare retina daha incedir. 10 ul aktifleştirilmiş papain, 5 mM EDTA içinde 10 ul 25 mM sistein ve 37 de 5 dakika için 10 mM HEPES ile desteklenmiş 380 ul Hank&#39;in dengeli tuz Çözelti (HBSS) ° C kullanılarak t ayırmak için yeterlidirHese retina. </li><li> Yavaşça herhangi bir yerleşmiş hücreleri çıkarmak için tüp dokunun, sonra P1000 pipet ile nazikçe 10-20 kez çiğnemek. 37 ek bir 10 dakika inkübe ° C dokusunun büyük kümeleri 10-20 kat inat ve sonra tekrar çiğnemek durumunda. </li><li> Dnaz i (10 U / ml) 5 ul ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir. Bir P1000 pipet ile hafifçe öğütmek. Kez tam sayısı ampirik olarak tespit edilmesi gerekmektedir, ancak genellikle 10-20 arasında kalan olacaktır. </li><li> 3 dakika 3000 rpm&#39;de bir masa üstü santrifüj santrifüjleyin altındaki sıvı 100-200 ul bırakarak süpernatantı ve pelet çıkarmak için tüp dokunun. HBSS 1 ml ekleyin ve nazik triturasyonun ile pelletini. Tüp dokunarak basitçe retina hücrelerinin çoğu lyse ile pelet resuspending burada kritik önem taşır. Bu yetişkin sıçan retinası ile özellikle doğrudur. </li><li> 3 dakika 3000 rpm&#39;de santrifüj dikkatlice içeren PBS 450 ul yılında süpernatan ve Pastör pipetiyle kaldırmakING% 0.1 BSA. Gelecekteki reaksiyonları inhibe edebilir ayrışma ile lizlendi hücreleri ve herhangi bir ürünlerden mRNA&#39;lar mevcudiyetinde en aza indirmek için mümkün olduğunca süpernatan kaldırmak için önemlidir. </li></ol> 2. Tek Hücreli Hasat <ol><li> % 0,1 BSA ile desteklenmiş PBS 5 ml içeren iki 6 cm tabaklar hazırlayın. Levha ayrışmış bir çanak üzerine hücreleri ve hücreler, en az 5 dakika boyunca yerleşmek izin verir. Kullanılan hücre yoğunluğu profilli olan tek bir hücre yapısı üzerine büyük ölçüde değişir. Örneğin, bir floresan işaretleyici böyle bir GFP ile etiketlenmiş çok nadir hücreleri için, tüm ayrıştırıldı retina tek bir 6 cm tabağına kaplanır. Biraz daha bol olan hücreler için, daha az hücre başlangıçta daha kolay ilk mikropipet ile bir (veya birine çok yakın) hücresini yapmak kaplanıyor. </li><li> Tersine çevrilmiş bir mikroskop ayrışmış hücrelerinin plakası yerleştirin. Biz Olympus&#39;un IMT-2 modeli kullanın. Bir fi için çizilmiştir mikropipetler kullanmaBirlikte bir aspiratör borusu ile ne ucu (iç çapı 0,5 mm, dış çapı 1.04 mm) (Şekil 2) ve tek bir hücresini. Hücreleri kolayca bu tabağına onlara yakın yerleştirilir mikropipet girin. Bu aspiratör borusu inverted mikroskop (bizim inverted mikroskop ile kullanmak aspiratör tüpleri 38,1 cm uzunluğunda) ile ilişkili sahneye ne çok uzun ne de mesafe çok kısa olduğu önemlidir. Tüp çok uzun ise, hücreler toplama tüp içine mikropipet etkin bir şekilde sürülen olabilir. Biz eski IMT-2 modeli inverted mikroskop kullanmak başlıca nedeni elimizden aspiratör montajı tüpleri için sahneye ideal mesafe vardır bulundu olmasıdır. Mikropipet girdikten sonra, hücrenin (veya hücre) ve tek bir hücre gen ekspresyon profili için hasat emin olmak için ikinci bir plaka (yıkama levha) üzerine atılır. İkinci tabağa ya yeni bir mikropipet ile yabancı hücreleri çıkarmak için sık sık gerekli olabilirveya tek bir hücre mikropipet girer sağlamak için farklı bir konuma ilgi hücre hareket eder. </li><li> Bireysel hücre tamamen komşu hücreler izole edildiğinde, bölümü 2,2 olarak ilgi hücre aspire için yeni bir mikropipet kullanımı ve daha sonra 4.5 ul hücre parçalama tampon içeren 0.2 ml PCR tüp içine doğrudan çıkarmak. Hücre tüpe mikropipet ucu kapalı kırmamaya dikkat ederek, tüp yüzüne atılır. Örnekler lizis tamponunda hücre batırmayın bir tezgah üstü mikrosantrifüj kısaca bükülmüş olabilir. Bu iplik genellikle tek bir hücre izolasyonu boyunca buz üzerinde tutulması, her 5 hücre sonra ve sonra tekrar lizis tamponu içinde tek bir hücre içeren collection.Tubes sonunda yapılır. En iyi sonuçlar için, tek hücreler iki saatlik bir pencere post-ayrışma içinde toplanır. Bu süre geçtikten sonra ek süre gözlemler bu yana, bu ters transkripsiyon adımla devam etmek en iyisied RNA bozulma şansını artırmak için. </li></ol> 3. Ters Transkripsiyon <ol><li> Kısaca, tüm tek hücrelerin hücre lizis tamponu batırılır sağlamak için, bir tezgah üstü minicentrifuge in örnekleri dönerler. Hücre parçalanmasını teşvik etmek, 90 saniye boyunca 70 ° C&#39;de inkübe örnek. bir termalcycler içinde. Hemen geri buz tüpü yerleştirin. </li><li> 2 dakika süreyle buz üzerinde tüpler bırakın. Tüm reaktif eklemeler için, kirliliği önlemek için filtre ucu pipet uçları kullanın. Ters transkripsiyon gerçekleştirmek için, 0,33 ul Superscript III (200 U / ml), 0.05 ul RNaz önleyici (40 U / ml), ve 0.07 ul T4 geni 32 proteini ekleyin. 