Yazarlar fikirli tartışmalar için Prof Frederic Geissmann ve Prof Christian Schulz&#39;a teşekkür ederler; Makale eleştirel okuma Dr Hannah Garner, Xavier Montagutelli ve Dr Jean Jaubert ve fare yetiştirme desteği Institut Pasteur hayvan tesisi personeli; Ve Pascal Dardenne ve Vytaute Boreikaite, bir Amgen Bursiyeri, teknik yardımları için. EGP laboratuarında yapılan araştırmalar, Institut Pasteur, CNRS, Cercle FSER (FRM ve Institut Pasteur ve REVIVE konsorsiyumundan bir başlangıç ​​paketi) tarafından finanse edilmektedir.LI, REVIVE konsorsiyumundan bir doktora bursuyla desteklenmektedir.

Hayvan prosedürleri Institut Pasteur (CETEA) onaylı kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesine uygun olarak gerçekleştirildi. 1. Csf1r MeriCreMer Rosa LSL-YFP Embriyolarında Utero Pulse Etiketleme <ol><li> Stok solüsyonu 4-hidroksitamoksifen (OH-TAM, 50 mg / mL) hazırlayın. <ol><li> Fümhür altında, 25 mg OH-TAM şişesini açın ve 250 μL etanol (% 100) ekleyin. </li><li> OH-TAM solüsyonunu 2 mL&#39;lik bir mikrosantrifüj tüpüne, kesilmiş uç ve 10 dakika boyunca maksimum hızda girdapla aktarın. </li><li> Sonikatör banyosunda 30 dakika sonikletin. </li><li> 50 mg / mL stok solüsyonu elde etmek için fümhid altında 250 μL PEG-35 hint yağı ekleyin. NOT: PEG-35 hint yağı, hidrofobik molekülleri bağlayan ve bunları sulu çözücüler içerisinde çözündüren amfifilik özelliklere sahip bir solventtir. </li><li> Yaklaşık 5 dakika boyunca girdapBir sonikatör banyosunda 30 dakika sonikasyon yapın. </li><li> Mikro santrifüj tüpü başına 90 μL (4.5 mg) (enjeksiyon başına 1 alikot). </li><li> Daha önce tarif edildiği gibi 1 hafta boyunca 4 ° C&#39;de veya uzun süre -20 ° C&#39;de saklayın 13 . </li></ol></li><li> Progesteron stok solüsyonu hazırlayın (10 mg / mL) <ol><li> Fumefood altında 10 mg / 100 μL süspansiyon hazırlamak için 25 mg progesterona 250 μL% 100 etanol ilave edin. Hafifçe girdap. </li><li> Kaputun altında 10 mg / ml progesteron solüsyonu yapmak için 2250 μL otoklavlanmış ayçiçeği yağı ekleyin. </li><li> Maksimum hızda yaklaşık 5 dakika boyunca girdap, alikot ve 4 ° C&#39;de saklayın. Saklandığında çözümün net olduğunu unutmayın. </li></ol></li><li> Tamoksifen uygulaması NOT: Embriyonik gelişim, embriyonik gün (E) 0.5 olarak vajinal fiş oluşum gününü dikkate alarak tahmin edilmiştir. Rekombinasyon, E8.5&#39;deki tek enjeksiyon ile indüklenirGebe Csf1r MeriCreMer dişilere 12 . Tamoksifen uygulamasından sonra kürtaj oranlarını düşürmek için OH-TAM&#39;ı 37.5 μg g Progesteron ile tamamlayın. Saat 13&#39;te enjekte edin (sabah gözlemlenen vajinal tıkaç için). <ol><li> Enjeksiyon sabahı, OH-TAM solüsyonunun bir alikotunu 10 dakika boyunca sonike (veya tamamen yeniden süspansiyona alınana kadar) sonike hale getirin. </li><li> 10 mg / mL OH-TAM solüsyonu elde etmek için fümehood altında 360 uL NaCl% 0.9 oranında ilave edin ve iyice girdaplayın. Solüsyon berraklaşıncaya ve tamamen yeniden süspansiyona alıncaya kadar sonikasyon yapın (en az 30 dakika). </li><li> Progesteronu oda sıcaklığına ısıtın. </li><li> Bir mikrosantrifüj tüpünde 450 μL OH-TAM ve 225 μL progesteron karıştırın. Girdap. </li><li> En az 10 dakika Sonike edin ve 25G&#39;lik bir iğne ile 1 mL şırıngaya yükleyin. </li><li> Hayvan tesislerinde, hamile kadın ağırlığındadır ( Csf1r MeriCreMer dişiler, yakın bir FVB genetik altyapısına sahiptir ve tipik ağırlığıEn 25 ve 33 g). </li><li> Hesaplanan hacmi fare içine yavaş yavaş enjekte ederek bir intra-peritoneal enjeksiyon uygulayın. İğneyi çektikten sonra, delici yarayı hafifçe bastırın ve karın bölgesine OH-TAM&#39;ı dağıtmak için masaj yaptırın. NOT: OH-TAM enjeksiyon dozu 75 mg / kg&#39;dır ve Progesteron dozu 37.5 mg / kg&#39;dır. Tablo 1 , hamile dişilere enjekte edilecek hacmi göstermektedir. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Fare ağırlığı (g) </td><td> Karışımdan enjekte edilecek toplam hacim (μL) </td></tr><tr><td> 25 </td><td> 281 </td></tr><tr><td> 26 </td><td> 292 </td></tr><tr><td> 27 </td><td> 303 </td></tr><tr><td> 28 </td><td> 315 </td></tr><tr><td> 29 </td><td> 326 </td></tr><tr><td> 30 </td><td> 338 </td></tr><tr><td> 31 </td><td> 348 </td></tr><tr><td> 32 </td><td> 360 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> 33 </td><td> 371 </td></tr><tr><td> 34 </td><td> 382 </td></tr><tr><td> 35 </td><td> 394 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: 4-OH-tamoksifenin (OH-TAM) enjeksiyon hacmi. E8.5&#39;de tek bir enjeksiyon için hacim başına 75 μg (vücut ağırlığı) OH-TAM&#39;ın, g progesteron başına 37.5 μg takviye edilmesi için gereken hacim. 