Bu teknik kullanılarak oluşturulan veriler, genel antikor veya antikor yaşam terapötikleri için kullanılabilecek otoimmün eğilimli fare modellerinin yanı sıra insanlaştırılmış farelerin anlaşılmasını daha da ileriye götürür. Sürekli genişleyen bir florofor yelpazesine sahip reaktiflerin mevcudiyeti, tek tek hücreler üzerinde birden fazla parametrenin eşzamanlı olarak analizini sağlar ve B hücre heterojenliğinin değerlendirilmesini sağlar. Bu protokol, genetik olarak tasarlanmış fareleri fenotipleme amacıyla geliştirilmiştir.
genetik manipülasyonu B hücre gelişimini değiştirip değiştirmeyeceğini belirlemek için. Merhaba, ben Faith Harris. Prosedürü bugün göstereceğim.
Her hayvandan her hücre türünden bir milyonu 96 kuyulu bir U-bottom plakasına ayırarak başlayın. Tam leke, floresan eksi bir numune ve her florofor için lekesiz numuneler de dahil olmak üzere tüm numuneler ve kontroller için yeterli Kuyuların mevcut olduğundan emin olun. Kemik iliği olgunlaşma paneli ve dalak olgunlaşma paneli için, aliquot hücreleri iki kuyuya, her tam leke örneği için kuyu başına 1 milyon hücreye.
Tek renk telafisi canlılık denetimleri için, her hücre türünün iki milyon hücresini tek tek kuyulara ekleyin. Plakayı 845 x g'da dört santigrat derecede iki dakika santrifüjleyin. Kuyuları çapraz kirletmemeye özen ederek plakayı bir lavabonun üzerine hızlı bir şekilde ters çevirip sallayarak süpernatantı deşarje edin.
Hücreleri 200 mikrolitre DPBS'de iki kez yıkayın. Her yıkamadan sonra süpernatantı santrifüj ve dekantize edin. Hücreleri DPBS'de seyreltilmiş 100 mikrolitre canlılık boyasında bir ila 1000 oranında yeniden biriktirin ve tek renk telafisi için kullanılan hücrelerden kaçının.
Her leke seti için, tamamen ellenmemiş bir numune ve ihtiyacınız olabilecek diğer kontroller için birkaç yersiz kuyu ve canlılık FDO kontrolü için ek bir yersiz kuyu bırakın. Bu kuyulara PBS ekleyin. Tek renk telafisi canlılık kontrollerinin hücrelerini 200 mikrolitre seyreltilmiş canlılık boyasında yeniden biriktirin.
Bu hücrelerin 100 mikrolitresini 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 65 santigrat derecede beş dakika ısıtın, ardından ısıtılan hücreleri kalan canlı hücrelerle orijinal kuyuya geri aktarın. Hücreleri ışıktan korunarak 30 dakika boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, hücreleri santrifüj edin ve diğer kuyuları çapraz kirletmeden plakayı titreterek veya ters çevirerek süpernatantı deşarj edin.
Hücreleri 200 mikrolitre DPBS'de yeniden yağlayarak yıkayın, ardından süpernatantı daha önce olduğu gibi santrifüj ve dekante edin. DPBS yıkamayı tekrarlayın. Mililitre başına 10 mikrogramlık son konsantrasyon elde etmek için bir ila 50 oranında leke tamponu ile seyreltilmiş FC bloğu mikrolitreleri ekleyin.
Periton hücreleri için, spesifik olmayan lekelenmeyi azaltmak için beş mikrolitre monosit bloker ekleyin. Daha sonra, hücreleri ışıktan korunarak 15 dakika boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Metin el yazmasındaki antikor tablolarını kullanarak milyon hücre başına 100 mikrolitrelik son hacim için leke tamponunda tam leke ana karışımları ve IPO'lar hazırlayın.
FC bloğunu çıkarmadan, seçilen kuyulara 100 mikrolitre tam leke mikseri ve IPO ekleyin. Her antikor ve bir leke seti için tek renk telafi kontrolleri hazırlayın. Kompanzasyon boncukları kullanıyorsanız üreticinin talimatlarını izleyin.