50 at 50 ° C, bir dakika içinde thermocycler için reaksiyon karışımının inkübe. Buz üzerinde 15 dk ve mekan için 70 ° C enziminin inaktive. </li><li> Ücretsiz astar kaldırmak için, 0.1 ul eksonükleaz Buffer (10X), 0.8 ul dH 2 0 (moleküler biyoloji grade), ve 0.1 ul eksonükleaz ekleyin I (20 U / ml). Içinde 30 dakika süreyle 37 ° C&#39;de inkübebir termalcycler. 25 dakika boyunca 80 ° C&#39;de kuluçkaya reaksiyon ve ardından buz üzerine tüp yerleştirerek enzim inaktive. </li></ol> 4. PCR tailing ve Tek Hücreli <ol><li> Atık reaksiyon karışımının 6 ul ekleyin ve 10 dakika süre ile 20 dakika, 70 ° C&#39;de 37 ° C&#39;de inkübe edilir numune için bir thermocycler kullanımı, ve 4 ° C de tutmak </li><li> PCR reaksiyon karışımına kuyruklu Örnek 10 ul ekleyin ve aşağıdaki koşulları kullanılarak ikinci bir iplikçik sentezi ve PCR amplifikasyonu gerçekleştirmek: <ol><li> 2 dakika süreyle 95 ° C </li><li> 5 dakika süreyle 37 ° C </li><li> 16 dakika süre ile 72 ° C </li><li> 40 sn için 93 ° C </li><li> 1 dakika süreyle 67 ° C </li><li> Döngü başına 6 sec ekleyerek 6 dakika süreyle 72 ° C, </li><li> 4 34 kez adıma git </li><li> 10 dakika süre ile 72 ° C </li><li> 4 Bekletme ° C </li></ol></li></ol> 5.. Affymetrix Chips için Etiketleme <ol><li> CDNA etiket 10-20 ug (amplifiye cDNA sonucu konsantrasyonunutek bir hücreden işlemleri genelde Affymetrix mikrodizinlerinde sağlam bir hibridizasyon elde etmek için) 1 mcg / ml Resimler ~ edilir. İlk olarak, bir parçası 80 ul içerisinde 8 ul 1X Bir phor-tüm tamponu ile seyreltilmiş ve 1 ul (1X içinde 1:10 Bir phor-tüm tamponu) DNaseI için tek hücre cDNA 10-20 ul ilave edilerek cDNA reaksiyon. 37 de 13 dakika süre ile, bir thermocycler içinde inkübe ° C. 100 ° C ve buz üzerinde bir yerde 15 dakika süreyle DNase I inaktive. </li><li> 20 ul 5X TdT tamponu, 2.5 ul Biotin N6-ddATP (Enzo Biosciences), ve 1 ul TdT (TdT tamponu içinde seyreltilir 01:08) eklenir. </li><li> 65 dk sonra 5 ° C&#39;de, 37 ° C&#39;de 90 dakika süreyle inkübe -20 ° C&#39;de saklayın veya Affymetrix mikroarray hemen melezler. Hibridizasyon standart Affymetrix protokolleri kullanılarak gerçekleştirilir. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar CDNA örneğin cDNA, 10 ul&#39;lik kalitesini belirlemek üzere% 1 agaroz jel üzerine yüklendi. CDNA ağırlıklı (500-2000 bp) boyut aralığı tarafından değerlendirilecektircDNA yayma ve şiddeti (Şekil 1 ve Şekil 3a). Şekil 1 içinde tasvir jel, her şeridinde retina hücrelerinden bir cDNA yayma E16.5 izole gösterir. Sadece ortamı aspire edilmiş ve iğne içine PCR tüp içine tevdi edildiğinde şeritleri arasında ortaya çıkan leke göstermiştir. Bu şerit soluk bir smear tamamen yoksun şey değildir ama gen-spesifik PCR primerleri onlardan genlerin yükseltmek için kullanıldıkları zaman, bunların hiçbir sonuç görünmüyor. Buna ek olarak, cDNA yayma yoğunluğu (Şekil 1 ve Şekil 3a karşılaştırın) biraz farklılık gösterebilir. Şerit b, c, d ve e daha az güçlü iken Şekil 3a şeritli bir, f, g, h ve sağlam cDNA smear içerir. Gen özgü PCR tek bir hücreden cDNA kalitesinin ikinci bir ekran olarak kullanılır. Şekil 3 içinde cDNAlann flüoresan retina ganglion hücrelerinden izole edildi ve bu teste edildid retina ganglion hücre işaretleyicileri Brn3b ve Pax6 için PCR primerleri kullanarak. Bu deneyde, cDNA 1 ul 30 döngü süresince PCR tabi tutuldu. Gerçek zamanlı kantitatif PCR tercih testi olurdu, ama pahalı olabilir ve sadece cDNA kalitesini değerlendirmek için gerekli değildir yapabilirsiniz. Tek hücrelerin Tüm 8 Pax6 (Şekil 3b) için 8 dışarı Brn3b ve 6 testi pozitif çıktı. Hatta cDNA Brn3b ve Pax6 için üretilen bantlar daha az güçlü idi smear. Bu PCR sonuçlara rağmen, bu tür şerit b, c, d ve e gibi cDNA smear Affymetrix dizileri sağlam hibridizasyonları vermeyen ve genellikle kaçınılır bizim deneyim. Fotoseptör işaretleyici için geni CRX özgü PCR tek hücre cDNAlann (Şekil 3b) kirlenme seviyelerini belirlemek için kullanılmıştır. Bu hücreler bu nedenle, retinanın çoğunluğu (~% 70) oluşturan ve çünkü fotoreseptör işaretleyici seçildi, meydana herhangi bir hücre parçalanması büyük olasılıkla çubuk photore içerecektirreseptör. CRX mevcut soluk bir miktarı bile PCR 30 devir sonunda