2. Yolk Sac (YS) ve Fetal Karaciğerin (FL) Diseksiyonu NOT: Embriyoları manipüle ederken, uzun vadeli kültür için kullanılacaksa, sert steril teknikler gerekli değildir. Yine de, çalışma alanı temiz ve emici kağıtların altında folyo ile kaplanmalıdır. <ol><li> Buz gibi fosfat tamponlu salin (PBS) ve sindirim karışımı (1 mg / mL kollajenaz D, 100 U / mL Deoksiribonükleaz I (DNase I) ve% 3 fetal sığır serumu içeren PBS) hazırlayın. </li><li> Hamile dişileri kurbanla öldürmekGerekli gebelik haftasında vikal çıkık ( örn. Embriyonik evre E10.5). </li><li> Cildi sadece cinsel organların üzerine sıkıştırın ve orta hattında makasla küçük bir kesi yapın. Kürk olmaksızın vücut duvarını tamamen ortaya çıkarmak için deriyi başa doğru çekin. İç organları ortaya çıkarmak için karın kaslarını kesin ve iki uterus boynuzunu ortaya çıkarmak için bağırsağa basın. </li><li> Orta büyüklükte künt forseps ile, yumurtalıktaki yağ bandını tutun ve hafifçe uterusu çekin. Uterus boynuzlarının servikal seviyesinden kesin ve boynuzları periton boşluğundan kaldırın. Uterus boynuzlarını tamamen boşaltmak için yağ yastığını çıkarın ve boynuzları her iki yanındaki yumurtalıktan kesin. </li><li> Boynuzları 10 mm&#39;lik bir Petri kabında buz gibi soğuk PBS&#39;ye koyun. Bir ucunda (rahim ağzı) uterus kas katmanlarını hızlı bir şekilde tutun ve embriyoları çevreleyen desidual dokuyla serbest bırakmak için kas tabakası ile desidual doku arasında ince makasları kaydırın. NOT: Kas hızla daralma eğilimi gösterirR ekstraksiyon, bu nedenle bu adım mümkün olduğunca çabuk olmalı. </li><li> Reichert zarı ve plasentayı kesmek için bir çift ince forseps kullanın. </li><li> Yumruk yumurta sarısını çıkarın ve 0.5 mL sindirim karışımı ile 24-iyi bir doku kültürü plakasına yerleştirin. NOT: Bu aşamada, embriyonik kan toplanabilir. <ol><li> Göbek ve vitellin damarlarını kestikten hemen sonra embriyo, 10 mM buz soğukluğunda etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içeren 12 yuvalı bir doku kültürü plakasına aktarın. Embriyo keskin ince makas kullanarak dekapitasyon, mümkün olduğunca çok sayıda doku dilatasyonu sınırlamaya çalışıyorum. Buz üzerinde 10-15 dakika inkübe edin ve kan içeren EDTA toplamak. </li></ol></li><li> Embriyo çevreleyen amniyon kaldırın. </li><li> Aşamalar &lt;E11.5 için, embriyoların daha iyi evrelemesi için somit çiftlerinin sayısını ve daha iyi bir zaman çözünürlüğü sayılayın (her bir somite çift, ~ 1 saat 30 dakika içinde gelişir). </li><li> Embriyonun başını kesin.Forseps veya ince makas. Başlığı, 0.5 mL&#39;lik sindirim karışımı ile 24 gözlü bir plakaya aktarın. NOT: Daha sonraki evrelerde nöroektoderm ve beyin, akış sitometrisi analizi için ayrılmıştır; Çevresindeki vasküler pleksus dikkatle çıkarın. </li><li> Embriyonu arka bacağın üstünden kesin ve forelimbleri çıkarın. </li><li> Karaciğerin izolasyonu için ince bir forseps kullanarak toraks açın. Anterior kalbe tutturun ve organları vücuttan kurtarmak için ikinci forsepsi kullanırken nazikçe çekin. <ol><li> Fetal karaciğeri kalpten ve bağırsaklardan dikkatlice ayırın. Fetal karaciğeri, 0.5 mL&#39;lik sindirim karışımı ile 24 gözlü bir plakaya aktarın. Diseksiyon mikroskopu altında transferi dikkatle izleyin. </li></ol></li><li> Polimeraz zincir reaksiyonu tahlili (PCR) ile genotiplendirme için kuyruk bölgesini (veya herhangi bir başka embriyo parçasını) toplayın. NOT: Diğer doku ve organlar akış sitometrisi kullanılarak benzer bir analiz için E10.5 embriyolarından hasat edilebilir. Kan, kafa kayağıN, aorta-gonad-mesonefros bölgesi (AGM), kalp ve nöroektoderm, E10.5&#39;te toplanabilir. Daha sonraki aşamalarda, akciğer, böbrek, dalak ve pankreas da toplanabilir. AGM&#39;nin farklı gelişim aşamalardaki diseksiyonunun ayrıntılı bir tarifi daha önce 14 açıklanmıştır. </li></ol> 3. Akış Sitometrisi için Embriyonik Dokuların İşlenmesi <ol><li> Organları (sindirim karışımına yerleştirilir) 37 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edin. </li><li> 6 ml FACS tamponu (1x PBS&#39;de% 0.5 Sığır Serum Albümini (BSA) ve 2 mM EDTA) ile dolu bir 6 oyuklu doku kültürü plakasına yerleştirilmiş 100 mikron süzgece doku ve enzimatik solüsyon aktarın. Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için 2 mL&#39;lik şırınganın siyah lastik pistonuyla hafifçe harmanarak mekanik olarak ayırın. NOT: Bundan böyle, tüm basamaklar 4 ° C&#39;de yapılmalıdır. </li><li> Bir Pasteur pipet ile hücre süspansiyonu toplayın ve 15 mL tüp içine aktarın. </li><li> SpiN, 7 dakika süreyle 320 xg&#39;de 4 ° C&#39;de. Süpernatantı özlemle atın. </li><li> Pelet 60 μL Fc-bloke edici tampon (CD16 / CD32, FACS tamponu içinde 1/50 oranında seyreltilmiş antikor engelleme) içinde tekrar süspanse edin. <ol><li> Bir yuvarlak tabanlı 96 çok oyuklu plakaya tek tek hücre süspansiyonu başına 50 mcL aktarın. Buz üzerinde en az 15 dakika inkübe edin. NOT: Az miktarda numuneyi tutarken boyama 5 mL polistiren FACS tüplerinde de yapılabilir. </li><li> Her dokudan alınan örneklerin bir havuzunu elde etmek için geri kalan 10 mcL&#39;yi 5 mL&#39;lik bir polistiren FACS tüpüne aktarın. Bu havuz, kontrol (yani, boyanmamış örnekler ve her florokrom floresan eksi bir (FMO) kontrol) olarak hizmet edecektir. 