Hücreleri ve boncukları ışıktan korunarak 30 dakika boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra, plakayı ters çevirerek ve titreterek süpernatantı santrifüj edin ve dekante edin. Hücreleri ve boncukları 200 mikrolitre leke tamponunda üç kez yıkayın, her seferinde süpernatantı santrifüjleme ve dekante edin.
Numuneleri analiz için sabitlemek için DPBS'de %2 paraformaldehitin 200 mikrolitresinde hücreleri ve boncukları yeniden biriktirin. Hücreyi ve boncukları 30 dakika boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın, ışıktan kornun, sonra plakayı ters çevirerek veya titreterek süpernatantı santrifüjleyin ve dekante edin. Hücreleri ve boncukları 200 mikrolitre leke tamponunda yeniden biriktirin.
Temiz bir 96 kuyulu U-bottom plakasının üzerine bir filtre plakası yerleştirin ve her numuneyi çoklu pipet kullanarak filtre plakasının bir kuyusuna aktarın. Filtre plakasını santrifüjleyin ve süpernatantı dekante edin. Kemik iliği ve dalak olgunlaşma panelleri için, tamamen lekeli hücreleri 100 mikrolitre leke tamponunda yeniden biriktirin.
Her hayvan için iki kuyuyu bir kuyuda birleştirin. Kalan panelleri, IPO'ları ve kontrolleri 200 mikrolitre leke tamponunda yeniden sunun. Sabit hücreleri ve boncukları bir gecede dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın, ışıktan korkun.
Hazırlanan tek leke kompanzasyonlarını kullanarak her leke paneli için kompanzasyon kontrollerini kaydedin ve her numune için pozitif ve negatif kapılar ayarlayın. Yazılımı kullanarak ücret matrisini hesaplayın. Kapıların uygun şekilde ayarlandığından emin olarak ilk örneği almaya başlayın.
Makineyi, metin el yazmasında belirtildiği gibi her örnek için çeşitli hücre olaylarını çalıştıracak ve kaydedecek şekilde ayarlayın. Metin yazısındaki gating stratejilerini izleyerek akış sitometri analiz yazılımını kullanarak veri analizine devam edin. Peritondaki periton B hücrelerinin karakterizasyonu için akış sitometrik analizi, farelerdeki B-1a ve B-1b hücrelerinin yanı sıra canlı periton hücrelerinin, toplam B hücrelerinin, B-1 ve B-2 alt kümelerinin frekanslarını gösterir.
Kemik iliği B hücreleri analiz edildiğinde, farelerde canlı hücrelerin frekansları, total B hücreleri, Fraksiyon A, B öncesi hücreler, Fraksiyon B, Fraksiyon C, Fraksiyon C'Fraksiyon D, olgunlaşmamış Fraksiyon E, geçiş fraksiyonu E ve fraksiyon F B hücrelerinin frekansları belirlendi. Dalak B hücrelerinin analizi, canlı dalak hücrelerinin, toplam B hücrelerinin, geçiş B hücrelerinin, T1, T2, T3 hücrelerinin, olgun B hücrelerinin, foliküler I hücrelerinin, foliküler II hücrelerinin, öncül ve olgun marjinal bölge hücrelerinin ve farelerdeki B-1 hücrelerinin frekanslarını göstermektedir. Farelerde immünoglobulin kappa ve immünoglobulin lambda B hücrelerinin frekansları dalak akış sitometrik analizi ile belirlendi.
Bu protokolü gerçekleştirirken, bir dedektör kanamasından diğerine gelen sinyali telafi kontrollerini kullanarak çözmeniz gerekir. Bu kontroller tekil olarak hücre lekeli veya ticari olarak kullanılabilir kompanzasyon boncukları ile olabilir. Lenfoid organlar içindeki hücre lokalizasyonunu görselleştirmek için immünhistokimya gibi akış sitometrisi ile birlikte ek tahliller ve B hücre yanıtlarını gerçek mekan ve zamanda analiz etmek için iki foton mikroskopisi kullanılabilir.
B hücre bölmelerinin akış sitometrisi analizi, BCR ve ilgili eksikliklerle ilişkili fenotiplerin karakterizasyonuna, BCR sinyal moleküllerinin pertürbasyonlarına veya B hücre sağkalımını modüle eden sitokinlerin bozulmasına izin verir.