bu cDNA hazırlıklar sadece vardı. Son olarak, bu PCR bazlı ekranı cDNAlann bir tam mikroarray onlara tabi önce elde edilmiştir, belirli bir hücre tipinde hangi alt belirlemek için başlaması için kullanılabilir. Bu durum, bu işlemde en pahalı adım olarak, profilli edilir hücreleri öncelik yardımcı olabilir. Örneğin, gen Tachykinin1 (Şekil 3b) varlığı için bunları eleme tarafından retina ganglion hücrelerinin alt tanımlamışlardır. Küçük PCR tabanlı ekranından, özellikle tek hücreler seçilir ve onların DNA&#39;larının bir Affymetrix mikroarray için melezi. Mikroarray verileri karşılaştırılır ve desenleri standart kümeleme algoritmaları kullanarak tespit edilebilir. Şekil 4, bu gibi Heatmaps, grafiksel verileri temsil oluşturulur. Şekil tek hücre profil verileriyle ilgili iki ana sonucu vardır4. Tek hücre protokolü gerçekleştirildikten sonra İlk olarak, belirli bir hücre tipleri ifade genler de hücre tiplerinde in hemen hemen sadece bulunur. Bir hücre türü işaretleyici gen bipolar hücreleri ikinci hücre tipinde, bu ifadenin kolaylıkla in situ ya ile teyit edilir, daha düşük seviyede bir miktar &quot;çubuk&quot; genleri ifade böyle bir gözlem olarak ikinci bir hücre tipinde, de bulunan çoğu durumda hibridizasyon veya antikor boyama. İkincisi, daha çeşitli amacrine ve ganglion hücre profilleri içerisinde, gen ekspresyonu heterojenliği hemen belli olmaktadır. Nr4a2 ve Scube2 farklı amacrine hücrelerinde eksprese heterojen genin iki örneği ise Pou4f1, sadece, gelişmekte ganglion hücrelerinin yaklaşık 1/4 ile ifade edilir. Birkaç yüz genler gelişmekte ganglion hücrelerinin belirteçleri olarak da 2,4 amacrine farklı hücre popülasyonlarının belirteçler olarak tespit ve teyit edilmiş Aslında, İlgi haritası gösterilen genlerin sadece küçük bir örnek vardır. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig1.jpg" /> Şekil 1.. Tek hücre profilleme yönteminin akış şeması. İlk retina izole ve papain kullanarak tek tek hücrelerin içine ayrışmış bulunmaktadır. İkincisi, tek hücre çekti cam iğne ile hasat ve PCR tüpleri yatırılır. Hücreler parçalanır ve cDNA PCR ardından ters transkripsiyon kullanılarak amplifiye edilir. Sonuçta elde edilen cDNA bu kalitesi gösterildiği gibi bir agaroz jeli üzerine tespit edilir. Ilk şeride DNA merdiveni sonra, şerit medya denetimleri amplifikasyon ürünleri ile alternatif tek hücre (kırmızı parantez ile gösterilir) cDNA smear göstermektedir. Bu kalite (kırmızı parantez) lekeleri Affymetrix mikroarrayler için melezi. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig2.jpg" /> Şekil 2. Iğneler ve aspiratör boru montaj resimleri. Tek hücre içindeki kılcal eylem kullanılarak izole edilmiştircam mikropipet (iç çapı 0,5 mm, dış çapı 1.04 mm) çekti ve aspiratör içine şişirme basıncı ile aktarılır. Bu aspiratör borusu hem uzun hem de kolay işlemek için yeterli ve güvenilir tek tek hücrelerin yerine kadar kısa olması önemlidir. Bir iğne içine çekti kapiler tüpün bir yakın görünümünü B. gösterilir <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig3.jpg" /> Şekil 3. Tek hücre cDNA smear ve gen spesifik PCR Temsilcisi örneği. Amplifikasyon sonra cDNA tek hücre kalitesini belirlemek için, her bir hücre örneği 10 ul negatif kontrol (A) ile birlikte% 1 agaroz jelde yürütülmüştür. Bir smear 500-2000 bp arasında görünmelidir. Spesifik genler için ek PCR tabanlı tarama tanımlamak / izole edilmiş hücre tipi ve örnek kontaminasyon mevcut miktarı (B) onaylamak için yardımcı olabilir. Retina ganglion hücrelerinin spesifik primerler Brn3b markersve Pax6 bu hücreler (Sıralar 1 ve 2) kimliğini teyit etmek için test edildi. Hazırlanmasında fotoseptör kirlenme miktarını belirlemek için, işaretleyici fotoseptör CRX için spesifik primerlerin (sıra 3) kullanılmıştır. Ganglion hücrelerinin alt kümeleri ayrıca Tachykinin1 (Satır 4) gibi belirteçlerin taranması ile tespit edilebilir. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig4.jpg" /> Şekil 4. Işaretleyici gen ifadesi tek bir hücre. 22 ayrı tek hücrelerin içinde ifade seçilen genleri için mikroarray sonuçlar İlgi haritası biçimde gösterilmektedir. Mikroarray sinyallerinden şiddetleri kırmızı renk yoğunluğu ile karşılık ölçeklenir edilmiştir. Siyah mikroarray sinyal yokluğunda gösterir. Diğer yetişkin hücrelerin retina izole edildi sırasında gösterilen retina ganglion hücrelerinin (RGC) öncüleri, embriyonik zaman noktalarında izole edilmiştir.