96 çoklu kuyucuklu plakaya her flüoresan eksi bir (FMO) kontrol için (florokrom başına bir) 50 mcL havuz aktarın. NOT: Her bir FMO kontrolü, antikor panelindeki tüm florokrom çiftli antikorları içerir;Bu ölçülüyor. FMO&#39;lar kapı sınırlarını tanımlamak ve çok renkli panellerde spektral örtüşmeyi kontrol etmek için kullanılır. Farklı dokulardaki arka plandaki ve otofloresansdaki değişimleri doğru bir şekilde ele almak için, bu kontrolleri her dokudaki örnek havuzundan hazırlamak önemlidir. YFP ifadesi için uygun kontrol, Cre-negatif embriyoların PCR genotiplemesi ile teyit edilen örnekleri olacaktır. </li></ol></li></ol> 4. Yüzey Antijen Boyaması <ol><li> Antikor karışımı FACS tamponunda hazırlayın (Tablo 2). Her numune için 50 uL antikor karışımı hazırlayın. <ol><li> Aşağıdaki florokrom bağlı antikorları kullanın: anti-CD45.2 (klon 104); Anti-CD11b (klon M1 / ​​70); Anti-F4 / 80 (klon BM8); Anti-AA4.1 (klon AA4.1); Anti-Kit (klon 2B8); Ve anti-Ter119 (klon Ter119). </li><li> FACS tamponundaki FMO kontrolleri için altı antikor karışımı hazırlayın. Kontrol numunesi başına antikor karışımı 50 mcL hazırlayın. YOK HAYIRTE: Antikor karışımındaki antikor seyreltmesi, malzeme tablosunda belirtilen son konsantrasyondan iki kat fazla konsantre. Altı florokroma bağlanmış antikor içeren bir panel için, 6 FMO kontrolü hazırlandı. Tablo 2 , bir tüp için antikor karışımı ve FMO kontrollerinin bileşimini sağlar. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="7"> Antikorun hacmi (μL) (Nihai Hacim 50 uL) </td></tr><tr><td> Antikor </td><td> Klon </td><td> Antikor Karışımı </td><td> FMO CD45.2 </td><td> FMO CD11b </td><td> FMO F4 / 80 </td><td> FMO AA4.1 </td><td> FMO Kiti </td><td> FMO Ter119 </td></tr><tr><td> Anti-CD45.2 </td><td> 104 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Anti-CD 11 b </td><td> M1 / 70 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> Anti-F4 / 80 </td><td> BM8 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Anti-AA4.1 </td><td> AA4.1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Anti-Kit </td><td> 2B8 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> Anti-Ter119 </td><td> Ter119 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="2"> FACS tamponu </td><td> 45,5 </td><td> 46.5 </td><td> 46 </td><td> 46.5 </td><td> 46.5 </td><td> 46 </td><td> 46 </td></tr></tbody></table>Tablo 2: Boyama için kullanılan antikorların hacmi ve Floresan eksi bir (FMO) kontroller. Nihai 50 μL hacim için gereken antikorun hacmi (μL). <ol start="2"><li> 96-çoklu plaka numunelerine antikor karışımı 50 mcL ekleyin (boyama sırasında son hacim 100 mcL&#39;dir). Yavaşça iki kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve 30 dakika boyunca buzda inkübe edin. </li><li> 96-çoklu plakayı 4 ° C&#39;de 320 xg&#39;de 7 dakika döndürün ve süpernatanı atın. 200 μL FACS tamponuna tekrar süspanse edin. </li><li> Tekrar yıkama prosedürünü (adım 4.3) 150 μL FACS tamponu ile tekrarlayın. </li><li> Numuneleri ve kontrolleri (FMO&#39;lar ve renksiz havuz örnekleri) 70 um&#39;lik süzgeçten geçirerek 5 ml&#39;lik polistiren tüplerine süzün. Kazanıncaya kadar buzda saklayın. </li></ol> 5. ÇYP&#39;lerin ve YS kaynaklı makrofajların Akış Sitometri ile tanımlanması NOT: Bu protokol, bir 4 lazer akış sitometresi eq405 nm Violet lazer, 488 nm Blue lazer, 562 nm Yellow lazer ve 638 nm Red lazer ile empoze edildi. <ol><li> Üreticinin talimatları uyarınca her bir birleştirilmiş antikor için kompozisyon boncukları hazırlayın. Lazer yoğunluklarını optimize etmek için renklendirilmemiş örnekler ve kompozisyon boncukları kullanın. </li><li> Kapı sınırlarını belirlemek için, her bir antikor için FMO (Floresans eksi bir) kontrolleri kullanın. </li><li> Ölü hücreleri dışarıda bırakmak için, edinme işleminden 1 dakika önce tüpe (200 uL boyanmış hücre süspansiyonu içeren) 1 mL&#39;lik DAPI (1 mg / ml) ekleyin. Ölü hücrelerin ve enkazın hariç tutulmasını gerçekleştirmek için güçlü DAPI sinyalini ve ileri dağılmış parametreyi (FSC) kullanın. NOT: edinme sırasında kapıları çizmek için akış sitometresinden yazılım kullanın. Tazminat matrisi ve analizi, piyasada bulunan diğer yazılımları kullanarak numune alımından sonra gerçekleştirilebilir. </li><li> Toplam olaylardan canlı hücre ve ikili ayrımcılık yapmak için ileri ve yan saçılım (FSC vs SSC) kullanın. </li><li> Log-ölçekli eksende floresan nokta çizelgeleri oluşturun ve kızıl kapıları çizin, önce eritrositler hariç tutun (Ter119 + ) ve daha sonra progenitör hücreleri (Kit + ) ve hematopoietik hücreleri (CD45 + Kit negatif ) tanımlayın (Bkz. Şekil 1 ). </li><li> YS ( Şekil 2 ), fetal karaciğer ( Şekil 3 ) ve beyindeki ( Şekil 4 ) farklı tanımlanan popülasyonlar arasında YFP&#39;nin etiketleme verimliliğini ölçmek için floresan histogramları oluşturun. </li></ol>