<ol>
	<li>Tietjen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptional+analysis+of+neuronal+progenitors.">Single-cell transcriptional analysis of neuronal progenitors.</a> Neuron. 38, 161-175 (2003).</li><li>Trimarchi, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+heterogeneity+of+developing+retinal+ganglion+and+amacrine+cells+revealed+through+single+cell+gene+expression+profiling.">Molecular heterogeneity of developing retinal ganglion and amacrine cells revealed through single cell gene expression profiling.</a> J. Comp. Neurol. 502, 1047-1065 (2007).</li><li>Trimarchi, J. M., Cho, S. H., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+expressed+preferentially+in+the+developing+peripheral+margin+of+the+optic+cup.">Identification of genes expressed preferentially in the developing peripheral margin of the optic cup.</a> Dev. Dyn. 238, 2327-2327 (2009).</li><li>Cherry, T. J., Trimarchi, J. M., Stadler, M. B., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+diversification+of+retinal+amacrine+interneurons+at+single+cell+resolution.">Development and diversification of retinal amacrine interneurons at single cell resolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9495-9500 (2009).</li><li>Roesch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptome+of+retinal+Muller+glial+cells.">The transcriptome of retinal Muller glial cells.</a> J. Comp. Neurol. 509, 225-238 (2008).</li><li>Ramos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+diversity+in+transcriptional+profiles+of+single+hematopoietic+stem+cells.">Evidence for diversity in transcriptional profiles of single hematopoietic stem cells.</a> PLoS Genet. 2, e159 (2006).</li><li>Chiang, M. K., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcript+analysis+of+pancreas+development.">Single-cell transcript analysis of pancreas development.</a> Dev. Cell. 4, 383-393 (2003).</li><li>Trimarchi, J. M., Stadler, M. B., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+retinal+progenitor+cells+display+extensive+heterogeneity+of+gene+expression.">Individual retinal progenitor cells display extensive heterogeneity of gene expression.</a> PLoS ONE. 3, e1588 (2008).</li><li>Nelson, S. B., Sugino, K., Hempel, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+problem+of+neuronal+cell+types:+a+physiological+genomics+approach.">The problem of neuronal cell types: a physiological genomics approach.</a> Trends Neurosci. 29, 339-345 (2006).</li><li>Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+diversity:+too+many+cell+types+for+comfort.">Neuronal diversity: too many cell types for comfort.</a> Curr. Biol. 8, R708-R710 (1998).</li><li>Cepko, C. L., Austin, C. P., Yang, X., Alexiades, M., Ezzeddine, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+determination+in+the+vertebrate+retina.">Cell fate determination in the vertebrate retina.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 589-595 (1996).</li><li>Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+molecular+markers+of+bipolar+cells+in+the+murine+retina.">Identification of molecular markers of bipolar cells in the murine retina.</a> J. Comp. Neurol. 507, 1795-1810 (2008).</li><li>Chang, H. H., Hemberg, M., Barahona, M., Ingber, D. E., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+noise+controls+lineage+choice+in+mammalian+progenitor+cells.">Transcriptome-wide noise controls lineage choice in mammalian progenitor cells.</a> Nature. 453, 544-547 (2008).</li><li>Levsky, J. M., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+and+the+myth+of+the+average+cell.">Gene expression and the myth of the average cell.</a> Trends Cell Biol. 13, 4-6 (2003).</li><li>Livesey, F. J., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+neural+cell-fate+determination:+lessons+from+the+retina.">Vertebrate neural cell-fate determination: lessons from the retina.</a> Nat. Rev. Neurosci. 2, 109-118 (2001).</li><li>Masland, R. H., Raviola, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confronting+complexity:+strategies+for+understanding+the+microcircuitry+of+the+retina.">Confronting complexity: strategies for understanding the microcircuitry of the retina.</a> Annu. Rev. Neurosci. 23, 249-284 (2000).</li><li>Blackshaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+mouse+retinal+development.">Genomic analysis of mouse retinal development.</a> PLoS Biol. 2, e247 (2004).</li><li>Livesey, F. J., Young, T. L., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+gene+expression+program+of+mammalian+neural+progenitor+cells.">An analysis of the gene expression program of mammalian neural progenitor cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1374-1379 (2004).</li><li>Chowers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+genes+preferentially+expressed+in+the+retina+using+a+custom+human+retina+cDNA+microarray.">Identification of novel genes preferentially expressed in the retina using a custom human retina cDNA microarray.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 3732-3741 (2003).</li><li>Clarke, G. C., Leavitt, R. A., Andrews, B. R., Hayden, D. F., Lumsden, M. R., J, C., McInnes, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one-hit+model+of+cell+death+in+inherited+neuronal+degenerations.">A one-hit model of cell death in inherited neuronal degenerations.</a> Nature. 406, 195-199 (2000).</li><li>McEvoy, J. F. -. O., Zhang, J., Nemeth, J., Brennan, K., Bradley, R., Krafcik, C., Rodriguez-Galindo, F., Wilson, C., Xiong, M., Lozano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexpression+of+normally+incompatible+developmental+pathways+in+retinoblastoma+genesis.">Coexpression of normally incompatible developmental pathways in retinoblastoma genesis.</a> Cancer Cell. 20, 260-275 (2011).</li><li>Gelder, R. N. V. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA.">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1663-1667 (1990).</li><li>Ginsberg, S. D., Che, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profile+analysis+within+the+human+hippocampus:+comparison+of+CA1+and+CA3+pyramidal+neurons.">Expression profile analysis within the human hippocampus: comparison of CA1 and CA3 pyramidal neurons.</a> J. Comp. Neurol. 487, 107-118 (2005).</li><li>Iscove, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Representation+is+faithfully+preserved+in+global+cDNA+amplified+exponentially+from+sub-picogram+quantities+of+mRNA.">Representation is faithfully preserved in global cDNA amplified exponentially from sub-picogram quantities of mRNA.</a> Nat. Biotechnol. 20, 940-943 (2002).</li><li>Subkhankulova, T., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+linear+and+exponential+amplification+techniques+for+expression+profiling+at+the+single-cell+level.">Comparative evaluation of linear and exponential amplification techniques for expression profiling at the single-cell level.</a> Genome Biol. 7, R18 (2006).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Çalışmaların sürekli genişleyen sayısı, gen ekspresyon 6,8 açısından daha homojen olduğu inanılan toplumlarda sağlam hücreden hücreye değişkenliği ortaya koymaktadır. En az bir örneği olarak, bu gen ifadesi &quot;gürültü&quot; önemli bir biyolojik fonksiyonları 13 oynamak için gösterilmiştir. Tek tek hücreler arasında gen ekspresyonu farklılıklar geleneksel bütün doku yöntemleri kullanarak gizlenmiş edilir. Bu deneyler temsilcisi 14 olmayabilir &quot...

Reaction mixtures:
Cell Lysis buffer
<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &mu;</td>
			<td>10X reaction buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.23 &mu;l</td>
			<td>10% NP-40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.23 &mu;l</td>
			<td>0.1M DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05 &mu;l</td>
			<td>RNase Inhibitor (40 U/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05 &mu;l</td>
			<td>SUPERase-In (20U/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.13 &mu;l</td>
			<td>Modified Oligo d(T) primer 
			(TATAGAATTCGCGGCCGCTCGCGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.09 &mu;l</td>
			<td>dNTPs (2.5 mM each)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.27 &mu;l</td>
			<td>dH20 (use molecular biology grade for all reaction mixtures)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tailing Reaction Mixture
<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.18 &mu;l</td>
			<td>100 mM dATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 &mu;l</td>
			<td>10X reaction buffer(100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.62 &mu;l</td>
			<td>dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3 &mu;l</td>
			<td>TdT (400 U/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3 &mu;l</td>
			<td>RNase H (2 U/&mu;l)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
PCR Reaction Mixture
<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 &mu;l</td>
			<td>10x Ex-Taq HS Buffer with Mg2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &mu;l</td>
			<td>2.5 mM dNTPs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &mu;l</td>
			<td>Modified Oligo d(T) primer (10 &mu;g/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 &mu;l</td>
			<td>Ex-Taq HS Polymerase (5U/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>68.8 &mu;l</td>
			<td>dH2O</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
10X One-Phor All Buffer
<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M</td>
			<td>Potassium acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M</td>
			<td>Tris acetate (pH 7.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M</td>
			<td>Magnesium acetate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Solutions:
10X Phosphate buffered saline (1 liter)
80g NaCl 
2g KCl 
14.4 g Na2PO4 
2.4 g KH2PO4 
adjust to pH 7.4 with NaOH and bring the volume to 1 liter with water
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical needle puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 750</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary tubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0674</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assembly</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning filter tips (100-1000 &mu;l</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-265</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank's balanced salt solution (1X)</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>10-508F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer (1M)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>091688449</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04716728001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS03126</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript III</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>AM2682</td>
			<td>These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase-In</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>AM2694</td>
			<td>These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Oligo d(T) primer (gel purified)</td>
			<td>Oligos ETC</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>We have used primers purchased from many different companies and have seen the most reliable and reproducible results from Oligos ETC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 gene 32 protein</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0300L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0293S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TdT</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3 333 574</td>
			<td>As with other reagents, using a TdT enzyme from other companies gave more variable results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase H</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18021-014</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex-Taq HS Polymerase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR006A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin N6-ddATP</td>
			<td>Enzo Biosciences</td>
			<td>42809</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. Specific reagents and equipment.