<ol>
	<li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+pathways+to+mature+macrophages+in+the+early+mouse+yolk+sac.">Three pathways to mature macrophages in the early mouse yolk sac.</a> Blood. 106 (9), 3004-3011 (2005).</li><li>Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+erythroid+and+myeloid+progenitors+in+the+yolk+sac+and+embryo+proper+of+the+mouse.">Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse.</a> Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).</li><li>Chen, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythroid/myeloid+progenitors+and+hematopoietic+stem+cells+originate+from+distinct+populations+of+endothelial+cells.">Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).</li><li>Frame, J. M., Fegan, K. H., Conway, S. J., McGrath, K. E., Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitive+Hematopoiesis+in+the+Yolk+Sac+Emerges+from+Wnt-Responsive+Hemogenic+Endothelium+Independently+of+Circulation+and+Arterial+Identity.">Definitive Hematopoiesis in the Yolk Sac Emerges from Wnt-Responsive Hemogenic Endothelium Independently of Circulation and Arterial Identity.</a> Stem Cells. , (2015).</li><li>Kieusseian, A., Brunetdela de la Grange, P., Burlen-Defranoux, O., Godin, I., Cumano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immature+hematopoietic+stem+cells+undergo+maturation+in+the+fetal+liver.">Immature hematopoietic stem cells undergo maturation in the fetal liver.</a> Development. 139 (19), 3521-3530 (2012).</li><li>Gomez Perdiguero, ., E, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages+originate+from+yolk-sac-derived+erythro-myeloid+progenitors.">Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors.</a> Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).</li><li>Hoeffel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-Myb(+)+erythro-myeloid+progenitor-derived+fetal+monocytes+give+rise+to+adult+tissue-resident+macrophages.">C-Myb(+) erythro-myeloid progenitor-derived fetal monocytes give rise to adult tissue-resident macrophages.</a> Immunity. 42 (4), 665-678 (2015).</li><li>Kierdorf, K., Prinz, M., Geissmann, F., Gomez Perdiguero, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+function+of+tissue+resident+macrophages+in+mice.">Development and function of tissue resident macrophages in mice.</a> Semin Immunol. 27 (6), 369-378 (2015).</li><li>Houssaint, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+the+mouse+hepatic+primordium.+II.+Extrinsic+origin+of+the+haemopoietic+cell+line.">Differentiation of the mouse hepatic primordium. II. Extrinsic origin of the haemopoietic cell line.</a> Cell Differ. 10 (5), 243-252 (1981).</li><li>Cumano, A., Godin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+the+hematopoietic+system.">Ontogeny of the hematopoietic system.</a> Annu Rev Immunol. 25, 745-785 (2007).</li><li>McGrath, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Sources+of+Hematopoietic+Progenitors+Emerge+before+HSCs+and+Provide+Functional+Blood+Cells+in+the+Mammalian+Embryo.">Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo.</a> Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).</li><li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells.">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li><li>Chevalier, C., Nicolas, J. F., Petit, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+delivery+of+4-hydroxy-tamoxifen+for+clonal+and+polyclonal+labeling+of+cells+of+the+surface+ectoderm,+skin,+and+hair+follicle.">Preparation and delivery of 4-hydroxy-tamoxifen for clonal and polyclonal labeling of cells of the surface ectoderm, skin, and hair follicle.</a> Methods Mol Biol. 1195, 239-245 (2014).</li><li>Bertrand, J. Y., Giroux, S., Cumano, A., Godin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+development+during+mouse+embryogenesis.">Hematopoietic stem cell development during mouse embryogenesis.</a> Methods Mol Med. 105, 273-288 (2005).</li><li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+purified+intraembryonic+hematopoietic+stem+cells+as+a+tool+to+define+their+site+of+origin.">Characterization of purified intraembryonic hematopoietic stem cells as a tool to define their site of origin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 134-139 (2005).</li><li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+analysis+reveals+that+adult+microglia+derive+from+primitive+macrophages.">Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.</a> Science. 330 (6005), 841-845 (2010).</li><li>Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+tamoxifen-regulated+Cre+activity+in+mice+using+a+cartilage-specific+CreER(T)+to+assay+temporal+activity+windows+along+the+proximodistal+limb+skeleton.">Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton.</a> Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).</li><li>Qian, B. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL2+recruits+inflammatory+monocytes+to+facilitate+breast-tumour+metastasis.">CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis.</a> Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).</li><li>Yona, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+reveals+origins+and+dynamics+of+monocytes+and+tissue+macrophages+under+homeostasis.">Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis.</a> Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).</li><li>Sheng, J., Ruedl, C., Karjalainen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+Tissue-Resident+Macrophages+Except+Microglia+Are+Derived+from+Fetal+Hematopoietic+Stem+Cells.">Most Tissue-Resident Macrophages Except Microglia Are Derived from Fetal Hematopoietic Stem Cells.</a> Immunity. 43 (2), 382-393 (2015).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Hematopoietik prekürsör hücrelerin farklı dalgaları kısa bir zaman çerçevesinde kısmen çakışır; bu da her gelişimsel hematopoetik dalganın katkısını teknik olarak çok zorlayıcı olan bağışıklık hücrelerine analiz eder. Tamoksifenle indüklenebilen Cre sistemleri, spesifik hücreleri zamansal olarak indüklenebilir bir şekilde etiketleme ve ex vivo veya in vitro kültür veya transplantasyona ihtiyaç duymadan embriyolar veya yetişkinlerde soy ana...