single-cell profiling of developing and mature retinal neurons

Hücrelerin çok özel, ama son derece küçük popülasyonlarda çok dokuda önemli rol oynamaktadır. Son derece nadir hücre alt grupları için hücre türüne özgü marker ve gen ekspresyonu programlarının belirlenmesi standart bütün doku yaklaşımları kullanarak bir meydan okuma olmuştur. Bireysel hücre gen ifadesi profil toplam doku 1-7 sadece küçük bir yüzdesi ihtiva hücre tipleri için eşsiz erişim sağlar. Buna ek olarak, bu teknik geçici olarak dinamik bir gelişim geçişleri sırasında 8 hücreleri az sayıda cinsinden ifade edilmiştir gen ifadesi programları incelemek için kullanılabilir. Hücresel çeşitlilik Bu sorun nöronal bağlantıları 9 oldukça farklı hücreler arasında oluşabilir merkezi sinir sistemi (SSS) tekrar tekrar ortaya çıkar. Farklı hücre tipleri kesin sayısı tam olarak bilinmemektedir, ancak korteks i kadar 1000 farklı tipte olabileceği tahmin edilmektedirtself 10. Karmaşık sinirsel devrelerin fonksiyonu (ler) nadir görülen nöronal türleri ve bunların ifade genlerin bazı bağımlı olabilir. Yeni bir belirteç tanımlanması ve moleküler olarak farklı nöronların sınıflandırmak için yardımcı olarak, tek bir hücre yaklaşımı sinir sisteminde hücre tiplerinin analizi özellikle faydalıdır. Ayrıca nöronal progenitör gelişiminin erken aşamalarında Farklı olarak ifade genler ve gen yolları tespit ederek nöral gelişim mekanizmaları aydınlatmak için yardımcı olabilir. Önemli nöronal çeşitliliği ile basit, kolay erişilebilir dokusu gibi, gözdeki hücresel gelişim, nöronal farklılaşma ve nöronal çeşitlendirme süreçleri incelemek için mükemmel bir model sistemidir. Ancak, merkezi sinir sistemi diğer bölgelerinde olduğu gibi, bu hücresel çeşitlilik çubuk fotoreseptör ma makyaj özellikle göz önüne alındığında, belirli bir hücre kaderinin benimsemeye retina ataları sürücü genetik yollarının belirlenmesi için bir sorun olabilirtotal retina hücre popülasyonu 11 bununla birlikte, çoğunluk. Burada tek retina hücreleri (Şekil 1) ile ifade transkriptlerin belirlenmesi için bir yöntem sunulmaktadır. Tek-hücre profil tekniği retinanın 2,4,5,12 farklı hücresel popülasyonları içinde heterojenite Mevcut miktarının değerlendirilmesi için olanak sağlar. Buna ek olarak, bu yöntem hücre kaderinin retina progenitör hücrelerin alt 8 meydana karar alma süreçlerinde rol (ler) oynayabilir yeni aday genler bir dizi ortaya çıkarmıştır. Protokolü için bazı basit ayarlamalar ile, bu teknik birçok farklı doku ve hücre tipleri için kullanılabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons at JoVE.com

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Tek retina hücreleri ve bunların cDNAlann sonraki amplifikasyon izolasyonu için bir yöntem tarif edilmiştir. Tek hücreli transkriptomik bir dokusunda hücresel heterojenite mevcut derecesini ortaya koymaktadır ve nadir hücre popülasyonu için yeni belirteç genlerin ortaya çıkarır. Beraberindeki protokol birçok farklı hücre tiplerine uyacak şekilde ayarlanabilir.

Gelişen ve Olgun Retina Nöronlar Tek hücreli Profilleme

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

single-cell-profiling-of-developing-and-mature-retinal-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.1K Görüntüleme.  Iowa State University. Tek retina hücreleri ve bunların cDNAlann sonraki amplifikasyon izolasyonu için bir yöntem tarif edilmiştir. Tek hücreli transkriptomik bir dokusunda hücresel heterojenite mevcut derecesini ortaya koymaktadır ve nadir hücre popülasyonu için yeni belirteç genlerin ortaya çıkarır. Beraberindeki protokol birçok farklı hücre tiplerine uyacak şekilde ayarlanabilir.

Video: Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Patch Kelepçe bir Karanlık adapte Dilim Hazırlık Fare Retina Nöronlar Kayıtlar

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Nörobilim

Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, difficult to separate and also not easily identified by their morphology. Thus, it is often difficult to analyze gene expression in a specific neuron type. Here we document a procedure that combines whole-cell patch clamp recording techniques with single-cell reverse transcription polymerase chain reaction (scRT-PCR) to profile mRNA expression in different types of neurons in the substantial nigra. Electrophysiological techniques are first used to record the neurophysiological and functional properties of individual neurons. Then, the cytoplasm of single electrophysiologically characterized nigral neurons is aspirated and subjected to scRT-PCR analysis to obtain mRNA expression profiles for neurotransmitter synthesis enzymes, receptors, and ion channels. The high selectivity and sensitivity make this method particularly useful when immunohistochemistry can not be used due to a lack of suitable antibody or low expression level of the protein. This method is also applicable to neurons in other brain areas.

Neurons are first characterized electrophysiologically. Then the cytoplasm from the recorded neuron is aspirated and subjected to reverse transcription-PCR analysis to detect the expression of mRNAs for neurotransmitter synthesis enzymes, ion channels, and receptors.

Voltaj-kapılı potasyum Kanal mRNA gösterilmeden Tek hücreli RT-PCR teknikleri kullanarak Nigral Nöronlar

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic transmission. Increasing evidence indicates that gap junctions not only permit electrical current flow and synchronous activity between interconnected or coupled cells, but that the strength or effectiveness of electrical communication between coupled cells can be modulated to a great extent1,2. In addition, the large internal diameter (~1.2 nm) of many gap junction channels permits not only electric current flow, but also the diffusion of intracellular signaling molecules and small metabolites between interconnected cells, so that gap junctions may also mediate metabolic and chemical communication. The strength of gap junctional communication between neurons and its modulation by neurotransmitters and other factors can be studied by simultaneously electrically recording from coupled cells and by determining the extent of diffusion of tracer molecules, which are gap junction permeable, but not membrane permeable, following iontophoretic injection into single cells. However, these procedures can be extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural tissue.
Numerous studies on electrical synapses and the modulation of electrical communication have been conducted in the vertebrate retina, since each of the five retinal neuron types is electrically connected by gap junctions3,4. Increasing evidence has shown that the circadian (24-hour) clock in the retina and changes in light stimulation regulate gap junction coupling3-8. For example, recent work has demonstrated that the retinal circadian clock decreases gap junction coupling between rod and cone photoreceptor cells during the day by increasing dopamine D2 receptor activation, and dramatically increases rod-cone coupling at night by reducing D2 receptor activation7,8. However, not only are these studies extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural retinal tissue, but it can be difficult to adequately control the illumination conditions during the electrophysiological study of single retinal neurons to avoid light-induced changes in gap junction conductance.
Here, we present a straightforward method of determining the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons under different illumination conditions and at different times of the day and night. This cut-loading technique is a modification of scrape loading9-12, which is based on dye loading and diffusion through open gap junction channels. Scrape loading works well in cultured cells, but not in thick slices such as intact retinas. The cut-loading technique has been used to study photoreceptor coupling in intact fish and mammalian retinas7, 8,13, and can be used to study coupling between other retinal neurons, as described here.

An easy and convenient method to determine the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons is described. This technique enables one to investigate the function of the electrical synapses between neurons in the intact retina under different illumination conditions and at different times of the day and night.

Cut-yükleme: Retina Nöronlar arasında Gap Junction Tracer Kaplin Kapsamı incelenmesi için yararlı bir araçtır

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

One of the central tasks in retinal neuroscience is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are responsible for shaping the signals transmitted to the brain. Photons are detected in the retina by rod and cone photoreceptors, which convert that energy into an electrical signal, transmitting it to other retinal neurons, where it is processed and communicated to central targets in the brain via the optic nerve. Important early insights into retinal circuitry and visual processing came from the histological studies of Cajal1,2 and, later, from electrophysiological recordings of the spiking activity of retinal ganglion cells - the output cells of the retina3,4.
A detailed understanding of visual processing in the retina requires an understanding of the signaling at each step in the pathway from photoreceptor to retinal ganglion cell. However, many retinal cell types are buried deep in the tissue and therefore relatively inaccessible for electrophysiological recording. This limitation can be overcome by working with vertical slices, in which cells residing within each of the retinal layers are clearly visible and accessible for electrophysiological recording.
Here, we describe a method for making vertical sections of retinas from larval tiger salamanders (Ambystoma tigrinum). While this preparation was originally developed for recordings with sharp microelectrodes5,6, we describe a method for dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells in which we manipulate the photoreceptor's membrane potential while simultaneously recording post-synaptic responses in horizontal or bipolar cells. The photoreceptors of the tiger salamander are considerably larger than those of mammalian species, making this an ideal preparation in which to undertake this technically challenging experimental approach. These experiments are described with an eye toward probing the signaling properties of the synaptic ribbon - a specialized synaptic structure found in a only a handful of neurons, including rod and cone photoreceptors, that is well suited for maintaining a high rate of tonic neurotransmitter release7,8 - and how it contributes to the unique signaling properties of this first retinal synapse.

We describe the preparation of thin retinal slices from aquatic tiger salamanders (Ambystoma tigrinum) and explain how we use these slices to study synaptic processing in the retina by obtaining dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells.