Gelişmekte olan birkaç ardışık ama örtüşen hematopoietik progenitör dalgaları vardır, bunların miyeloid nesli yetişkinliğe kalmaktadır. İlk olarak, tek başlı &quot;ilkel&quot; öncüller , E7.5-E8.25 arasındaki fare yumurta sarısı 1 , 2&#39;de ortaya çıkar ve herhangi bir monositik ara madde olmadan embriyonik makrofajlara yol açar. İlkel progenitörlerden türetilen makrofajların yetişkin beyinde devam edip etmediği, yoksa mikroglia aktif bir sorunun konusudur. İkincisi, Eritrom-Myeloid Öncüleri (EMPs) E8.5&#39;teki yolk kesesinde ortaya çıkarlar, kan dolaşımına girerler ve embriyonu kolonize ederler. EMP&#39;ler, Runx1&#39;e bağımlı endotel-to-hematopoietik geçiş 3 , 4&#39;te yumurta sarısı hemogenik endotelden ortaya çıkar. EMP yolk kesesi içinde makrofajlar ayırt mümkün olmakla birlikte, aynı zamanda, embriyonik gün (E) 9 5 ve ayırıcı fetal karaciğer kolonizeEritrositler, megakaryositler, makrofajlar, monositler granülositleri ve mast hücreleri haline gelin 6 . ÇYP&#39;lerden kaynaklanan makrofajlar gelişimsel ve erişkin dokularda proliferatif kapasite gösterir. EMP&#39;den türeyen makrofajların, farklılaşmanın monosit safhasını bypass edip etmediği, farklılaşma yolları hakkında çok az bilginin olduğu için hala tartışmalıdır. 7 , 8 . Son olarak, Hematopoietik Kök Hücreler (HSC), E10.5&#39;te aorta-gonad-mesonefroz bölgesinden uygun embriyo içerisinde ortaya çıkar ve fetal karaciğere göç eder. Uzun vadeli repopülasyon kapasitesine sahip HSC&#39;ler yalnızca E11&#39;den sonra (42 somite çift aşamasında) algılanır 9 . Orada, genişletmek ve kesin hematopoez doğum sonrası yaşamın 10 süresince kan hücresi üretiminin baskın siteyi olur kemik iliği geçiş başlayana kadar E12.5 ayrılırlar. SpAtıonal ve temporal örtüşmenin yanı sıra paylaşılan immüno-fenotipik belirteçler, embriyonik hematopoietik progenitörlerin bu dalgalarının spesifik katkılarını ayırt etme kabiliyetimizi engellemiştir. Hem EMP hem de HSC Runx1&#39;e bağımlı bir şekilde üretilirken ve diğerleri arasında Myb ve büyüme faktörü reseptörü Csf1r (Koloni Uyarıcı Faktör 1 Alıcı, ayrıca Makrofaj Kolonisi Uyarıcı Faktör Alıcı olarak da bilinir) ifade ederken, EMP&#39;ler Hem in vitro hem de in vivo olarak lenfoid potansiyellerinin bulunmaması, uzun dönem repopulasyon potansiyelinin olmaması ve soyu markörü Sca- 11&#39;in yüzey ekspresyonunun eksikliği nedeniyle. Genetik kader haritalama modelleri, embriyonik öncüleri bir hücreye spesifik ve zamana özgü biçimde hedeflemeye izin verdiklerinden, makrofaj ontogenezini karakterize etmek için gereklidir. Burada, iki soy arasındaki ayrım yapmak için laboratuvarımızda kullanılan kaderi haritalama protokolünü sunuyoruzYetişkin dokuların çoğunda bulunan makrofajların: HSC kaynaklı sızıntı makrofajları ve HSC&#39;den bağımsız ikamet makrofajları. Doku ikamet makrofajları, sitokin reseptörü Csf1r 12&#39;yi eksprese eden Myb&#39;den bağımsız öncü hücrelere geri izlenir ve üç tamamlayıcı kader-haritalama stratejisi 6 kullanarak E8.5-E10.5&#39;deki embriyo içerisinde bulunur. Fetal HSC&#39;leri etiketlemeden yolk sac hematopoez araştırmak için, &#39;geliştirilmiş&#39; Cre rekombinazın tamoksifenle uyarılabilir bir füzyon proteini ve iki fare östrojen reseptörü (Mer-iCre-Mer) kontrolünün altında olan bir transgenik suş Csf1r MeriCreMer kullanıyoruz . Csf1r destekçisi. Dolayısıyla, Cre rekombinaz, sınırlı bir zaman aralığı boyunca CSF1R eksprese eden hücrelerde aktif olacaktır. Bir lox-STOP-lox kasetinin (Rosa26 LSL-eYFP ) aşağı akışta bir flüoresan proteini içeren bir muhabir suşuyla kullanıldığında, kalıcılığa yol açacaktırIndüksiyon zamanında mevcut olan hücrelerin genetik etiketlenmesi ve aynı zamanda soylarının genetik etiketlenmesi. E8.5 aktif formda tamoksifen, 4-hidroksitamoksifen (OH-TAM) uygulaması, yumurta sarısı unipotent &quot;ilkel&quot; öncüleri veya fetüs HSC&#39;leri etiketlemeden, EMP&#39;leri ve makrofajları etiketlemektedir. Böylece, embriyonik gelişim sırasında EMP&#39;lerin ve bunların yavrularının immünofenotiplerini karakterize ettik ve aynı zamanda sarı kese kaynaklı makrofajların yetişkin makrofaj havuzlarına katkısını de değerlendirdik. İlkel atadan türetilen makrofajların bu yaklaşımı kullanarak da etiketlendiğini ve yetişkin makrofaj havuzlarına katkıda bulunup katkı sağlayamayacaklarını karakterize etmek için daha fazla çalışma gerekmektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#5 Straight Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15371-92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.5 cm straight scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Kit-PE (clone 2B8)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553355</td>
			<td>1/200 dilution in FACs Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7 (clone 104)</td>
			<td>Sony</td>
			<td>1149120</td>
			<td>1/100 dilution in FACs Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse AA4.1-APC (CD93, clone AA4.1)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-5892</td>
			<td>1/100 dilution in FACs Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (clone Ter119)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>560512</td>
			<td>1/200 dilution in FACs Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse F4/80-BV421 (clone BM8)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>123137</td>
			<td>1/100 dilution in FACs Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (clone M1/70)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>552850</td>
			<td>1/200 dilution in FACs Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block, clone 2.4G2)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>12559069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>11570506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088882001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4527-20KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>Dutscher Dominique</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well tissue culture plate</td>
			<td>Dutscher Dominique</td>
			<td>353224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plate</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>11874235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 wells U-shape bottom tissue culture plate</td>
			<td>Dutscher Dominique</td>
			<td>353227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Syringe Plastipak 2 mL&#160;</td>
			<td>Dutscher Dominique</td>
			<td>300185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon grid 100 &#181;m cell strainers</td>
			<td>Dutscher Dominique</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon grid 70 &#181;m cell strainers</td>
			<td>Dutscher Dominique</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Falcon tubes</td>
			<td>Dutscher Dominique</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup GP Millipore filtration kit, 0.2 &#956;m</td>
			<td>Dutscher Dominique</td>
			<td>51246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Z)-4-HYDROXYTAMOXIFEN 25mg</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7904-25MG</td>
			<td>Special care should be taken when preparing and working with tamoxifen and its derivates. Always use appropriate personal protective equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3972</td>
			<td>Always use appropriate personal protective equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-35 castor oil (Kolliphor/Cremophor EL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunflower oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5007-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>24103-1L-R-D</td>
			<td>Always use appropriate personal protective equipment and use under the fumehood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI, 1 ML (1 MG/ML IN WATER)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>10116287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B75408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX Daily QC Fluorospheres</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>B53230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VersaComp Antibody Capture Bead kit (2x5 mL)</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>B22804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J</td>
			<td>The Jackson laboratory</td>
			<td>19098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J</td>
			<td>The Jackson laboratory</td>
			<td>6148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of erythromyeloid progenitors and their progeny in the mouse embryo by flow cytometry