Bir Amfibi Retina Dilim hazırlanması Fotoreseptörler ve İkinci dereceden nöronlar eş zamanlı tam hücreli Kayıtlar

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for the improved understanding of neuronal diversity, it is important to identify genes whose expression defines various subpopulations of cells. The retina serves as an excellent model for the study of central nervous system diversity, as it is composed of multiple major cell types. The study of each major class of cells has yielded genetic markers that facilitate the identification of these populations. However, multiple subtypes of cells exist within each of these major retinal cell classes, and few of these subtypes have known genetic markers, although many have been characterized by morphology or function. A knowledge of genetic markers for individual retinal subtypes would allow for the study and mapping of brain targets related to specific visual functions and may also lend insight into the gene networks that maintain cellular diversity. Current avenues used to identify the genetic markers of subtypes possess drawbacks, such as the classification of cell types following sequencing. This presents a challenge for data analysis and requires rigorous validation methods to ensure that clusters contain cells of the same function. We propose a technique for identifying the morphology and functionality of a cell prior to isolation and sequencing, which will allow for the easier identification of subtype-specific markers. This technique may be extended to non-neuronal cell types, as well as to rare populations of cells with minor variations. This protocol yields excellent-quality data, as many of the libraries have provided read depths greater than 20 million reads for single cells. This methodology overcomes many of the hurdles presented by Single-cell RNA-Seq and may be suitable for researchers aiming to profile cell types in a straightforward and highly efficient manner.

Here, we present a combinatorial approach for classifying neuronal cell types prior to isolation and for the subsequent characterization of single-cell transcriptomes. This protocol optimizes the preparation of samples for successful RNA Sequencing (RNA-Seq) and describes a methodology designed specifically for the enhanced understanding of cellular diversity.

Retinal Ganglion Hücrelerinin Tanımlanmış Alt Kümelerinin Tek Hücreli RNA-Seqi

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

Yetişkin omurilik çekirdeği yalıtım kitlesel paralel tek-çekirdek RNA sıralama için

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing platforms process all input cells indiscriminately. Sometimes, fluorescence-activated cell sorting (FACS) is used upstream to isolate a specifically labeled population of interest. A limitation of FACS is the need for high numbers of input cells with significantly labeled fractions, which is impractical for collecting and profiling rare or sparsely labeled neuron populations from the mouse brain. Here, we describe a method for manually collecting sparse fluorescently labeled single neurons from freshly dissociated mouse brain tissue. This process allows for capturing single-labeled neurons with high purity and subsequent integration with an in vitro transcription-based amplification protocol that preserves endogenous transcript ratios. We describe a double linear amplification method that uses unique molecule identifiers (UMIs) to generate individual mRNA counts. Two rounds of amplification results in a high degree of gene detection per single cell.

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

This protocol describes the manual sorting procedure to isolate single fluorescently labeled neurons followed by in vitro transcription-based mRNA amplification for high-depth single-cell RNA sequencing.

Tek hücreli RNA sıralama Fluorescently etiketli fare nöronların el ile sıralama ve çift Vitro transkripsiyon mutlak sayar (DIVA-Seq) sıralama kullanarak

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.

Immünhistokimya için fare retinal Cryo-bölümler hazırlanması

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding environment and initiate contacts with potential synaptic partners. Although the connection between dendritic branch dynamics and synaptogenesis is well established, how developmental and activity-dependent processes regulate dendritic branch dynamics is not well understood. This is partly due to the technical difficulties associated with the live imaging and quantitative analyses of these fine structures using an in vivo system. We established a method to study dendrite dynamics using Drosophila larval ventral lateral neurons (LNvs), which can be individually labeled using genetic approaches and are accessible for live imaging. Taking advantage of this system, we developed protocols to capture branch dynamics of the whole dendritic arbor of a single labeled LNv through time-lapse live imaging. We then performed post-processing to improve image quality through drift correction and deconvolution, followed by analyzing branch dynamics at the single-branch level by annotating spatial positions of all branch terminals. Lastly, we developed R scripts (Supplementary File) and specific parameters to quantify branch dynamics using the coordinate information generated by the terminal tracing. Collectively, this protocol allows us to achieve a detailed quantitative description of branch dynamics of the neuronal dendritic arbor with high temporal and spatial resolution. The methods we developed are generally applicable to sparsely labeled neurons in both in vitro and in vivo conditions.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Here, we describe the method we employed to image highly motile dendritic filopodia in a live preparation of the Drosophila larval brain, and the protocol we developed to quantify time-lapse 3D imaging datasets for quantitative assessments of dendrite dynamics in developing neurons.

Drosophila Nöronlarının Geliştirilmesinde Hızlı Dendritik Dal Dinamiğinin Hızlandırılmış Canlı Görüntüleme ve Nicelleştirilmesi

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a single-cell electroporation technique that maximizes the efficiency (~80%) of in vitro gene transfection in excitatory and class-specific inhibitory neurons in mouse organotypic hippocampal slice culture. Using large glass electrodes, tetrodotoxin-containing artificial cerebrospinal fluid and mild electrical pulses, we delivered a gene of interest into cultured hippocampal CA1 pyramidal neurons and inhibitory interneurons. Moreover, electroporation could be carried out in cultured hippocampal slices up to 21 days in vitro with no reduction in transfection efficiency, allowing for the study of varying slice culture developmental stages. With interest growing in examining the molecular functions of genes across a diverse range of cell types, our method demonstrates a reliable and straightforward approach to in vitro gene transfection in mouse brain tissue that can be performed with existing electrophysiology equipment and techniques.

Presented here is a protocol for single-cell electroporation that can deliver genes in both excitatory and inhibitory neurons across a range of in vitro hippocampal slice culture ages. Our approach provides precise and efficient expression of genes in individual cells, which can be used to examine cell-autonomous and intercellular functions.

Fare Hipokampal Uyarıcı ve Sınıfa Özgü inhibitör Nöronların Farklı Organotipik Dilim Kültürü boyunca Tek Hücreli Elektroporasyon

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...