Makrofajlar bağışıklık sisteminin doğuştan gelen kolundan profesyonel fagositlerdir. Kararlı durumda, sabit makrofajlar erişkin dokularda bulunurlar ve burada enfeksiyon ve doku hasarının ön hatları olarak görev yaparlar. Diğer bağışıklık hücreleri, kemik iliğinde bulunan hematopoietik kök ve progenitör hücrelerden (HSPC) sürekli olarak yenilenirken, ikamet makrofajları olarak bilinen bir makrofaj serisinin, kemik iliği HSPC&#39;leri girilmeden dokularda kendini idame ettirdiği gösterilmiştir. Bu soydan beyinde mikroglia, karaciğerde Kupffer hücreleri ve epidermide Langerhans hücreleri örneklenmektedir. Bağırsak ve kolon lamina propriası, HSPC&#39;den bağımsız ikamet makrofajlarından yoksun olan tek erişkin dokudur. Yakın tarihli araştırmalar, yerleşik makrofajların, fetal hematopoietik kök hücrelerden (HSC) farklı progenitör (ler) den kaynaklanan ekstra embriyonik yolk kesesi hematopoezlerinden kaynaklandığını tespit etmiştir. Yolk kesesi kesin hematopoezisi arasındaRythromyeloid progenitörler (EMP) hem eritroid hem de myeloid hücrelere, özellikle ikamet makrofajlarına neden olur. ÇYP gelişme E8.5 ve E10.5 günleri arasında yolk kesesi içinde üretilir ve sirkülasyon bağlı olduğu yerde fetal karaciğere göç ederler; burada en azından E16.5&#39;e kadar genişler ve ayırt edilirler. Onların soyları eritrositler, makrofajlar, nötrofiller ve mast hücreleri içerir, ancak sadece EMP&#39;den türeyen makrofajlar dokularda yetişkinliğe kadar ısrarcı kalırlar. ÇÇ gelişinin geçici doğası ve HSC üretimi ile zamansal örtüşme, bu öncüllerin analizini zorlaştırır. Akış sitometrisi vasıtasıyla in vivo olarak EMP ve EMP türevi hücreleri karakterize etmek için makrofaj sitokin reseptörü Csf1r promotörünün ekspresyonuna dayanan bir tamoksifen-uyarılabilir kader eşleme protokolü kurduk.

Genetik kader eşleştirmesi, bir Rosa26-LSL-eYFP raportörü taşıyan erkeklerle çiftleştirilen Csf1r-Mer-iCre-Mer dişilerinde E8.5 OH-TAM ile idare edilerek gerçekleştirildi. OH-TAM&#39;ın varlığında, durdurma kasetinin eksizyonu, Csf1r&#39;yi ifade eden hücrelerde YFP&#39;nin kalıcı şekilde eksprese edilmesine yol açar. İki hematopoietik dokuyu topladık: yolk kesesi ve fetal karaciğer ve E10.5 embriyolarından alınan hematopoietik olmayan bir doku,...

Watch this Scientific Journal Video about Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry at JoVE.com

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Süzülen makrofajlar dolaşımdaki öncüllerden yetişkin dokulara sürekli olarak işlenirken, yerleşik makrofajlar, gelişme sırasında dokularını tohumlamakta ve burada progenitörlerden başka girdiler almadan korunmaktadırlar. Yerleşik makrofajların öncüleri yakın zamanda tanımlandı. Burada, yerleşik makrofaj öncüllerinin genetik kader haritalaması için yöntemleri sunuyoruz.

Akım Sitometresi ile Fare Embriyosunda Eritromiyeloid Progenitörlerin Ve Döllerinin Belirlenmesi

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

identification-erythromyeloid-progenitors-their-progeny-mouse-embryo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.9K Görüntüleme.  Institut Pasteur.  Süzülen makrofajlar dolaşımdaki öncüllerden yetişkin dokulara sürekli olarak işlenirken, yerleşik makrofajlar, gelişme sırasında dokularını tohumlamakta ve burada progenitörlerden başka girdiler almadan korunmaktadırlar. Yerleşik makrofajların öncüleri yakın zamanda tanımlandı. Burada, yerleşik makrofaj öncüllerinin genetik kader haritalaması için yöntemleri sunuyoruz. 

Video: Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Timus Karakterizasyonu kullanma Fare Embriyo atalarıdır Settling<em&gt; In Vivo</em&gt; Ve<em&gt; In Vitro</em&gt; Tahliller

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Gelişim Biyolojisi

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head and heart progenitor cell development with pharyngeal arches (also known as branchial arches) ex vivo. Using this method, we have recently described that the second pharyngeal arch contains self-renewing heart progenitors and serves as a microenvironment for expansion of the progenitors during mouse heart development. The progenitor cells remain undifferentiated and expansive inside the arch, but quickly become functional cardiomyocytes as they migrate out of the arch. We also reported that first pharyngeal arch contains muscle progenitors giving rise to myotubes after leaving the arch. Here, we demonstrate the procedure for the dissection and ex vivo culture of first and second pharyngeal arches from developing mouse embryos. The method enables one to study head and heart progenitor/muscle development, including cardiomyocyte and myotube formation in detail ex vivo.

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

Faringeal Arches Ex Vivo Kültür Kalp ve kas atalarıdır ve Bunların Niche Eğitim için

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to the next generation. So far, molecular studies of this morphological transition have been hampered by the lack of a method allowing adequate separation of these important steps of spermatid differentiation for subsequent analyses. Earlier attempts at proper gating of these cells using flow cytometry may have been difficult because of a peculiar increase in DNA fluorescence in spermatids undergoing chromatin remodeling. Based on this observation, we provide details of a simple flow cytometry scheme, allowing reproducible purification of four populations of mouse spermatids fixed with ethanol, each representing a different state in the nuclear remodeling process. Population enrichment is confirmed using step-specific markers and morphological criterions. The purified spermatids can be used for genomic and proteomic analyses.

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

Adım özgü Fare spermatidlerin Sıralama&#39;yı Akışı Sitometrinin tarafından

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, including endothelial, neuronal, and mesenchymal cells were shown to regulate cell differentiation and proliferation in the embryonic pancreas. In the adult, the function and mass of insulin-producing cells were shown to depend on cells in their microenvironment, including pericyte, immune, endothelial, and neuronal cells. Lastly, changes in the pancreas microenvironment were shown to regulate pancreas tumorigenesis. However, the cues underlying these processes are not fully defined. Therefore, characterizing the different cell types that comprise the pancreas microenvironment and profiling their gene expression are crucial to delineate the tissue development and function under normal and diseased states. Here, we describe a method that allows for the isolation of mesenchymal cells from the pancreas of embryonic, neonatal, and adult mice. This method utilizes the enzymatic digestion of mouse pancreatic tissue and the subsequent fluorescence-activated cell sorting (FACS) or flow-cytometric analysis of labeled cells. Cells can be labeled by either immunostaining for surface markers or by the expression of fluorescent proteins. Cell isolation can facilitate the characterization of genes and proteins expressed in cells of the pancreas mesenchyme. This protocol was successful in isolating and culturing highly enriched mesenchymal cell populations from the embryonic, neonatal, and adult mouse pancreas.

Here, we describe a method for the isolation of cells in the pancreas microenvironment from embryonic, neonatal and adult mouse tissue, focusing on the isolation of mesenchymal cells. This method allows profiling of cell gene expression and protein secretion in order to elucidate the extrinsic signals that regulate pancreas development, function, and tumorigenesis.

Yalıtımlı ve Akış Sitometrisi ile Pankreas mezenkim ve Hücreler Analizi

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. Currently, it allows the discrimination of up to 9 murine germ cell populations with high yield and purity. This high-resolution in discrimination and purification is possible due to unique changes in chromatin structure and quantity throughout spermatogenesis. These patterns can be captured by flow cytometry of male germ cells stained with fluorescent DNA-binding dyes such as Hoechst-33342 (Hoechst). Herein is a detailed description of a recently developed protocol to isolate mammalian testicular germ cells. Briefly, single cell suspensions are generated from testicular tissue by mechanical dissociation, double stained with Hoechst and propidium iodide (PI) and processed by flow cytometry. A serial gating strategy, including the selection of live cells (PI negative) with different DNA content (Hoechst intensity), is used during FACS sorting to discriminate up to 5 germ cell types. These include, with corresponding average purities (determined by microscopy evaluation): spermatogonia (66%), primary (71%) and secondary (85%) spermatocytes, and spermatids (90%), further separated into round (93%) and elongating (87%) subpopulations. Execution of the entire workflow is straightforward, allows the isolation of 4 cell types simultaneously with the appropriate FACS machine, and can be performed in less than 2 h. As reduced processing time is crucial to preserve the physiology of ex vivo cells, this method is ideal for downstream high-throughput studies of male germ cell biology. Moreover, a standardized protocol for multispecies purification of mammalian germ cells eliminates methodological sources of variables and allows a single set of reagents to be used for different animal models.

This work describes the standardization of a method to obtain purified germ cell populations from testicular tissue of different mammalian species. It is a straightforward protocol that combines mechanical testis dissociation, staining with Hoechst-33342 and propidium iodide, and FACS sorting, with wide applications in comparative studies of male reproductive biology.

Memeli Erkek Germ Hücrelerinin Çok Denekli Saflaştırılmasında Standart Bir Yaklaşım, Mekanik Doku Ayrılma ve Akış Sitometrisi ile

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Fare Malı İnsani Kemik İliği Mikro Çevrelerinin Biyomühendisliği ve Canlı Görüntüleme ile Görselleştirilmesi

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be difficult to study, and can lead to confounding results. The protocol described here is a straightforward breeding paradigm to increase and decrease penetrance in lethal zebrafish skeletal mutants. Because lethal mutants cannot be selectively bred directly, the classic selective breeding strategy of progeny testing is employed. This method also includes protocols for Kompetitive Allele Specific PCR (KASP) genotyping zebrafish and staining larval zebrafish cartilage and bone. Applying the husbandry strategy described here can increase the penetrance of an interesting skeletal phenotype enabling more reproducible results in downstream applications. In addition, decreasing the mutant penetrance through this selective breeding strategy can reveal the developmental processes that most crucially require the function of the mutated gene. While the skeleton is specifically considered here, we propose that this methodology will be useful for all zebrafish mutant lines.

The goal of this protocol is to alter the penetrance of lethal skeletal mutant phenotypes in zebrafish by selective breeding. Lethal mutants cannot be grown to adulthood and bred themselves, therefore this protocol describes a method for tracking and selecting penetrance through multiple generations by progeny testing.

Zebra balığı öldürücü iskelet Mutant alellerle test döl tarafından değişen

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell types include enzyme-secreting acinar cells, an arborized ductal system responsible for the transportation of enzymes to the gut, and hormone-producing endocrine cells. 
Endocrine beta-cells are the sole cell type in the body that produce insulin to lower blood glucose levels. Diabetes, a disease characterized by a loss or the dysfunction of beta-cells, is reaching epidemic proportions. Thus, it is essential to establish protocols to investigate beta-cell development that can be used for screening purposes to derive the drug and cell-based therapeutics. While the experimental investigation of mouse development is essential, in vivo studies are laborious and time-consuming. Cultured cells provide a more convenient platform for screening; however, they are unable to maintain the cellular diversity, architectural organization, and cellular interactions found in vivo. Thus, it is essential to develop new tools to investigate pancreatic organogenesis and physiology.
Pancreatic epithelial cells develop in the close association with mesenchyme from the onset of organogenesis as cells organize and differentiate into the complex, physiologically competent adult organ. The pancreatic mesenchyme provides important signals for the endocrine development, many of which are not well understood yet, thus difficult to recapitulate during the in vitro culture. Here, we describe a protocol to culture three-dimensional, cellular complex mouse organoids that retain mesenchyme, termed pancreatoids. The e10.5 murine pancreatic bud is dissected, dissociated, and cultured in a scaffold-free environment. These floating cells self-assemble with mesenchyme enveloping the developing pancreatoid and a robust number of endocrine beta-cells developing along with the acinar and the duct cells. This system can be used to study the cell fate determination, structural organization, and morphogenesis, cell-cell interactions during organogenesis, or for the drug, small molecule, or genetic screening.

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Here, we present a protocol to generate insulin expressing 3D murine pancreatoids from free-floating e10.5 dissociated pancreatic progenitors and the associated mesenchyme.

İskele-free, üç boyutlu insülin ifade Pancreatoids fare pankreas ataları Vitro gelen nesil

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal and postnatal consequences. To ensure the innocuousness of ART applications, studies in animal models are necessary. In addition, as a last step, embryo development studies require evaluation of their capacity to develop full-term healthy offspring. Here, embryo transfer to the uterus is indispensable to perform any ARTs-related experiment.
The rabbit has been used as a model organism to study mammalian reproduction for over a century. In addition to its phylogenetic proximity to the human species and its small size and low maintenance cost, it has important reproductive characteristics such as induced ovulation, a chronology of early embryonic development similar to humans and a short gestation that allow us to study the consequences of ART application easily. Moreover, ARTs (such as intracytoplasmic sperm injection, embryo culture, or cryopreservation) are applied with suitable efficiency in this species.
Using the laparoscopic embryo transfer technique and the cryopreservation protocol presented in this article, we describe 1) how to transfer embryos through an easy, minimally invasive technique and 2) an effective protocol for long-term storage of rabbit embryos to provide time-flexible logistical capacities and the ability to transport the sample. The outcomes obtained after transferring rabbit embryos at different developmental stages indicate that morula is the ideal stage for rabbit embryo recovery and transfer. Thus, an oviductal embryo transfer is required, justifying the surgical procedure. Furthermore, rabbit morulae are successfully vitrified and laparoscopically transferred, proving the effectiveness of the described techniques.

Assisted reproductive techniques (ARTs) are in continuous evaluation to improve outcomes and reduce the associated risks. This manuscript describes a minimally invasive embryo transfer procedure with an efficient cryopreservation protocol that allows the use of rabbits as an ideal animal model of human reproduction.

En düşük Invaziv embriyo transferi ve tavşan modelinde optimum embriyo aşamasında embriyo vitrifikasyon

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood cytopenias, dysplasia, and a propensity for transformation to acute leukemia. NUP98-HOXD13 (NHD13) transgenic mice recapitulate human MDS in terms of peripheral blood cytopenias, dysplasia, and transformation to acute leukemia. We previously demonstrated that MDS could be transferred from a genetically engineered mouse with MDS to wild-type recipients by transplanting MDS bone marrow nucleated cells (BMNC). To more clearly understand the MDS cell of origin, we have developed approaches to transplant specific, immunophenotypically defined hematopoietic subsets. In this article, we describe the process of isolating and transplanting specific populations of hematopoietic stem and progenitor cells. Following transplantation, we describe approaches to assess the efficiency of transplantation and persistence of the donor MDS cells.

We describe the use of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) to assess the malignant potential of genetically engineered hematopoietic cells. HSCT is useful for evaluating various malignant hematopoietic cells in vivo as well as generating a large cohort of mice with myelodysplastic syndromes (MDS) or leukemia to evaluate novel therapies.

Hematopoetik kök hücre transplantasyonu myelodisplastik sendromu kökeni değerlendirmek için kullanımı

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...